CN103937847B - 一种发酵生产利普司他汀的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种发酵生产利普司他汀的方法，具体地，涉及用混合脂肪酸替代发酵培养过程中流加补入的亚油酸，其中按重量百分计，该混合脂肪酸包括如下有效量的组分：硬脂酸2.0～7.0%，油酸14.0～30%，亚油酸61～78%，棕榈酸5.0～7.0%。在发明人已有专利CN102268466基础上，通过用混合脂肪酸替代发酵培养过程中流加补入的亚油酸，不仅降低了发酵成本，更令人惊喜的是，通过HPLC检测发现，发酵液中不含有蛋氨酸类似物的利普斯他汀，本发明的变速补料法，使培养基内始终保持养分平衡，提供利普司他汀合成阶段足够而又不过剩的养料，发酵效价提高了6‑16%。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵生产利普司他汀的方法，属于微生物发酵领域。
背景技术
利普司他汀（式1）是新型减肥药奥利司他的中间体。奥利司他是一种长效和强效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，它通过与胃和小肠腔内胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性丝氨酸部位形成共价键使酶失活而发挥治疗作用，失活的酶不能将食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解为可吸收的游离脂肪酸和单酰基甘油。未消化的甘油三酯不能被身体吸收，从而减少热量摄入，控制体重。
奥利司他的生产有两种方法，发酵合成法以及全合成法。全合成法生产成本比较高。发酵合成法生产成本比较低，更适合大规模生产。US4598089、US2005089978A1涉及到的利普司他汀发酵工艺不采用流加补料以及中间补料的方法，发酵水平比较低。WO2007134836、WO2007078263涉及到的发酵工艺部分采用流加亚油酸和氨基酸的工艺，但是发酵水平比较低。
目前一般采用的补料方式为周期补料或是连续恒速补料，周期补料由于是一次性补入碳源、氮源及其他必需的基质，会造成短时间内营养物质浓度过高，这会使菌体向大量繁殖菌丝体的方向发展，使营养成分主要消耗在菌丝生长上，使产物合成阶段缩短，最后代谢产物产出量减少。连续恒速补料法虽然可以消除周期补料因一次性补入大量营养物质产生的营养物质浓度过高对菌丝生长产生的压制现象，但此补料方式仍存在一定缺陷，即在整个补料周期内恒速补入相同量的基质，而忽视了菌体在代谢过程中处于的各个阶段消耗的实际情况。
无论哪种方法，在发酵期间，均生成了若干种副产物，在这些副产物中，一种含有蛋氨酸类似物的利普斯他汀（式2化合物）的含量较高，可达3%左右，其性质与利普斯他汀很接近，非常难以除去。
而对于用利普斯他汀制备奥利司他来说，除去这种杂质是非常重要的，否则，后续的氢化将被含硫化合物所抑制。CN1266058提供了一种去除该含硫化合物的方法，将该含硫化合物氧化成亚砜或是砜，其氧化剂的用量为含硫化合物的1.5-2倍，然后通过双流萃取与逆流萃取相结合的方法，达到除去的目的，其操作过程不仅复杂，过量的氧化剂，对于利普斯他汀来说是不利，加速了利普斯他汀的降解，增加了新的杂质，如果能从源头来限制这种含硫化合物的生成，将大大降低后处理的难度，降低成本，取得竞争优势。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明预提供一种发酵生产利普司他汀的方法，该方法发酵水平高、产品纯度高、杂质易除。
本发明目的通过以下技术方案得以实现：本发明提供一种发酵生产利普司他汀的方法，具体地，涉及用混合脂肪酸替代发酵培养过程中流加补入的亚油酸。其中，按重量百分计，该混合脂肪酸包括如下有效量的组分：硬脂酸2.0～7.0%，油酸14.0～30%，亚油酸61～78%，棕榈酸5.0～7.0%。
本发明提供一种发酵生产利普司他汀的方法，包含以下步骤：毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)或其衍生物的斜面菌种培养、摇瓶种子液培养、种子液培养和发酵培养。所述毒三素链霉菌(Streptomycestoxytricini)可以是ACCC41038。具体工艺过程如下：
斜面菌种的制备：将冻干的菌种用无菌水稀释后涂布装有固体培养基的斜面上，温度25-30℃，湿度40～60％，培养8～10天。产孢后加无菌水制成孢子悬浮液。培养基成分和 含量为：葡萄糖2-5g/L，麦芽提取物8-10g/L，酵母提取物10-15g/L，琼脂15g/L，pH为6.9～7.4。
摇瓶种子液制备：将斜面孢子接种摇瓶种子培养基，250rpm，温度25-30℃，培养20～30小时，培养基成分和含量为：甘油10-15g/L，麦芽提取物10-15g/L，酵母提取物5-8g/L，脱脂豆粉20-30g/L，pH为6.0～6.5。
种子液的制备：将摇瓶种子液制备步骤中培养好的摇瓶种子接种到储有种子培养基的种子罐中，接种量为种子培养基体积的0.1～0.8％(V/V)，在28℃下通气量0.8VVM～1.0VVM（单位VVM是体积/体积/分钟），罐压0.04～0.07MPa的条件下，培养20～40小时。其中，种子培养基成分和含量为：甘油10-15g/L，麦芽提取物10-15g/L，酵母提取物5-8g/L，脱脂豆粉20-30g/L，pH为6.0～6.5。
发酵培养：将种子液的制备步骤中培养好的菌种接种到储有发酵培养基的发酵罐中，接种种子液的量占发酵培养基和种子液体积之和的5～10％(V/V)，在温度为25-30℃，通气量0.6VVM～1.1VVM，罐压0.06～0.08MPa，发酵过程中pH控制在6.5～7.5范围内，发酵过程中补入营养物质，培养160～190小时。其中所用液体培养基成分和含量为：甘油10～20g/L，脱脂豆粉20～40g/L，豆油10～20g/L，消泡剂2～5g/L，发酵初始pH为6.7～7.0，可通过调节罐压、转速、通气量来控制溶氧为20-25%。
在发酵培养过程中，发酵接种24-35小时，溶氧出现剧烈上升至70-90%，立即开始流加补入混合脂肪酸和亮氨酸溶液，补料量的增加速度不能过快也不能太慢，过快容易导致菌体生长速度过快，过慢会造成菌体饥饿。发明人根据分析检测的结果，粘度，生物量情况确定了，以发酵罐内料液重量计，混合脂肪酸补料流速为100-400g/h/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：（1～3），其中亮氨酸是以配成为水溶液形式进行补料，其浓度可为每升溶液中含亮氨酸60～100g，NaOH20～30g。根据分析检测的结果，粘度，生物量情况等情况，发明人对补料流速进行了优选，优选地，上述混合脂肪酸的补料流速为200-350g/h/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：（1～1.5）；最优选上述混合脂肪酸的补料流速为210g/h/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：1.5。
发酵接种35-150小时为发酵中期，随着慢速利用的碳源的不断消耗，混合脂肪酸和亮氨酸的补入量将不足以维持利普司他汀产物的合成，此时可以增加补料量，但是调控的幅度要适宜，以保证菌体生长环境的相对稳定。混合脂肪酸补料流速每小时增加5-40g/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：（1～3），最高补料量不超过每小时1000g/t。发明人对补料流速增加量进行了优选，优选地，上述混合脂肪酸补料流速每小时增加10-30g/t，最高 补料量不超过每小时800g/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：（1～1.5），最优选混合脂肪酸补料流速为每小时增加20g/t，亮氨酸与混合脂肪酸的补料质量比为亮氨酸：混合脂肪酸为1：1.5，最高补料量每小时不超过700g/t。
发酵接种150小时至下罐为发酵中后期，菌丝进入生长平稳期及衰退期，菌体的生长速率减缓，基质消耗的速率也相应减缓，此时期出现亚油酸积累，若亚油酸积累量超过1g/L，补料量每小时降低10-200g/t。根据生物量，粘度等情况，为了保证菌体生长环境的相对稳定，发明人对每小时补料量降低量进行了优选；优选地，上述混合脂肪酸补料量每小时降低30-100g/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：（1～1.5）；最优选，上述混合脂肪酸补料量每小时降低50g/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：1.5。
通过对比试验发明人发现，使用混合脂肪酸与亮氨酸溶液补料，HPLC结果显示，保留时间5.7-7.7之间为两个峰；相比之下，采用亚油酸和亮氨酸补料，HPLC结果显示，保留时间5.7-7.7min之间为三个峰，在6.5与7.3min之间多出一个峰；通过进一步的分离检测，发明人确该峰为蛋氨酸类似物的利普斯他汀（式2化合物）。同时，本发明发酵效价提高了6-16%。
在发明人已有专利CN102268466B基础上，通过用混合脂肪酸替代发酵培养过程中流加补入的亚油酸，不仅降低了发酵成本，更令人惊喜的是，通过HPLC检测发现，发酵液中不含有蛋氨酸类似物的利普斯他汀（式2化合物），本发明的变速补料法，使培养基内始终保持养分平衡，提供利普司他汀合成阶段足够而又不过剩的养料，发酵效价还有所提高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不仅限于以下实施例。除非另外指出，用在本说明书和权利要求书中的表示组分和性质数量的全部数目将被理解为在全部实例中通过术语"大约"被修改。因此，相反除非指出，在本发明和附属权利要求中所提出的数值参数为近似值。至少，并非意图将等同原则的申请限制于权利要求范围内，各数值参数至少应该根据有效数字的数目和通过普通舍入方法来分析。尽管说明本发明宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在实施例中设置的数值尽可能精确地被报道。任何数值可内在地包含一定的误差，其由实验、测试方法、统计分析等中的变化产生。
除非另外定义，本文所用的各技术和科学术语具有如本领域所属技术人员普遍理解的相同的含义。尽管类似或等价于本文所描述的那些方法和材料能够用在本发明的实践或测试，但是合适的方法和材料描述如下。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并非意图为限制性的。
实施例1
斜面培养：按如下比例配制培养基：葡萄糖2g/L，麦芽提取物8g/L，酵母提取物10g/L，琼脂15g/L，pH为7.1。配制培养基300mL，加热琼脂融化后搅拌均匀装入10支大试管中，灭菌，做成斜面备用。将冻干的毒三素链霉菌菌种用无菌水5mL溶解，取4mL均匀涂布在10支斜面上，温度28℃，湿度40%，培养10天，产生大量孢子，加无菌水制成孢子悬浮液。
摇瓶种子液制备：按如下比例配制培养基：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。配制培养基200mL，装500mL三角瓶4瓶(每瓶装液量50mL)，灭菌，备用。将孢子悬浮液2mL接种到摇瓶中。温度28℃，培养30小时。
种子罐培养：采用15L罐进行种子培养。按如下比例配制种子罐所用液体培养基(按实消后10L配制)：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。实消后体积为10L，当温度降至28℃时，将80mL种子液(0.8％)接种到种子罐中，在温度为28℃的条件下，搅拌转速450转/分，通气量0.8VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.04MPa的条件下，培养20小时。
发酵罐培养：采用50L发酵罐进行培养。按如下比例配制液体培养基：甘油10g/L，脱脂豆粉20g/L，豆油10g/L，消泡剂2g/L，pH为7.0。实消后体积为33.25L，待温度降至28℃时，培养好的种子罐菌种接种到发酵罐中，接种量为5％(1.75L)，在温度为28℃的条件下，整个过程中通过调节罐压、转速、通气量控制溶氧在40％。搅拌转速为300～540转/分，通气量0.6VVM～1.1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.06～0.08MP。在发酵接种后至27小时，溶氧出现剧烈上升至90%，立即开始流加补入混合脂肪酸和亮氨酸溶液，以发酵罐内料液重量计，混合脂肪酸补料流速210g/h/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：1.5，控制溶氧为20-25%；发酵接种40h，混合脂肪酸补料流速每小时增加10g/t，最高补料量不超过每小时700g/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：1.5；发酵接种152h，亚油酸积累量为1.08g/L，混合脂肪酸补料量每小时降低50g/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：1.5，培养170小时下罐，发酵效价为7.8g/L
实施例2
参照实施例1进行斜面培养，摇瓶种子液制备，种子罐培养。发酵罐培养：采用50L发酵罐进行培养。其中，按如下比例配制液体培养基：甘油10g/L，脱脂豆粉20g/L，豆油10g/L， 消泡剂2g/L，pH为7.0。实消后体积为33.25L，待温度降至28℃时，培养好的种子罐菌种接种到发酵罐中，接种量为5％(1.75L)，在温度为28℃的条件下，整个过程中通过调节罐压、转速、通气量控制溶氧在40％。搅拌转速为300～540转/分，通气量0.6VVM～1.1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.06～0.08MP。在发酵接种后至29小时，溶氧出现剧烈上升至70%，立即开始流加补入混合脂肪酸和亮氨酸溶液，以发酵罐内料液重量计，混合脂肪酸补料流速280g/h/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：1.5，控制溶氧为25%；发酵接种37h，混合脂肪酸补料流速每小时增加10g/t，最高补料量不超过每小时800g/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：1.5；发酵接种155h，亚油酸积累量为1.19g/L，混合脂肪酸补料量每小时降低70g/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：1.5，培养172小时下罐，发酵效价为7.1g/L。
实施例3
参照实施例1进行斜面培养，摇瓶种子液制备，种子罐培养。发酵罐培养：采用500L发酵罐进行培养。其中，按如下比例配制液体培养基：甘油10g/L，脱脂豆粉20g/L，豆油10g/L，消泡剂2g/L，pH为7.0。实消后体积为335L，待温度降至28℃时，培养好的种子罐菌种接种到发酵罐中，接种量为5％(16.7L)，在温度为28℃的条件下，整个过程中通过调节罐压、转速、通气量控制溶氧在40％。搅拌转速为300～540转/分，通气量0.6VVM～1.1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.06～0.08MP。在发酵接种后至30小时，溶氧出现剧烈上升至70%，立即开始流加补入混合脂肪酸和亮氨酸溶液，以发酵罐内料液重量计，混合脂肪酸补料流速280g/h/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：1.5，控制溶氧为25%；发酵接种37h，混合脂肪酸补料流速每小时增加10g/t，最高补料量不超过每小时800g/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：1.5；发酵接种155h，亚油酸积累量为1.25g/L，混合脂肪酸补料量每小时降低70g/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为亮氨酸：混合脂肪酸为1：1.5，培养175小时下罐，发酵效价为7.4g/L。
对比实施例1：
斜面培养：按如下比例配制培养基：葡萄糖2g/L，麦芽提取物8g/L，酵母提取物10g/L，琼脂15g/L，pH为7.1。配制培养基300mL，加热琼脂融化后搅拌均匀装入10支大试管中，灭菌，做成斜面备用。将冻干的毒三素链霉菌菌种用无菌水5mL溶解，取4mL均匀涂布在10支斜面上，温度28℃，湿度40％，培养10天，产生大量孢子。加无菌水制成孢子悬浮液。
摇瓶种子液制备：按如下比例配制培养基：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取 物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。配制培养基200mL，装500mL三角瓶4瓶(每瓶装液量50mL)，灭菌，备用。将孢子悬浮液2mL接种到摇瓶中。温度28℃，培养30小时。
种子罐培养：采用15L罐进行种子培养。按如下比例配制种子罐所用液体培养基(按实消后10L配制)：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0。实消后体积为10L，当温度降至28℃时，将80mL种子液(0.8％)接种到种子罐中，在温度为28℃的条件下，搅拌转速450转/分，通气量0.8VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.04MPa的条件下，培养20小时。
发酵罐培养：采用50L发酵罐进行培养。按如下比例配制液体培养基：甘油10g/L，脱脂豆粉20g/L，豆油10g/L，消泡剂2g/L，pH为7.0。实消后体积为33.25L，待温度降至28℃时，培养好的种子罐菌种接种到发酵罐中，接种量为5％(1.75L)，在温度为28℃的条件下，整个过程中通过调节罐压、转速、通气量控制溶氧在40％。搅拌转速为300～540转/分，通气量0.6VVM～1.1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.06～0.08MP。在发酵接种后至27小时，甘油被利用完，开始进入利普司他汀合成阶段。此时开始补料亚油酸和亮氨酸溶液，补料流速为亚油酸0.3g/L/h，亮氨酸溶液(浓度为70g/L，PH为11)0.3g/L/h，发酵接种后至115h，补料速度调整为亚油酸0.35g/L/h，亮氨酸溶液(浓度70g/L，pH为11)0.35g/L/h。发酵接种后至70小时，补入灭菌后的酵母提取物、甘油分别350克。培养过程中，用20％NaOH、20％H2SO4控制PH在6.5～7.5范围内。培养180小时，发酵效价为6.7g/L。
Claims (10)
1.一种发酵生产利普司他汀的方法，包括毒三素链霉菌ACCC41038的斜面菌种的制备、摇瓶种子液的制备、种子液的制备以及发酵培养，其特征在于：在发酵培养过程中，发酵接种24-35小时，流加补入混合脂肪酸和亮氨酸溶液，以发酵罐内料液重量计，混合脂肪酸和亮氨酸溶液补料流速均为100-400g/h/t，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：（1~3），溶氧为20-25%；发酵接种35-150小时，混合脂肪酸和亮氨酸溶液补料流速均每小时增加5-40g/t，最高补料量不超过每小时1000g/t；发酵接种150小时至下罐，亚油酸积累量不超过1g/L，补料速度不再变化；其中按重量百分计，混合脂肪酸包括如下有效量的组分：硬脂酸2.0~7.0%，油酸9.0~20%，亚油酸66~84%，棕榈酸5.0~7.0%。
2.如权利要求1所述的发酵生产利普司他汀的方法，其特征在于：在发酵培养过程中，发酵接种24-35小时，以发酵罐内料液重量计，混合脂肪酸补料流速200-350g/h/t。
3.如权利要求2所述的发酵生产利普司他汀的方法，其特征在于：在发酵培养过程中，发酵接种24-35小时，以发酵罐内料液重量计，混合脂肪酸补料流速210g/h/t。
4.如权利要求1所述的发酵生产利普司他汀的方法，其特征在于：在发酵培养过程中，发酵接种35-150小时，混合脂肪酸补料流速每小时增加10-30g/t，最高补料量不超过每小时800g/t。
5.如权利要求4所述的发酵生产利普司他汀的方法，其特征在于：在发酵培养过程中，发酵接种35-150小时，混合脂肪酸补料流速每小时增加20g/t，最高补料量每小时不超过700g/t。
6.如权利要求1所述的发酵生产利普司他汀的方法，其特征在于：在发酵培养过程中，发酵接种150小时至下罐过程中，亚油酸积累量超过1g/L，混合脂肪酸补料量每小时降低10-200g/t。
7.如权利要求6所述的发酵生产利普司他汀的方法，其特征在于：发酵接种150小时至下罐过程中，亚油酸积累量超过1g/L，混合脂肪酸补料量每小时降低30-100g/t。
8.如权利要求7所述的发酵生产利普司他汀的方法，其特征在于：在发酵培养过程中，发酵接种150小时至下罐过程中，亚油酸积累量超过1g/L，混合脂肪酸补料量每小时降低50g/t。
9.如权利要求1-8任一权利要求所述的发酵生产利普司他汀的方法，其特征在于：在发酵培养过程中，补料亮氨酸与混合脂肪酸的质量比为1：（1~1.5）。
10.如权利要求9所述的发酵生产利普司他汀的方法，其特征在于：亮氨酸是以配成为水溶液形式进行补料，其浓度为每升溶液中含亮氨酸 60~100g，NaOH 20~30g。
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2014
- 2014-03-04 CN CN201410075893.6A patent/CN103937847B/zh active Active
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