CN111398579A - 一种构建古尔图病毒抗体的间接elisa检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种构建古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法及应用。通过构建pET‑32a‑NP载体，转化至E.coli BL21感受态细胞大量培养获得rNP蛋白通过纯化测定，rNP蛋白纯度超过80%，通过使用本发明构建的古尔图病毒抗体间接ELISA检测方法与常规检测方法对比，本发明构建的间接ELISA检测方法的符合率高达92.7%，该检测方法具有特异性强、灵敏度高、结果准确可靠的特点，是一种具有广谱性的检测方法，为古尔图病毒抗体血清流行病学监测提供了简单、快速和成本低廉的技术支持具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和微生物学领域。具体地讲，本发明涉及一种古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法及其应用的技术领域。
背景技术
古尔图病毒(Guertu virus，GTV)可通过蜱传引起一种人畜共患病，流行病学调查表明草原革蜱是中国西部某地区GTV的主要传播媒介，其平均阳性率为7.89％，高于中国中部长角血蜱携带SFTSV 的阳性率(2.1-5.4％)。草原革蜱是中国西部某地区的一种优势蜱种，是蜱传疾病的重要载体。
GTV基因组由单股、负链RNA组成，分为大(L)、中(M)、小(S) 三段，分别编码RNA依赖的聚合酶、前体囊膜糖蛋白(GP，包括Gn 和Gc)和核蛋白(NP)。NP能够刺激机体发生早期体液免疫和细胞免疫，并且在感染早期体内仅仅只能够测定到NP。据报道，病毒NP 蛋白对于白蛉病毒属的许多成员具有高度免疫原性，并且可作为主要抗原，NP蛋白是病毒体和病毒感染细胞中最丰富的病毒产物。据报道，RVFV的NP蛋白被报道为免疫显性病毒蛋白，感染后早期和恢复期个体很容易检测到抗NP蛋白抗体，为疾病的诊断检测提供了坚实的基础。此外，通过免疫印迹和半定量放射免疫沉淀测定，Toscana 病毒的核蛋白被鉴定为托斯卡纳病毒感染患者中负责IgM和IgG的主要抗原。因此，GTV NP抗原的主要表位和相关的功能意义需要更多的研究。
在Min-Ah Yu等的一项研究中，建立了针对韩国最普遍的SFTSV 毒株(CB1)的基于NP和Gn的ELISA方法。基于NP和Gn的ELISA 方法均显示出对同源性SFTSV CB1株具有很好的一致性。比较结果表明，基于NP的ELISA方法更有利于评估一般血清流行率，因为它具有较高的SFTSV基因型之间的交叉反应性。然而，基于Gn的 ELISA方法可用于建立基因型特异性诊断方法。该研究认为建立的基于NP和Gn的ELISA方法可用于测量动物和人类的感染率。目前，针对GTVNP蛋白的抗原性分析及ELISA方法的建立尚未见报道。
发明内容
针对现有技术未见有关古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法报道的技术现状，本发明旨在提供一种古尔图病毒抗体的间接ELISA 检测方法及其应用。通过使用本发明提供的古尔图病毒抗体的间接 ELISA方法与常规检测方法对比，建立的间接ELISA检测方法的符合率高达92.7％。本发明的ELISA检测方法可为GTV血清流行病学监测提供了简单、快速和成本低廉的技术支持。
因此，为了建立针对GTV的检测方法，本发明通过选取GTV的核蛋白NP作为靶蛋白，建立以纯化得到重组蛋白rNP为包被抗原的间接ELISA方法来测定血清中GTV IgG抗体。本发明为GTV NP蛋白的抗原性研究及针对GTV的检测试剂盒的开发提供了理论基础。
为解决上述的技术问题，本发明通过以下技术方案实现。
本发明利用已分离的古尔图病毒DXM株NP序列进行生物信息学分析，并将设计的带有KpnⅠ和NotⅠ酶切位点的NP基因连接入 pET-32a(+)空载体，将的pET-32a-NP，转化至E.coli BL21感受态细胞大量培养获得rNP蛋白。
本发明具体提供一种古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法，具体步骤如下：
(1)将具有KpnⅠ和NotⅠ酶切位点的合成NP基因连接入 pET-32a(+)空载体，的pET-32a-NP载体转化至E.coli BL21感受态细胞；
(2)将步骤(1)中制备获得的E.coli BL21感受态细胞加入含氨苄青霉素(A+)的培养基中大量繁殖过夜后，以1：1000的比例加入IPTG诱导剂后培养4h；
(3)将步骤(2)中获得的将诱导后菌液离心后去培养基，沉淀用1×PBS溶解，利用细胞超声破碎仪破碎细胞，离心后取沉淀，用6 mol/L浓度的尿素溶解变性，继续离心后得到上清，用20mmol/L-500 mmol/L咪唑浓度来洗脱，洗脱获得rNP；
(4)用抗原稀释液稀释步骤(3)中获得的rNP抗原包被液至 2-8μg/mL，以200μL的体积加入孔中，静置于4℃过夜，PBST洗 15min；
(5)分别用0-5％脱脂奶粉的封闭液以200μL的体积加入孔中，在37℃培养箱中封闭2h，PBST洗15min；
(6)GTV阴性和阳性羊、人血清以1:100-400稀释度稀释，以每孔加入100μL，37℃孵育15-90min，PBST洗25min；
(7)加入HRP标记的兔抗羊或兔抗人酶标二抗，以1:10000稀释度稀释，每孔加入100μL，37℃培养箱中孵育15-90min后，PBST 洗20min；
(8)按1:1体积比例加入TMB A液及B液底物显色液，每孔加入100μL，置于黑暗处5-25min后，加入终止液，每孔加入50μL。
优选的，咪唑采用200mmol/L浓度进行洗脱。
优选的，rNP抗原包被液浓度选用4μg/mL。
优选的，封闭液中的脱脂乳粉浓度为3％。
优选的，GTV阴性和阳性羊、人血清稀释度为1:100。
优选的，GTV阴性和阳性羊、人血清孵育时间为45min。
优选的，酶标二抗的稀释度为1:2000。
优选的，酶标二抗的孵育时间为30min。
优选的，TMB显色时间为25min。
进一步，本发明通过古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法在检测古尔图病毒中的应用，以rNP作为抗原的间接ELISA检测方法结果与免疫荧光检测法(IFA)检测结果相比较后发现，本发明提供的间接ELISA检测方法的符合率为92.7％，是一种可靠的，具有广谱性的检测方法。
通过实施本发明具体的发明内容可以达到以下有益效果：
本发明中采用古尔图病毒DXM株，并将带有KpnⅠ和NotⅠ酶切位点的NP基因pET-32a-NP，转化至E.coli BL21感受态细胞大量培养获得rNP蛋白。通过纯化测定，rNP蛋白纯度超过80％，以rNP 作为抗原的间接ELISA检测方法结果与IFA检测结果相比较后发现，的间接ELISA检测方法的符合率为92.7％。本发明提供的一种以rN P作为抗原的一种古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法具有特异性强、灵敏度高、结果准确可靠的特点，是一种具有广谱性的检测方法，为GTV血清流行病学监测提供了简单、快速和成本低廉的技术支持具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为GTV NP原核表达质粒的酶切鉴定图。
图2为GTV NP原核表达质粒诱导表达结果检测图。
图3为GTV NP全长重组蛋白的纯化结果检测图。
图4为rNP的Western blot鉴定结果图。
图4中，图A为抗His鼠单克隆抗体；1为未诱导的 pET-32a-NP/BL21；2为诱导后的pET-32a-NP/BL21；M为预染蛋白 Marker(14-120kD)；图B为兔抗GTV多克隆抗血清；1为未诱导的 pET-32a-NP/BL21；2为诱导后的pET-32a-NP/BL21；M为预染蛋白 Marker(14-120kD)。
图5为采集血清样本中抗GTV NP抗体Western blot检测结果图。
图5中，图A为阳性羊血清；B为阴性羊血清；C为阳性人血清； D为阴性人血清。1为未诱导的pET-32a-NP/BL21；2为诱导后的 pET-32a-NP/BL21；M为预染蛋白Marker(14-120kD)。
图6为基于rNP间接ELISA检测脱脂奶粉浓度条件优化结果图。
图7为基于rNP间接ELISA检测一抗孵育时间条件优化结果图。
图8为基于rNP间接ELISA检测一抗稀释度条件优化结果图。
图9为基于rNP间接ELISA检测酶标二抗孵育时间条件优化结果图。
图10为基于rNP间接ELISA检测酶标二抗稀释度条件优化结果图。
图11为基于rNP间接ELISA检测TMB显色时间条件优化结果图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中涉及的设备和材料：
限制性内切酶(BamHⅠ和XhoⅠ)购自TaKaRa公司；Proteinlso Ni-NTA Resin、抗His鼠单克隆抗体、预染蛋白Marker质粒、小量提取试剂盒和E.coli BL21(DE3)感受态细胞购自北京Trans公司；酶标二抗均购自北京Trans公司；其他试剂均为国产分析纯。
LB培养基：NaCl 20g，酵母浸粉10g，蛋白胨20g，NaOH 0.66g，定容至2L，经灭菌后备用。
10×PBS：NaCl(氯化钠)80g，Na2HPO4·12H2O(磷酸氢二钠) 36.3g，KCl(氯化钾)2g，KH2PO4(磷酸二氢钾)2.4g，定容至 1L经灭菌后备用。
Western blot转膜缓冲液：Gly(甘氨酸)2.9g，Tris-base(三羟甲基氨基甲烷)5.8g，SDS(十二烷基磺酸钠)0.37g，加甲醇200mL 后定容至800mL。
Western blot洗膜缓冲液：Tris-base(三羟甲基氨基甲烷)6.0545 g，NaCl8.7660g，Tween-200.5mL，定容至1L。
Western blot封闭液：脱脂奶粉，用TBST定容至100mL。
检测所用血清采集于中国西部某地区部分人血清。
本发明中选用的所有试剂、仪器、原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限制本明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法
本发明利用已分离的古尔图病毒DXM株NP序列进行生物信息学分析，并将设计的带有KpnⅠ和NotⅠ酶切位点的NP基因连接入 pET-32a(+)空载体，将的pET-32a-NP，转化至BL21感受态细胞大量培养获得rNP蛋白。
本发明具体提供一种古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法，具体步骤如下：
(1)将具有KpnⅠ和NotⅠ酶切位点的合成NP基因连接入 pET-32a(+)空载体，的pET-32a-NP载体转化至E.coli BL21感受态细胞。
(2)将步骤(1)中制备获得的E.coli BL21感受态细胞加入含氨苄青霉素(A+)的培养基中大量繁殖过夜后，以1:1000的比例加入IPTG诱导剂后培养4h。
(3)将步骤(2)中获得的将诱导后菌液离心后去培养基，沉淀用1×PBS溶解，利用细胞超声破碎仪破碎细胞，离心后取沉淀，用6 mol/L浓度的尿素溶解变性，继续离心后得到上清，用20mmol/L-500 mmol/L咪唑浓度来洗脱，洗脱获得rNP。
(4)用抗原稀释液稀释步骤(3)中获得的rNP抗原包被液至 2-8μg/mL，以200μL的体积加入孔中，静置于4℃过夜，PBST洗 15min。
(5)分别用0-5％脱脂奶粉的封闭液以200μL的体积加入孔中，在37℃培养箱中封闭2h，PBST洗15min。
(6)GTV阴性和阳性羊、人血清以1:100-400稀释度稀释，以每孔加入100μL，37℃孵育15-90min，PBST洗25min。
(7)加入HRP标记的兔抗羊或兔抗人酶标二抗，以1:10000稀释度稀释，每孔加入100μL，37℃培养箱中孵育15-90min后，PBST 洗20min。
(8)按1:1体积比例加入TMB A液及B液底物显色液，每孔加入100μL，置于黑暗处5-25min后，加入终止液，每孔加入50μL。
实施例二：原核表达载体pET-32a-NP的制备
选取GTV DXM株NP序列进行生物信息学分析，并将设计的带有KpnⅠ和NotⅠ酶切位点的NP基因送至上海捷瑞生物工程有限公司合成，将合成的NP基因连接入经KpnⅠ和NotⅠ酶切的pET-32a(+) 空载体，转化至BL21感受态细胞，的pET-32a-NP由上海生物工程有限公司测序。经分析可知GTV DXM株NP序列内无信号肽和跨膜区，重组质粒pET-32a-NP经KpnⅠ和NotⅠ双酶切，实验表明显示大小正确。DNA测序结果经DNAMan比对与设计的一致，结果显示重组质粒pET-32a-NP成功，参见附图1。
实施例三：原核表达载体pET-32a-NP的诱导表达
基于实施例二中获得的原核表达载体pET-32a-NP，将转化至 E.coli BL21(DE3)感受态细胞的pET-32a-NP质粒过夜培养和将阳性克隆加入含氨苄青霉素(A+)的培养基中大量繁殖过夜。接取10mL 培养后的菌液提取质粒进行酶切鉴定，剩下的菌液继续培养4h，以 1：1000的比例加入IPTG诱导剂后培养4h，SDS-PAGE电泳检测表达产物，检测结果参见附图2所示。
实施例四：rNP蛋白的纯化
基于实施例三中制备获得的诱导后的菌液离心后去培养基，将沉淀用1×PBS溶解，利用细胞超声破碎仪破碎细胞，离心后取沉淀，用6mol/L浓度的尿素溶解变性，继续离心后得到上清，用20 mmol/L-500咪唑浓度来洗脱，洗脱样本用SDS-PAGE电泳检测结果如附图3所示。通过浓度检测显示：rNP以包涵体形式存在，在200 mmol/L浓度洗脱下来，纯度超过80％，利用BCA试剂盒测定其浓度为4.6mg/mL。
实施例五：免疫印迹实验
基于实施例四，将诱前处理样本、诱后处理样本及纯化蛋白处理样本处理，凝胶电泳分离蛋白后转移至PVDF膜，加入封闭液(脱脂奶粉5g，用洗膜缓冲液定容至100mL)在37℃培养箱中封闭2 h；TBST洗膜30min后，将膜放进已用抗体稀释液稀释好的抗His鼠单克隆抗体(1:4000)、兔抗NP多克隆抗血清(1:1000)或天然感染GTV 的阳性羊血清(1:100)中，在37℃培养箱中静置2h，将孵育有抗His 鼠单克隆抗体(1:4000)、兔抗NP多克隆抗血清(1:1000)或天然感染 GTV的阳性羊血清(1:100)的PVDF膜利用TBST洗膜50min，将 PVDF膜放进HRP标记的羊抗鼠、羊抗兔或兔抗羊IgG二抗，在4℃孵育过夜后TBST漂洗55min；加ECL显色液，置于LAS仪中，调整至自动曝光，曝光后观察并分析结果。检测结果如附图4、附图5 所示。免疫印迹实验表明，约在46kD处出现条带，说明得到的rNP 能够和抗His鼠单克隆抗体作用。rNP也能被兔抗GTV-NP多克隆抗血清、GTV阳性羊血清及人血清特异性识别，表明rNP具有较高的抗原性。
实施例六：古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法的优化
基于上述实施例二至实施例四，最优间接ELISA检测方法。
(1)最佳工作条件
用抗原稀释液稀释rNP成2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL和8μ g/mL，以200μL的体积加入孔中，静置于4℃过夜，PBST洗15m in。分别用0、1％、2％、3％、4％和5％的封闭液以200μL的体积加入孔中，在37℃培养箱中封闭2h，PBST洗15min；GTV阴性和阳性羊、人血清以1:100、1:200、1:300、1:400四个稀释度分别稀释，以100μL每孔的体积加入，同一稀释度的血清设置三个重复组，并设计一组空白对照组，37℃孵育，PBST洗25min；加入HRP标记的兔抗羊或兔抗人酶标二抗，以1:2000、1:4000、1:8000、1:10000 四个不同稀释度稀释，以100μL每孔的体积加入，在37℃培养箱中孵育后，PBST洗20min；以1:1体积比例加入TMBA液及B液底物显色液，以100μL每孔的体积加入，置于黑暗处，最后加入终止液，以50μL每孔加入。测定其OD450nm值。最终确定抗原包被的最佳浓度、封闭液的最佳浓度、血清和二抗的最适稀释度。最终检测结果参见附图6、附图7、附图8、附图9、附图10、附图11所示。
(2)临界值的确定：
P/N值＝(阳性OD值平均-空白组OD值平均)/(阴性OD值平均- 空白组OD值平均)。P/N≥2.1则认定为阳性样本，以P/N值最大的实验组作为间接ELISA检测方法的最适反应条件的决定因素。
最终筛选表明，当抗原包被浓度为4μg/mL，封闭液脱脂奶粉浓度为为3％，一抗的稀释浓度为1:100，孵育时间为45min；酶标二抗稀释浓度为1:2000，孵育时间为30min时P/N值最佳，因此rNP 的最适包被浓度为4μg/mL，一抗最佳稀释浓度为1:100，最佳孵育时间为45min，最适封闭液为3％脱脂奶粉，酶标二抗最佳稀释浓度为1:2000。
实施例七：古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法的特异性检验
为了验证的ELISA检测方法的可靠性，采用实施例二至实施例六中所提供的古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法对83份采集于新疆中国西部某地区部分人血清进行检测，并与IFA检测结果相比较。校测结果如表1所示。
表1：rNP间接ELISA检测方法与IFA检测结果的比较
以rNP作为抗原建立的间接ELISA方法检测结果与IFA检测结果相比较后发现，建立的间接ELISA方法的符合率为92.7％(77/83)。可见本发明提供的一种以rNP作为抗原的一种古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法具有特异性强、灵敏度高、结果准确可靠的特点，是一种具有广谱性的检测方法，为GTV血清流行病学监测提供了简单、快速和成本低廉的技术支持具有广泛的应用价值。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法及应用，该方法的具体步骤如下：
（1）将具有KpnⅠ和NotⅠ酶切位点的合成NP基因连接入pET-32a(+)空载体，构建的pET-32a-NP载体转化至E.coli BL21感受态细胞；
（2）将步骤（1）中制备获得的E.coli BL21感受态细胞加入含氨苄青霉素（A＋）的培养基中大量繁殖过夜后，以1：1000的比例加入IPTG诱导剂后培养4 h；
（3）将步骤（2）中获得的将诱导后菌液离心后去培养基，沉淀用1×PBS溶解，利用超声细胞破碎仪破碎细胞，离心后取沉淀，用6 mol/L浓度的尿素溶解变性，继续离心后得到上清，用20 mmol/L-500mmol/L咪唑浓度来洗脱，洗脱获得rNP；
（4）用抗原稀释液稀释步骤（3）中获得的rNP抗原包被液至2-8 μg/mL，以200 μL的体积加入孔中，静置于4℃过夜，PBST洗15 min；
（5）分别用0-5%脱脂奶粉的封闭液以200 μL的体积加入孔中，在37℃培养箱中封闭2h，PBST洗15 min；
（6）GTV阴性和阳性羊、人血清以1:100-400稀释度稀释，以每孔加入100 μL，37℃孵育15-90 min，PBST洗25 min；
（7）加入HRP标记的兔抗羊或兔抗人酶标二抗，以1:-10000稀释度稀释，每孔加入100 μL，37℃培养箱中孵育15-90min后，PBST洗20 min；
（8）以1:1体积比例加入TMB A液及B液底物显色液，每孔加入100 μL，置于黑暗处5-25min后，加入终止液，每孔加入50 μL。
2.如权利要求1所述的古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，咪唑采用200 mmol/L浓度进行洗脱。
3.如权利要求1所述的古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，rNP抗原包被液浓度选用4 μg/mL。
4.如权利要求1所述的古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，封闭液中的脱脂乳粉浓度为3%。
5.如权利要求1所述的古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，GTV阴性和阳性羊、人血清稀释度为1:100。
6.如权利要求1所述的古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，GTV阴性和阳性羊、人血清孵育时间为45 min。
7.如权利要求1所述的古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，酶标二抗的稀释度为1:2000。
8.如权利要求1所述的古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，酶标二抗的孵育时间为30 min。
9.如权利要求1所述的古尔图病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，TMB显色时间为25 min。
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