CN105063118A - 一种添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法。首先是制备亚油酸缓释微囊，方法如下：将亚油酸与海藻酸钠溶液混合，加入非离子乳化剂均质乳化；将上述溶液匀速滴入含有壳聚糖和氯化钙的冰醋酸溶液中，形成微球，冷却至室温后，加入无毒交联剂，抽滤并用乙醇和蒸馏水洗涤，经真空低温干燥后得到亚油酸缓释微囊。将制备好的微囊添加到利普斯他汀发酵瓶中，利普斯他汀发酵单位提高22-25%。本发明有效延长了亚油酸的释放时间，提高了利普斯他汀的产量，而且解决了添加高浓度亚油酸对毒三素链霉菌的毒性问题。
Description
技术领域
本发明属于微生物制药领域，涉及了一种亚油酸缓释微囊制备以及其在利普斯他汀发酵中的应用，具体地说涉及一种添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法。
背景技术
利普斯他汀是由毒三素链霉菌（Streptomycestoxytricini）产生的内源性脂肪酶抑制剂，经催化加氢后生成奥利司他，是目前唯一非中枢神经系统抑制的减肥药。奥利司他有两种生产工艺，一种是化学合成法，另一种是半合成法，即先经生物发酵获得利普斯他汀，再氢化得到奥利司他。
目前半合成法是工业化生产奥利司他的主要方法。其中利普斯他汀的发酵和纯化是关键工艺，在发酵过程中通常会补加不饱和脂肪酸油酸、亚油酸等作为前体，但是这些脂肪酸的过量补加会对菌体造成毒害，而且不易于下游提取纯化。专利US20110014664A1采用直接补加亚油酸、油酸以及λ-9脂肪酸发酵生产利普斯他汀，效价可达到5g/L，但该工艺补加脂肪酸种类多，生产成本高，并且不利于下游分离纯化。WO2007134836、WO2007078263描述了直接补加亚油酸和氨基酸的工艺，但是发酵效价低。
发明内容
针对现有的技术问题：在利普斯他汀发酵过程中间歇补加亚油酸不但会增加发酵液粘度，降低氧传递，影响微生物对溶氧的需要，而且间歇补加会造成亚油酸短时高浓度，对菌体细胞有毒害作用。本发明通过制备亚油酸缓释微囊控制亚油酸缓慢释放，解决了上述问题。
本发明技术方案如下
（1）将亚油酸与2-8%海藻酸钠溶液混合，亚油酸质量含量3-7%，然后加入非离子乳化剂进行搅拌均质，乳化剂用量0.1-1%，组成溶液1。
（2）将氯化钙加入冰醋酸溶液中，氯化钙用量1-5%，溶解后加入壳聚糖，壳聚糖用量0.5-3%，组成溶液2。
（3）用注射器抽取溶液1缓慢逐滴滴入溶液2中，形成微球。
（4）冰浴冷却至8-10°C，加入溶液2体积1-3%的交联剂，交联剂可以是戊二醛或甘油醛，或二者的组合物，交联过程搅拌速度控制在100-300rpm。
（5）真空抽滤获得微球，然后依次用乙醇和蒸馏水各洗涤3次。
（6）真空干燥48-60h获得亚油酸缓释微囊，干燥温度35-45°C。
（7）配制利普斯他汀发酵培养液，经121°C，30min消毒灭菌后，在无菌环境下接入5-15%经75%乙醇处理和紫外消毒的亚油酸微球，并设置阴性对照。
（8）在无菌环境下向发酵培养基（100mL/500mL三角瓶）中接入5%预先培养好的种子培养液，发酵温度27°C，转速200-250rpm，发酵时间140h，发酵结束后测定利普斯他汀的效价。
具体实施方式
本发明由下述实施例进一步说明，但本发明的技术方案并不限于如下实施例。
实施例1
（1）称取10g海藻酸钠溶于200ml水中，边搅拌边加热，待溶解后加入6g亚油酸混合，同时加入0.5gSpan-20乳化剂进行均质乳化，均质时间10min，转速5000-8000rpm，均质结束后为稳定的乳白色液体，为溶液1。
（2）称取5g氯化钙溶于200ml冰醋酸中，溶解后加入壳聚糖2g，混合均匀后组成溶液2。
（3）用20ml注射器配7号针头抽取溶液1缓慢逐滴滴入溶液2中，形成微球，控制滴速为60-70d/min。
（4）将微球混悬液用冰浴冷却至10°C，加入4ml戊二醛交联剂，交联过程搅拌速度控制在150rpm，交联时间6h。
（5）真空抽滤获得微球，然后依次用无水乙醇和蒸馏水各洗涤3次。
（6）真空干燥48-60h获得亚油酸缓释微囊，干燥温度40°C。
（7）配制利普斯他汀发酵培养液，经121°C，30min消毒灭菌后，在无菌环境下接入5%经75%乙醇处理和紫外消毒2h的亚油酸微球，并设置阴性对照。
（8）在无菌环境下向发酵培养基（100mL/500mL三角瓶）中接入5%预先培养好的种子培养液，发酵温度27°C，转速200-250rpm，发酵时间140h，发酵结束后测定利普斯他汀的效价为4.27g/L，比阴性对照提高13%。
实施例2
（1）称取10g海藻酸钠溶于200ml水中，边搅拌边加热，待溶解后加入10g亚油酸混合，同时加入0.5gSpan-20乳化剂进行均质乳化，均质时间10min，转速5000-8000rpm，均质结束后为稳定的乳白色液体，为溶液1。
（2）称取5g氯化钙溶于200ml冰醋酸中，溶解后加入壳聚糖2g，混合均匀后组成溶液2。
（3）用20ml注射器配7号针头抽取溶液1缓慢逐滴滴入溶液2中，形成微球，控制滴速为50-60d/min。
（4）将微球混悬液用冰浴冷却至10°C，加入4ml戊二醛交联剂，交联过程搅拌速度控制在200rpm，交联时间6h。
（5）真空抽滤获得微球，然后依次用无水乙醇和蒸馏水各洗涤3次。
（6）真空干燥48-60h获得亚油酸缓释微囊，干燥温度40°C。
（7）配制利普斯他汀发酵培养液，经121°C，30min消毒灭菌后，在无菌环境下接入10%经75%乙醇处理和紫外消毒2h的亚油酸微球，并设置阴性对照。
（8）在无菌环境下向发酵培养基（100mL/500mL三角瓶）中接入5%预先培养好的种子培养液，发酵温度27°C，转速200-250rpm，发酵时间140h，发酵结束后测定利普斯他汀的效价为4.81g/L，比阴性对照提高21%。
实施例3
（1）称取10g海藻酸钠溶于200ml水中，边搅拌边加热，待溶解后加入14g亚油酸混合，同时加入0.5gSpan-20乳化剂进行均质乳化，均质时间15min，转速8000-10000rpm，均质结束后为稳定的乳白色液体，为溶液1。
（2）称取5g氯化钙溶于200ml冰醋酸中，溶解后加入壳聚糖4g，混合均匀后组成溶液2。
（3）用20ml注射器配7号针头抽取溶液1缓慢逐滴滴入溶液2中，形成微球，控制滴速为50-60d/min。
（4）将微球混悬液用冰浴冷却至10°C，加入4ml戊二醛交联剂，交联过程搅拌速度控制在200rpm，交联时间8h。
（5）真空抽滤获得微球，然后依次用无水乙醇和蒸馏水各洗涤3次。
（6）真空干燥48-60h获得亚油酸缓释微囊，干燥温度40°C。
（7）配制利普斯他汀发酵培养液，经121°C，30min消毒灭菌后，在无菌环境下接入15%经75%乙醇处理和紫外消毒2h的亚油酸微球，并设置阴性对照。
（8）在无菌环境下向发酵培养基（100mL/500mL三角瓶）中接入5%预先培养好的种子培养液，发酵温度27°C，转速200-250rpm，发酵时间140h，发酵结束后测定利普斯他汀的效价为5.23g/L，比阴性对照提高26%。
Claims (14)
1.一种添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：（1）首先制备亚油酸缓释微囊，方法如下：将亚油酸与海藻酸钠溶液混合，加入非离子乳化剂均质乳化；将上述溶液匀速滴入含有壳聚糖和氯化钙的冰醋酸溶液中，形成微球，冷却至室温后，加入无毒交联剂，抽滤乙醇洗涤，经真空低温干燥后得到亚油酸缓释微囊；（2）将制备好的微囊添加到利普斯他汀发酵瓶中，利普斯他汀发酵单位提高22-25%左右。
2.按照权利要求1所述的添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：乳化剂为烷基酚聚氧乙烯醚（OP-10)、失水山梨醇单月桂酸酯（Span-20）或吐温20，添加量为0.1-1%。
3.按照权利要求1所述的添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：海藻酸钠质量分数为2-8%。
4.按照权利要求1所述的添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：亚油酸质量分数为3-7%。
5.按照权利要求1所述的添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：冰醋酸的添加量为2-5%。
6.按照权利要求1所述的添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：壳聚糖的添加量为0.5-3%。
7.按照权利要求1所述的添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：氯化钙的添加量为1-5%。
8.按照权利要求1所述的添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：制备亚油酸微囊所用交联剂为戊二醛或甘油醛，或它们的组合物，用量为1-3%。
9.按照权利要求1所述的添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：制备亚油酸微囊是搅拌速率为100-300rpm。
10.按照权利要求1所述的添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：亚油酸微囊干燥温度为35-45°C。
11.按照权利要求1所述的添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：亚油酸微囊在摇瓶发酵中添加量为5-15%。
12.按照权利要求1所述的添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：利普斯他汀种子培养基配方和培养条件为葡萄糖0.5-1.0%，蛋白胨1.0-3.0%，酵母粉1.5-2.5%，硫酸镁0.05-0.2%，磷酸二氢钾0.1-0.5%，pH7.0-7.2，培养温度27°C，转速200-250rpm，发酵时间40-48h，装液量50mL/250mL三角瓶。
13.按照权利要求1所述的添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：利普斯他汀发酵培养基配方为葡萄糖0.5-1.0%，黄豆粉2.0-5.0%，豆油0.5-1.5%，硫酸镁0.05-0.2%，磷酸二氢钾0.1-0.5%，pH7.0-7.2。
14.按照权利要求1所述的添加亚油酸缓释微囊提高利普斯他汀发酵单位的方法，其特征在于：利普斯他汀发酵所用菌株为毒三素链霉菌，发酵温度27°C，转速200-250rpm，发酵时间140h，装液量100mL/500mL三角瓶。
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