CN103937750A

CN103937750A - 抗大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN103937750A
Application number: CN201410116476.1A
Authority: CN
Inventors: 谯仕彦; 何涛; 宋青龙; 张海燕
Original assignee: BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2014-03-26
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2034-03-26
Also published as: CN103937750B

Abstract

本发明公开了一种抗大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明所提供的抗大豆球蛋白的单克隆抗体是由杂交瘤细胞3F5分泌产生的；所述杂交瘤细胞3F5在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.8704。实验证明，该杂交瘤细胞株所稳定分泌的大豆球蛋白单克隆抗体，亲和常数达8.2×10¹⁰L/mol。以该大豆球蛋白单克隆抗体为检测抗体建立竞争性酶联免疫方法检测大豆球蛋白，检测限为200ng/mL。本发明所提供的大豆球蛋白单克隆抗体及其检测方法和试剂盒具有检测限低，检测范围广，且高效、准确的优点，可广泛应用于大豆、大豆制品中大豆球蛋白的定性和定量检测。

Description

抗大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术

大豆中含有丰富的蛋白质，由于其必需氨基酸（如赖氨酸、苏氨酸和色氨酸）组成比例适宜，是畜禽优质的植物性蛋白源。但大豆中含有的大豆抗原蛋白所导致的动物过敏反应越来越受到人们的关注。在幼龄动物饲料中添加豆粕作为蛋白质来源会导致仔猪、犊牛等的腹泻、生长性能下降、肠黏膜细胞增生以及免疫功能失调等一系列不良反应，严重的甚至导致死亡。

大豆球蛋白是大豆中主要的致敏蛋白质，占大豆籽实总蛋白的40%以上，其分子量为320-360kDa，有5个亚基。大豆球蛋白作为大豆中含量最高的抗原蛋白，在幼龄动物致过敏反应中充当着重要角色。

因此，定量检测不同大豆制品中的大豆球蛋白的含量具有重要的理论意义及应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用。

本发明所提供的抗大豆球蛋白的单克隆抗体，是由杂交瘤细胞3F5分泌产生的；所述杂交瘤细胞3F5在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.8704。

所述的单克隆抗体可用于检测或辅助检测大豆球蛋白。

所述杂交瘤细胞3F5CGMCC No.8704或所述单克隆抗体在制备检测或辅助检测大豆球蛋白的试剂或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测大豆球蛋白的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒中含有独立包装的所述抗大豆球蛋白的单克隆抗体。

所述试剂盒中还含有独立包装的如下1）-7）试剂中的至少一种：

1）包被缓冲液：溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄·12H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O；所述Na₂HPO₄·12H₂O和所述NaH₂PO₄·2H₂O在所述包被缓冲液中的终浓度分别为5.8g/L和0.59g/L，pH值为7.4；

2）封闭液：溶剂为水，溶质为牛血清白蛋白、小牛血清、吐温-20和蔗糖；所述牛血清白蛋白、所述小牛血清、所述吐温-20和所述蔗糖在所述封闭液中的终浓度分别为10g/L、100ml/L、0.5ml/L和100g/L；

3）洗涤液：溶剂为PBS缓冲液，溶质为吐温-20，所述吐温-20在所述洗涤液中的终浓度为50ml/L；

所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄；所述溶质NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄在所述PBS缓冲液中的浓度分别为8g/L、0.2g/L、0.2g/L和0.46g/L，pH值为7.4；

4）抗体稀释液：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20和明胶；所述吐温-20和所述明胶在所述抗体稀释液中的终浓度分别为0.1ml/L和1g/L；

5）终止液：2M的硫酸水溶液；

6）底物液A和底物液B；

所述底物液A：溶剂为水，溶质为过氧化氢脲、Na₂HPO₄·12H₂O、一水合柠檬酸和吐温-20；所述过氧化氢脲、所述Na₂HPO₄·12H₂O、所述一水合柠檬酸和所述吐温-20在所述底物液A中的终浓度分别为1g/L、35.8g/L、10.3g/L和0.1ml/L；

所述底物液B：溶剂为水，溶质为四甲基联苯胺、一水合柠檬酸和硫代硫酸钠；所述四甲基联苯胺、所述一水合柠檬酸和所述硫代硫酸钠在所述底物液B中的终浓度分别为0.4g/L、2g/L和0.1g/L；

7）30×样品提取液：溶剂为水，溶质为Tris、HCl和β-巯基乙醇；所述Tris、所述HCl和所述β-巯基乙醇在所述30×样品提取液中的终浓度分别为181.7g/L、73ml/L、21ml/L（所述HCl的浓度为37.5%质量分数）。

本发明的还一个目的是提供一种检测或辅助检测大豆球蛋白的方法。

本发明所提供的检测或辅助检测大豆球蛋白的方法，包括使用所述试剂盒对待测样品进行检测的步骤。

所述试剂盒在定性或定量检测大豆球蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护如下：将所述抗大豆球蛋白的单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂；或以所述免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱；或含有所述免疫亲和吸附剂或所述免疫亲和色谱柱的试剂盒。

所述免疫亲和吸附剂、所述免疫亲和色谱柱或所述试剂盒在分离纯化大豆球蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。

实验证明，以大豆球蛋白为免疫原免疫小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合获得杂交瘤细胞3F5CGMCC No.8704，该杂交瘤细胞株所稳定分泌的大豆球蛋白单克隆抗体，亲和常数达8.2×10¹⁰L/mol。以该大豆球蛋白单克隆抗体为检测抗体建立竞争性酶联免疫方法检测大豆球蛋白，检测限为200ng/ml。本发明所提供的大豆球蛋白单克隆抗体及其检测方法和试剂盒具有检测限低，检测范围广，且高效、准确的优点，可广泛应用于大豆、大豆制品中大豆球蛋白的定性和定量检测。

保藏说明

参椐的生物材料（株）：3F5

科学描述：杂交瘤细胞

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2013年12月31日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.8704

附图说明

图1为竞争性ELISA试剂盒检测大豆球蛋白的标准曲线。其中，横坐标为各标准品溶液中大豆球蛋白浓度（μg/mL）的Lg值，纵坐标为百分吸光度值（%）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的大豆球蛋白购自SIGMA公司，产品目录编号为G3171；雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；SP2/0细胞购自上海佳和生物科技有限公司。

下述实施例中蛋白质浓度测定使用的试剂盒为BCA蛋白定量试剂盒，购自pierce公司，产品目录编号为23227。

下述实施例中所涉及的试剂：四甲基联苯胺（TMB）、明胶、DMEM培养基（Sigma-Aldrich）；青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺（L-G）、二甲基亚砜（DMSO，Amresco，USP grade，上海生工分装）；HEPES、Tris（Angus,北京宏宝达生物技术有限公司分装）；HRP标记羊抗鼠IgG和HRP-streptoavidin（Jackson，中山金桥公司分装）；福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、HAT、HT（GibcoBRL）；胎牛血清（FBS）（Hyclone，USA）；Mabs类及亚型检测试剂盒（ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit I，Pierce）；HiTrapTM Protein A HP（Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden）；其它常规试剂（国产分析纯）。

下述实施例中所用到的仪器：SW-2J-1F超净工作台，5410型CO₂恒温培养箱（Napco），三用电热恒温水浴箱，倒置显微镜（Nikon），台式高速冷冻离心机，连续波长酶标仪，Ultrospec3000型UV/Visible分光光度计，pH酸度计。

下述实施例中所用的溶液：

包被缓冲液：溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄·12H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O；所述Na₂HPO₄·12H₂O和所述NaH₂PO₄·2H₂O在所述包被缓冲液中的终浓度分别为5.8g/L和0.59g/L，pH值为7.4；

封闭液：溶剂为水，溶质为牛血清白蛋白、小牛血清、吐温-20和蔗糖；所述牛血清白蛋白、所述小牛血清、所述吐温-20和所述蔗糖在所述封闭液中的终浓度分别为10g/L、100ml/L、0.5ml/L和100g/L；

PBS缓冲液：溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄；所述溶质NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄在所述PBS缓冲液中的浓度分别为8g/L、0.2g/L、0.2g/L和0.46g/L，pH值为7.4；

洗涤液：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20，所述吐温-20在所述洗涤液中的终浓度为50ml/L；

抗体稀释液：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20和明胶；所述吐温-20和所述明胶在所述抗体稀释液中的终浓度分别为0.1ml/L和1g/L；

终止液：2M的硫酸水溶液；

底物液A：溶剂为水，溶质为过氧化氢脲、Na₂HPO₄·12H₂O、一水合柠檬酸和吐温-20；所述过氧化氢脲、所述Na₂HPO₄·12H₂O、所述一水合柠檬酸和所述吐温-20在所述底物液A中的终浓度分别为1g/L、35.8g/L、10.3g/L和0.1ml/L；

底物液B：溶剂为水，溶质为四甲基联苯胺、一水合柠檬酸和硫代硫酸钠；所述四甲基联苯胺、所述一水合柠檬酸和所述硫代硫酸钠在所述底物液B中的终浓度分别为0.4g/L、2g/L和0.1g/L；

30×样品提取液：溶剂为水，溶质为Tris、HCl和β-巯基乙醇；所述Tris、所述HCl和所述β-巯基乙醇在所述30×样品提取液中的终浓度分别为181.7g/L、73ml/L、21ml/L（所述HCl的浓度为37.5%质量分数）。

不完全DMEM培养基：DMEM（1L包装）粉剂1袋，超纯水1000ml，NaHCO₃3.7g，1mol/L盐酸调节pH值到7.0～7.2，过滤除菌，分装4℃保存。

完全DMEM培养基：不完全DMEM培养基88ml，加小牛血清12ml，无菌条件下配制。

HT培养基：完全DMEM培养基99ml，加100×HT贮存液1ml，无菌条件下配制。

HAT培养基：完全DMEM培养基99ml，加100×HAT贮存液1ml，无菌条件下配制。

100×HT贮存液：购自sigma，货号：H0137。

100×HAT贮存液：购自sigma，货号：H0262。

50%PEG溶液：称取PEG20002g，放入青霉素小瓶中，塞紧橡皮塞，塞上插一9号针头（排气用），8磅高压灭菌15min或水浴30min，使PEG融化并达到灭菌目的，待冷却至50～60℃时（在此温度以上PEG仍为均匀的液体状态），加入已在37℃预热的不完全培养液2ml，充分混匀，调pH，盖紧瓶塞，4℃保存，用前可置37℃加温助溶。

8-氮杂鸟嘌呤贮存液（100×）：称取200mg8-氮杂鸟嘌呤(8-azayuanine,MW152.1)，加入4N NaOH1ml，待其溶解后，加三蒸水或去离子水99ml，过滤除菌，分装小瓶，-20℃冻存，使用时按1%浓度加入到培养液中（即终浓度为20μg/ml）。

细胞冻存液：含10％（体积分数）DMSO的完全DMEM培养液。

实施例1、杂交瘤细胞株的获得及抗大豆球蛋白单克隆抗体的制备

一、杂交瘤细胞株的获得

1、动物免疫

实验动物：雌性BALB/c小鼠（体重约18～22g），3只。

将大豆球蛋白（即免疫原）溶于0.5ml生理盐水中，加入等体积佐剂制成乳化剂，免疫雌性BALB/c小鼠。第三次免疫后7～10d测定血清效价。免疫程序见表1。

表1动物免疫程序

时间（ｄ）	免疫次数	免疫原剂量	佐剂	免疫部位
					0	第一次免疫	50μg/0.2ml/只	完全佐剂	颈背部皮下
21	第二次免疫	25μg/0.2ml/只	不完全佐剂	颈背部皮下
					35	第三次免疫	25μg/0.2ml/只	不完全佐剂	颈背部皮下
49	加强免疫	25μg/0.2ml/只	无	腹腔

2、细胞融合及克隆化

（1）脾细胞悬液的制备

将步骤1第三次免疫后的小鼠尾部采血测定血清效价（具体方法见下文），选择血清效价最高（1：4.2×10⁵）的小鼠，融合前3天加强免疫（见上表1）。处死小鼠，在75%酒精中浸泡消毒5min。取出小鼠，移入超净工作台，小鼠腹部朝上固定在解剖版上，剪开腹部皮肤和腹膜，找到脾脏（注意无菌操作）。取出脾脏后，将脾脏上的结缔组织去除干净，置于包有120目尼龙纱布的小烧杯，用少量不完全DMEM培养基湿润纱布和脾脏。剪碎脾脏，用摄子轻轻研磨，用少量不完全DMEM培养基冲洗，脾细胞被过滤到烧杯中。离心收集脾细胞。

上述血清效价测定方法如下：

免疫后的BALB/c小鼠尾部采血0.1ml，3000rpm离心5min，收集血清，4℃保存。用ELISA法测定血清效价。

①包被抗原：用包被缓冲液将包被抗原（大豆球蛋白）稀释至适当的工作浓度（2μg/ml）；加入到酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；然后弃去孔内的液体。

②封闭：每孔加封闭液200μl，37℃湿盒孵育1h，然后用洗涤液洗3次，每次90s（简称洗涤，下同），拍干。

③加待测血清样品：将血清样品倍比稀释后加入酶标板中，每孔100μl；同时设空白对照、阴性对照各2孔。37℃孵育0.5h，洗涤、拍干。

其中，空白对照为抗体稀释液；阴性对照为未经免疫的小鼠血清。

④加酶标第二抗体：先用抗体稀释液将HRP标记羊抗鼠IgG（中杉金桥公司，产品目录号为ZB-2305）稀释到适当的工作浓度，每孔加入100μl，置37℃孵育0.5h；然后洗涤、拍干。

⑤加底物溶液：各孔加新鲜配制的底物液A、底物液B各100μl，37℃孵育15min。

⑥终止反应：每孔加终止液50μl。

⑦判定结果：测定OD450nm，以空白孔调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性，满足此条件的待测样品的最大稀释倍数即为血清效价。

（2）饲养细胞的制备

取未经免疫的BALB/c小鼠，放血致死，收集血液，制备血清留作阴性血清备用。将小鼠于75%的酒精中浸泡消毒5min。在超净台中小鼠腹部朝上，固定在解剖板上，无菌操作剪开腹部皮肤，露出腹膜。用酒精棉球对腹膜进行消毒。小心提起腹膜，腹腔注射5mL4℃预冷的不完全DMEM培养基，反复柔打腹部数次，再吸回注射器中，注入离心管。1000rpm离心10min，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮并混匀，作细胞计数，然后根据细胞计数结果，补加HAT培养基至40mL，充分混匀。按照将饲养细胞悬液加入4块96孔培养板，每孔0.1ml。置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。

（3）骨髓瘤细胞悬液的制备

融合前一周复苏SP2/0骨髓瘤细胞于完全DMEM培养液中。用20μg/ml的8-氮杂鸟嘌呤来处理骨髓瘤细胞，使其对HAT呈均一的敏感性。选择呈对数生长的细胞，于融合前48～36h，将骨髓瘤细胞扩大培养于100ml细胞培养瓶中，每瓶加10ml培养液，置37℃、5%CO₂温箱内培养。融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管内。1000rpm离心5min，弃去上清。沉淀中加入30ml不完全DMEM培养液，同上离心洗涤一次。然后将细胞重悬至10ml不完全DMEM培养基中，混匀。取瘤细胞悬液，加台酚兰染液进行活细胞计数后备用。

（4）细胞融合

分别吸取含1×10⁸个脾细胞和2～3×10⁷个骨髓瘤细胞的悬液量，加入到一只50ml离心管中，补加不完全DMEM培养基至30ml，充分混匀。用1000rpm离心7min，将上清尽量弃去。轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。一手均匀转动离心管，另一手用1ml吸管吸取50%PEG溶液1ml，并沿转动的管壁（尽量接近细胞处）加入，从加入到加完的时间控制在60s左右，然后立即将细胞悬液全部吸入吸管（时间控制在30s左右），静置30s，再将其吹入离心管内（时间也控制30s左右）。立即在5min内加入25ml不完全DMEM培养基，使PEG稀释而失去促融作用。具体加法是第1min加1ml，第2min加4ml（均应边加边轻轻转动离心管），随后的3min内将剩余液体加完。所有操作过程保持在37℃。用800rpm离心7min，弃去上清。加入10ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀的细胞，使其悬浮并混匀。将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml（相当于2滴）。然后将培养板置37℃，含5%CO₂的培养箱内培养。

（5）选择性培养融合后4～5d显微镜下观察杂交瘤细胞的生长情况，并作记录，如发现污染，对有污染的孔采用高浓度抗生素清洗处理，融合后5～6d，取单克隆孔的培养上清液，ELISA法检测其效价及阻断情况，融合后7～10d，细胞集落约显微镜下1/3～1/2视野大小，更换为HT培养基，换液时，用消毒的8孔移液器和灭菌枪头每孔吸去0.1ml细胞上清液，每个枪头只用于一个孔，随后用滴管吸取HT培养基，每孔滴加两滴约0.1ml，封盖，37℃，含5%CO2的培养箱内培养。

（6）杂交瘤细胞株的筛选及扩大培养

用间接ELISA法检测细胞培养上清液，选出阳性产抗大豆球蛋白抗体的单克隆孔，挑出阳性高，阻断情况好的单克隆孔继续做亚克隆，直至最后一次克隆有细胞的孔都为阳性产目的抗体。具体是采用有限稀释法对分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行筛选的。进而采用间接ELISA法筛选出稳定分泌抗大豆球蛋白单克隆抗体效价最高（效价为1:80000）的杂交瘤细胞株，命名为3F5，于2013年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.8704。

其中，间接ELISA法检测杂交瘤细胞株抗体效价的具体方法如下：

③加待测样品：将杂交瘤细胞培养液倍比稀释后加入酶标板中，每孔100μl；同时设空白对照（抗体稀释液）和阴性对照(不含杂交瘤细胞的培养液)各2孔。37℃孵育0.5h，洗涤、拍干。

⑥终止反应：每孔加终止液50μl。

⑦判定结果：测定OD450nm，以空白孔调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性，满足此条件的待测样品的最大稀释倍数即为抗体效价。

（7）杂交瘤细胞株的冻存与复苏

冻存：收集处于对数生长的细胞，1000rpm离心10min，弃去上清，打散细胞团，加入细胞冻存液，制成细胞悬液。用1.8mL的细胞冻存管分装，每管加入1.5mL细胞悬液。在管壁上写上细胞种类，冻存日期标记。快速将细胞冻存管移到-20℃保存Ih，再转入-80℃超低温冰箱12h，然后转入液氮中存放。

复苏：从液氮中取出冻存细胞，直接投入37℃水浴锅中，待完全融解后，将细胞悬液转移到细胞培养瓶中，补加预热好的完全DMEM培养基至10mL，于37℃、5%CO₂培养箱中培养。

二、单克隆抗体的制备与纯化

1、腹水制备

采用小鼠体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体。取健康BALB/c雌性小鼠，注入液体石蜡0.5ml，1～2周后备用。将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞3F5CGMCCNo.8704用不完全DMEM培养基制备成细胞悬液，细胞计数后，将细胞数调至10⁶/ml，注射小鼠腹腔lmL/只。7～10天后收集腹水，一只小鼠可获5～10mL腹水，3000rpm离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，分装，-70℃冻存。

采用间接ELISA法进行腹水效价检测，具体操作及结果判定方法参见步骤一，结果表明其效价为1：10000。

2、单克隆抗体的纯化

腹水的预处理采用二氧化硅吸附法：取一定量的腹水，加等体积的巴比妥缓冲盐水（VBS）稀释。加适量二氧化硅粉末，室温30min，不时摇动。2000g离心20min，即得澄清的腹水。将所述澄清的腹水再进行辛酸－硫酸铵沉淀法纯化和亲和层析纯化，最后用5mM PBS缓冲液透析，获得抗大豆球蛋白的单克隆抗体溶液。

三、单克隆抗体的鉴定

1、抗体的类及亚型的鉴定

取阳性杂交瘤细胞3F5CGMCC No.8704的培养液，2000rpm离心8min去除细胞及其碎片，采用Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit（Thermo scientific，产品编号：37503），按照使用说明书步骤测定杂交瘤细胞3F5CGMCC No.8704分泌的单克隆抗体的类、亚类及轻链的亚型。实验重复三次。

测定结果显示，杂交瘤细胞株3F5CGMCC No.8704分泌的单克隆抗体属于IgG2a亚类，其轻链为κ亚型。

2、抗体亲和力的测定

采用非竞争性ELISA法测定杂交瘤细胞3F5CGMCC No.8704..培养液中单克隆抗体的亲和常数，操作程序如下：

（1）将大豆球蛋白用包被缓冲液配成如下三种浓度：0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml，包被酶标板，0.1ml/孔，4℃过夜。

（2）每孔加封闭液200μl，37℃湿盒孵育1h，然后用洗涤液洗3次，每次90s（简称洗涤，下同），拍干。

（3）洗涤后，加入系列稀释的已知浓度的被检的杂交瘤细胞培养液，0.1ml/孔，37℃孵育1h。

（4）洗涤后，加入适宜浓度的HRP标记羊抗鼠IgG（中杉金桥公司，产品目录号为ZB-2305），0.1ml/孔，37℃孵育1h。

（5）洗涤后，各孔加新鲜配制的底物液A、底物液B各50μl，37℃闭光显色20min。

（6）用50μl2M H₂SO₄终止反应后，测定各孔的OD_492nm值。

实验重复三次，结果取平均值。

以被检样品的不同浓度为横坐标，以其相应的OD值为纵坐标，绘制3条测定曲线，以各曲线上部趋于平坦的OD值为100%，计算OD值为50%时的单克隆抗体的浓度[Ab]t，这样每份被检样品可得[Ab]t﹑[Ab]′t﹑[Ab]″t三个值，然后根据文献（徐志凯，实用单克隆抗体技术，1992，第27-102页）中的方法，计算杂交瘤细胞3F5CGMCC No.8704分泌的单克隆抗体的亲和常数为8.2×1010L/mol。

实施例2、检测大豆球蛋白的竞争性ELISA方法及其专用试剂盒

一、棋盘法筛选最适的抗原包被浓度和抗体工作浓度

1、包被抗原：取大豆球蛋白，用包被缓冲液配制成浓度依次为5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL的4种包被液；将这4种包被液按浓度由高到低依次加入酶标板1-4列中，每列一种包被液，0.1ml/孔，4℃包被16h；弃液体。

2、封闭：加封闭液200μL/孔，在37℃湿盒中封闭1h；弃液体，拍干。

3、竞争抗原和单抗的加入：洗涤后，A、C、E、G行每孔加入50μL抗体稀释液，B、D、F、H行每孔加入50μL浓度为30μg/mL的大豆球蛋白标准品（SIGMA，产品目录编号为G3171）；同时取实施例1纯化后的杂交瘤细胞3F5CGMCC No.8704分泌的单克隆抗体，用抗体稀释液依次按照如下体积比进行稀释：1:1000、1:2000、1:4000、1:8000，共得到4份不同浓度的抗体液；将这4种抗体液按稀释倍数由低到高依次加入酶标板A-H行中，每两行一种抗体液，50μL/孔，37℃孵育0.5h。

4、酶标二抗的加入：洗涤后，加入适宜浓度的HRP标记的兔抗鼠IgG抗体（中杉金桥公司产品，其产品目录号为ZB-2305），0.1ml/孔，37℃孵育0.5h。

5、显色：洗涤后，各孔加新鲜配制的底物液A、底物液B各50μl，37℃闭光显色15min。

6、终止：50μl2M H₂SO₄终止反应后，测定各孔的OD_450nm值。

OD值约为2时，且大豆球蛋白标准品的抑制率最高的抗原包被浓度和抗体稀释度为抗原抗体反应的适宜浓度。

结果如表2所示。选择1G/1H对应的包被抗原浓度和单克隆抗体工作浓度（分别为5μg/mL和1:8000倍稀释）作为最适浓度。

表2、棋盘法筛选合适的包被抗原浓度和抗体工作浓度的OD值

	1	2	3	4
					A	2.778	1.723	0.717	0.34
B	0.509	0.173	0.038	0.007
					C	2.454	1.611	0.551	0.248
D	0.238	0.06	0.017	0.005
					E	2.33	1.322	0.56	0.219
F	0.096	0.023	0.005	0.004
					G	1.97	1.046	0.342	0.133
H	0.046	0.011	0.004	0.005

注：表2中1-4各列间的包被抗原浓度不同，依次为5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL；A-H每两行间的抗体稀释度不同，依次为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000。

二、用实施例1的单克隆抗体检测大豆球蛋白

（一）大豆球蛋白竞争性ELISA标准曲线的建立

1、包被：取步骤一1中配制的含大豆球蛋白5μg/mL的包被液，将该包被液按0.1ml/孔的量加入酶标板中，4℃包被16h；弃液体。

2、封闭：向已包被抗原的酶标板中每孔加入封闭液200μl，37℃孵育2h，然后洗涤、拍干。

3、竞争抗原和单抗的加入：依次加入系列稀释度（0、0.2μg/mL、0.4μg/mL、1.6μg/mL、6.4μg/mL、25.6μg/mL）的大豆球蛋白标准品（SIGMA公司，产品目录编号为G3171）50μl和实施例1纯化后的杂交瘤细胞3F5CGMCC No.8704分泌的单克隆抗体的1：8000倍稀释液50μl，以加入样品稀释液溶液作为空白对照，每个标准品各做2孔平行.37℃30min，洗涤、拍干。

4、酶标二抗的加入：在各反应孔中，加入适宜浓度HRP标记二抗（中杉金桥公司产品，其产品目录号为ZB-2305）100μl，37℃孵育30min，洗涤、拍干。

5、显色：于各反应孔中加入新鲜配置的底物液A、底物液B各50μl，室温反应15min。

6、终止：每孔加2M H₂SO₄50μl终止反应。以空白对照调零，用酶标仪测定各孔450nm处的OD值（即吸光度值）。

7、结果计算

以大豆球蛋白标准品溶液的浓度（μg/mL）的lg值为横坐标，以相应的百分吸光度值（%）为纵坐标，制作标准曲线。结果如图1所示，线性方程为Y==-0.322x+0.627（R2=0.996）。

百分吸光度值（%）=标准品溶液孔的吸光度值（B）/阴性对照孔的吸光度值（B0）×100%。

图1中，蛋白浓度为0、0.2μg/mL、0.4μg/mL、1.6μg/mL、6.4μg/mL、25.6μg/mL的大豆球蛋白标准品溶液所对应的OD值分别为：1.955、1.704、1.434、1.108、0.706、0.353，百分吸光度值分别为87.16%、73.35%、56.68%、36.11%、18.06%。竞争性ELISA的IC50为2.6μg/mL，最低检测限可达0.2μg/mL，检测线性范围为0.2-25.6μg/mL。

（二）大豆球蛋白间接竞争ELISA试剂盒的样本添加回收率

具体操作步骤如下：

（1）试剂配制

1×样品提取工作液的配制：根据用量，将30×样品提取液与蒸馏水按1:29（体积比）的比例稀释至工作浓度。

1×样品稀释工作液：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为巯基乙醇和明胶，所述巯基乙醇在所述1×样品稀释工作液中的浓度为0.2M，所述明胶在所述1×样品稀释工作液中的浓度为0.01M。

（2）样品制备

供试样品：豆粕、发酵豆粕、膨化大豆。

将供试样品粉碎成60目以上颗粒，分别添加大豆球蛋白标准品，每种供试样品中均设置添加量分别为0（即添加大豆球蛋白标准品前）、10mg/g、20mg/g、50mg/g的几个平行，获得系列混合样品。

称取0.1g样品于50mL离心管中，加入30mL1×样品提取工作液，于25℃振荡提取16小时，取上层液体4000rpm离心5分钟，然后取上清液用1×样品稀释工作液稀释70倍（稀释方法：先取100μL上清液加到装有600μL1×样品稀释工作液的容器中混匀，然后再取混合液100μL加到装有900μL1×样品稀释工作液的容器中混匀待用），得到待测样品。

（3）样品检测

将所需试剂从冷藏环境中取出，回温至20～28℃，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板条，将不用的酶标板条放入自封袋，于2～8℃干燥保存。洗涤工作液在使用前也需回温。将待测样品和大豆球蛋白标准品对应微孔按序编号，每个待测样品和大豆球蛋白标准品做2孔平行，并记录待测样品孔和大豆球蛋白标准品孔所在的位置。按照如下方法测定

①包被：与（一）中的步骤1相同。

②封闭：与（一）中的步骤2相同。

③待测样品和单抗的加入：每孔加入50μL步骤（2）获得的待测样品，以及50μl实施例1纯化后的杂交瘤细胞株3F5CGMCC No.8704分泌的单克隆抗体的1：8000倍稀释液，同时设置空白对照和阴性对照各2孔，37℃30min，洗涤、拍干。

④酶标二抗的加入：与（一）中的步骤4相同。

⑤显色：与（一）中的步骤5相同。

⑥终止：与（一）中的步骤6相同。

⑦结果计算：

根据公式：百分吸光度值（%）=待测样品溶液孔的吸光度值（B）/阴性对照孔的吸光度值（B0）×100%，获得待测样品的百分吸光度值，代入（一）中的线性方程，得到待测样品中大豆球蛋白的浓度（μg/mL），进而计算大豆球蛋白检测试剂盒的回收率。

回收率=(添加后样品中大豆球蛋白的含量-添加前样品中大豆球蛋白的含量)/添加大豆球蛋白的量×100%。

结果如表3所示。结果表明，三种样品的回收率在80%-100%，说明本发明提供的单克隆抗体及试剂盒检测β-大豆球蛋白具有良好的准确性。

表3大豆球蛋白样品回收率测定

Claims

1.杂交瘤细胞3F5，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.8704。

2.抗大豆球蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞3F5C GMCC No.8704分泌产生的。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测或辅助检测大豆球蛋白中的应用。

4.权利要求1所述的杂交瘤细胞3F5CGMCC No8704或权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测或辅助检测大豆球蛋白的试剂或试剂盒中的应用。

5.一种检测或辅助检测大豆球蛋白的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有独立包装的权利要求2所述的大豆球蛋白的单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有独立包装的如下1）-7）试剂中的至少一种：

所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄；所述溶质NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄在所述PBS缓冲液中的浓度为8g/L、0.2g/L、0.2g/L和0.46g/L，pH值为7.4；

5）终止液：2M的硫酸水溶液；

6）底物液A和底物液B；

7）30×样品提取液：溶剂为水，溶质为Tris、HCl和β-巯基乙醇；所述Tris、所述HCl和所述β-巯基乙醇在所述30×样品提取液中的终浓度分别为181.7g/L、73ml/L、21ml/L。

7.一种检测或辅助检测大豆球蛋白的方法，包括使用权利要求5或6所述试剂盒对待测样品进行检测的步骤。

8.权利要求5或6所述试剂盒在定性或定量检测大豆球蛋白中的应用。

9.将权利要求2所述抗大豆球蛋白的单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂；或

以所述免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱；或

含有所述免疫亲和吸附剂或所述免疫亲和色谱柱的试剂盒。

10.权利要求9所述的免疫亲和吸附剂、免疫亲和色谱柱或试剂盒在分离纯化大豆球蛋白中的应用。