CN103937752A - 一种h3n2亚型犬流感病毒灭活疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗及其制备方法和应用，本发明还公开了用于制备该灭活疫苗的H3N2亚型犬流感病毒株以及制备该灭活疫苗的方法，其中所述的H3N2亚型犬流感病毒株，命名为CIV-HLJ株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.8760。对本发明制备得到的犬流感灭活疫苗进行安全性和免疫原性评价，试验结果表明，该疫苗对犬具有良好的安全性，并可以诱导犬体产生理想免疫保护效果。因此，本发明的提出为H3N2亚型犬流感疾病防治提供了一种有效的手段。

Description

一种H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种犬流感灭活疫苗，其制备方法及由其制备得到的疫苗。属于生物制品技术领域。 

背景技术

犬流感(Canine influenza，CI)是由正黏病毒科、流感病毒属的A型流感病毒中的犬流感病毒(Canine influenza virus，CIV)引起的犬的一种呼吸道急性高度接触性传染病，多呈暴发性流行，传播非常迅速而且广泛。2005年，国内首次有CI的报道，有研究者对广东地区CI流行病学调查结果显示，抗体平均阳性率为7.92％(ELISA)和6.25％(HI)， 

目前流行的CIV主要有H3N8亚型犬流感病毒和H3N2亚型犬流感病毒。国内目前尚无H3N8亚型马流感病毒感染犬的报道。自2006年以来，在我国江苏、广东、北京、浙江和辽宁等地相继发生了禽源H3N2亚型流感病毒感染犬并导致犬发生严重呼吸道疾病的事件，血清学调查发现犬群中禽源H3N2亚型犬流感病毒导致的犬流感的阳性率达到10％以上。禽源H3N2CIV不仅可以感染犬，而且可以感染雪貂和猫，表明该病毒已经跨越种间障碍，具备了感染哺乳动物的能力。而犬作为人类主要的伴侣动物之一，与人之间的接触非常密切，这也增加了人感染CIV的风险。 

鉴于此，为避免犬流感在犬群暴发流行及对人类的健康造成威胁,需要切实有效的防治措施。疫苗是防控病毒性传染病的有效手段，因而研发一种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型高效犬流感疫苗具有重要的公共卫生学意义。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗，其特征在于含有灭活的保藏号为CGMCC No.8760的H3N2亚型犬流感病毒。 

本发明的目的之二是提供所述H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗的制备方法。 

本发明的目的之三是提供所述H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗在制备防治由H3N2亚型犬流感病毒引起的犬流感疾病药物中的应用。 

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的： 

H3N2亚型犬流感病毒的分离与鉴定：2013年，病料采集自黑龙江省某宠物医院呼吸道症状发病死亡犬，肺脏组织病料经过研磨后，接种9-11日龄SPF鸡胚分离病毒，对分离毒进行血凝、血凝抑制、特异性鉴定及生物学鉴定，证明分离的病毒为H3N2亚型犬流感病毒，本发明所分离得到的病毒全称为A/Canine/Heilongjiang/L1/2013(H3N2)株，简称为CIV-HLJ株。 

本发明的一种H3N2亚型犬流感病毒株，命名为CIV-HLJ株，分类命名为犬流感病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.8760；保藏时间是：2014年1月13日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

进一步的，本发明还提出了所述的H3N2亚型犬流感病毒在制备H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗中的应用。 

本发明的一种H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗，其特征在于含有灭活后的本发明所述的H3N2亚型犬流感病毒株。 

优选的，所述的H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗中还含有药学上可接受的载体或佐剂。 

一种制备所述的H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤： 

(1)将保藏编号为CGMCC NO.8760的H3N2亚型犬流感病毒株按照体积比进行500-1500倍稀释，得到稀释后的病毒液； 

(2)将步骤(1)得到的稀释后的病毒液接种9-11日龄SPF鸡胚，72h收获鸡胚尿囊液，置-20℃保存，不超过6个月； 

(3)鸡胚尿囊液中加入灭活剂，灭活后，再加入佐剂，乳化，即得。 

其中，优选的，所述的灭活剂为β-丙内酯，所述的佐剂为Montanide PET GEL A。 

更优选的，具体操作步骤为：向鸡胚尿囊液加入终浓度为质量百分比0.2％的β-丙内酯，灭活48h，再加入终浓度为质量百分比8％的Montanide PET GEL A，利用桨式搅拌器，在剪切速度200rpm下，乳化10min，即得。 

对本发明制备得到的犬流感灭活疫苗进行安全性和免疫原性评价，试验结果表明，该疫苗对犬具有良好的安全性，并可以诱导犬体产生理想免疫保护效果。 

附图说明

图1CIV-HLJ株HA基因PCR扩增结果； 

1、阴性对照；2：HA扩增产物；M：DL2000DNA Marker 

图2CIV-HLJ株NA基因PCR扩增结果。 

1、阴性对照；2：NA扩增产物；M：DL2000DNA Marker 

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

实施例1本发明犬流感病毒A/Canine/Heilongjiang/L1/2013(H3N2)株的分离鉴定 

材料与方法

1、病料和鸡胚 

病料采集自黑龙江省某宠物医院呼吸道症状发病死亡犬的肺脏组织；9-11日龄SPF鸡胚由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。 

2、病毒增殖及HA试验 

肺脏组织研磨后5000rpm离心10min，取上清，加入1000U双抗，接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，0.2ml/枚，37℃培养72h，4℃过夜，无菌收集鸡胚尿囊液，分装后，-70℃保存备用。并测定其HA效价。 

3、分子生物学试剂 

RNA提取试剂TRIzol、cDNA反转录试剂禽源反转录酶AMV购自Invitrogen公司；PCR扩增所用的Ex Taq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)公司；胶回收(小量)试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。 

4、载体和菌种 

pMD18-T克隆载体和DH5α大肠杆菌感受态细胞，购自宝生物工程(大连)公司。 

5、病毒RNA的提取与cDNA的制备 

采用TRIzol试剂从鸡胚尿囊液提取病毒RNA；以Uni-12: 5’-AGCAAAAGCAGG-3’为引物，采用禽源反转录酶AMV，按试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。 

6、引物设计 

利用Oligo6.0软件设计合成扩增流感病毒的HA和NA基因的特异性引物，如下表1所示。 

表1扩增CIV HA和NA基因的特异性引物 

7、HA和NA基因的RT-PCR扩增 

PCR扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸2min，循环扩增30次；72℃延伸10min。PCR产物用上海华舜公司胶回收(小量)试剂盒回收。 

8、连接与转化 

将胶回收的PCR产物与pMD18-T载体连接后，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，然后取出100μL菌液涂布于含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板上，37℃培养16h。挑取白色孤立菌落，接种于5mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中，37℃培养12h。 

9、目的基因测序 

将经过鉴定为阳性的菌液，送Invitrogen公司进行序列测定。 

结果

1、HA效价测定结果 

CIV-HLJ接种鸡胚后HA效价达到210。 

2、RT-PCR结果 

HA和NA分别约为1.7kb和1.4kb，与预期的大小相符(见图1和图2)。 

通过对分离毒进行血凝、血凝抑制、特异性鉴定及生物学鉴定，证明分离的病毒为H3N2亚型犬流感病毒，命名A/Canine/Heilongjiang/L1/2013(H3N2)株，简称为CIV-HLJ株。本发明已将所分离的H3N2亚型犬流感病毒提交专利认可机构保藏，其微生物保藏号是：CGMCC No.8760；分类命名为：犬流感病毒；保藏时间是：2014 年1月13日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

实施例2本发明H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗的制备及其免疫效力评价 

1材料与方法 

1.1病毒增殖、灭活及乳化 

将CIV-HLJ株稀释1000倍，接种9-11日龄SPF鸡胚，72h收集鸡胚尿囊液，6000rmp离心20min，取上清。 

1.2病毒灭活及乳化 

鸡胚尿囊液加入终浓度为0.2％(质量百分比浓度)的β-丙内酯，灭活48h。加入终浓度为8％(质量百分比浓度)Montanide PET GEL A(简称GEL A)，利用桨式搅拌器，在剪切速度200rpm下，乳化10min，即得。 

1.3犬体免疫效力分析 

将8只10周龄比格犬随机分为2组，HI检测H3N2亚型流感病毒抗体阴性。第1组为疫苗免疫组，疫苗免疫组犬均通过肌肉注射本发明制备得到的H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗1ml/只犬；第2组为对照组，注射相同体积的PBS缓冲液。一免3周后加强免疫，剂量方法同一免。二免后2周用10⁶EID⁵⁰CIV-HLJ株进行鼻腔攻毒，攻毒前，各组犬均通过肌肉注射0.15mL/kg的犬眠宝，每天观察临床症状，并定时采集鼻腔拭子，连续监测10天，用SPF鸡胚滴定检测排毒情况。免疫后每周分别采血，分离血清，测定HI抗体效价。 

2结果 

2.1疫苗免疫后犬的抗体水平 

免疫后第1周即可检测到HI抗体，而对照组均未检测到HI抗体，抗体效价见表2。 

表2疫苗免疫犬后不同时间的HI抗体效价 

“-”代表未检出。 

2.2攻毒犬的排毒情况 

攻毒后排毒监测结果表明：免疫组所有犬在监测的10d内鼻拭子均没有检测到病毒，所有犬均未见到可视临床症状。对照组在攻毒后第1d到第5d所有犬的鼻拭子均能够检测到病毒，对照组犬第2d开始表现精神沉郁、食欲下降、眼屎等症状，偶见喷嚏和咳嗽，第6d之后病毒检测为阴性。 

上述研究结果表明：本发明制备得到的H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗能够有效诱导犬产生HI抗体，攻毒后免疫犬不排毒，具有良好的免疫保护效果。该疫苗作为我国H3N2亚型犬流感理想的候选疫苗将会带来巨大的社会和经济效益。 

Claims (7)

1.一种H3N2亚型犬流感病毒株，命名为CIV-HLJ株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.8760。

2.权利要求1所述的H3N2亚型犬流感病毒在制备H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗中的应用。

3.一种H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗，其特征在于含有灭活后的权利要求1所述的H3N2亚型犬流感病毒株。

4.如权利要求3所述的H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗，其特征在于还含有药学上可接受的载体或佐剂。

5.一种制备权利要求3或4所述的H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将保藏编号为CGMCC NO.8760的H3N2亚型犬流感病毒株按照体积比进行500-1500倍稀释，得到稀释后的病毒液；

（2）将步骤（1）得到的稀释后的病毒液接种9-11日龄SPF鸡胚，72h收获鸡胚尿囊液，置-20℃保存，不超过6个月；

（3）鸡胚尿囊液中加入灭活剂，灭活后，再加入佐剂，乳化，即得。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的灭活剂为β-丙内酯，所述的佐剂为Montanide PET GEL A。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于加入向鸡胚尿囊液加入终浓度为质量百分比0.2%的β-丙内酯，灭活48h，再加入终浓度为质量百分比8%的Montanide PET GEL A，利用桨式搅拌器，在剪切速度200rpm下，乳化10min。