CN103948619A - 一种具有抗氧化抗高糖损伤的王不留行黄酮苷的应用 - Google Patents

Abstract

一种具有抗氧化抗高糖损伤的王不留行黄酮苷的应用，属于中药应用技术领域。本发明首次发现王不留行黄酮苷具有保护内皮细胞氧化应激损伤、高糖损伤的活性，可用于动脉粥样硬化、白内障、老年黄斑变性等由于内源性或外源性活性氧类的侵袭而诱发的一系列疾病；以及糖尿病、高血压等与高糖损伤引起的相关疾病的预防与治疗。这种王不留行黄酮苷可应用于药物制剂、营养品、保健品、化妆品等用途。

Description

一种具有抗氧化抗高糖损伤的王不留行黄酮苷的应用

技术领域：

一种具有抗氧化损伤和抗高糖损伤的王不留行黄酮苷的应用，属于中药应用技术领域。本发明涉及一种具有抗氧化抗高糖损伤活性的王不留行黄酮苷，阐明其在医药，食品、化妆品方面的新用途。 

背景技术：

王不留行为石竹科植物麦蓝菜Vaccaria segetalis(Neck.)Garcke的干燥成熟种子。王不留行中主要含有三萜皂苷、黄酮苷、环肽、类脂和脂肪酸、单糖等成分[1、李帆，梁敬钰.王不留行的研究进展[J].海峡药学，2007，19(3)：1-5]，王不留行黄酮苷为淡黄色颗粒状结晶，易溶于甲醇、甲醇-水、乙醇、乙醇-水、正丁醇等，难溶于氯仿、乙酸乙酯，石油醚等。据报道，王不留行黄酮苷在常温下存在旋转异构现象，当温度升高时该现象减弱甚至消失[2、孟贺，陈玉平等.王不留行中王不留行黄酮苷的分离与鉴定[J].中草药，2011，42(5)：874-876]。实验发现王不留行黄酮苷具有抗氧化抗高糖损伤的作用，其结果为下式所示： 

血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cell)具有多种生理功能，参与机体的凝血、免疫、物质转运和生物活性物质释放等生活活动。研究表明[3、Reinhart K，Bayer O，Brunkhorst F，et al.Markers ofendothelial damage in organ dysfunction and sepsis[J].CritCare Med，2002，30(5)：302.]，内皮细胞的损伤及功能紊乱与多种疾病的发生密切相关，包括高血压、冠心病、糖尿病、慢性肾功能衰竭等。引起内皮细胞损伤是一个复杂的病理过程，参与的因素很多，如糖尿病、高血脂和高血压等多种疾病，氧化应激反应等等。近年研究表明，多种中药对血管内皮细胞有保护作用，如中药可降低血管内皮细胞脂质过氧化，抗氧化损伤，可调节血管内皮细胞活性物质释放，可抑制内皮细胞凋亡，提高内皮细胞的存活率，促进内皮细胞的生长。(1)中药降低血管内皮细胞脂质过氧化、抗氧化损伤：丹参酮IIA能抑制由过氧化氢损伤引起的人脐静脉血管内皮细胞(CRL-1730)减少[4、王维蓉，林蓉，彭宁，等.丹参酮IIA对过氧化氢损伤人血管内皮细胞的保护作用[J].中药材，2006，29(1)：49-51]，抑制损伤的CRL-1730释放LDH和MDA，保护血管内皮细胞。复方丹参注射液共培养能提高过氧化氢氧化损伤的血管内皮细胞的存活率，降低细胞培养上清液中MDA的含量，通过抗脂质过氧化作用保护血管内皮细胞[5、任香善，宋京郁，林贞花，等.复方丹参注射液对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用[J].延边大学医学院学报，2006，29(1)：30-34]。川芎嗪共培养可抑制由低氧缺糖引起的血管内皮细胞(EVC-340)释放LDH增多、MDA生成增多和膜流动性增强，可提高一氧化氮(NＯ)的水平。羟乙基葛根素对过氧化氢损伤的牛脑微血管内皮细胞(BCMEC)的坏死和凋亡有保护作用，其作用机制与其提高过氧化氢损伤的BCMEC存活率、降低LDH的释放量、抗氧化作用有关[6、GUANG HM，ZHANG XM，LI Y Q， et al.Protective effects of hydroxyethylpuerarin on cultured bovine cerebralm icrovaseular endothelial cells damaged by hydrogen peroxide[J].Acta Pharm Sin，2005，40(3)：220-224.]。(2)中药调节血管内皮细胞活性物质的释放：一些中药的单体、有效成分及其复方制剂通过增强细胞培养液中的一氧化氮和一氧化氮合酶(NOs)的活性，抑制ET含量的增多，提高PGI的合成，抑制炎症因子白细胞介素(IL)等物质的分泌等作用来对抗病理条件下舒/缩血管活性物质的比例失衡，发挥保护血管内皮细胞的作用。(3)中药抑制内皮细胞凋亡，提高血管内皮细胞的存活率，促进内皮细胞的生长：部分中药可通过抑制内皮细胞的凋亡，提高血管内皮细胞的存活率，促进血管内皮细胞生长因子(VEGF)的分泌等作用来发挥其保护血管内皮细胞的作用。 

经过调研，未见我国学者对王不留行黄酮苷具有保护内皮免受氧化应激损伤作用的相关文献报道(自CNKI、维普中国期刊网)，因此王不留行黄酮苷在抗氧化抗高糖损伤的药理、药效等研究领域尚处于空白阶段。本研究发现王不留行黄酮苷具有保护内皮细胞抗氧化抗高糖损伤的作用，为保护内皮细胞的相关疾病提供新的治疗方法与应用。 

发明内容：

发现所述王不留行黄酮苷对内皮细胞抗氧化应激有保护作用：建立过氧化氢氧化模型，给药后发现，王不留行黄酮苷的高剂量组(13.76μmol/L)对H₂Ｏ₂诱导的细胞活力有明显改善。因此，所述王不留行黄酮苷可以用于防止和/或治疗动脉粥样硬化、白内障、老年黄斑变性等由于内源性或外源性活性氧类的侵袭而诱发的一系列疾病。 

发现所述王不留行黄酮苷对内皮细胞抗高糖有保护作用：建立高糖损伤模型，给药后发现王不留行黄酮苷的高剂量组(13.76μmol/L)对高糖诱导的细胞活力有明显改善。因此，所述王不留行黄酮苷可以用于防止和/或治疗糖尿病、高血压等与高糖损伤引起的相关疾病。 

具体实施方式：

实施例1：王不留行黄酮苷对H₂Ｏ₂诱导EA·hy926细胞损伤的改善 

选择对数生长期的细胞，胰酶消化制成细胞悬液，调整细胞浓度，按每孔8000个细胞接种于96孔板，每孔接种160μL，每组设4个复孔，24h后随机分组：正常组和模型组加入20μL无血清培养基，3个给药组分别加入相应浓度等体积王不留行黄酮苷的药液，使药物终浓度分别为13.76、6.88、3.44μmol/L，于37℃孵育预保护12h后，模型组和王不留行黄酮苷组每孔加入20μLH₂Ｏ₂，其终浓度为1000μmol/L，正常对照组加入20μL无血清培养基，于37℃孵育2h后，SRB法检测细胞活力。见表1： 

表1王不留行黄酮苷对H₂Ｏ₂损伤的细胞活力的影响 

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01 

与正常组比较，过氧化氢模型损伤组细胞活力显著下降；而与模型组比较，王不留行黄酮苷的高剂量组(13.76μmol/L)对H₂Ｏ₂诱导的细胞活力有明显改善。 

接着，选择对数生长期的细胞，胰酶消化制成细胞悬液，调整细胞浓度，按每孔4×10⁴个接种于24孔 板，每孔接种800μL，每组设3个复孔，24h后随机分组：正常组和模型组加入100μL无血清培养基，三个给药组分别加入相应浓度等体积王不留行黄酮苷药液，使药物终浓度分别为13.76、6.88、3.44μmol/L，于37℃孵育预保护12h后，除正常组加入100μL无血清培养基外，模型组和王不留行黄酮苷组每孔加入100μLH₂Ｏ₂，其终浓度为1000μmol/L，正常对照组加入100μL无血清培养基，于37℃孵育2h后，按说明书要求取细胞上清液测定LDH和MDA的释放量；裂解细胞，BCA法测定蛋白含量，测定胞内SOD活力。根据公式计算得到各组细胞的生化指标，见表2： 

表2王不留行黄酮苷对H₂Ｏ₂诱导的细胞损伤氧化指标的影响 

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01 

与正常组比较，模型组LDH和MDA水平显著升高，SOD活性显著下降；而与模型组比较，王不留行黄酮苷中、高剂量组LDH释放量显著下降；而在MDA水平上，王不留行黄酮苷给药组均能使之显著降低；SOD活性中，和王不留行黄酮苷高剂量组均能使之显著升高，表明王不留行黄酮苷在细胞氧化指标上具有保护细胞抗氧化损伤的作用。 

实施例2：王不留行黄酮苷对高糖诱导EA·hy926细胞损伤的改善 

选择对数生长期的细胞，胰酶消化制成细胞悬液，调整细胞浓度，按每孔8000个细胞接种于96孔板，每孔接种160μL，24h后随机分组：正常组和模型组加入20μL无血清培养基，3个给药组分别加入相应浓度等体积王不留行黄酮苷的药液，使药物终浓度分别为13.76、6.88、3.44μmol/L，于37℃孵育预保护12h后，模型组和王不留行黄酮苷组每孔加入20μL葡萄糖(终浓度180mmol/L)，正常对照组加入20μL无血清培养基，每组设4个复孔，37℃孵育24h后，SRB法检测细胞活力。见表3： 

表3王不留行黄酮苷对高糖损伤的细胞活力的影响 

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01 

与正常组比较，高糖模型损伤组细胞活力显著下降；而与模型组比较，王不留行黄酮苷的高剂量组(13.76μmol/L)对高糖诱导的细胞活力有明显改善。 

接着，选择对数生长期的细胞，胰酶消化制成细胞悬液，调整细胞浓度，按每孔为8×104个接种于24孔板，每孔接800μL，每组设3个复孔，24h后，随机分6组：正常组和模型组加入20μL无血清培养基，阳性对照组加入终浓度为100μmol/L的维生素C溶液(溶于无血清培养基中)，3个给药组分别加 入相应浓度等体积王不留行黄酮苷的药液，使药物终浓度分别为13.76、6.88、3.44μmol/L，于37℃孵育预保护12h后，模型组、维生素C组和王不留行黄酮苷组每孔加入20μL葡萄糖(终浓度180mmol/L)，正常对照组加入20μL无血清培养基，于37℃孵育24h后，按说明书要求，取细胞上清液测定LDH和MDA的释放量，裂解细胞，BCA法测定蛋白含量，测定胞内SOD活力。根据公式计算得到各组细胞的生化指标，见表4： 

表4王不留行黄酮苷对高糖诱导的细胞损伤氧化指标的影响 

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01 

与正常组比较，模型组LDH和MDA水平显著升高，SOD活性显著下降；而与模型组比较，王不留行黄酮苷高剂量组LDH和MDA水平显著降低，SOD活性显著升高；同时，王不留行黄酮苷中、低剂量组也可显著降低细胞的MDA水平。表明王不留行黄酮苷在细胞氧化指标上具有保护细胞抗高糖损伤的作用。 

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员能领会在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果，而不超出本发明的构思、精神和范围。更具体地说，显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说，显然都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求范围内的，即所有上述这些等价形式和所有对工艺参数的改进和变动都同样属于本发明的权利要求书所限定的范围。 

Claims (3)

1.一种具有抗氧化抗高糖损伤的王不留行黄酮苷的应用。

2.根据权利要求1所述王不留行黄酮苷，其特征在于：所述王不留行黄酮苷是用于防止和/或治疗至少一种选自下述之一的疾病：动脉粥样硬化、白内障、老年黄斑变性等由于内源性或外源性活性氧类的侵袭而诱发的一系列疾病；以及糖尿病、高血压等与高糖损伤引起的相关疾病的预防与治疗。

3.根据权利要求1所述，其特征在于：王不留行黄酮苷应用的产品形式包括药物制剂、营养品、保健品、化妆品。