CN103933563A - 使用遗传修饰的乳杆菌通过抗原的粘膜递送治疗免疫疾病 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过经由微生物特别是乳酸乳球菌粘膜递送分泌的免疫显性抗原来治疗自身免疫和变应性疾病。

Description

使用遗传修饰的乳杆菌通过抗原的粘膜递送治疗免疫疾病

本申请是申请日为2008年1月25日、申请号为200880004735.4的同名申请的分案申请。

本发明涉及通过经由微生物特别是乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）粘膜递送分泌的免疫显性抗原来治疗自身免疫和变应性疾病。

发明领域

免疫系统具有区别自身和非自身物质的任务。沿着呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道存在的粘膜免疫系统具有与丰富的细菌和无害抗原例如食物、空气播散的抗原或共生的细菌群落共存的另外的负荷。粘膜免疫系统的关键特征是它保留对这些抗原耐受的能力，同时保留有效击退病原体的能力。无论通过注射还是损伤，全身性引入抗原导致炎性细胞的局部浸润和特异性免疫球蛋白的产生。相比之下，在粘膜表面例如胃肠道和泌尿生殖道处引入的抗原引发免疫应答对于那些抗原的全身性有效抑制。通过经由胃肠道施用抗原特异性诱导这些被调节的应答称为口服耐受性（oral tolerance）。抗原的经口施用可以导致全身性无应答性，并且是具有不希望有的副作用（例如类固醇）的免疫抑制医学发明的有吸引力的替代物。本发明特别地属于通过持续暴露于低剂量的抗原获得的低剂量耐受性的领域。经由粘膜的耐受性诱导已提议作为针对自身免疫、变应性和炎性疾病的治疗策略。

技术发展水平

本发明背景的下述讨论仅用于帮助读者理解本发明，并非承认其描述或构成本发明的现有技术。

自身免疫、变应性和炎性疾病对患者和社会造成巨大负担，导致降低的生活质量和巨大成本。此外，不存在具有可接受的副作用或在全社会中合适的适当治疗。关于自身免疫疾病的目前治疗在很大程度上是姑息性的，一般是免疫抑制或抗炎性的。非免疫治疗例如在桥本氏甲状腺炎或DM1型中的激素替代产生自身攻击性应答的结果。类固醇或NSAID治疗限制了许多疾病的炎性症状。IVIG用于CIDP和GBS。更具体的免疫调节治疗例如TNFα拮抗剂依那西普已显示在治疗RA中是有用的。然而，这些免疫治疗可能与增加的不良反应风险相关，例如对感染增加的易感性。可以表征为慢性小肠炎症的乳糜泻（celiacdisease）仅能够通过限制的饮食进行有效治疗，这要求终生禁食包含小麦、黑麦或大麦的食物。虽然严格不含谷蛋白的饮食可以导致小肠治愈，但对谷蛋白的不耐受性是永久的。

也称为口炎性腹泻（celiac sprue）或谷蛋白敏感性肠病的乳糜泻是慢性炎性疾病，其由针对包含谷蛋白的特别饮食谷物的免疫应答发展。可以基于腹泻、脂粪、腹部气胀和绞痛、重量减轻、代谢性骨疾病、贫血的常规表现以及对于麦醇溶蛋白和组织转谷氨酰胺酶（tTG）具有特异性的血清抗体（也称为抗肌内膜）的存在进行诊断。粘膜损伤集中于小肠的近端部分，并且特征在于绒毛萎缩、隐窝细胞增生、以及上皮和固有层的淋巴细胞性浸润，其响应麦醇溶蛋白释放促炎细胞因子例如IL-2和IFN-γ。乳糜泻可以视为人中最常见的食物敏感性肠病，并且可以在个人生命中的任何时候出现。其流行率在西方、阿拉伯和印度人口中为1：100至1：300。除谷蛋白外，该疾病还可以在手术、病毒感染、严重情绪应激、妊娠或分娩后首次触发。

因此，抗原特异性口服耐受性的诱导将是有吸引力的治疗方法。尽管口服耐受性在1911年首次描述，但直到20世纪70年代末期研究者才开始致力于所涉及的机制（Mayer和Shao，2004a）。对于口服耐受性的发展已提出几个机制，从抗特异性T细胞的缺失、超过免疫偏离和无反应性的诱导到经由Treg的抑制（Mucida等人，2005）。大多数研究者认为，存在获得口服耐受性的2种不同途径，在单次高剂量抗原后获得的高剂量耐受性，其基于无反应性和/或缺失（Friedman和Weiner，1994），和通过反复暴露于低剂量抗原获得的低剂量耐受性，其通过经由CD4⁺T细胞的免疫应答的有效抑制介导，所述CD4⁺T细胞包括Foxp3⁺、IL-10和/或TGF-β产生调节T细胞。重要的是，通过粘膜耐受诱导的调节T细胞已显示介导旁观者抑制（bystandersuppression），即通过其对于一种蛋白质特异的调节细胞抑制附近效应细胞对另一种蛋白质的应答的过程。旁观者抑制是抗原诱导的抑制的另一个重要特征，因为诱导器官特异性自身免疫的抗原库大部分是未知的，并且它废除了表位扩展（epitope spreading）现象。表位扩展是自身免疫和变应性疾病的并发症，通过其起始免疫应答随着时间扩展，以诱导对于其他抗原的应答。

用于治疗和预防应用的分子的靶向和更有效递送是医药工业所优先考虑的。有效的策略应通过使分子集中于所需作用位点来减少所需剂量、增加安全性和改善功效。与注射比较，药物和疫苗递送的粘膜途径提供许多后勤和生物学优点。由于易于施用，经口递送是特别有吸引力的。然而，胃肠道降解和低水平的吸收一般使得这个途径对于肽和蛋白质药物递送无效。可选的粘膜途径例如鼻、直肠、肺和眼途径也正进行研究。

因此，在本领域中存在有效诱导抗原耐受性的问题。

发明概述

令人惊讶地，我们发现在患者的粘膜位点处递送且优选持续存在的免疫显性抗原诱导抗原特异性免疫耐受性。特别地，当微生物例如优选地乳酸乳球菌（LL）（其持续表达和分泌免疫显性抗原）在粘膜位点处每日递送时，诱导抗原特异性免疫耐受性。观察到与所述抗原或所述微生物的单独粘膜递送相比，此种抗原经由乳酸乳球菌微生物的粘膜递送产生明显更好的抗原特异性免疫应答抑制。

我们证实本发明可以以比用单独的抗原或对照乳酸乳球菌的单一疗法高得多的功效诱导口服耐受性。抗原特异性调节T细胞的体内激活得到显著增强。特别地，麦醇溶蛋白衍生肽的粘膜递送诱导局部和全身性DQ8限制性T细胞应答的抑制，所述麦醇溶蛋白衍生肽对于由遗传修饰的乳酸乳球菌产生的DQ8介导的T细胞应答是免疫显性的。处理导致脾细胞和腹股沟淋巴结细胞的增殖能力的抗原特异性减少，这决定性地依赖于IL-10和TGF-β的产生，且与Foxp3+调节T细胞的显著诱导相关。因为这种抗原递送细菌方法具有甚至在确定的超敏性的背景中使得口服耐受性成为可能的能力，所以它可用于治疗乳糜泻和其他自身免疫和/或变应性疾病。本发明的功效在自身免疫或变应性疾病小鼠模型中，以及在治疗的免疫灭活的背景中得到证实。

发明详述

在本公开内容中，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过明确引用作为参考。这些出版物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用在此并入本公开容内，以更充分地描述本发明所属领域的技术发展水平。

一般技术

除非另有说明，本发明的实施将采用有机化学、药理学、分子生物学（包括重组技术）、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力内。此种技术在文献中得到充分说明，例如"Molecular Cloning：A Laboratory Manual"第2版（Sambrook等人，1989）；"Oligonucleotide Synthesis"（M.J.Gait，编辑，1984）；"Animal Cell Culture"（R.I.Freshney，编辑，1987）；"Methods in Enzymology"系列（Academic Press，Inc.）；"Handbook of Experimental Immunology"（D.M.Weir & C.C.Blackwell，编辑）；"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"（J.M.Miller&M.P.Calos，编辑，1987）；"Current Protocolsin Molecular Biology"（F.M.Ausubel等人，编辑，1987和期刊）；"Polymerase Chain Reaction"（Mullis等人，编辑，1994）；和"CurrentProtocols in Immunology"（J.E.Coligan等人，编辑，1991）。

定义

如本文所使用的，某些术语可以具有下述定义的含义。如说明书和权利要求中所使用的，除非上下文明确地另有说明，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数提及物。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。类似地，除非上下文明确地另有说明，“化合物”用于如本文所描述的治疗或药剂制备的用途涉及使用本发明的一种或多种化合物用于此种治疗和制备。

如本文所使用的，术语“包含”意指组合物和方法包括所述元件，但不排除其他元件。“基本上由……组成”当用于限定组合物和方法时，意欲排除对于组合具有任何基本重要性的其他元件。因此，基本上由如本文限定的元件组成的组合物将不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由……组成”意欲排除超过痕量的其他成分和用于施用本发明组合物的其他基本方法步骤。由这些过渡术语各自限定的实施方案在本发明的范围内。

发明

我们证实由微生物例如优选地乳酸乳球菌分泌的免疫显性抗原的粘膜递送诱导局部和全身性T细胞应答的抑制。处理导致脾细胞和腹股沟淋巴结细胞的增殖能力的抗原特异性减少，这决定性地依赖于IL-10和TGF-β的产生，且与Foxp3+调节T细胞的显著诱导相关。这种抗原递送细菌方法具有甚至在确定的超敏性的背景中使得口服耐受性成为可能的能力。因此它可用于治疗乳糜泻和其他自身免疫和/或变应性疾病。本发明的功效在自身免疫和变应性疾病小鼠模型中，以及在治疗的免疫灭活的背景中得到证实。

本发明的第一个方面是用于诱导对抗原的免疫耐受性的方法，其包括所述抗原经由微生物的粘膜递送。

优选地本发明涉及分泌抗原的微生物、优选地非病原性微生物、更优选地乳酸细菌或酵母、更加优选地乳酸乳球菌用于制备用于粘膜递送以治疗患者中的免疫应答相关疾病的药剂、医学食物或营养食品的用途，其中所述抗原优选持续存在于所述患者中。

优选地，所述抗原由抗原表达微生物递送。优选地所述抗原由抗原分泌或抗原展示微生物或细胞内抗原递送。因此，本发明包含了这样的实施方案，其中所述抗原展示在所述抗原表达微生物的表面上，或其中所述抗原被分泌，或所述抗原在消化后是游离的。

优选地，本发明涉及抗原表达微生物用于制备用于粘膜递送以诱导免疫耐受性的药剂的用途。

优选地，所述免疫耐受性在患者中被诱导。所述患者优选是动物。所述动物优选是哺乳动物，且优选选自小鼠、大鼠、猪、牛、绵羊、马和人。优选地，所述哺乳动物是人。优选地，所述免疫耐受性是粘膜耐受性。

粘膜

如本文所使用的，粘膜可以是任何粘膜，例如口腔粘膜、直肠粘膜、尿道粘膜、阴道粘膜、眼粘膜、颊粘膜、肺粘膜和鼻粘膜。如本申请自始至终所使用的，粘膜递送包含至粘膜的递送。口腔粘膜递送包括颊、舌下和齿龈递送途径。因此，本发明涉及其中所述粘膜递送选自直肠递送、颊递送、肺递送、眼递送、鼻递送、阴道递送和经口递送的方法。优选地，所述粘膜递送是经口递送，所述耐受性是口服耐受性。

如本申请自始至终所使用的，粘膜耐受性是动物（包括人）中对抗原的特异免疫应答性（immune responsiveness）的抑制，在所述动物已经由粘膜途径暴露于所述抗原后。优选地，所述粘膜耐受性是全身耐受性。抗原的后续暴露可以是本领域技术人员已知的每一种暴露，例如经由肠胃外注射、通过粘膜递送、或例如在自身抗原的情况下通过内源生产暴露。口服耐受性是动物（包括人）中对抗原的特异免疫应答性的抑制，在所述动物已经由经口途径暴露于所述抗原后。低剂量口服耐受性是通过低剂量抗原诱导的口服耐受性，并且特征在于由环磷酰胺敏感性调节T细胞介导的有效免疫抑制，所述调节T细胞可以将耐受性转移给首次用于实验的宿主。高剂量口服耐受性是由高剂量的抗原诱导的口服耐受性，对环磷酰胺处理不敏感，并且经由无反应性和/或抗原特异性T细胞的缺失进行至T细胞低反应性的诱导。对环磷酰胺的敏感性的差异可以用于区别低剂量和高剂量耐受性（Strobel等人，1983）。优选地，所述口服耐受性是低剂量口服耐受性，如由Mayer和Shao（2004b）描述的。

本发明因此涉及如本文所描述的方法或用途，其中相对于所述诱导之前，所述免疫耐受性的诱导是至少1.5、优选2、更优选3倍或更多。可选地，相对于所述诱导之前，耐受所述抗原至少1.5、2、3倍或更多。免疫耐受性的诱导可以通过本领域已知的方法进行测量。优选地，所述免疫耐受性的诱导可以通过所述动物中细胞因子水平的调节来测量。像这样，调节可以是细胞因子水平的增加，例如相对于所述诱导之前，所述细胞因子水平的增加是至少1.5、2、3倍或更多，例如IL-10或TGF-β。可选地，所述调节是特定细胞因子水平的减少，例如相对于所述诱导之前，所述细胞因子水平的减少是至少1.5、2、3倍或更多，例如IL-12、IL-17和IFN-γ。被调节的细胞因子可以选自任何相关细胞因子，优选地所述细胞因子选自IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ、IFN-α、MCP-1、TGF-β、RANK-L和Flt3L。

构建体、递送和整合

在本发明中，微生物在预期位点即粘膜处递送抗原。微生物表达所述抗原，这之后抗原暴露于细胞表面或被分泌。因此，在一个优选实施方案中，微生物例如乳酸乳球菌包含表达载体，所述载体能够细胞内地或分泌地表达异源抗原例如用于诱导免疫耐受性的抗原和/或使得异源抗原在于预期粘膜处（例如在胃肠道中）存在的条件下暴露在细胞表面上。微生物例如乳酸乳球菌可以包含能够细胞内地或分泌地表达异源抗原和/或使得异源抗原暴露在细胞表面上至足以诱导免疫耐受性的程度的表达载体。设想尽可能高程度表达而不损害待处理的细胞或宿主的活力。更高的表达，更少的频率和更低的剂量可能是耐受性目的所需的。无疑地给药方案将不仅依赖于抗原量，还依赖于抗原类型和组合物中其他免疫原性刺激或抑制因子的存在或不存在。

通常，表达系统将包含基因构建体，其包含编码所需抗原的至少一种核苷酸序列，优选所述序列与能够指导序列在宿主微生物中的表达的启动子可操作地连接。适当地待表达的抗原可以由核酸序列编码，所述核酸序列适合于宿主的优选密码子使用。构建体可以进一步包含在所选择的宿主中可操作的（所有）其他合适的元件，包括增强子、转录起始序列、信号序列、报道基因、转录终止序列等，如本领域技术人员已知的。构建体优选为适合于转化宿主的形式和/或为可以在宿主中稳定维持的形式，例如载体、质粒或微型染色体。可以选择或构建包含用于引入微生物例如细菌内的核酸的合适载体，适当时，其包含合适的调节序列，包括启动子序列、终止子片段、增强子序列、标记基因和其他序列。适当时，载体可以是质粒、病毒例如噬菌体或噬菌粒。关于进一步的细节，参见例如，Molecular Cloning：aLaboratory Manual：第2版，Sambrook等人，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press。用于核酸操作，例如核酸构建体的制备、诱变、测序、DNA引入细胞内和基因表达、以及用于蛋白质的分析的许多已知技术和方案在Short Protocols in Molecular Biology，第2版，Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons，1992中详细描述。Sambrook等人和Ausubel等人的公开内容通过引用并入本文。在一个优选实施方案中，生物活性多肽和抗原的编码序列包含在操纵子中，即用于多顺反子表达的核酸构建体中。在操纵子中，从启动子的转录导致包含超过一种编码序列的mRNA，所述编码序列各自具有适当地定位的核糖体结合位点上游。因此，超过一种多肽可以由单个mRNA翻译。操纵子的使用使得能够协调表达生物活性多肽和抗原。更优选地，使用食物级别构建体。

在一个实施方案中，本发明涉及稳定转染的微生物，即其中编码抗原的基因已整合到宿主的基因组内的微生物。用于建立稳定转染的微生物的技术是本领域已知的。例如，目的基因可以经由同源重组克隆到宿主的基因组内。优选地，宿主的必需基因由同源重组事件破坏，例如基因缺失、导致由必需基因编码的蛋白质的灭活形式的一个或多个氨基酸置换、或导致由必需基因编码的蛋白质的截短形式的移码突变。在一个实施方案中，必需基因是thyA基因。优选技术在WO02/090551中描述，所述专利明确以其整体并入本文。转化质粒可以是任何质粒，只要它不能补足破坏的必需基因，例如thyA基因。质粒可以是自我复制型质粒，优选携带一种或多种目的基因和一种或多种抗性标记，或者质粒是整合质粒。在后一种情况下，通过在必需基因的基因座例如thyA位点处引起整合，整合质粒其自身可以用于破坏必需基因，由此必需基因例如thyA基因的功能被破坏。优选地，必需基因例如thyA基因由盒经由双重同源重组替代，所述盒包含侧翼于靶向序列的一种或多种目的基因，所述靶向序列使插入物靶向必需基因，例如thyA靶位点。应当理解这些靶向序列足够长且足够同源，以使得目的基因能够整合到靶位点内。

编码本发明抗原的基因构建体因此可以染色体外地存在于宿主细胞内，优选其使用自身的复制起点自主复制，或者可以整合到微生物基因组DNA内，例如细菌或酵母染色体，例如乳球菌属（Lactococcus）染色体。在后一种情况下，可以整合所述核酸的单个或多个拷贝；整合可以在染色体的随机位点处发生，或如上所述在其预定位点处发生，优选在预定位点处发生，例如在一个优选的非限制性例子中，在乳球菌例如乳酸乳球菌的thyA基因座中发生。

因此，在一个实施方案中，编码本发明抗原的基因构建体可以进一步包含经设计以将所述基因构建体有效插入宿主细胞的基因组例如染色体内的序列。

在一个例子中，基因构建体插入宿主细胞的基因组例如染色体内的特定位点处可以通过同源重组得到促进。例如，本发明的基因构建体可以包含对于宿主细胞的基因组例如染色体内的所述整合位点同源的一个或多个区域。在所述基因组例如染色体位点处的序列可以是天然的，即如天然存在的，或可以是通过先前的基因工程引入的外源序列。

例如，所述一个或多个同源性区域可以是至少50bp，优选至少100bp，例如至少200bp，更优选至少300bp，例如至少400bp，更加优选至少500bp，例如至少600bp或至少700bp，更加优选至少800bp，例如至少900bp，或至少1000bp或更多。

在一个优选例子中，可以包括2个同源性区域，一个侧翼于本发明的基因构建体中存在的相关表达单位的一侧。此种配置可以使相关序列有利地插入宿主细胞内，所述相关序列例如至少编码且实现目的抗原表达的序列。执行同源重组（特别是在细菌宿主中）和选择重组体的方法是本领域一般已知的。

微生物的转化方法是本领域技术人员已知的，例如原生质体转化和电穿孔。

高程度的表达可以通过使用在微生物例如乳酸乳球菌中存在的表达载体上的同源表达和/或分泌信号来达到。合适的表达调节信号如实施例中的构建体中存在的那些是有用的。其他表达信号对于本领域技术人员将是显而易见的。表达载体可以对于表达进行优化，依赖于它掺入其中的微生物，例如乳酸乳球菌。例如，在乳球菌属、乳乳杆菌（Lactobacillus lactis）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）中给出足够表达水平的特定表达载体是已知的。此外，已开发用于在非病原性、非定殖性（non-colonising）、非侵袭性食物级别细菌乳酸乳球菌中表达异源抗原的系统是已知的（参见通过引用并入本文的英国专利GB2278358B）。根据本发明特别优选的构建体包含PCT/NL95/00135（WO-A-96/32487）中描述的多拷贝表达载体，其中已掺入编码抗原的核苷酸序列。此种构建体特别适合于在乳酸细菌特别是乳杆菌属（Lactobacillus）中以高表达水平表达所需抗原，并且也可以有利地用于将所表达产物导向细菌细胞的表面。构建体（例如PCT/NL95/00135的构建体）的特征可以在于编码抗原的核酸序列在5'非翻译核酸序列后，所述5'非翻译核酸序列包含至少核糖体识别和RNA稳定所需的最低限度序列。这可以随后为翻译起始密码子，其可以（紧）随后为乳酸细菌基因的翻译核酸序列的5'末端部分的至少5个密码子的片段，或者该片段的结构或功能等价物。该片段还可以由启动子控制。PCT/NL95/00135的内容包括其中公开的不同实施方案，以及该说明书中提及的所有其他文件，通过引用并入本文。本发明的一个方面提供了允许异源基因在宿主中高水平调节的表达以及表达与分泌偶联的方法。在一个进一步优选的实施方案中，根据WO93/17117，T7噬菌体RNA聚合酶及其相关启动子用于开发有力的表达系统，所述专利通过引用并入本文。优选地表达质粒衍生自pT1NX。

依照本发明采用的启动子优选地在细菌中组成型表达。本发明人观察到与诱导型表达比较，抗原的组成型表达导致增加的免疫耐受性。此外，组成型启动子的使用避免了提供诱导物或其他调节信号以用于表达发生的需要。优选地，启动子以在其下细菌宿主细胞保持存活（即保留某些代谢活性，即使生长未得到维持）的水平指导表达。有利地，此种表达可以处于低水平。例如，当表达产物在细胞内积累时，表达水平可以导致表达产物以小于约10％的细胞蛋白质积累，优选约或小于约5％，例如约1-3％。启动子对于所采用的细菌可以是同源的，即天然在那种细菌中发现的启动子。例如，乳球菌属启动子可以在乳球菌属中使用。用于乳酸乳球菌（或其他乳球菌属物种）中的优选启动子是衍生自乳酸乳球菌的染色体的“P1”（Waterfield，N R，Lepage，R W F，Wilson，P W,等人（1995）.The isolation of lactococcalpromoters and their use in investigating bacterial luciferasesynthesis in Lactococcus lactis.Gene165（1），9-15）。另一种优选启动子是usp45启动子。

一种或多种核酸构建体可以包含分泌信号序列。因此，在一个优选实施方案中，编码抗原的核酸可以提供所述抗原的分泌（通过使编码信号序列的核酸序列与编码抗原的核酸序列适当地偶联）。细菌容纳核酸以分泌抗原的能力可以在体外在培养条件下进行测试，所述培养条件维持生物的活力。优选的分泌信号序列包括在革兰氏阳性微生物例如芽孢杆菌属（Bacillus）、梭菌属（Clostridium）和乳杆菌属（Lactobacillus）中具有活性的那些。此种序列可以包括解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquetaciens）的α-淀粉酶分泌前导区，或由某些葡萄球菌属（Staphylococcus）菌株分泌的葡激酶的分泌前导区，其已知在革兰氏阳性和革兰氏阴性宿主中起作用（参见"GeneExpression Using Bacillus"，Rapoport（1990）Current Opinion inBiotechnology1：21-27），或来自众多其他芽孢杆菌属酶或S-层蛋白质的前导序列（参见Harwood和Cutting，"Molecular BiologicalMethods for Bacillus"的第341-344页，John Wiley & Co.1990）。优选地，所述分泌信号衍生自usp45（Van Asseldonk等人1993Mol.Gen.Genet.240：428-434）。优选地，所述抗原组成型分泌。

在可选实施方案中，生物活性多肽和抗原的编码序列是同一核酸载体或分开的载体的部分，并且独立地处于分开的启动子的调节控制下。启动子可以是相同或不同的。包含生物活性多肽的编码序列和抗原的编码序列的核酸构建体或载体由本发明的进一步方面提供，其中每种编码序列处于启动子的控制下用于在非侵袭性宿主例如乳球菌中表达，无论其是否作为操纵子。

抗原

编码抗原的序列可以得自任何天然来源和/或可以使用众所周知的DNA合成技术进行合成制备。编码抗原的序列随后可以（例如）掺入合适的表达载体内，以提供本发明的基因构建体，其随后用于转化或转染预期宿主。因此获得的重组体随后可以进行培养，这之后收获的细胞可以用于配制组合物，任选地在进一步的纯化和/或加工步骤后，例如冷冻干燥以形成粉末。

抗原可以是本领域技术人员已知的任何抗原。如本申请自始至终所使用的，抗原优选是当引入动物体内时激发免疫应答的任何物质，其中所述免疫应答可以是T细胞介导的和/或B细胞介导的应答。抗原可以包含T细胞表位和/或B细胞表位。抗原的长度无具体限制，条件是所述抗原可以在本发明的微生物中表达。抗原可以是蛋白质或其部分，例如多肽或肽。根据本发明的抗原包括线性和/或构象表位。T细胞介导的应答包括Th1、Th2和/或Th17应答。抗原可以是任何抗原，例如但不限于变应原（包括食物变应原）、同种异体抗原、自体抗原、自身抗原、和诱导免疫应答的治疗分子或抗原。优选地，所述抗原涉及与疾病相关的免疫应答的诱导。更加优选地，所述抗原涉及变应性哮喘、多发性硬化症、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类风湿性关节炎、食物过敏、乳糜泻或移植物抗宿主病的诱导。

本发明人观察到本发明的分泌的免疫显性抗原抑制全身性炎性T细胞应答，并且这些抗原对于诱导显著致耐受性效应是必需和足够的。

调节T细胞（Treg）在口服耐受性的诱导和维持中起关键作用。Treg的诱导是几种自身免疫疾病、变应性疾病和炎性疾病的免疫治疗的主要目标。抗原特异性抑制细胞的治疗诱导的目前策略面临重大障碍，并且通常要求分离、处理和转移足够数目的调节细胞的严格技术。微生物例如乳酸乳球菌——本发明的抗原递送系统避免了这些问题，且有效诱导抗原特异性Treg。在本发明中，证实Treg的诱导可以通过使粘膜免疫系统暴露于低剂量抗原来达到。暴露于低剂量抗原优选是持续暴露。因此，本发明涉及诱导和/或扩展Treg细胞，优选地CD4⁺CD25⁺、CD4⁺CD25^-和CD8⁺Treg细胞的抗原。

在本发明中进一步证实，通过根据本发明的抗原诱导和/或扩展的Treg细胞通过TGF-β和/或IL-10依赖机制起作用。先前已提供TGF-β在口服耐受性中以及在外周诱导Treg的发展中起关键作用的证据。因此，本发明提供了刺激内源TGF-β和/或IL-10表达的免疫显性抗原。

此外，显示抗原特异性TGF-β产生Th3细胞驱动抗原特异性Foxp3⁺调节细胞在外周中的分化。此外，外周CD4⁺CD25^-T细胞的TGF-β依赖性转变成CD25⁺、CD45RB^-/low抑制细胞已得到报道。显示由CTB缀合的Ag诱导的口服耐受性通过产生Foxp3⁺CD25⁺以及Foxp3⁺和Foxp3^-CD25^-CD4⁺调节T细胞与TGF-β的增加相关。这些数据暗示Foxp3⁺‘适应性’Treg在口服耐受性的诱导和维持中的关键作用。还显示显著的粘膜Foxp3诱导。此外，‘粘膜’诱导的调节T细胞趋向于抗原特异性，因为单独的乳酸乳球菌无法在GALT内诱导这种Foxp3上调。因此，本发明优选涉及Foxp3+Treg细胞。

本发明进一步证实通过根据本发明的抗原诱导和/或扩展的Treg细胞减少炎症，特别是在脾和腹股沟淋巴结细胞中。此外，IFN-γ和IL-12产生减少。因此，本发明提供了减少内源IFN-γ和/或IL-12产生、和/或刺激内源TGF-β和/或IL-10表达的免疫显性抗原。此外，本发明涉及减少脾和/或腹股沟淋巴结细胞增殖的抗原。应当理解本发明还涉及抑制炎性抗原特异性T细胞应答的抗原。

应当理解某些HLA-DQ同种型通常与某些自身免疫疾病更相关。例如，定义乳糜泻的慢性小肠炎症的特征在于对摄入的谷蛋白肽的耐受性的丧失，并且与HLA-DQ2或HLA-DQ8限制性T细胞应答强相关。HLA-DQ2或HLA-DQ8的表达是乳糜泻表达所必需的，并且在西方人口中赋予高达40％的遗传风险。在乳糜泻发病机理中的最重要方面之一是T辅助1免疫应答的激活，这在表达HLA-DQ2/DQ8分子的抗原呈递细胞将谷蛋白肽呈递给CD4+T细胞时发生。

DQ8因为其不仅与乳糜泻还与青少年糖尿病的强关联而突出。它还与牵涉RA的HLA-DR等位基因连接，且可能增加风险。HLA-DQ并非均匀地散布，并且某些群体处于增加的风险中；然而，这种风险通常依赖环境（谷蛋白消费），并且某些疾病增加的流行率可以是个体从低风险环境转移到更高风险环境的结果。

根据本发明的HLA DQ8是DQA1：DQB1单元型的血清型表示（serotypic representation）。DQ8代表单元型DQA1*0301：DQB1*0302、DQA1*0302：DQB1*0302或DQA1*0303：DQB1*0302单元型。这些单元型与已知的最常见自身免疫疾病中的某些相关。DQA1*0301：DQB1*0302是这3种单元型中最频繁的，并且表示约80％的总体DQ8。本发明因此涉及经由DQA1*0301：DQB1*0302、DQA1*0302：DQB1*0302和/或DQA1*0303：DQB1*0302单元型识别的抗原，称为“DQ8表位”。

HLA-DQ2在超过90％的具有乳糜泻的人中表达。HLA DR3-DQ2是HLA-DRB1：DQA1：DQB1单元型的血清型表示。DR3-DQ2主要表示DRB1*0301：DQA1*0501：DQB1*0201单元型。它在西半球中相对丰富。DQ2由与其他α等位基因组合的DQB1*02等位基因编码。2个最常见的DQ2β链是非常相似的。本发明因此涉及经由DQB1*0201、DQB1*0202和/或DQB1*0203单元型识别的抗原，称为“DQ2表位”。

本发明优选涉及衍生自糖蛋白的抗原。优选地所述抗原衍生自麦醇溶蛋白，优选α-麦醇溶蛋白和/或大麦醇溶蛋白。可以再分成α-、γ-和ω-麦醇溶蛋白的麦醇溶蛋白和大麦醇溶蛋白是本领域众所周知的，并且它们的序列可经由公众域文库例如NCBI容易地检索。优选地，所述α-麦醇溶蛋白衍生自小麦属（Triticum），例如小麦（T.aestivum）或圆锥小麦（T.turgidum）。

本发明证实CD4+T细胞在DQ2或DQ8背景中识别天然谷蛋白肽。

在一个实施方案中，本发明涉及DQ8表位：

QYPSGQGSFQPSQQNPQA，对应于可经由UniProtKB/TrEMBL条目Q9M4L6检索的序列的残基203-220（SEQ ID NO：4）。

所述天然的DQ8表位优选由核苷酸序列5'-caa tac cca tca ggtcaa ggt tca ttc caa cca tca caa caa aac cca caa gct-3'（SEQ IDNO：3）编码。

在一个实施方案中，本发明涉及DQ2表位：

LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF，对应于可经由UniProtKB/TrEMBL条目Q9M4L6检索的序列的残基57-89（SEQ ID NO：8）

所述DQ2表位优选由下述核苷酸序列编码：

5'-tta caa tta caa cca ttc cca caa cca caa tta cca tae cca tta cca tae cca caa cca caa tta cca taecca caa cca caa cca ttc(SEQ ID NO:7)

抗原通常通过例如内源组织转谷氨酰胺酶在肠中脱去酰胺基。脱去酰胺基的抗原比未脱去酰胺基的抗原更具有免疫活性且容易识别。内源组织转谷氨酰胺酶的存在在抗原由其他方式脱去酰胺基的情况下不重要。在一个实施方案中，本发明涉及由核苷酸序列编码的脱去酰胺基的抗原，其中表位中的谷氨酰胺残基的密码子优选由谷氨酸残基的密码子替换。

特别地，本发明涉及脱去酰胺基的DQ8表位：

QYPSGEGSFQPSQENPQA(SEQ ID NO:2)

所述脱去酰胺基的DQ8表位优选由核苷酸序列5'-caa taecca tea ggt gaa ggt tea ttc caa cca tea caa gaa aac cca caa get-3'.(SEQ ID NO:1)编码。

特别地，本发明涉及脱去酰胺基的DQ2表位

LQL QPF PQP ELP YPQ PQL PYP QPE LPY PQP QPF(SEQ ID NO:6)

所述脱去酰胺基的DQ2表位优选由下述核苷酸序列编码：

5'-tta caa tta caa cca ttc cca caa cca gaa fta cca tae cca tta cca tae cca caa cca 9aa tta cca taecca caa cca caa cca ttc(SEQ ID NO:5)

进一步证实另外的序列例如标签的存在不影响对表位序列的免疫应答。因此，在进一步的实施方案中，所述表位可以包含进一步的氨基酸，例如50个氨基酸、43、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。因此，本发明涉及包含至多50个另外的氨基酸的DQ8表位。在一个进一步的实施方案中，本发明涉及包含DQ8表位和e-标签（GAPVPYPDPLEPR（SEQID NO：31））的氨基酸序列GAPVPYPDPLEPRQYPSGEGSFQPSQENPQA（SEQID NO：16）

免疫应答

如本文所使用的，免疫应答相关疾病是由机体针对抗原的不希望有的免疫应答引起的疾病，由此所述抗原可以是异源抗原或自身抗原。免疫应答相关疾病包括但不限于变态反应（包括食物过敏）、乳糜泻、变应性哮喘、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类风湿性关节炎、I型糖尿病和多发性硬化症。免疫应答相关疾病还包括不希望有的免疫反应，例如移植物抗宿主病或药物的免疫激活，例如针对非内源因子VIII的抗体产生。优选地，所述疾病选自变应性哮喘、食物过敏、乳糜泻、I型糖尿病和治疗的免疫失活。因此应当理解免疫应答相关疾病包括但不限于变态反应（包括食物过敏）、乳糜泻、变应性哮喘、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类风湿性关节炎、I型糖尿病和多发性硬化症。免疫应答相关疾病还包括不希望有的免疫反应，例如移植物抗宿主病或药物的免疫激活，例如针对非内源因子VIII的抗体产生。优选地，所述疾病选自变应性哮喘、食物过敏、乳糜泻、移植物抗宿主病、I型糖尿病和治疗的免疫失活。

根据本发明，术语“免疫显性”涉及诱导免疫应答的基本抗原。

考虑到上文，因此应当理解本发明涉及如本文所描述的方法或用途，其中所述方法或用途是治疗和/或预防的。

本发明的进一步方面涉及用于诱导对抗原的免疫耐受性的方法，其包括所述抗原通过微生物的粘膜递送与免疫调节化合物产生微生物的粘膜递送组合。免疫调节化合物和抗原可以通过相同微生物递送，或它可以是不同微生物。

药剂和施用

化合物意指生物化合物或复合物的任何化学制品，包括简单或复杂的有机和无机分子、肽、拟肽（peptido-mimetics）、蛋白质、蛋白质复合物、抗体、碳水化合物、核酸或其衍生物。免疫调节化合物是修饰免疫系统的功能的化合物。如本文所使用的，免疫调节化合物是耐受性诱导化合物；作为非限制性例子，耐受性诱导可以通过诱导调节T细胞例如Treg、Tr1或Th3、或通过使Th1/Th2平衡朝向Th1或Th2转变、或通过抑制Th17，以直接方式获得，或通过激活未成熟的树突状细胞以耐受树突状细胞和/或抑制诱导Th2免疫应答的成熟树突状细胞上的“共刺激”因子表达，以间接方式获得。免疫调节和免疫抑制化合物是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于细菌代谢产物例如精胍菌素，真菌和链霉菌属代谢产物例如他克莫司、雷帕霉素或环孢素，免疫抑制细胞因子例如IL-4、IL-10、IFNα、TGFβ（作为调节T细胞的选择性佐剂）Flt3L、TSLP、CTB和Rank-L（作为选择性致耐受性DC诱导物抗体和/或拮抗剂例如抗-CD40L、抗-CD25、抗-CD20、抗-IgE、抗-CD3、抗-IL-6（或IL6R）和蛋白质、肽或融合蛋白，例如CTL-4Ig或CTLA-4激动剂融合蛋白。

因此，免疫调节化合物可以是本领域技术人员已知的任何免疫调节化合物。优选地，所述免疫调节化合物是免疫抑制化合物，更加优选地所述化合物是免疫抑制细胞因子或抗体。优选地，所述免疫抑制细胞因子是耐受性增强细胞因子或抗体。免疫抑制细胞因子是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于IL-4、IL-10、IFN-α和TGF-β（作为调节T细胞的选择性佐剂），和Flt3L、TSLP、CTB和Rank-L（作为选择性致耐受性DC诱导物）。优选地，所述免疫抑制细胞因子选自IL-4、IL-10、IFNα和Flt3L。本领域技术人员应当理解，本发明还涉及其功能相应物（homologue）。功能相应物意指至少对于预期目的具有基本上相同或相似的功能，但在结构上可以不同的分子。最优选地，所述免疫抑制耐受性增强细胞因子是IL-10，或其功能相应物。优选地，所述免疫抑制抗体选自抗-IL-2、抗-IL12、抗-IL6、抗-IFN-γ。

如本文所使用的，递送意指本领域技术人员已知的任何递送方法，并且包括但不限于待递送化合物的包被或非包被药物制剂，包含或携带待递送化合物或微生物的胶囊、脂质体、油体、聚合物颗粒，所述微生物分泌、展示或积聚待递送化合物，任选地在可增强粘膜递送和/或粘膜摄取的化合物的存在下。

本文描述的化合物或组合物可以以纯的形式，与其他活性成分组合，或与药学上可接受的无毒赋形剂或载体组合施用。口服组合物将一般包括惰性稀释剂载体或可食用载体。可以包括药学上相容的结合剂、和/或佐剂材料作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、糖锭、灌肠剂等可以包含任何下述成分，或具有相似性质的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，分散剂例如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁；助流剂例如二氧化硅胶体；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷油、水杨酸甲酯或橙调味剂。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的材料外，它还可以包含液体载体例如脂肪油。此外，剂量单位形式可以包含改变剂量单位的物理形式的各种其他材料，例如糖包衣、虫胶或肠内试剂。此外，除活性化合物外，糖浆可以包含蔗糖作为甜味剂和某些防腐剂、染料、着色剂和调味剂。应当理解药学上可接受的载体的形式和特征由它将与之组合的活性成分的量、施用途径和其他众所周知的变量指示。一种或多种载体从与制剂的其他成分相容且对其接受者无害的意义上说必须是“可接受的”。

用于施用的可选制剂包括无菌水性和非水性溶液、悬浮液和乳状液。非水性溶剂的例子是二甲基亚砜、醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括醇和水的混合物、缓冲介质和盐水。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏右旋糖的那些等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。各种液体制剂可用于这些递送方法，包括盐水、醇、DMSO和基于水的溶液。

优选地所述抗原和/或所述免疫抑制细胞因子在小鼠实验背景中以低量优选0.1μg或更低/剂量施用的细菌表达，此种量将在人疾病背景中转变。

如本文所使用的，术语“治疗”等包括发展的精神疾病或病状的改善或消除（一旦它已建立），或此种疾病或病状的特征性症状的减轻。如本文所使用的，依赖患者的状况，这些术语还包括预防疾病或病状或者与疾病或病状相关的症状的发作，包括在被所述疾病或病状折磨前减少疾病或病状或与之相关的症状的严重度。此种在折磨前的预防或减少指给患者施用本发明的化合物或组合物，所述患者在施用时未被该疾病或病状折磨。“预防”还包括预防疾病或病状或与之相关的症状的再发生或复发，例如在改善时期后。显而易见的是精神病状可能负责身体疾病。在这方面，术语“治疗”还包括身体疾病或病状的预防或者发展的身体疾病或病状的改善或消除（一旦它已建立），或此种病状的特征性症状的减轻。

如本文所使用的，术语“药剂”还包括术语“药物”、“治疗剂”、“饮剂”或其他术语，其在医学领域中用于指示具有治疗或预防效应的制剂。

应当理解本发明的化合物即抗原以治疗有效量递送或表达。如本文所使用的，术语“治疗有效量”意指本发明的化合物或组合物的量，当根据所需治疗方案施用时，其将引起所需治疗或预防效应或应答。观察到当免疫显性抗原持续存在时，炎性抗原特异性细胞应答甚至进一步减少。与像这样施用抗原、像这样施用微生物或抗原的不持续存在比较，这种减少明显更大。根据本发明术语“持续存在”指根据本发明的抗原在预期粘膜位点例如炎症位点处的持续或不间断存在。抗原的存在可以通过本领域众所周知的技术进行测量，例如PCR、ELISA或免疫沉淀技术，例如实施例部分和上文中详细描述的。此外，乳酸乳球菌的存在可以是抗原的存在的测量。此外，由抗原引起的效应可以是抗原的存在的测量，例如内源TGF-β或IL-10水平的存在或增加，或IFN-γ或IL-12水平的减少，或Treg细胞的存在，例如本文描述的，或脾细胞和引流淋巴结细胞的增殖能力的减少。因此应当理解抗原的水平可以改变，而抗原仍视为持续存在。

优选地化合物或组合物以单位剂型例如片剂、胶囊、灌肠剂或定量气雾剂（metered aerosol dose）提供，从而使得单个剂量施用于受试者例如患者。

活性成分可以每天施用1-6次，足以显示所需活性。这些日剂量可以作为单个剂量每天给予1次，或可以作为2个或更多更小的剂量在每天的相同或不同时间给予，其总共给出指定日剂量。优选地，活性成分每天施用1次或2次。例如，一个剂量可在早晨服用和一个在白天稍后服用。

在本发明的所有方面，日维持剂量可以在患者中给予临床所需时期，例如1天直至数年（例如，对于哺乳动物的整个其余生命）；例如约（2或3或5天、1或2周、或1个月）以上和/或例如直至约（5年、1年、6个月、1个月、1周、或3或5天）。日维持剂量一般施用约3-约5天或约1周-约1年。液体制剂的其他组成成分可以包括防腐剂、无机盐、酸、碱、缓冲剂、营养物、维生素、或其他药物。

递送抗原的微生物可以以至少10⁴菌落形成单位（cfu）-10¹²cfu/天，优选10⁶cfu-10¹²cfu/天，最优选10⁹cfu-10¹²cfu/天的剂量递送。依照如Steidler等人（Science2000）中所述的方法，例如10⁹cfu的抗原和可能地免疫调节化合物分泌为至少1ng-100ng。通过本领域技术人员已知的ELISA，本领域技术人员可以计算与cfu的任何其他剂量相关的抗原的分泌范围。

抗原可以以诱导低剂量应答的剂量递送。优选地，所述抗原以至少10fg-500μg/天、优选1pg-250μg/天、更优选100pg-200μg/天、或优选1ng-150μg、或更优选10ng-125μg/天、更加优选100ng-100μg/天、更加优选1μg-90μg/天、和最优选10μg-75μg/天，例如25μg、30μg、40μg、50μg、60μg或70μg/天的剂量递送。

优选地化合物或组合物以单位剂型例如片剂、溶液、胶囊或定量气雾剂提供，从而使得单个剂量施用于受试者例如患者。

依赖于施用方式，例如经口施用、或上文描述的那些中的任何一种，技术人员了解如何限定或计算待施用于患者的实际剂量。本领域技术人员对于依赖患者、微生物、载体等等调整剂量将是在行的。

本发明的化合物也可以采用药理学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或代谢产物的形式。药理学上可接受的盐包括无机和有机酸的碱性盐，所述酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、苹果酸、乙酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、琥珀酸、马来酸、水杨酸、苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸等。当本发明的化合物包括酸性官能团例如羧基时，用于羧基的合适的药学上可接受的阳离子对是本领域技术人员众所周知的，并且包括碱、碱土、铵、季铵阳离子等。

微生物

根据本发明的微生物可以是适合于粘膜递送的任何微生物，包括细菌、酵母或真菌。优选地，所述微生物是非病原性微生物、更加优选地，所述微生物是益生微生物。益生生物是本领域技术人员已知的。益生生物包括但不限于，细菌例如乳杆菌属物种、乳球菌属物种和酵母例如酿酒酵母布拉酵母菌亚种（Saccharomyces cerevisiaesubspecies boulardii）。优选地，所述细菌是乳酸细菌；更加优选地，所述乳酸细菌选自乳杆菌属、明串珠菌属（Leuconostoc）、片球菌属（Pediococcus）、乳球菌属、链球菌属（Streptococcus）、气球菌属（Aerococcus）、肉杆菌属（Carnobacterium）、肠球菌属（Enterococcus）、酒球菌属（Oenococcus）、四联球菌属（Teragenococcus）、漫游球菌属（Vagococcus）和魏斯氏菌属（Weisella）。在一个进一步优选的实施方案中，所述微生物是乳酸乳球菌。在另一个优选实施方案中，所述乳酸细菌是乳杆菌属物种。在另一个优选实施方案中，所述微生物是酿酒酵母，更加优选地，所述酵母是酿酒酵母布拉酵母菌亚种。

最优选地，所述益生微生物是乳酸细菌，因为异种蛋白质（即非乳酸细菌蛋白质）通过乳酸细菌递送到粘膜内，包括经口和阴道递送，已得到描述（Steidler和Rottiers，2006；Liu等人，2006），这使得这些乳酸细菌非常适合于递送所述抗原和可能地所述免疫抑制化合物。乳酸乳球菌是非病原性、非侵袭性、非定殖性革兰氏阳性菌。产生各种遗传修饰的乳酸乳球菌菌株，用于免疫调节蛋白质的局部合成和递送给肠粘膜。此外，建立生物学包容系统（containment system），其使得遗传改造的乳酸乳球菌的临床应用成为可行的策略。

在一个优选实施方案中，所述微生物是乳酸乳球菌thyA突变体。特别优选的实施方案使用乳酸乳球菌thyA突变体，其中编码抗原的基因已用于破坏thyA基因。

营养食品和医学食物

应当理解本发明的化合物和组合物可以用作营养食品、功能或医学食物，或用作所述营养食品、功能或医学食物中的添加剂。另一个实施方案提供了优选适合于人消费的食物或饮料，其由营养食品和调味剂组成，其中营养食品由来自农产品的提取物组成。

无论是液体提取物还是干组合物形式，营养食品都是可食用的，并且可以直接由人食用，但优选以添加剂或营养补充剂的形式提供给人，例如以在保健食物店中出售的片剂种类形式，或作为可食用固体，优选地加工食品，例如谷类食物、面包、豆腐、饼干、冰激淋、蛋糕、马铃薯片、椒盐卷饼、干酪等中的成分提供，以及在可饮用液体，例如饮料，例如乳、苏打、体育饮料和果汁中提供。因此，在一个实施方案中，通过使食物或饮料与营养食品以有效增强食物或饮料的营养价值的量混合，提供了用于增强食物或饮料的营养价值的方法。

另一个实施方案提供了用于增强食物或饮料的营养价值的方法，其包括使食物或饮料与营养食品混合，以产生营养上增强的食物或饮料，其中营养食品以有效增强食物或饮料的营养价值的量混合，其中营养食品由来自包含本发明抗原的农作物的提取物组成，并且其中营养上增强的食物或饮料可以进一步包含调味剂。优选的调味剂包括甜味剂，例如糖、玉米糖浆、果糖、右旋糖、maltodextrose、环己烷氨基磺酸盐、糖精、苯丙氨酸、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇，和草本甜味剂例如甜叶菊（stevia）。

本文描述的营养食品预期用于人消费，并且因此用于获得它们的过程优选依照药品生产和质量管理规范（Good ManufacturingPractices）（GMP）和管理此种过程的任何可应用的政府条例进行。特别优选的过程仅利用天然衍生的溶剂。本文描述的营养食品优选包含相对高水平的健康增强物质。营养食品可以彼此混合，以增加其健康增强效应。

与营养食品形成对比，所谓的“医学食物”不意欲由普通民众使用，并且在商店或超市无法获得。医学食物并非在健康饮食内包括以减少疾病的风险的那些食物，例如减脂食物或低钠食物，它们也不是重量减轻产品。当患者具有特定营养需求时，医生开出医学食物处方，以便管理疾病或健康状况，并且患者处于医生的护理下。标签必须清楚阐述该产品预期用于管理特定医学病症或病状。医学食物的例子是设计用于向具有慢性炎症病状的患者提供靶向营养支持的营养上不同的医学食物。这种产品的活性化合物例如是本文描述的一种或多种化合物。功能食物可以包括在健康饮食内包含以减少疾病的风险的那些食物，例如减脂食物或低钠食物，或重量减轻产品。因此，本发明涉及包含根据本发明的营养食品的食物或饮料。

本领域技术人员应当理解可以对本发明的优选实施方案进行众多改变和修饰，并且可以进行此种改变和修饰而不背离本发明的精神。因此，预期附加权利要求包含在本发明的真实精神和范围内的所有此种等价变化。

此外，在本发明化合物的描述中使用的所有术语具有其在本领域中众所周知的含义。

附图简述

图1：LL-OVA的经口饲喂显著减少DTH应答。Balb/c小鼠在第0天时通过皮下注射OVA/CFA进行致敏，并且在第21天时接受OVA/IFA的加强免疫。在第7-11、14-18、21-25和28-31天时，小鼠用BM9、LLpTREX1、LL-OVA和1μg OVA进行经口处理。在第31天时，小鼠用在10μl盐水中的10μg Ova在耳的耳廓中进行攻击。DTH应答表示为攻击后24小时时2只耳在OVA攻击前和后的耳厚度的差异。

图2：LL-OVA的经口饲喂显著减少大量脾细胞的OVA特异性增殖（A）以及IFN-γ（B）、IL-6（C）和IL-10（D）产生。Balb/c小鼠在第0天时通过皮下注射OVA/CFA进行致敏，并且在第21天时接受OVA/IFA的加强免疫。在第21-25和28-31天时，小鼠用BM9、LLpTREX1和LL-OVA进行经口处理。在第31天时，分离大量脾细胞且在用100μg/ml OVA离体刺激72小时后就OVA特异性增殖进行测试，其表示为在不同OVA浓度时的平均cpm±SEM，并且就IFN-γ、IL-6和IL-10产生进行测试。

图3：LL-OVA的经口饲喂显著减少CD4+脾T细胞的OVA特异性增殖。Balb/c小鼠在第0天时通过皮下注射OVA/CFA进行致敏，并且在第21天时接受OVA/IFA的加强免疫。在第21-25和28-31天时，小鼠用BM9（A）、LLpTREX1（B）和LL-OVA（C）进行经口处理。在第31天时，分离大量脾细胞，并且在用100μg/ml OVA离体再刺激90小时后，通过CFSE和CD4-APC标记以及流式细胞术分析评估CD4+脾T细胞的OVA特异性增殖。

图4：LL-OVA处理的小鼠的CD4+T细胞将耐受性转移给首次用于实验的接受者。Balb/c小鼠在第0天时通过皮下注射OVA/CFA进行致敏，并且在第21天时接受OVA/IFA的加强免疫。在第21-25和28-31天时，小鼠用BM9、LLpTREX1和LL-OVA进行经口处理。在第31天时，分离CD4+脾T细胞且就耐受性转移能力进行测试。耐受性通过CD4+脾T细胞从LL-OVA和LL-pTREX处理的小鼠转移至首次用于实验的接受者通过对后者进行致敏和攻击就DTH应答进行评估，所述DTH应答表示为攻击后24小时时2只耳在OVA攻击前和后的耳厚度的差异。

图5：NOD AB° DQ8转基因小鼠在第1天时通过皮下注射在CFA中的100μg eDQ8d进行免疫。小鼠在第1-10天时用LL-eDQ8d或LL-pT1NX进行经口处理。对照小鼠接受BM9。在第10天时，小鼠用在10μl盐水中的10μg eDQ8d在耳的耳廓中进行攻击。DTH应答表示为注射后24小时时平均值的增加（减去eDQ8d攻击前的耳厚度后）。结果概括了包括6只小鼠/组的3次独立实验的数据。

图6：在DTH测量后，分离BM9（对照）、LL-pT1NX和LL-eDQ8d组的脾（A）和腹股沟淋巴结（B），并且用50μg eDQ8d肽离体进行再刺激。大量脾细胞（p=0.048）和腹股沟淋巴结细胞（p=0.0022）的eDQ8d特异性增殖应答表示为平均cpm。

图7：脾（A）和腹股沟淋巴结细胞（B）的上清液中的细胞因子测量在再刺激后24小时时进行。结果是代表至少2次单独实验的以pg/ml表示的细胞因子分泌平均值。

图8：减少的脾eDQ8d特异性增殖依赖于IL-10和TGF-β。

实施例

实施例A：通过用遗传修饰的乳酸乳球菌将OVA递送给OVA致敏 的野生型小鼠诱导OVA特异耐受性

前言

为了这个目的，遗传改造分泌OVA的LL（LL-OVA），并且在自身免疫/过敏的治疗模型，即OVA免疫模型中评估全身耐受性的诱导。

材料与方法

细菌和培养基：乳酸乳球菌MG1363（LL）菌株进行遗传修饰，并且在本研究自始至终使用。细菌在GM17E培养基中进行培养，所述GM17E培养基由补充有0.5％葡萄糖和5μg/ml红霉素（Abbott）的M17肉汤（Difco Laboratories，Detroit，MI）组成。LL菌株的贮备悬浮液于-20℃贮存于在GM17E培养基中的50％甘油中。贮备悬浮液在GM17E培养基中稀释500倍，并且于30℃温育过夜。在16小时内，它们达到2x10⁹菌落形成单位（CFU）/ml的饱和密度。细菌通过离心进行收获，并且以2x10¹⁰细菌/ml重悬浮于BM9培养基中。每只小鼠通过胃内导管每天接受100μl这种悬浮液。

质粒：编码原鸡（Gallus gallus）卵白蛋白的mRNA序列从Genbank（登记号AY223553）和公开数据中检索。从鸡子宫中分离总RNA，并且在25μl体积中使用2μg总RNA、2μM寡核苷酸dT引物（PromegaCorporation Benelux，Leiden，The Netherlands）、0.01mM DTT（Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，The Netherlands）、0.5mM dNTP（Invitrogen，Merelbeke，Belgium）、20U Rnasin（PromegaIncorporation Benelux）和100U superscript II逆转录酶（Invitrogen）合成cDNA。通过聚合酶链式反应（PCR）扩增OVA cDNA片段，使用下述引物：正向5’-GGCTCCATCGGTGCAGCAAGCATGGAATT-3’（SEQ ID NO：9）和反向5’-ACTAGTTAAGGGGAAACACATCTGCCAAAGAAGAGAA-3’（SEQ ID NO：10）。反应条件是94℃2分钟，随后为94℃45秒、62℃30秒和72℃90秒的30个循环。使扩增片段与乳球菌属P1启动子17下游的红霉素抗性pT1NX载体的Usp45分泌信号融合。用携带OVA cDNA的质粒转化的MG1363菌株命名为分泌OVA的乳酸乳球菌（LL-OVA）。其为包含空载体pTREX1的MG1363的乳酸乳球菌-pTREX1充当对照（LL-pTREX）。

小鼠：7周大的雌性Balb/c小鼠得自Charles RiverLaboratories（Calco，Italy），并且在常规动物实验室中在特定无病原体条件下进行饲养。动物研究由Ghent University的EthicsCommittee of the Department for Molecular Biomedical Research批准（档案号07/029）。

抗原：完整的无LPS的OVA V级别蛋白质在所有实验中用作抗原（Sigma Aldrich）。

小鼠的免疫和口服耐受性的诱导：Balb/c小鼠在第一天时通过在尾的基部处皮下注射在100μl CFA（Difco，BD Bioscience，Erembodegem，Belgium）和盐水溶液的1：1混合物中的100μg OVA进行免疫。在第7-11、14-18、21-25和28-31天时（方案1），以及在第21-25和28-31天时（方案2），每天施用溶解于100μl BM9中的LL-OVA、LL-pTREX1或1μg纯化的OVA。对照小鼠仅接受BM9。抗原或细菌悬浮液使用18号（18-gauge）不锈钢动物饲喂针导入胃内。在第21天时，通过皮下注射在100μl IFA（Sigma-Aldrich）的1：1混合物中的100μg OVA给予加强免疫。通过DTH应答、细胞因子和OVA特异性增殖的测量、以及过继转移实验来评估耐受性诱导。

迟发型超敏反应：抗原特异性DTH应答通过在第31天时注射OVA进行评估。24小时后执行DTH测量。对于抗原特异性DTH应答的测量，小鼠用在10μl盐水中的10μg OVA在耳的耳廓中进行攻击。定义为由于攻击引起的耳厚度增加的耳肿胀，在攻击后24小时时使用数字测微计（Conrad，Belgium）以不知情方式进行测量。DTH应答表示为2只耳在OVA攻击前和后的耳厚度的差异。

OVA特异性增殖和细胞因子测定：在第39天时，收获脾，并且就OVA特异性增殖和细胞因子产生评估脾细胞。通过使细胞通过70-μm细胞过滤器（Becton/Dickinson Labware）制备脾的单细胞悬浮液。通过与红细胞裂解缓冲液一起温育裂解细胞悬浮液中的红细胞。使用CD4+T细胞分离试剂盒和midiMACS柱（Miltenyi Biotec，Germany）富集CD4+T细胞。

为了测定总脾细胞群体的增殖，在96孔U形底平板中在单独或具有以1.2-100μg/ml浓度加入的OVA的总体积200μl的完全培养基[即包含10％胎牛血清（FCS）、10U/ml青霉素、10μg/ml链霉素、2mML-glutamax、0,4mM丙酮酸钠的RPMI-1640]中培养2x10⁵细胞。增殖通过5,6-CFSE标记（Invitrogen，Merelbeke，Belgium）进行进一步评估。脾细胞以10⁷/ml重悬浮于PBS中，并且以10μM CFSE的终浓度于37℃温育12分钟。在96孔U形底平板中在具有100μg/mlOVA的总体积200μl的完全培养基中以2x10⁵细胞培养之前，标记的细胞用冰冷的完全培养基洗涤2次。在37℃和5％CO₂下在加湿培养箱中培养90小时后，收获细胞并且用别藻蓝蛋白标记的抗-CD4（BD，Biosciences）对细胞染色，并且使用流式细胞术（FACSCanto，BDBiosciences）测定增殖。

为了测定CD4+T细胞的增殖，在96孔U形底平板中在总体积200μl的完全培养基中，以1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03和1/0的比例培养2x10⁵个CD4+T细胞与充当抗原呈递细胞的丝裂霉素C处理的OVA装载的脾细胞。细胞在37℃和5％CO₂下在加湿培养箱中培养90小时。对于增殖测定，加入1μCi/孔[3H]-胸苷进行最后18小时的培养，在玻璃纤维滤器垫（Perkin Elmer，Boston，USA）上收获DNA，并且在闪烁计数器（Perkin Elmer）上测量DNA结合的放射性活性。对于细胞因子测量，在培养72小时后收集在不同增殖测定中使用的细胞培养上清液，且于-20℃进行冷冻。细胞因子产生使用Mouse Flex SetCytometric Bead Array（BD Biosciences，Mountain View，CA，USA）进行定量。

过继转移实验：在第39天时，从处理组中收集脾。通过切碎脾且使它们通过70-μm细胞过滤器（Becton/Dickinson Labware）而获得单细胞悬浮液。如上所述，细胞悬浮液就CD4+T细胞进行富集。CD4+富集细胞通过静脉内注射1x10⁶CD4+T细胞而过继转移给首次用于实验的BALB/c受体小鼠。过继转移后1天，所有小鼠通过在尾基部处皮下注射100μg OVA/25μl盐水/25μl IFA（Sigma-Aldrich）进行致敏，并且其后5天，小鼠根据上文描述的DTH方案进行攻击。

统计分析：在耳厚度和细胞因子测量中组间差异的显著性使用单因素ANOVA进行检验。统计显著性标示为*（p<0.05）或**（p<0.01）。

结果

与游离OVA比较，LL-OVA在OVA免疫模型中显著增强耐受性诱导 能力。

为了研究口服耐受性的诱导，小鼠如上所述进行经口饲喂。与致敏的对照小鼠（BM9组）以及用LL-pTREX1或1μg纯化的OVA处理的小鼠比较，给OVA致敏的BALB/c小鼠施用LL-OVA导致DTH应答的显著减少（图1）。

这些数据伴随与BM9组或LL-pTREX1处理组比较，LL-OVA处理的小鼠的大量脾细胞显著减少的增殖能力以及IFN-γ、IL-10和IL-6产生（图2）。

LL-OVA经由CD4+T细胞增强口服耐受性。

为了评估CD4T细胞是否介导口服耐受性的诱导，研究脾细胞中的OVA特异性增殖的CD4T细胞应答。流式细胞术证实与BM9和LL-pTREX1组中的4.5％和11.6％比较，在LL-OVA组中在OVA再刺激后仅0.8％的CD4+脾T细胞增殖（图3）。此外，从LL-OVA处理组到首次用于实验的BALB/c小鼠的过继转移CD4+脾T细胞证实这些细胞可以转移耐受性，因为这些细胞在用OVA免疫且攻击受体小鼠后能够减少DTH应答（图4）。

结论

此处，证实OVA分泌乳酸乳球菌的胃内施用经由诱导CD4+调节而抑制OVA特异性T细胞应答。证实这种免疫耐受性诱导比游离OVA蛋白质更有效，并且这可以在治疗背景中建立。

实施例B：通过用遗传修饰的乳酸乳球菌将DQ8特异性免疫显性 麦醇溶蛋白表位递送给谷蛋白致敏的II类转基因小鼠诱导抗原特异 性口服耐受性。

前言

也称为口炎性腹泻或谷蛋白敏感性肠病的乳糜泻是慢性炎性疾病，其由针对包含谷蛋白的特别饮食谷物的免疫应答发展。乳糜泻是与基因强相关的复杂多基因病症，所述基因编码人白细胞抗原变体HLA-DQ2或HLA-DQ8。在乳糜泻发病机理中的最重要方面之一是T辅助1免疫应答的激活。这在表达HLA-DQ2/DQ8分子的抗原呈递细胞将毒性谷蛋白肽呈递给CD4+T细胞时发生。2类谷蛋白，麦醇溶蛋白和麦谷蛋白包含结合DQ2和DQ8的肽。一般公认免疫应答例如来自谷蛋白特异性T细胞的IFN-γ产生触发乳糜泻患者的小肠中的粘膜破坏。因此，有害的免疫T细胞应答在乳糜泻患者的肠中的激活看起来在该疾病的起始和进展中是关键的。

抗原特异性免疫抑制是治疗乳糜泻的有吸引力的治疗目标。重组谷蛋白蛋白质/肽通过遗传修饰的乳酸乳球菌（LL）在肠粘膜处的有效递送提供了用于诱导耐受性的新治疗方法。为了这个目的，遗传改造分泌脱去酰胺基的DQ8表位的LL（LL-eDQ8d），并且在经口补充后在谷蛋白致敏的NOD AB° DQ8II类转基因小鼠中评估局部和全身免疫应答。

此处，证实产生麦醇溶蛋白肽的乳酸乳球菌的经口递送经由诱导抗原特异性CD4⁺调节T细胞而抑制麦醇溶蛋白特异性免疫应答。

材料与方法

细菌和培养基：乳酸乳球菌MG1363（LL）菌株进行遗传修饰，并且在本研究自始至终使用。细菌在GM17E培养基中进行培养，所述GM17E培养基是补充有0.5％葡萄糖和5μg/ml红霉素（Abbott）的M17肉汤（Difco Laboratories，Detroit，MI）。LL菌株的贮备悬浮液于-20℃贮存于在GM17E培养基中的50％甘油中。贮备悬浮液在GM17E培养基中稀释200倍，并且于30℃温育过夜。在培养16小时内，达到2x10⁹菌落形成单位（CFU）/ml的饱和密度。细菌通过离心进行收获，并且以2x10⁹细菌/100μl在BM9接种缓冲液中进行10倍浓缩。对于处理，每只小鼠通过胃内导管每天接受100μl这种悬浮液。

质粒：编码脱去酰胺基的DQ8表位的序列（编码DQ8d：caa tac ccatca ggt gaa ggt tca ttc caa cca tca caa gaa aac cca caa gct（SEQ ID NO：1））从公开数据中检索。总之，将α-麦醇溶蛋白肽内的2个谷氨酰胺残基改变成谷氨酸，以对携带DQ8的乳糜泻患者刺激脱去酰胺基的免疫显性α-麦醇溶蛋白应答，并且这个表位由这些小鼠的T细胞识别。DQ8d cDNA片段通过合成构建（Operon，TheNetherlands），并且通过聚合酶链式反应（PCR）进行扩增，使用下述正向和反向引物：5’-caatacccatcaggtgaaggttc-3’（SEQ ID NO：11）和5’-cgactagttaagcttgtgggttttcttgtgat-3’（SEQ ID NO：12）。为了检测目的，使e-标签（e）与由下述序列ggt gct cca gttcca tac cca gat cca ctt gaa cca cgt（SEQ ID NO：13）组成的片段附着。为了给DQ8d基因的5'末端添加e-标签，在步骤1中产生的PCR产物（DQ8d）在另一PCR中用作模板，使用寡核苷酸5’-ggtgctccagttccatacccagatccacttgaaccacgtcaatacccatca-3’（SEQID NO：14）和5’-cgactagttaagcttgtgggttttcttgtgat-3’（SEQ IDNO：15）。使扩增片段与乳球菌属P1启动子下游的红霉素抗性pT1NX载体的Usp45分泌信号融合。用携带eDQ8d cDNA的质粒转化的MG1363菌株命名为分泌eDQ8d的乳酸乳球菌（LL-eDQ8d）。其为包含空载体pT1NX的MG1363的LL-pT1NX充当对照。

功能分析分泌的表位：对于分泌的eDQ8d表位的功能分析，执行用衍生自乳糜泻（CD）患者的肠的人T细胞克隆的增殖测定。细菌如上所述过夜生长，1：50稀释，且分别生长另外4或6小时。对于谷蛋白特异的T细胞克隆由得自患者S的小肠活组织检查产生，患者S是已进行不含谷蛋白饮食数年的成年荷兰人CD患者。患者给出关于该研究的知情同意书，这得到医院伦理委员会批准。该患者血清学分型为HLA-DR3/4，DQ2/8，因此携带2种CD相关DQ二聚体。发现当与HLA-DQ8结合时，T细胞克隆II29响应具有最少9氨基酸核心QGSFQPSQQ的α-麦醇溶蛋白衍生肽。发现P1和/或P9谷氨酰胺残基（Q）通过组织转谷氨酰胺酶的活性脱去酰胺基成为谷氨酸（E），显著增强这种谷蛋白肽的T细胞刺激能力。增殖测定在150μl培养基（Iscoves）中在96孔平底平板（Falcon）中一式两份或一式三份地进行，使用在几个浓度的上清液不存在或存在的情况下用10⁵HLA-DQ-匹配的和3000RAD辐射的外周血单核细胞刺激的10⁴T细胞。48小时后，培养物用0.5uCi的³H-胸苷进行脉冲，其后18小时时收获培养物，这之后测定³H-胸苷掺入作为增殖的量度。

小鼠：在内源MHC II-缺陷背景中表达HLA-DQ8的转基因小鼠（AB°DQ8⁺）与NOD小鼠回交10代，并且互交以产生同基因型NOD AB°DQ8⁺小鼠。7-16周大的小鼠用于实验。小鼠进行断奶且维持在常规动物实验室，直至8-12周大。

抗原和抗体：合成含(GAPVPYPDPLEPRQYPSGEGSFQPSQENPQA(SEQ ID NO：16))和不含（QYPSGEGSFQPSQENPQA（SEQ ID NO：2））e-标签的脱去酰胺基的DQ8表位。对于T细胞表型分型，分别地，从BD-Biosciences（San Jose，CA）购买CD4和CD25抗体，并且从eBiosciences（San Diego，USA）购买APC抗-Foxp3染色试剂盒。抗-IL-10中和单克隆抗体（1μg/ml，克隆JES052A5），TGF-β中和单克隆抗体（1μg/ml，克隆1D11）和LAP中和抗体（1μg/ml，克隆27235）得自R&D systems（Minneapolis，MN）。

经口饲喂和DTH（迟发型超敏）反应：以不含谷蛋白食物为生的NOD AB° DQ8小鼠在第一天时通过在尾基部中皮下注射在100μl1：1CFA（购自Difco of Becton，Dickinson and Company，San Jose，CA）盐水溶液中的100μg脱去酰胺基的eDQ8肽进行致敏。用于致敏作用的肽具有与分泌的表位相同的序列。对小鼠饲喂作为阴性对照的BM9、LL-pT1NX或LL-eDQ8d[全部在第1-10天时溶解于100μl BM9中]。通过使用18号不锈钢管饲针胃内施用抗原或细菌悬浮液进行饲喂。免疫后10天，评估抗原特异性DTH应答。其后24小时时执行DTH测量。对于抗原特异性DTH应答的测量，小鼠用在10μl盐水中的10μg eDQ8d在耳的耳廓中进行攻击。在攻击后24小时时使用工程师的测微计（Mitutoyo，Tokyo，Japan）以不知情方式测量耳厚度的增加。DTH应答表示为在eDQ8d注射后24小时时增加的差异（减去攻击前的耳厚度后）。随后处死小鼠，收获脾和淋巴结，并且就DQ8d特异性增殖和细胞因子产生评估细胞。对于e-标签干扰，NOD AB° DQ8小鼠在第1天时在尾基部中用在100μl1：1完全弗氏佐剂（CFA，Difco，BD）盐水溶液中的100μg含（eDQ8d）或不含E-标签（DQ8d）的脱去酰胺基的DQ8表位进行免疫。在第7天时，如上所述用对应于用于免疫的肽的10μg含或不含e-标签的DQ8d执行小鼠DTH测量。

细胞培养、增殖和细胞因子产生测定：在实验的第11天时通过用组织磨碎器在1X PBS中使组织均质化制备脾和淋巴结的细胞悬浮液。通过与ACK（氯化铵/钾（裂解缓冲液））一起温育从脾细胞悬浮液中去除红细胞。细胞以5x10⁵细胞/孔在0.2-ml体积中于37℃在RPMI1640（1.5％Hepes、1％Penstrep和10％FBS）中在96孔微量滴定板中温育，所述RPMI1640具有包含单独的培养基、10μg Con A或50μg eDQ8d表位的补充物。在分开的实验中，将IL-10、TGF-β、IL10和TGF-β或LAP中和抗体加入LL-eDQ8d处理的小鼠的脾细胞中。24小时后，通过加入1μCi/孔[³H]-胸苷进行最后24小时培养来评估增殖。在玻璃纤维滤器垫上收获DNA结合的放射性活性，并且在闪烁计数器（Perkin Elmer）上测量胸苷掺入。结果表示为一式三份孔的平均cpm。对于细胞因子测量，在培养24小时后如上所述收集在不同增殖测定中使用的细胞培养上清液，且于-20℃进行冷冻直至执行细胞因子分析。细胞因子产生使用Mouse Inflammation Cytometric BeadAssay（BD Biosciences）进行定量。

流式细胞术分析：分离BM9、LL-pT1NX或LL-eDQ8d处理的小鼠的脾和肠相关淋巴结组织（GALT），如上所述进行制备，并且就CD4、CD25和Foxp3进行染色。根据制造商的说明书（eBiosciences，SanDiego，CA）针对Foxp3执行细胞内染色，并且随后使用流式细胞术在Becton Dickinson FACSCaliburs上进行测量。对于分析，细胞针对CD4⁺CD25⁺和CD4⁺CD25^-亚群进行门控，并且在这些群体内，Foxp3直方图用于测定平均荧光强度（MFI）。

统计分析：来自细胞因子测量的结果表示为平均值±SEM。eDQ8d特异性增殖、耳厚度和细胞因子测量就显著性进行检验，使用单因素ANOVA随后为斯氏t检验比较：2个样品假定相等差异，以测定单独的组间的差异。对于所有检验，p值<0.05：*，<0.01：**用于指示2种检验的统计显著性。

结果

eDQ8d表位经由乳酸乳球菌的粘膜递送显著减少DQ8d诱导的DTH 应答以及大量脾和腹股沟淋巴结细胞的增殖能力。

与致敏的阴性对照小鼠比较，LL-eDQ8d在eDQ8d免疫的NOD AB°DQ8II类转基因小鼠中的每日胃内施用导致DTH应答的显著减少（图5）。对照小鼠（饲喂BM9）明显对于eDQ8d免疫，但LL-eDQ8d的每日胃内施用显著减少DTH（13.1x10^-2mm对5.1x10^-2mm，p=0.0031）。与对照比较，耳肿胀在LL-pT1NX处理的小鼠中也轻微减少（9.3x10^-2mm对13.1x10^-2mm p=0.0343），但程度比LL-eDQ8d处理的小鼠中小得多。非DQ8转基因NOD AB°小鼠显示耳厚度仅微小的增加（3.2x10^-2mm）。这些数据表明经口施用的LL-eDQ8d抑制免疫的NOD AB° DQ8转基因小鼠中的全身性炎性T细胞应答，并且分泌的抗原对于诱导显著的致耐受性效应是必需的。这些数据伴随脾细胞和腹股沟淋巴结细胞显著减少的增殖能力（图6）。减少的增殖应答伴随IL-10的显著上调和IL-12产生的下调（在脾细胞的离体eDQ8d刺激后）（图7）。此外，与BM9和LL-pT1NX处理的小鼠比较，LL-eDQ8d显著减少在腹股沟淋巴结中的eDQ8d诱导的IFN-γ产生。总之，这些数据表明LL-eDQ8d处理在eDQ8d刺激后抑制T细胞激活，并且暗示DC激活也可以进行调节。

减少的脾eDQ8d特异性增殖依赖于IL-10和TGF-β，并且LL-DQ8d 处理显著增加脾和GALT的Foxp3表达

TGF-β、IL-10和LAP（膜结合TGF-β）对于eDQ8d特异性脾增殖应答的功能重要性使用中和抗体进行分析。IL-10-、TGF-β-或LAP-中和抗体未显著干扰LL-eDQ8d处理的小鼠减少的脾增殖应答，但添加TGF-β和IL-10中和单克隆抗体的组合完全取消LL-eDQ8d处理的小鼠脾细胞减少的eDQ8d特异性增殖能力（图8）。这些数据强烈暗示LL-eDQ8d处理在eDQ8d免疫的NOD AB° DQ8II类转基因小鼠中能够抑制T细胞激活，并且这种抑制依赖于IL-10和TGF-β。此外，与对照（BM9）比较，在LL-eDQ8d处理的小鼠的脾CD4⁺CD25⁺以及CD4⁺CD25^-细胞群体内可见Foxp3的显著上调（分别为MFI171对61和35对6）。值得注意的是，与BM9处理比较，Foxp3在LL-eDQ8d处理的小鼠的肠相关淋巴结组织（GALT）中的CD4⁺CD25^-群体中也是上调的（MFI73对30），但在GALT CD4⁺CD25⁺群体中不是。LL-pT1NX饲喂也诱导一定的Foxp3上调，但专有地在脾CD4⁺CD25^-T细胞群体中，并且程度比LL-eDQ8d低（分别为MFI15对35）。

结论

我们的数据证实对于DQ8介导的T细胞应答免疫显性的麦醇溶蛋白衍生肽通过遗传修饰的乳酸乳球菌的粘膜递送，在NOD AB° DQ8II类转基因小鼠中诱导局部和全身DQ8限制性T细胞应答的抑制。处理导致脾细胞和腹股沟淋巴结细胞的增殖能力的抗原特异性减少，这关键性地依赖IL-10和TGF-β的产生，并且与Foxp3+调节T细胞的显著诱导相关。因为这种抗原递送细菌方法具有甚至在确定的超敏性的背景中使得口服耐受性成为可能的能力，所以它可用于治疗乳糜泻和可能地其他自身免疫和/或变应性疾病。

天然DQ8表位

上述实验用天然α-麦醇溶蛋白表位即QYPSGQGSFQPSQQNPQA（SEQID NO：4）进行重复，所述表位对应于可经由UniProtKB/TrEMBL条目Q9M4L6检索的序列的残基203-220。所述天然的DQ8表位由核苷酸序列5'-caa tac cca tca ggt caa ggt tca ttc caa cca tca caa caaaac cca caa gct-3'（SEQ ID NO：3）编码。

用天然α-麦醇溶蛋白DQ8表位的结果基本上等同于上文对于脱去酰胺基的α-麦醇溶蛋白DQ8表位描述的结果。

使用DQ8表位在乳糜泻患者中进行的试验

在预备研究中，根据本发明的改造的乳酸乳球菌在具有乳糜泻的患者的试验中用作治疗剂。我们的发现提供了这种方法以抗原特异性方式有效的希望。

由于LL在初次应答的位点处递送抗原以达到直接和旁观者耐受性的能力，乳糜泻是这种方法的特别有吸引力的靶。

使用DQ2表位在乳糜泻患者中进行的试验

不存在可与上文使用的HLA-DQ8小鼠比较的，在内源MHC II-缺陷背景中表达HLA-DQ2的转基因小鼠。因此，上文对于DQ8表位描述的实验在合适的小鼠模型中是不可能的。因此在具有乳糜泻的患者中进行某些预备实验，使用天然以及脱去酰胺基的α-麦醇溶蛋白DQ2表位。

特别地，上述实验使用下述进行重复：

脱去酰胺基的DQ2表位LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF（SEQ ID NO：6），其由核苷酸序列5'-tta caa tta caa cca ttc ccacaa cca gaa tta cca tac cca tta cca tac cca caa cca gaa tta ccatac cca caa cca caa cca ttc（SEQ ID NO：5）编码，

和天然DQ2表位：LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF（SEQ IDNO：8），其由核苷酸序列5'-tta caa tta caa cca ttc cca caa ccacaa tta cca tac cca tta cca tac cca caa cca caa tta cca tac ccacaa cca caa cca ttc（SEQ ID NO：7）编码。

用天然和脱去酰胺基的α-麦醇溶蛋白DQ2表位的结果基本上等同于上文对于α-麦醇溶蛋白DQ8表位描述的结果。

实施例C：在分泌所述因子的乳酸乳球菌的经口施用后诱导对凝 血因子VIII和因子IX的耐受性

前言

几种治疗（重组）蛋白质，例如干扰素、因子VIII/IX和抗体（Remicade）在延长的治疗期以高剂量施用。然而，与其使用相关的并发症是蛋白质特异性免疫应答例如抗体的发展。这些抗体（Ab）也称为抑制剂，使得治疗蛋白质更不有效。例子包括在经历慢性肾衰竭的治疗的患者中在血友病中的因子VIII/IX、促红细胞生成素（Epo）的抑制剂的形成，和在经历多发性硬化症的治疗的患者中IFN-的抑制剂的形成。此处，证实因子VIII（和因子IX）通过乳酸乳球菌的经口递送经由诱导抗原特异性CD4⁺调节T细胞而抑制所述因子的抑制剂形成。

材料与方法

细菌和质粒：乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至终使用。细菌在GM17培养基中进行培养，所述GM17培养基即补充有0.5％葡萄糖的M17（Difco Laboratories，Detroit，MI）。所有菌株的贮备悬浮液于-20℃贮存于在GM17中的50％甘油中。对于胃内接种，贮备悬浮液在新鲜GM17中稀释200倍，并且于30℃进行温育。它们在16小时内达到2x10⁹菌落形成单位（CFU）/ml的饱和密度。本研究自始至终，使用混合的细菌悬浮液。因此，混合的细菌通过离心进行收获，并且2种细菌培养物的沉淀在BM9培养基（Schotte，Steidler等人2000）中进行10倍浓缩。对于处理，每只小鼠通过胃内导管接受100μl这种悬浮液。

代表FVIII和FIX特异性CD4+T细胞表位的人FVIII和FIX cDNA或cDNA片段进行扩增，并与乳球菌属P1启动子下游的红霉素抗性pT1NX载体的Usp45分泌信号融合。

用携带人FVIII（和/或表位片段）、FIX（和/或表位片段）的质粒转化的MG1363菌株命名为分泌FVIII、FIX的乳酸乳球菌LL-FVIII、LL-FIX。其为包含空载体pT1NX的MG1363的LL-pT1NX充当对照。

FVIII和FIX的定量：分别来自LL-FVIII和LL-IX的FVIII或FIX使用人FVIII和FIX特异性酶联免疫吸附测定（ELISA）进行测定，所述ELISA先前已得到描述（Chuah等人，2003）。重组蛋白质也通过蛋白质印迹分析以及COATests和aPTT测定进行分析，如所描述的（Chuah等人，2003；VandenDriessche等人，1999）。这种蛋白质的NH2-末端通过自动化埃德曼（Edman）降解进行测定。因为FVIII和FIX通常在肝中表达，在其中它们经历广泛的翻译后修饰，所以由改造的乳酸乳球菌产生的凝血因子可能是无生物学活性的。然而，这些翻译后差异将可能对这些乳酸乳球菌产生的重组蛋白质诱导免疫耐受性的能力不具有影响。事实上，迄今为止已详细表征的大多数抑制剂一般识别氨基酸残基（Villard等人，2003），而不是糖基化部分。

动物：使用如由Bi等人，（1995）和Wang等人，（1997）描述的在ES细胞中的同源重组，通过敲除鼠类FVIII或FIX基因获得的血友病A或B小鼠在实验室中进行培育。在CFA存在下用纯化的重组FVIII或FIX抗原进行攻击时，这些接受小鼠产生中和抗体（Mingozzi等人，2003）。抑制剂状态可以使用Bethesda测定或抗-FVIII/抗-FIX特异性ELISA随着时间过去进行监控。用FVIII或FIX（+CFA）攻击的接受小鼠一般在抗原攻击后2-3周发展抑制剂。

实验设置：4-6周大的小鼠接受FVIII、FIX、LL-FVIII、LL-FIX或LL-pT1NX或LL-OVA（无关抗原）（1或10μg）。作为耐受性诱导的阳性对照，用从肝细胞特异性启动子表达FIX的腺伴随病毒载体（AAV）注射小鼠。接受动物发展FIX特异性免疫耐受性，其在用FIX+CFA后续攻击后阻止抗-FIX抗体的诱导。

在预防背景中，单独的FVIII、FIX、LL-FVIII、LL-FIX使用胃导管经口施用于血友病A或B小鼠，使用不同的处理间隔和剂量。这些接受小鼠随后在CFA的存在下用纯化的重组FVIII和FIX抗原进行攻击（Mingozzi等人，2003）。使对照动物暴露于LL-pT1NX和LL-OVA。通过眶后采血收获血浆。针对FVIII或FIX的抗体的发展使用Bethesda测定（Kasper等人，1975）或使用改良的抗-FVIII或抗-FIX特异性ELISA（VandenDriessche等人，1999）以不同时间间隔进行评估。

在治疗背景中，如所述的（Mingozzi等人，2003），血友病A或B小鼠首先用FVIII或FIX进行免疫。抑制剂状态使用Bethesda测定或抗-FVIII/抗-FIX特异性ELISA随着时间过去进行监控。具有低或高抑制剂滴度的小鼠随后用单独的FVIII、FIX、LL-FVIII、LL-FIX进行处理，使用不同的处理间隔和剂量，并且抑制剂滴度随着时间过去进行测定。可能的免疫耐受性的特异性通过用无关抗原（破伤风类毒素或Ova）攻击接受单独的FVIII、FIX、LL-FVIII、LL-FIX的小鼠进行评估。

细胞培养、增殖和细胞因子测定：通过使细胞通过70μm细胞过滤器（Becton/Dickinson Labware）制备脾和淋巴结的单细胞悬浮液。通过与红细胞裂解缓冲液一起温育从脾细胞悬浮液中去除红细胞。

对于总脾细胞群体的增殖测定，2x10⁵细胞在96孔U形底平板中在总体积200μl的完全培养基中进行培养，所述培养基单独或具有纯化的FVIII或FIX、并且含有或不含抗-IL-10或抗-TGF-β中和单克隆抗体。FVIII和FIX以1-100μg/ml的浓度加入。中和抗体以1、0.1和0.01μg/ml加入。对于CD4⁺T细胞和CD4⁺CD25^-T细胞群体的增殖测定，0.2x10⁵个CD4⁺T细胞或CD4⁺CD25^-T细胞在96孔U形底平板中与充当抗原呈递细胞的1x10⁵经辐射的CD4^-细胞，和FVIII或FIX（0或100μg/ml）一起在含或不含中和抗体的总体积200μl的完全培养基中进行培养。于37℃在5％CO₂加湿培养箱中72小时后，通过加入1μCi/孔[³H]-胸苷来评估增殖。在16-18小时后在玻璃纤维滤器垫（Perkin Elmer，Boston，USA）上收获DNA结合的放射性活性，并且在闪烁计数器（Perkin Elmer）上测量胸苷掺入。

对于细胞因子测量，在培养24、48和72小时后收集在不同增殖测定中使用的细胞培养上清液，且于-20℃进行冷冻直至执行细胞因子分析。细胞因子产生使用Mouse Inflammation Cytometric Bead Assay（BD Biosciences，Mountain View，CA，USA）进行定量。

体内T调节活性测定：为了测试小鼠中抗体形成的有效抑制，将从不同实验乳酸乳球菌处理的组中分离的脾细胞、珠纯化的CD4⁺T细胞、CD4⁺CD25^-或CD4⁺CD25⁺T细胞过继转移给首次用于实验的C3H/HeJ小鼠。未处理的小鼠用作对照。转移细胞的数目对于整体脾细胞、亚群耗尽的脾细胞、或阳性选择的CD4⁺细胞以及CD4⁺CD25^-和CD4⁺CD25⁺T细胞是10⁷。接受小鼠（n=4-5/实验群组）在过继转移后36小时时用在cFA中的5μg hF.IX进行皮下注射。血浆中的抗hF.IX IgG滴度在免疫后2.5周进行测量。

结果

与游离FVIII或FIX比较，LL-FVIII和LL-IX显著增强血友病A 或B小鼠的耐受性诱导能力

为了研究口服耐受性的诱导，小鼠如上所述（实验设置）进行经口饲喂。LL-FVIII或LL-FIX的添加显著增强针对FVIII和FIX的耐受性诱导，因为与对照以及游离FVIII和FIX组比较，脾细胞的因子特异性增殖应答在这个组中显著减少。

LL-FIIIV和LL-FIX增强与响应所述因子的减少的FVIII-和FIX 特异性滴度和IFN-γ以及更多的IL10和TGF-β产生相关的口服耐受 性。

为了研究口服耐受性的诱导，小鼠如上所述（实验设置）进行经口饲喂。脾细胞和淋巴结中响应所述因子的FVIII和FIX特异性抗体以及细胞因子产生如上所述进行定量。与对照和游离FVIII/IX组比较，在LL-FVIII/FIX组中抑制剂形成和促炎细胞因子IFN-γ的产生强烈减少，并且免疫抑制细胞因子IL-10和TGF-β显著增加。

LL-FVIII/FIX经由CD4+T细胞增强口服耐受性

为了评估CD4+T细胞是否介导口服耐受性的诱导，因子特异性增殖CD4+T细胞应答在脾细胞和淋巴结中进行研究。因此，小鼠如上所述（实验设置）进行经口饲喂，并且因子特异性CD4+T细胞增殖如细胞培养、增殖和细胞因子测定中所述进行测定。与对照和游离FVIII/IX组比较，LL-FVIII/FIX组中的因子特异性CD4T细胞应答显著减少。

在LL-FVIII/FIX处理后抗原诱导的T调节细胞可以在体内转移保 护避免抑制剂形成

为了在用口服耐受性方案处理的小鼠中测试抗体形成的有效抑制，如上所述（体内T调节活性测定）过继转移来自不同处理组的脾细胞。与对照和游离FVIII/IX组比较，抗因子IgG形成在LL-FVIII/FIX组中显著减少，表明在我们的组合口服耐受性方案中调节CD4⁺T细胞激活。

结论

我们的数据证实分泌重组FVIII或FIX的乳酸乳球菌的粘膜递送在抑制血友病A和B小鼠中的FVIII-和FIX-特异性抑制剂的形成中分别比游离FVIII或FIX更有效。

实施例D：在分泌所述变应原的乳酸乳球菌的经口施用后诱导对 变应原Der p1的耐受性

前言

变应性哮喘是气道的慢性炎性病症。它的特征在于可逆的气道阻塞、变应原特异性免疫球蛋白E升高的血清水平、粘液分泌过多和对ronchospasmogenic刺激的气道高应答性（AHR）。它的症状通过暴露于患者已对其致敏的变应原（例如，树、草和杂草花粉、粉尘和尘螨、霉菌、动物毛屑）而变得更糟。2型T-辅助（Th2）淋巴细胞在疾病的起始、进展和持续中起关键作用。目前数据暗示对变应原的Th2应答通常由调节T细胞抑制。此外，由这个亚集进行的抑制在过敏个体中减少。此处，证实变应原经由乳酸乳球菌的经口递送经由诱导抗原特异性CD4⁺调节T细胞而抑制哮喘样应答。

材料与方法

模拟人疾病的2种变应性哮喘小鼠模型是Ova变应原模型和人源化SCID模型。

Ova变应原模型：OVA致敏的小鼠用OVA气溶胶进行吸入攻击，这导致Th2细胞因子依赖性嗜酸性粒细胞性气道炎症、支气管高反应性和IgE产生，从而表现出人变应性哮喘的高度特征（Brusselle，1994，Clin Exp Allergy24：73；Kips等人1996，Am J Respir Crit CareMed153：535；Brusselle等人1995，Am J Respir Cell Mol Biol12：254）。

细菌：乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至终使用。细菌在GM17培养基中进行培养，所述GM17培养基即补充有0.5％葡萄糖的M17（Difco Laboratories，Detroit，MI）。所有菌株的贮备悬浮液于-20℃贮存于在GM17中的50％甘油中。对于胃内接种，贮备悬浮液在新鲜GM17中稀释500倍，并且于30℃进行温育。它们在16小时内达到2x10⁹菌落形成单位（CFU）/ml的饱和密度。细菌通过离心进行收获，并且在BM9培养基中进行10倍浓缩。对于处理，每只小鼠通过胃内导管每天接受100μl这种悬浮液。

质粒：编码原鸡卵白蛋白的mRNA序列从Genbank（登记号AY223553）中检索。从鸡子宫中分离总RNA，并且在25μl体积中使用2μg总RNA、2μM寡核苷酸dT引物（Promega Corporation Benelux，Leiden，The Netherlands）、0.01mM DTT（Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，The Netherlands）、0.5mM dNTP（Invitrogen，Merelbeke，Belgium）、20U Rnasin（Promega Incorporation Benelux）和100U superscript II逆转录酶（Invitrogen）合成cDNA。通过聚合酶链式反应（PCR）扩增OVA cDNA片段，使用下述条件：94℃2分钟，随后为94℃45秒、62℃30秒和72℃90秒的30个循环，使用下述正向和反向引物5’-GGCTCCATCGGTGCAGCAAGCATGGAATT-3’（SEQID NO：17）和5’-ACTAGTTAAGGGGAAAC-ACATCTGCCAAAGAAGAGAA-3’（SEQ ID NO：18）。

使扩增片段与乳球菌属P1启动子下游的红霉素抗性pT1NX载体的Usp45分泌信号融合。

用携带OVA cDNA的质粒转化的MG1363菌株命名为LL-OVA。其为包含空载体的MG1363的LL-pTREX1充当对照。

OVA的定量：来自LL-OVA的OVA使用内部开发的OVA特异性酶联免疫吸附测定（ELISA）进行测定。重组蛋白质的产生也通过蛋白质印迹分析进行评估。

小鼠：BALB/c小鼠（6-8周大）购自Charles River Laboratories（Calco，Italy）。小鼠在特定无病原体条件下维持。

小鼠的免疫：小鼠用在1mg氢氧化铝（alum）中的10μg OVA（V级别；Sigma-Aldrich）进行腹膜内免疫。这种免疫在21天后进行重复（在第0和21天时）。对照小鼠接受盐水注射代替OVA/alum溶液。免疫后26天，致敏的小鼠吸入在PBS中溶解的1％OVA的气溶胶化溶液10分钟。OVA吸入连续进行3天（第47、48和49天）。对照小鼠在用于实验组的相同条件下吸入单独的PBS。

口服耐受性的诱导：小鼠在第0-4、7-11、14-18和21-25天时接受LL-OVA、LL-pTREX1、1μg OVA或BM9。作为口服耐受性诱导的阳性对照，小鼠通过胃内导管饲喂30mg OVA，其减少支气管嗜酸性粒细胞增多和气道高应答性，其中高剂量饲喂比低剂量饲喂更有效。

气道高应答性（AHR）的测量：最后吸入后24小时（第50天），气道高应答性通过乙酰甲胆碱诱导的气流阻塞进行评估。小鼠暴露于雾化生理盐水（Otsuka Pharmaceutical）2.5分钟，随后为增加剂量（1-30mg/ml）的雾化乙酰甲胆碱。在喷雾作用后将这些小鼠置于整体体积描记器中2.5分钟，并且使用Biosystem XA WBP系统（BuxcoElectronics）测量增强的间歇（Penh）。“Penh”代表肺气流阻塞并且使用下式进行计算：Penh=（（Te-Tr）/（Tr xPEF/PIF）），其中Penh=增强的间歇（无量纲的），Te=呼气时间（秒），Tr=松弛时间（秒），PEF=呼气流量峰值（毫升/秒），和PIF=吸气流量峰值（毫升/秒）。Penh约每5秒进行测量且求平均值，并且累积值平均为每个时间点的Penh值。气道高应答性表示为PC200Mch（乙酰甲胆碱的200%激发浓度），这是双倍基线Penh值的乙酰甲胆碱浓度。

支气管肺泡灌洗液（BALF）分析：在气道高应答性测量后，获得支气管肺泡灌洗样品。小鼠通过腹膜内注射过量氯胺酮和赛拉嗪实施安乐死，随后肺用0.5ml盐水灌洗4次。将灌洗液离心，并且使细胞重悬浮于具有1％BSA的1ml盐水中。使用血球计数器计数总细胞数目。通过使悬浮液在300rpm下离心5分钟制备Cytospin样品。为了明确区分嗜酸性粒细胞与嗜中性粒细胞，应用3种不同染剂：Diff-Quick、May-Grünwald-Giemsa和Hansel（曙红）染剂。基于标准形态学标准通过光学显微镜检查区分至少300个白细胞。BALF中的IL-13、IL-4和IL-5水平通过Cytometric Bead Assay（BDBiosciences，Mountain View，CA，USA）根据制造商的说明书进行检测。

血清总IgE和OVA特异性Ig的测量：在第50天时，在麻醉下从眶后窦获得血样。在样品已完全凝固后，将它们离心，并且收集血清且贮存于-80℃直至使用。总IgE通过ELISA使用配对Ab（BDPharmingen）根据制造商的说明书进行测定。为了测量血清中的OVA特异性IgE、IgG1和IgG2a，用2μg/ml OVA包被微量滴定板（Maxisorp，Nunc，VWR International，Haasrode，Belgium）。随后，用在PBS中的0.1％酪蛋白封闭孔，这之后使平板与在包含0.1％酪蛋白和0.05％Tween20的PBS（PBS-CT）中以1：10-1：20480稀释的小鼠血清样品一起温育，使用山羊抗小鼠IgG2a-HRP[SouthernBiotechnology Associates（SBA），Imtec ITK Diagnostics，Antwerpen，Belgium，1：5000稀释]、山羊抗小鼠IgG1-HRP或山羊抗小鼠IgE-HRP（SBA，1：5000稀释）。洗涤后，向每个孔中加入底物[3,3’,5,5’四甲基联苯胺（TMB）底物试剂，Pharmingen，BectonDickinson，Erembodegem，Belgium]。最后，通过向孔中加入1M H₂SO₄来终止反应。吸光度在450nm处读取。ELISA得分表示为滴度，其是仍具有比计算的截止值更高的OD₄₅₀的最高稀释度的倒数。截止值计算为伴随3倍SD增加的5只非免疫小鼠的平均OD₄₅₀。

肺组织的组织学检查：获得支气管肺泡灌洗样品后，使肺充满生理盐水并且从小鼠中切除。用中和缓冲的福尔马林使肺固定，并且在石蜡中进行包埋。切片（3-μm厚）用H&E或过碘酸-希夫（PAS）进行染色。肺中的组织学改变强度用4级得分进行评估（0，无炎症；1，轻度/弱；2，中等；和3，重度），根据下述发现的分布和强度：1）上皮脱落或支气管上皮细胞核的波动（undulation），2）杯形细胞数目的增加，3）炎性细胞从血管到支气管和支气管周间质的粘膜和粘膜下层区域内的浸润，和4）平滑肌细胞层的肥大和增厚。

用于分析肺中的细胞因子和趋化因子基因表达的RT-PCR：在用生理盐水灌注后摘除肺，并且根据制造商的说明书使用ISOGEN（NipponGene）提取总RNA。总RNA（10μg）使用寡核苷酸（dT）15引物（Promega）和Superscript II RNA酶H-逆转录酶（Invitrogen LifeTechnologies）于42℃逆转录2小时。为了确保每个样品包含相同量的cDNA，使用β-肌动蛋白特异性引物首先测定每种样品的β-肌动蛋白cDNA浓度。使这些样品扩增合适的循环数目，从而使得PCR产物量保持在扩增曲线的线性部分上。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，并且通过溴化乙啶染色进行显现。IL-13、eotaxin、IL-10、IFN-γ和TGF-β的水平使用下述特定引物组进行测定。

用于β-肌动蛋白的有义引物5’-ACGACATGGAGAAGATCTGG-3’（SEQID NO：19），和

反义引物5’-TCGTAGATGGGCACAGTGTG-3’（SEQ ID NO：20）。

用于IL-13的有义引物5’-TCTTGCTTGCCTTGGTGGTCTCGC-3’（SEQID NO：21），和

反义5’-GATGGCATTGCAATTGGAGATGTTG-3’（SEQ ID NO：22）。

用于eotaxin的有义引物5’-GGGCAGTAACTTCCATCTGTCTCC-3’（SEQID NO：23），和

反义引物5’-CACTTCTTCTTGGGGTCAGC-3’（SEQ ID NO：24）。

用于IL-10的有义引物5’-TACCTGGTAGGAGTGATGCC-3’（SEQ IDNO：25），和

反义5’-GCATAGAAGCATACATGATG-3’（SEQ ID NO：26）。

用于IFN-γ的有义引物5’-CATAGATGTGGAAGAAAAGA-3’（SEQ ID NO：27）和

反义5’-TTGCTGAAGAAGGTAGTAAT-3’（SEQ ID NO：28）。

用于TGF-β的有义引物5’-CTTTAGGAAGGACCTGGGTT-3’（SEQ IDNO：29），和

反义5’-CAGGAGCGCACAATCATGTT-3’（SEQ ID NO：30）。

细胞培养、增殖和细胞因子测定：最后吸入后1天（第50天），通过使细胞通过70-μm细胞过滤器（Becton/Dickinson Labware）制备脾和纵隔淋巴结的单细胞悬浮液。通过与红细胞裂解缓冲液一起温育从脾细胞悬浮液中去除红细胞。CD4⁺T细胞和CD4⁺CD25^-T细胞分别使用CD4⁺T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec，Germany）或CD4⁺CD25⁺调节T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec，Germany），以及MACS柱（midiMACS；Miltenyi Biotec）进行富集。

对于大量脾细胞和LN群体的增殖测定，2x10⁵细胞在96孔U形底平板中在总体积200μl的完全培养基中单独或与纯化的OVA一起进行培养。OVA以1-100μg/ml的浓度加入。对于CD4⁺T细胞和CD4⁺CD25^-T细胞群体的增殖测定，2x10⁵个CD4⁺T细胞或CD4⁺CD25^-T细胞在96孔U形底平板中与丝裂霉素处理的脾细胞一起，以CD4⁺T细胞或CD4⁺CD25-T细胞/APC1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0的比例在总体积200μl的完全培养基中培养16小时，所述脾细胞装载有1mg/ml OVA，充当抗原呈递细胞。于37℃在5％CO₂加湿培养箱中72小时后，通过加入1μCi/孔[³H]-胸苷来评估增殖。在18小时后在玻璃纤维滤器垫（Perkin Elmer，Boston，USA）上收获DNA结合的放射性活性，并且在闪烁计数器（Perkin Elmer）上测量胸苷掺入。

对于细胞因子测量，在培养24、48和72小时后收集在不同增殖测定中使用的细胞培养上清液，且于-80℃进行冷冻直至执行细胞因子分析。细胞因子产生使用Mouse Inflammation Cytometric Bead Array（BD Biosciences，Mountain View，CA，USA）进行定量。

体内T调节活性测定：最后吸入后1天（第21天），经处理的小鼠的脾用0.1％胶原酶（Sigma-Aldrich）于37℃消化20分钟。在某些实验中，制备整体脾细胞的单细胞悬浮液，并且与Con A（2μg/ml；Sigma-Aldrich）一起培养48小时。收集细胞，并且将10⁷细胞静脉内过继转移到首次用于实验的BALB/c小鼠内。对于阴性选择，根据制造商的说明书，使用具有生物素化的抗小鼠CD4、CD8、CD11c、CD19和CD11b mAb（BD Pharmingen）的磁珠（MACS；Miltenyi Biotec）使CD4⁺、CD8⁺、CD11c⁺、CD19⁺或CD11b⁺细胞从整体脾细胞中耗尽。通过流式细胞术检查耗尽的效率（>99％）。CD4⁺、CD4⁺CD25^-细胞使用CD4⁺T细胞分离试剂盒、调节T细胞分离试剂盒遵循制造商的说明书进行纯化。使用流式细胞术检查阳性选择的细胞的纯度。对于细胞转移实验，紧在它们用OVA/alum进行第一次免疫前或进行第二次免疫后，细胞从尾静脉转移到BALB/c小鼠内。转移细胞的数目对于整体脾细胞、亚群耗尽的脾细胞、或阳性选择的CD4⁺细胞和CD4⁺CD25^-细胞是10⁷。

在人源化的SCID（hu-SCID）模型中（如由Duez等人，2000；Hammad等人，2000描述的）

在这个模型中，可以研究对房尘螨（HDM）变应原Der p1的变应性免疫应答。此种hu-SCID小鼠用来自HDM过敏患者的PBMC进行腹膜内重构，并且随后暴露于HDM的气溶胶，从而产生人IgE，发展由活化T细胞和DC组成的肺浸润，并且响应支气管收缩剂显示AHR（Pestel等人1994，J Immunol，153：3804；Duez等人，Am J Respir Crit CareMed，第161卷，第200-206页，2000）。

细菌

乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至终使用。细菌在GM17培养基中进行培养，所述GM17培养基即补充有0.5％葡萄糖的M17（DifcoLaboratories，Detroit，MI）。所有菌株的贮备悬浮液于-20℃贮存于在GM17中的50％甘油中。对于胃内接种，贮备悬浮液在新鲜GM17中稀释200倍，并且于30℃进行温育。它们在16小时内达到2x10⁹菌落形成单位（CFU）/ml的饱和密度。细菌通过离心进行收获并且在BM9培养基中进行10倍浓缩。对于处理，每只小鼠通过胃内导管每天接受100μl这种悬浮液。

质粒

Der p1，222个氨基酸残基的球状糖蛋白，是来自屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）（Dpt）的主要变应原之一。合成编码Der p1蛋白质的具有最佳乳酸乳球菌密码子使用的DNA序列，进行扩增且将其与乳球菌属P1启动子下游的红霉素抗性pT1NX载体的Usp45分泌信号融合。用携带鼠类Der p1、Der p1aa52-71和Der p1aa117-133cDNA的质粒转化的MG1363菌株命名为LL-Derp1、LL-Derp1aa52-71和LL-Derp1aa117-133。其为包含空载体pT1NX的MG1363的LL-pT1NX充当对照。

Der p1的定量

来自LL-Derp1的Der p1使用内部开发的Der p1特异性酶联免疫吸附测定（ELISA）进行测定。重组蛋白质的产生也通过蛋白质印迹分析进行评估。

患者

从对房尘螨敏感或不敏感的供体中收集血液。过敏患者呈现房尘螨致敏的通常特征。针对屋尘螨（Dpt）变应原的皮肤点刺测试（Stallergènes，Fresnes，France）（直径≥10mm）是阳性的，并且所有患者具有血清特异性IgE抗体。总IgE浓度超过150IU/ml（150-1600IU/ml）。健康供体作为阴性对照进行测试（总IgE水平小于150IU/ml，并且它们针对通常吸入的变应原具有阴性的皮肤点刺测试）。

人外周血单核细胞制备

在离心（120x g，15分钟）后获得富含血小板的血浆且弃去。血细胞随后在RPMI1640（Life Technologies，Paisley，Scotland）（体积/体积）中进行稀释，并且在Ficoll梯度（Pharmacia，Uppsala，Sweden）上分层。离心（400x g，30分钟）后，在界面处收获PBMC，并且在转移前在无菌RPMI培养基中洗涤3次。

小鼠

C.B.-17SCID小鼠（6-8周大）维持在特定动物实验室中的具有无菌垫层的隔离器中。SCID集落通过ELISA就小鼠血清免疫球蛋白的不存在进行定期检查。

在SCID小鼠中的外周血单核细胞转移：PBMC hu-SCID小鼠

SCID小鼠在细胞转移时为6-8周大。小鼠通过经由23号针腹膜内注射在400μl RPMI中的来自过敏患者或健康供体的10x10⁶单核细胞进行重构。在同一天，它们腹膜内接受2指数反应性（indexreactivity）[IR]单位Dpt。细胞重构后4天，使SCID小鼠每天暴露于包含100IR单位Dpt（100IR单位等价于包含在Dpt提取物中的约200μg蛋白质）的变应原气溶胶，进行连续4天（第0天-第4天）。对照组不暴露于Dpt。气道应答性测量前1天（第35天和第60天），使hu-SCID小鼠暴露于另一个100IR单位Dpt溶液的气溶胶。

实验设置

小鼠接受经改造以表达Der p1或作为阴性对照的无关抗原（OVA）的乳酸乳球菌。

改造的乳酸乳球菌细菌使用胃导管经口施用于SCID小鼠，在PBMC重构后1天开始且使用不同处理间隔和剂量。通过测量人血清IgE抗体、分析肺浸润、测量AHR以及分析在BALF中的细胞群体和细胞因子产生来评估口服耐受性的诱导。此外，耐受性的诱导通过分析针对Derp1的增殖T细胞应答进行评估。

气道应答性（AHR）的评估

气道应答性（表示为引起肺阻力增加50％的氨甲酰胆碱的激发剂量）在第35天或第60天时进行测量，如由Duez等人2000描述的。

人IgE测量

用人细胞移植后数天，小鼠在麻醉下从眶后窦进行采血。总人IgE通过双位点免疫放射测定方法进行研究，使用对于ε-链特异的2种不同小鼠mAb（Immunotech International，Luminy，France）。在一式两份的测试中使用至少20μl血清。该方法的灵敏度允许检测0.1IUiml（0.24ng/ml）。

抗Dpt变应原的特定IgE Ab通过ELISA进行定量。简言之，塑料管（Maxisorb Startube，Nunc，Denmark）用在0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）中的Dpt变应原于4℃包被过夜，并且用在0.1M PBS（pH7.4）中的1％BSA在室温下饱和2小时。洗涤后，管与在包含BSA（1％）和Tween（0.01％）的PBS中稀释的Hu-SCID小鼠血清在室温下温育2小时，并且于4℃温育过夜。充分洗涤后，加入HRP标记的抗人IgE Ab。洗涤后，向每个孔中加入底物[3,3’,5,5’四甲基联苯胺（TMB）底物试剂，Pharmingen，Becton Dickinson，Erembodegem，Belgium]。最后，通过向孔中加入1M H₂SO₄来终止反应。吸光度在450nm处读取。

肺的组织学检查

肺在第35天时进行切除，并且在低聚甲醛中进行固定，并且进行加工以用于石蜡包埋。石蜡组织切片进行染色以检测人CD45+细胞，这之后鼠类肺切片上的人细胞通过组织学评分进行定量，如由Duez等人2000描述的。

支气管肺泡灌洗液（BALF）的分析

BALF如OVA变应原模型中所述进行分析。

细胞培养、增殖和细胞因子测定：

通过使细胞通过70μm细胞过滤器（Becton/Dickinson Labware）制备脾的单细胞悬浮液。通过与红细胞裂解缓冲液一起温育从脾细胞悬浮液中去除红细胞。CD4⁺T细胞和CD4⁺CD25^-T细胞分别使用人CD4⁺T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec，Germany）或人CD4⁺CD25⁺调节T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec，Germany）以及MACS柱（midiMACS；Miltenyi Biotec）进行富集。

对于大量脾细胞的增殖测定，2x10⁵细胞在96孔U形底平板中在总体积200μl的完全培养基中进行培养，所述培养基单独或具有纯化的Der p1、并且含或不含抗-IL-10或抗-TGF-β中和单克隆抗体。Der p1以1-100μg/ml的浓度加入。中和抗体以1、0.1和0.01μg/ml加入。对于人CD4⁺T细胞和人CD4⁺CD25^-T细胞群体的增殖测定，2x10⁵个CD4⁺T细胞或CD4⁺CD25^-T细胞在96孔U形底平板中与丝裂霉素处理的人PBMC一起，以CD4⁺T细胞或CD4⁺CD25^-T细胞/APC1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0的比例在总体积200μl的完全培养基中培养16小时，所述培养基含或不含中和抗体，所述人PBMC装载有1mg/ml Der p1，充当抗原呈递细胞。于37℃在5％CO₂加湿培养箱中72小时后，通过加入1μCi/孔[³H]-胸苷来评估增殖。在18小时后在玻璃纤维滤器垫（Perkin Elmer，Boston，USA）上收获DNA结合的放射性活性，并且在闪烁计数器（Perkin Elmer）上测量胸苷掺入。

对于细胞因子测量，在培养24、48和72小时后收集在不同增殖测定中使用的细胞培养上清液，且于-80℃进行冷冻直至执行细胞因子分析。细胞因子产生使用Human Inflammation Cytometric Bead Assay（BD Biosciences，Mountain View，CA，USA）进行定量。

结果

LL-OVA和LL-Der p1分别在哮喘的OVA-和huSCID小鼠模型中显 著增强耐受性诱导能力。

为了研究口服耐受性的诱导，小鼠如上所述（实验设置）进行经口饲喂。LL-OVA/Derp1的添加显著增强针对OVA/Derp1的耐受性诱导，因为与对照以及游离OVA/Derp1组比较，脾细胞的变应原特异性增殖应答在LL-OVA/Derp1组中显著减少。

LL-OVA/Derp1增强与响应所述变应原的减少的AHR，嗜酸性粒细 胞性浸润，血清IgE水平，以及减少的IL-13、IL-4和IL-5细胞因子 产生相关的口服耐受性。

为了研究口服耐受性的诱导，小鼠如上所述（实验设置）进行经口饲喂。响应所述抗原的AHR、嗜酸性粒细胞性BALF浸润、IgE滴度以及细胞因子产生如上所述进行测定。与对照和游离OVA/Derp1组比较，在LL-OVA/Derp1组中AHR、嗜酸性粒细胞性BALF浸润、IgE滴度显著减少，并且IL-13、IL-4和IL-5显著降低。

LL-OVA/Derp1经由CD4+T细胞增强口服耐受性。

为了评估CD4T细胞是否介导口服耐受性的诱导，变应原特异性增殖CD4T细胞应答在脾细胞和淋巴结中进行研究。因此，小鼠如上所述（实验设置）进行经口饲喂，并且变应原特异性CD4+T细胞增殖如细胞培养、增殖和细胞因子测定中所述进行测定。与对照和游离OVA/Derp1组比较，LL-OVA/Derp1组中的变应原特异性CD4T细胞应答显著减少。

在LL-OVA处理后抗原诱导的T调节细胞可以在体内转移保护避免 哮喘样应答

为了在用口服耐受性方案处理的小鼠中测试哮喘样应答的有效抑制，如上所述（体内T调节活性测定）过继转移来自不同处理组的脾细胞。与对照和游离OVA组比较，哮喘样应答在LL-OVA组中显著减少，表明在我们的组合口服耐受性方案中调节CD4⁺T细胞激活。

结论

我们的数据证实分泌变应原的乳酸乳球菌的粘膜递送比游离变应原更有效地经由诱导抗原特异性CD4⁺调节T细胞来诱导变应原特异性免疫耐受性，即使在建立的超敏性的背景中。

实施例E：在分泌所述变应原的乳酸乳球菌的经口施用后诱导对 BLG食物变应原的耐受性

前言

食物过敏是影响约2％-5％人口的疾病。在人类中，升高的IgE抗体以及产生IL-4的、抗原特异性T淋巴细胞的存在暗示Th2倾斜（Th2-skewed）机制。此处，证实食物变应原通过乳酸乳球菌的经口递送经由诱导抗原特异性CD4⁺调节T细胞而抑制变应原特异性免疫应答。

实施例的材料与方法

细菌和质粒

乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至终使用。细菌在GM17培养基中进行培养，所述GM17培养基即补充有0.5％葡萄糖的M17（DifcoLaboratories，Detroit，MI）。所有菌株的贮备悬浮液于-20℃贮存于在GM17中的50％甘油中。对于胃内接种，贮备悬浮液在新鲜GM17中稀释200倍，并且于30℃进行温育。它们在16小时内达到2x10⁹菌落形成单位（CFU）/ml的饱和密度。细菌通过离心进行收获并且在BM9培养基中进行10倍浓缩。对于处理，每只小鼠通过胃内导管每天接受100μl这种悬浮液。

牛β-乳球蛋白cDNA进行扩增，且与乳球菌属P1启动子下游的红霉素抗性pT1NX载体的Usp45分泌信号融合。

用携带鼠类BLG的质粒转化的MG1363菌株命名为LL-BLG。其为包含空载体pT1NX的MG1363的LL-pT1NX充当对照。

牛β-乳球蛋白（BLG）的定量

来自LL-BLG的BLG使用内部开发的BLG特异性酶联免疫吸附测定（ELISA）和蛋白质印迹分析进行测定。

实验设置

用于研究乳酸乳球菌的保护效应的食物过敏鼠类模型是食物诱导的IgE型应答的小鼠模型，如由Frossard等人（J Allergy ClinImmunol113：958-964，2004）描述的。小鼠接受LL-BLG或作为阴性对照的无关抗原（OVA）。作为耐受性诱导的阳性对照，小鼠接受在饮用水中的高剂量BLG，其在用BLG经口攻击后使小鼠免于过敏反应（anaphylaxis）。

在预防背景中，产生BLG的经改造的乳酸乳球菌细菌使用胃导管经口施用于小鼠，使用不同的处理间隔和剂量。随后，这些接受小鼠在霍乱毒素的存在下用纯化的BLG抗原进行经口攻击。使对照动物暴露于用不表达BLG（但表达OVA）的对照载体改造的乳酸乳球菌。通过测量血清和粪便中的BLG特异性IgG1、IgG2a和IgE滴度，通过测定脾和PP中的抗体分泌细胞数目，通过分析MLN、PP和脾中的T细胞增殖和细胞因子产生，在胃内抗原攻击后分析过敏反应，从而评估耐受性的诱导。

为了评估针对BLG的免疫耐受性的诱导是否可以通过乳酸乳球菌增强，对小鼠施用LL-BLG或1μg游离BLG。

BLG的经口致敏。

4-5周大的雌性C3H/HeOuJ小鼠（Charles River）在第0、7、14和21天时通过用在0.2mol/L NaHCO₃中的购自List BiologicalLaboratories的20mg BLG（Sigma）和10μg CTX胃内管饲（gavage）进行免疫。阳性对照组（耐受的小鼠）随意接受在其饮用水中的0.8mg/mL BLG，进行4周。给予的蛋白质总量（22.4mg）类似于给予致敏小鼠的BLG总量。为了证实耐受操作也持久地激活外周以及粘膜免疫系统，耐受小鼠组在第28和42天时用吸附于1mg alum的80μg ipBLG注射2次。

抗原攻击

在第28天时，所有小鼠通过用在0.4mL0.2mol NaHCO3中的100mg BLG胃内管饲进行攻击。观察到过敏反应，并且通过使用其他地方详细描述的（Frosssard等人，2001）反应得分（0，无反应，至3，严重反应或死亡）进行分级。核心体温在攻击前和管饲后30分钟在耳处通过红外线进行测量。处死动物，并且血液通过心脏穿刺收集到含EDTA的管内，并且获得血浆以用于通过商业ELISA试剂盒（Immunotech，Marseille，France）进行的组胺测量。

细胞培养、增殖和细胞因子测定：

脾、肠系膜淋巴结和PP的单细胞悬浮液如由Frossard等人（2004）所述进行制备。CD4⁺T细胞和CD4⁺CD25-T细胞分别使用CD4⁺T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec，Germany）或CD4⁺CD25⁺调节T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec，Germany）以及MACS柱（midiMACS；Miltenyi Biotec）进行富集。

对于大量脾细胞和LN群体的增殖测定，2x10⁵细胞在96孔U形底平板中在总体积200μl的完全培养基中进行培养，所述培养基单独或具有纯化的BLG，并且含有或不含抗-IL-10或抗TGF-β中和单克隆抗体。BLG以1-100μg/ml的浓度加入。中和抗体以1、0.1和0.01μg/ml加入。对于CD4⁺T细胞和CD4⁺CD25^-T细胞群体的增殖测定，2x10⁵个CD4⁺T细胞或CD4⁺CD25^-T细胞在96孔U形底平板中与丝裂霉素处理的脾细胞一起，以CD4⁺T细胞或CD4⁺CD25^-T细胞/APC1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0的比例在含或不含中和抗体的总体积200μl的完全培养基中培养16小时，所述脾细胞装载有1mg/ml BLG，充当抗原呈递细胞。于37℃在5％CO₂加湿培养箱中72小时后，通过加入1μCi/孔[³H]-胸苷来评估增殖。在18小时后在玻璃纤维滤器垫（Perkin Elmer，Boston，USA）上收获DNA结合的放射性活性，并且在闪烁计数器（Perkin Elmer）上测量胸苷掺入。

对于细胞因子测量，在培养24、48和72小时后收集在不同增殖测定中使用的细胞培养上清液，且于-80℃进行冷冻直至执行细胞因子分析。细胞因子产生使用Mouse Inflammation Cytometric Bead Assay（BD Biosciences，Mountain View，CA，USA）进行定量。

体内T调节活性测定

为了测试抗体形成在小鼠中的有效抑制，将从不同实验乳酸乳球菌处理的组中分离的脾细胞、珠纯化的CD4⁺T细胞、CD4⁺CD25^-或CD4⁺CD25⁺T细胞过继转移给首次用于实验的C3H/HeOuJ小鼠。未处理的小鼠用作对照。转移细胞的数目对于整体脾细胞、亚群耗尽的脾细胞、或阳性选择的CD4⁺细胞以及CD4⁺CD25^-和CD4⁺CD25⁺T细胞是10⁷。如果牵涉Treg，那么这些小鼠用BLG抗原的后续攻击应阻止针对BLG的体液免疫应答的诱导和过敏反应。

用于BLG特异性血清和粪便抗体的酶联免疫测定。

在第0、7、14、21和28天时通过尾部采血获得血清。同时获得粪便，并且重悬浮于补充有0.1mg/mL的胃酶抑素（pepstatin）1：1000（Fluka）的PBS加1％FCS（Life technologies）中。样品进行机械解聚，并且涡旋2分钟，随后2次于4℃在14,000rpm下离心20分钟。

血清和粪便通过从Adel-Patient等人（2000，J.ImmunolMethods）改良的方法就BLG特异性IgE、IgG1、IgG2a和/或IgA抗体水平进行测定。简言之，MaxiSorp微量滴定板（Nunc）在室温下用250ng/孔链霉抗生物素蛋白（Fluka）包被18小时，随后用300μL聚乙烯吡咯烷酮K25（Fluka）溶液包被过夜。1微克生物素化的BLG温育3小时，并且在0.5μg/mL山羊抗小鼠IgA、大鼠抗小鼠IgG1或抗小鼠IgG2a过氧化物酶标记的抗体（Southern Biotechnologies）的存在下，一式两份地加入在PBS加10％马血清中的稀释血清（1：6666和1：2222用于IgG1、1：666和1：222用于IgG2a、1：66和1：22用于IgE）或粪便（1：3、1：10和1：33），温育2小时。对于IgE测量，加入单克隆大鼠抗小鼠IgE Ab（克隆R35-72，BD Pharmingen），随后加入过氧化物酶偶联的抗大鼠Ab（Caltag）。光密度在490nm处进行测量。结果表示为任意单位，且来自BLG加alum免疫的小鼠的混合血清用作参考血清。

抗原特异性抗体产生通过ELISPOT方法进行测量。

淋巴集结（Peyer's patches）机械地从肠切除，并且在补充有5mmol EDTA（Life Technologies）的HBSS培养基中温育30分钟。类似地，将淋巴集结和肠系膜淋巴结轻轻压碎，并且通过70-μm尼龙滤器进行过滤。脾细胞在Tris缓冲的NH₄Cl中预温育5分钟以去除红细胞。淋巴母细胞在Percoll60％/66％梯度（Amersham）上进行分离。

对于BLG特异性IgG1、IgG2a和IgA抗体的测量，ELISPOT平板（Millipore）用链霉抗生物素蛋白于37℃包被过夜，随后添加1μg生物素化的BLG并温育3小时。在Percoll60％/66％梯度上分离的淋巴母细胞以2个不同浓度（1和2×10⁶）重悬浮于Iscove's改良的Dulbecco's培养基中并于37℃温育24小时，所述培养基补充有青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺、庆大霉素、多粘菌素B和5％FCS，随后与抗-IgA、抗-IgG1和抗-IgG2a抗体（Southern Biotechnology）一起于4℃温育过夜。加入氨基乙基咔唑100μL/孔并温育10分钟，并且通过使用KS ELISPOT4.2.1Software（Zeiss）自动计数斑点，且将其表示为细胞形成单位/10⁶细胞（CFU）。

LL-BLG在食物过敏鼠类模型中显著增强BLG的耐受性诱导能力

为了研究口服耐受性的诱导，小鼠如上所述（实验设置）进行经口饲喂。LL-BLG的添加显著增强针对BLG的耐受性诱导，因为与对照以及游离BLG组比较，脾细胞的变应原特异性增殖应答在LL-BLG组中显著减少。

LL-BLG增强与响应所述变应原的减少的BLG特异性抗体应答和降低的IL-4细胞因子产生相关的口服耐受性。

为了研究口服耐受性的诱导，小鼠如上所述（实验设置）进行经口饲喂。响应所述因子的BLG特异性抗体应答和细胞因子产生如上所述进行测定。与对照和游离BLG组比较，BLG特异性抗体水平和IL-4在LL-BLG组中显著减少。

结果

LL-BLG经由CD4+T细胞增强口服耐受性。

为了评估CD4T细胞是否介导口服耐受性的诱导，变应原特异性增殖CD4T细胞应答在脾细胞和淋巴结中进行研究。因此，小鼠如上所述（实验设置）进行经口饲喂，并且变应原特异性CD4+T细胞增殖如细胞培养、增殖和细胞因子测定中所述进行测定。与对照和游离BLG组比较，LL-BLG组中的变应原特异性CD4T细胞应答显著减少。

在LL-BLG处理后抗原诱导的T调节细胞可以在体内转移保护避免 过敏样应答

为了在用口服耐受性方案处理的小鼠中测试过敏样应答的有效抑制，如上所述（体内T调节活性测定）过继转移来自不同处理组的脾细胞。与对照和游离BLG组比较，过敏样应答在LL-BLG组中显著减少，表明在我们的组合口服耐受性方案中调节CD4⁺T细胞激活。

结论

我们的数据证实分泌变应原的乳酸乳球菌的粘膜递送比游离变应原更有效地经由诱导抗原特异性CD4⁺调节T细胞来诱导变应原特异性免疫耐受性。

实施例F：在分泌所述自身抗原的乳酸乳球菌的经口施用后诱导 对胰岛素的耐受性

前言

自身免疫的特征在于由对自体抗原的耐受性的丧失导致的自发性炎性组织损害和损伤的生理功能。它与部分过度活跃的免疫系统相关，所述免疫系统特征在于过量的T辅助（Th）细胞。诱病因素例如易感基因和环境因素难以影响，因此，开发免疫治疗的近期努力集中于重新建立病原性效应细胞和免疫调节T细胞之间的功能平衡（通过耗尽前者和/或增强后者）。胰岛β细胞的自身免疫破坏是1型糖尿病（T1D）的主因。这种破坏与针对几种β细胞自身抗原的细胞和体液免疫应答相关，这两种应答可以在疾病的临床发作之前。

此处，证实自身抗原递送乳酸乳球菌的经口递送经由诱导抗原特异性CD4⁺调节T细胞而抑制糖尿病特异性免疫应答。

材料与方法

细菌和质粒

乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至终使用。细菌在GM17培养基中进行培养，所述GM17培养基即补充有0.5％葡萄糖的M17（DifcoLaboratories，Detroit，MI）。所有菌株的贮备悬浮液于-20℃贮存于在GM17中的50％甘油中。对于胃内接种，贮备悬浮液在新鲜GM17中稀释200倍，并且于30℃进行温育。它们在16小时内达到2x10⁹菌落形成单位（CFU）/ml的饱和密度。细菌通过离心进行收获并且在BM9培养基中进行10倍浓缩。对于处理，每只小鼠通过胃内导管每天接受100μl这种悬浮液。

合成编码人胰岛素原II B24-C36肽（hpIIp）、猪胰岛素和免疫显性肽InsB_9-23（B9-23在许多物种包括人、大鼠和小鼠中基本上相同）的具有最佳乳酸乳球菌密码子使用的DNA序列，进行扩增且将其与乳球菌属P1启动子下游的红霉素抗性pT1NX载体的Usp45分泌信号融合。

用携带鼠类hpIIp、胰岛素、InsB_9-23的质粒转化的MG1363菌株命名为LL-hpIIp、LL-胰岛素、LL-InsB_9-23。其为包含空载体pT1NX的MG1363的LL-pT1NX充当对照。这些蛋白质的表达使用抗原特异性ELISA和蛋白质印迹分析进行测定。

小鼠

非肥胖雌性和雄性糖尿病（NOD）小鼠和NOD严重联合免疫缺陷（SCID）（Balb/c背景）小鼠购自Jackson实验室。Balb/c野生型（WT）小鼠购自Charles River Italy。小鼠维持于特定无病原体中心动物实验室中。小鼠依照机构指导进行处理和使用。

实验设置

在预防背景中，LL-hpIIp、LL-胰岛素、LL-InsB_9-23从第21天大时（断奶）开始经口施用于NOD小鼠，使用最佳饲喂方案或直至100天大时（此时大多数小鼠发展糖尿病）。此外，LL-pT1NX作为阴性对照进行经口施用。对于阳性（耐受）对照组，3周大的NOD小鼠用0.8mg人胰岛素/hpIIp/InsB_9-23进行经口处理，每周3次，进行2或4周。糖尿病的发展通过每周3次连续监控尿糖水平进行测定，并且在糖尿的情况下监控血糖水平。在12-23周时以及在实验结束时（35周）收集胰腺，并且连续切片用苏木精/曙红染色以对单核细胞浸润评分，或通过免疫组织化学以分析T细胞浸润。

在治疗背景中，LL-hpIIp、LL-胰岛素、LL-InsB_9-23经口施用于显示稳定糖尿和高血糖症的糖尿病NOD雌性（12-23周）。此外，LL-pT1NX作为阴性对照进行经口施用。对于阳性（耐受）对照组，糖尿病NOD小鼠如Bresson等人2006中所述进行处理。完全缓解定义为糖尿的消失和回复正常血糖。

在同基因岛移植背景中，具有近期发作的糖尿病的雌性NOD小鼠用LL-hpIIp、LL-胰岛素、LL-InsB_9-23或用作为阴性对照的LL-pT1NX经口处理3周。3周后，将来自非糖尿病NOD小鼠的500个新近分离的胰岛移植给糖尿病NOD小鼠。血糖随后每周监控3次，直至糖尿病复发或直至移植后15周时。具有连续2次葡萄糖水平≥250mg/dL的动物视为患有糖尿病，并且随后将其处死用于血清收集和移植物的组织学分析。

耐受性诱导的精确机制在用特定自身抗原再攻击NOD小鼠后通过将T细胞过继转移到NOD-SCID小鼠内在体外、在体内进行分析。

糖尿病的检测：

葡萄糖监控：尿糖通过使用Diastix（Miles）进行测量，并且通过血糖测量用血糖监控系统OneTouch Ultra（LifeScan Inc.）加以证实。糖尿病定义为连续2次血糖值超过250mg/dl。

胰岛炎：通过CO₂窒息杀死小鼠，并且胰腺在10％福尔马林中固定过夜，在石蜡中进行包埋，并且连续5μm切片用苏木精和曙红进行染色。胰岛炎得分（平均值±SD）通过用显微镜将10-15个岛/小鼠中的细胞浸润程度如下分级进行测定：0，无可见的岛浸润标志；1，岛周围浸润；2，<50％浸润；3，>50％浸润。

岛分离和移植：通过在剧烈振荡过程中用在Hanks’平衡盐溶液中的胶原酶消化胰腺进行无菌去除后分离无胰岛炎和糖尿病的14-21天大的供体NOD小鼠的岛。通过在立体显微镜下的直接人工挑选进行岛分离。糖尿病受体NOD小鼠通过腹膜内注射阿佛丁（0.02ml/g BWT）进行麻醉，经由腰部切开暴露左肾，并且在肾小囊下给予500个新近分离的岛。

免疫组织化学

为了检测在胰腺β细胞中的胰岛素、CD4和CD8表达，将一抗（来自Dako的豚鼠抗猪胰岛素[稀释度1：300]、来自BD Biosciences的抗-CD4RM4.5和抗-CD8a IHC[稀释度1：50]）应用于冷冻组织切片，如Christen等人，2004中所述。

体外增殖测定

制备脾、肠系膜LN（MLN）和PLN的单细胞悬浮液。对于总脾细胞群体的增殖测定，2x10⁵细胞在96孔U形底平板中在总体积200μl的完全培养基中进行培养，所述培养基单独或具有分级浓度（1-100μg/ml）的纯化的人胰岛素、或对于CD4T细胞（InsB_9-23，H-2^d或g限制的）或对于CD8T细胞（InsB_15-23，K^d限制的）特异的肽（Sigma）、并且含有或不含抗-IL-10或抗-TGF-β中和单克隆抗体。中和抗体以1、0.1和0.01μg/ml加入。对于总CD3⁺T细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞和CD4⁺CD25-T细胞群体的增殖测定，0.2x10⁵个T细胞在96孔U形底平板中与来自WT Balb/c小鼠的1x10⁵经辐射的脾细胞一起，在含或不含中和抗体的总体积200μl的完全培养基中进行培养，所述脾细胞装载有胰岛素或GAD65或者对于CD4⁺或CD8⁺T细胞特异的肽。于37℃在5％CO₂加湿培养箱中72小时后，通过加入1μCi/孔[³H]-胸苷来评估增殖。在16-18小时后在玻璃纤维滤器垫（Perkin Elmer，Boston，USA）上收获DNA结合的放射性活性，并且在闪烁计数器（Perkin Elmer）上测量胸苷掺入。使用CD3⁺、CD4⁺或CD8⁺分离试剂盒（MACS；Milteny Biotec，Auburn，CA），通过磁珠分离经由阴性选择从PLN或脾中纯化T细胞。CD4⁺T细胞作为总细胞使用，或使用CD25⁺分离试剂盒（Milteny Biotec）通过MACS进一步分离成CD25⁺和CD25^-。细胞群体的纯度（>90％）通过流式细胞术分析进行测定。

对于细胞因子测量，在培养72小时后收集在如上所述的不同增殖测定（抗原特异性刺激）中使用的细胞培养上清液，且于-80℃进行冷冻直至执行细胞因子分析。细胞因子产生使用Mouse InflammationCytometric Bead Assay（BD Biosciences，Mountain View，CA，USA）进行定量。纯化的CD3⁺T细胞、CD4⁺T或CD8⁺T细胞进行培养，并且用抗-CD3/抗-CD28混合物（各1μg/ml）在体外非特异性刺激24小时，或它们保持未刺激作为对照。收获上清液，并且使用在BDFACSArray Bioanalyzer上的BD^TM Cytometric Bead Array flex set使用FCAP阵列软件（BD Biosciences）就IL-10、IL-4、IL-5和IFNγ产生进行分析。捕获ELISA实验使用Quantikine试剂盒（R&D Systems）进行，用于测定TGF-β1。

体外T细胞增殖抑制测定

在来自WT Balb/c小鼠的T细胞耗尽的经辐射的胰岛素或肽装载的2x10⁴脾细胞的存在下，从最近的糖尿病雌性NOD（8-12周）中分离的2x10⁴纯化的总脾CD4⁺CD25^-T细胞与不同数目的CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞和CD4⁺CD25^-T细胞群体进行共培养，所述细胞群体从来自不同实验组的脾、MLN或PLN中分离。于37℃在5％CO₂加湿培养箱中72小时后，通过加入1μCi/孔[³H]-胸苷来评估增殖。在16-18小时后在玻璃纤维滤器垫（Perkin Elmer，Boston，USA）上收获DNA结合的放射性活性，并且在闪烁计数器（Perkin Elmer）上测量胸苷掺入。

体外细胞毒性测定

所使用的淋巴母细胞靶是来自BALB/c小鼠的Con A-激活的脾细胞。总共10⁶靶细胞用100μCi⁵¹Cr（Amersham International，Buckinghamshire，U.K）于37℃标记90分钟，洗涤3次，随后与1μg/ml肽（InsB_15-23或无关肽）于37℃温育1小时。将靶细胞洗涤2次，并且以10⁴细胞/孔进行接种。以各种效应物：靶（E：T）的比例向每个孔中一式三份地加入从脾、MLN和PLN中分离的CD8⁺T细胞。平板在500rpm下离心2分钟，并且于37℃温育4小时。温育后，收集上清液用于测定⁵¹Cr释放[裂解％=100x（测试cpm-自发cpm）/（总cpm-自发cpm）]。对于间接杀死测定，在与效应物一起温育前，CD8⁺T细胞与5μg/ml抗-CD3抗体（克隆145-2C11，Pharmingen）一起温育。

糖尿病的过继转移

8-10周大的NOD-SCID小鼠用2x10⁷脾细胞进行静脉内注射或用5x10⁶脾细胞进行腹膜内注射，所述脾细胞从糖尿病雌性NOD小鼠（6周、12周和18周）中分离，与或不与分级数目的从不同实验乳酸乳球菌处理的组中分离的珠纯化的CD3⁺T细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD4⁺CD25^-或CD4⁺CD25⁺T细胞组合。未处理的小鼠用作对照。糖尿病的发展通过每周3次连续监控血糖水平进行测定。

结果

在同基因岛移植后，LL-hpIIp、LL-胰岛素、LL-InsB _9-23 延迟糖尿 病复发

为了评估LL-hpIIp、LL-胰岛素和LL-InsB（9-23）是否诱导口服耐受性，研究在同基因岛移植后的糖尿病复发。因此，小鼠如上所述（实验设置）进行经口饲喂，并且如（岛分离和移植）所述的移植胰岛。与对照比较，糖尿病复发在LL-hpIIp/胰岛素/InsB_9-23组中延迟。

LL-hpIIp、LL-胰岛素和LL-InsB_9-23在非肥胖糖尿病小鼠中显著增强游离hpIIp、胰岛素或InsB_9-23的耐受性诱导能力

为了研究口服耐受性的诱导，小鼠如上所述（实验设置）进行经口饲喂。LL-hpIIp、LL-胰岛素和LL-InsB_9-23的添加显著增强针对自身抗原的耐受性诱导，因为与对照以及游离hpIIp/胰岛素/InsB_9-23组比较，脾细胞的自身抗原特异性增殖应答在LL-hpIIp/胰岛素/InsB_9-23组中显著减少。

LL-hpIIp、LL-胰岛素和LL-InsB_9-23增强与减少的胰岛炎、减少的β细胞破坏率和脾细胞增加的IL-10产生相关的口服耐受性。

为了研究口服耐受性的诱导，小鼠如上所述（实验设置）进行经口饲喂。响应所述自身抗原的胰岛炎的存在、β细胞破坏率和细胞因子产生如上所述进行测定。组织学分析显示与对照以及游离hpIIp/胰岛素/InsB_9-23组比较，在LL-hpIIp/胰岛素/InsB_9-23组中显著降低程度的胰岛炎和β细胞破坏以及增加的IL-10产生。

LL-hpIIp、LL-胰岛素和LL-InsB _9-23 经由CD4+T细胞增强口服耐 受性

为了评估CD4T细胞是否介导口服耐受性的诱导，自身抗原特异性增殖CD4T细胞应答在脾细胞和淋巴结中进行研究。因此，小鼠如上所述（实验设置）进行经口饲喂，并且自身抗原特异性CD4+T细胞增殖如所述的（体外增殖测定）进行测定。与对照以及游离hpIIp/胰岛素/InsB_9-23组比较，LL-hpIIp/胰岛素/InsB_9-23组中的自身抗原特异性CD4T细胞应答。

实施例F5：在LL-InsB _9-23 处理后，自身攻击性CD8+应答在NOD 小鼠中被抑制

为了检查我们的组合方法是否诱导抑制性CD4+T细胞，所述CD4+T细胞能够通过旁观者抑制机制调节糖尿病，我们分析对CD8+自身攻击性T细胞的作用。抗原特异性自身攻击性CD8+细胞的百分比和/或活性在LL-InsB_9-23处理后强烈减少。

在LL-InsB _9-23 处理后抗原诱导的T调节细胞可以在体内转移保护 避免自身免疫样应答

为了在用口服耐受性方案处理的小鼠中测试糖尿病样应答的有效抑制，如上所述（糖尿病的过继转移）过继转移来自不同处理组的脾细胞。与对照和游离InsB_9-23组比较，糖尿病样应答在LL-InsB_9-23组中显著减少，表明在我们的组合口服耐受性方案中调节CD4⁺T细胞激活。

结论

证实自身抗原递送乳酸乳球菌的经口递送经由诱导抗原特异性CD4⁺调节T细胞来抑制糖尿病特异性免疫应答。

讨论

总的来说，上文呈现的数据表明，即使在致敏受试者中，分泌抗原的遗传修饰的乳酸乳球菌的经口补充也可以减少由该抗原诱导的全身性炎症。有利地，乳球菌属介导的抑制通常看起来比游离抗原的粘膜施用后的抑制更有效。潜在地，该抑制可以通过诱导Foxp3⁺调节T细胞来介导。

本申请涉及下述实施方案：

1.用于粘膜递送以治疗患者中的免疫应答相关疾病的分泌抗原的微生物，其中所述免疫应答相关疾病选自变应性哮喘、多发性硬化症、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类风湿性关节炎、食物过敏或乳糜泻。

2.用于粘膜递送以治疗、预防和/或减轻患者中的免疫应答相关疾病的组合物，所述免疫应答相关疾病选自变应性哮喘、多发性硬化症、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类风湿性关节炎、食物过敏或乳糜泻，所述组合物的特征在于其包含至少分泌抗原的微生物。

3.根据项目1使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2使用的组合物，其中所述微生物是乳酸细菌或酵母，更优选是乳酸乳球菌（LL）。

4.根据项目1或3中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2或3中任一项使用的组合物，其中所述抗原组成型分泌。

5.根据项目1、3或4中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2、3或4中任一项使用的组合物，其中所述微生物每天进行施用。

6.根据项目1或3-5中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2-5中任一项使用的组合物，其中所述抗原诱导调节T细胞（Treg）。

7.根据项目6使用的分泌抗原的微生物，或根据项目6使用的组合物，其中所述Treg细胞是Foxp3+Treg细胞。

8.根据项目1或3-7中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2-7中任一项使用的组合物，其中所述抗原是免疫显性的脱去酰胺基的抗原。

9.根据项目1或3-8中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2-8中任一项使用的组合物，其中所述抗原在HLA-DQ2或-DQ8的背景中被识别。

10.根据项目1或3-9中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2-9中任一项使用的组合物，其中所述抗原是α-麦醇溶蛋白或大麦醇溶蛋白。

11.根据项目10使用的分泌抗原的微生物，或根据项目10使用的组合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO：2、4、6或8，或由SEQ IDNO：2、4、6或8组成。

12.根据项目1或3-11中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2-11中任一项使用的组合物，其中所述抗原减少脾和腹股沟淋巴结细胞的增殖。

13.根据项目1或3-12中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2-12中任一项使用的组合物，其中所述抗原抑制炎性抗原特异性T细胞应答。

14.根据项目1或3-13中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2-13中任一项使用的组合物，其中所述粘膜递送选自直肠递送、颊递送、肺递送、眼递送、鼻递送、阴道递送和经口递送。

15.根据项目1或3-14中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2-14中任一项使用的组合物，其中递送所述微生物至少1周、更优选至少1个月或1年。

16.根据项目1或3-15中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2-15中任一项使用的组合物，其中所述微生物每天递送至少1次，优选每天2次。

17.根据项目1或3-16中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2-16中任一项使用的组合物，其中所述微生物以至少10毫微微克-100mg/天，例如100fg-10mg/天、或1pg-1mg/天、或10pg-100μg/天、或100pg-10μg/天、或1ng-1μg/天、或10ng-100mg/天的剂量进行递送。

18.根据项目1或3-17中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2-17中任一项使用的组合物，其中所述微生物通过喷雾剂、胶囊、气雾剂、锭剂、大丸剂、片剂、囊剂、液体、悬浮液、乳状液或糖锭进行施用。

19.根据项目1或3-18中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2-18中任一项使用的组合物，其中所述微生物或组合物配制为药剂、医学食物或营养食品。

20.用于治疗、预防和/或减轻患者中的免疫应答相关疾病的方法，其包括粘膜递送包含表达抗原的微生物的组合物，其中所述抗原被分泌，并且其中所述组合物每天进行递送。

21.根据项目20的方法，其中所述微生物是乳酸细菌或酵母，更优选是乳酸乳球菌（LL）。

22.根据项目20或21中任一项的方法，其中所述疾病选自变应性哮喘、多发性硬化症、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类风湿性关节炎、食物过敏或乳糜泻。

23.根据项目20-22中任一项的方法，其中所述分泌是组成型的。

24.根据项目20-23中任一项的方法，其中所述抗原诱导调节T细胞（Treg）。

25.根据项目24的方法，其中所述Treg细胞是Foxp3+Treg细胞。

26.根据项目20-25中任一项的方法，其中所述抗原是免疫显性的脱去酰胺基的抗原。

27.根据项目20-26中任一项的方法，其中所述抗原在HLA-DQ2或-DQ8的背景中被识别。

28.根据项目20-27中任一项的方法，其中所述抗原是α-麦醇溶蛋白或大麦醇溶蛋白。

29.根据项目28的方法，其中所述抗原包含SEQ ID NO：2、4、6或8，或由SEQ ID NO：2、4、6或8组成。

30.根据项目20-29中任一项的方法，其中所述抗原减少脾和腹股沟淋巴结细胞的增殖。

31.根据项目20-30中任一项的方法，其中所述抗原抑制炎性抗原特异性T细胞应答。

32.根据项目20-31中任一项的方法，其中所述粘膜递送选自直肠递送、颊递送、肺递送、眼递送、鼻递送、阴道递送和经口递送。

33.根据项目20-32中任一项的方法，其中递送所述微生物至少1周、更优选至少1个月或1年。

34.根据项目20-33中任一项的方法，其中所述微生物每天递送至少1次，优选每天2次。

35.根据项目20-34中任一项的方法，其中所述微生物以至少10毫微微克-100mg/天，例如100fg-10mg/天、或1pg-1mg/天、或10pg-100μg/天、或100pg-10μg/天、或1ng-1μg/天、或10ng-100mg/天的剂量进行递送。

36.根据项目20-35中任一项的方法，其中所述微生物通过喷雾剂、胶囊、气雾剂、锭剂、大丸剂、片剂、囊剂、液体、悬浮液、乳状液或糖锭进行施用。

37.包含微生物的组合物，其中所述微生物组成型分泌抗原，所述抗原涉及变应性哮喘、多发性硬化症、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类风湿性关节炎、食物过敏或乳糜泻的诱导。

38.根据项目37的组合物，其中所述微生物是乳酸细菌或酵母，更优选是乳酸乳球菌（LL）。

39.根据项目37或38中任一项的组合物，其中所述微生物以至少10毫微微克-100mg，例如100fg-10mg、或1pg-1mg、或10pg-100μg、或100pg-10μg、或1ng-1μg、或10ng-100mg的剂量存在。

40.产品，其包含项目37-39中任一项的组合物。

41.项目40的产品，其中所述产品选自喷雾剂、胶囊、气雾剂、锭剂、大丸剂、片剂、囊剂、液体、悬浮液、乳状液或糖锭。

42.用于治疗、预防和/或减轻涉及免疫应答相关疾病的疾病或病症的药剂、医学食物或营养食品，其包含至少微生物，其中所述微生物组成型分泌抗原，所述抗原涉及变应性哮喘、多发性硬化症、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类风湿性关节炎、食物过敏或乳糜泻的诱导。

43.根据项目42的药剂、医学食物或营养食品，其中所述微生物是乳酸细菌或酵母，更优选是乳酸乳球菌（LL）。

44.根据项目1或3-19中任一项使用的分泌抗原的微生物，或根据项目2-19中任一项使用的组合物，其中所述抗原被制备以在所述患者中持续存在。

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Claims (57)

1.用于粘膜递送以治疗、预防和/或减轻受试者中的过敏的分泌抗原的微生物。

2.根据权利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述过敏是变态反应、变应性哮喘或食物过敏。

3.根据权利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原涉及受试者中过敏的诱导。

4.根据权利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述微生物是乳酸细菌。

5.根据权利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述微生物是乳酸乳球菌（LL）。

6.根据权利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原诱导调节T细胞（Treg）。

7.根据权利要求6使用的分泌抗原的微生物，其中所述Treg细胞是Foxp3+Treg细胞。

8.根据权利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原是Der p1或β-乳球蛋白（BLG）肽。

9.根据权利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原减少脾和腹股沟淋巴结细胞的增殖。

10.根据权利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原抑制炎性抗原特异性T细胞应答。

11.根据权利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述粘膜递送选自直肠递送、颊递送、肺递送、眼递送、鼻递送、阴道递送和经口递送。

12.根据权利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述分泌是组成型的。

13.用于粘膜递送以治疗、预防和/或减轻受试者中的过敏的组合物，所述组合物的特征在于其包含至少分泌抗原的微生物。

14.根据权利要求13使用的组合物，其中所述过敏是变态反应、变应性哮喘或食物过敏。

15.根据权利要求13使用的组合物，其中所述抗原涉及受试者中过敏的诱导。

16.根据权利要求13使用的组合物，其中所述微生物是乳酸细菌。

17.根据权利要求13使用的组合物，其中所述微生物是乳酸乳球菌（LL）。

18.根据权利要求13使用的组合物，其中所述抗原诱导调节T细胞（Treg）。

19.根据权利要求18使用的组合物，其中所述Treg细胞是Foxp3+Treg细胞。

20.根据权利要求13使用的组合物，其中所述抗原是Der p1或β-乳球蛋白（BLG）肽。

21.根据权利要求13使用的组合物，其中所述抗原减少脾和腹股沟淋巴结细胞的增殖。

22.根据权利要求13使用的组合物，其中所述抗原抑制炎性抗原特异性T细胞应答。

23.根据权利要求13使用的组合物，其中所述粘膜递送选自直肠递送、颊递送、肺递送、眼递送、鼻递送、阴道递送和经口递送。

24.根据权利要求13使用的组合物，其中所述分泌是组成型的。

25.表达抗原的微生物在制备用于粘膜递送以治疗、预防和/或减轻过敏的组合物中的用途，其中所述抗原被分泌。

26.根据权利要求25的用途，其中所述过敏是变态反应、变应性哮喘或食物过敏。

27.根据权利要求25的用途，其中所述抗原涉及受试者中过敏的诱导。

28.根据权利要求25的用途，其中所述微生物是乳酸细菌。

29.根据权利要求25的用途，其中所述微生物是乳酸乳球菌（LL）。

30.根据权利要求25的用途，其中所述抗原诱导调节T细胞（Treg）。

31.根据权利要求30的用途，其中所述Treg细胞是Foxp3+Treg细胞。

32.根据权利要求25的用途，其中所述抗原是Der p1或β-乳球蛋白（BLG）肽。

33.根据权利要求25的用途，其中所述抗原减少脾和腹股沟淋巴结细胞的增殖。

34.根据权利要求25的用途，其中所述抗原抑制炎性抗原特异性T细胞应答。

35.根据权利要求25的用途，其中所述粘膜递送选自直肠递送、颊递送、肺递送、眼递送、鼻递送、阴道递送和经口递送。

36.根据权利要求25的用途，其中所述分泌是组成型的。

37.包含微生物的组合物，其中所述微生物组成型分泌抗原，所述抗原涉及过敏的诱导。

38.根据权利要求37的组合物，其中所述过敏是变态反应、变应性哮喘或食物过敏。

39.根据权利要求37的组合物，其中所述微生物是乳酸细菌。

40.根据权利要求37的组合物，其中所述微生物是乳酸乳球菌（LL）。

41.根据权利要求37的组合物，其中所述微生物以至少10飞克-100mg的剂量存在。

42.根据权利要求41的组合物，其中所述微生物以100fg-10mg/天的剂量存在。

43.根据权利要求41的组合物，其中所述微生物以1pg-1mg/天的剂量存在。

44.根据权利要求41的组合物，其中所述微生物以10pg-100μg/天的剂量存在。

45.根据权利要求41的组合物，其中所述微生物以100pg-10μg/天的剂量存在。

46.根据权利要求41的组合物，其中所述微生物以1ng-1μg/天的剂量存在。

47.根据权利要求41的组合物，其中所述微生物以10ng-100mg/天的剂量存在。

48.权利要求37的组合物，其中所述组合物选自喷雾剂、胶囊、气雾剂、锭剂、大丸剂、片剂、囊剂、液体、悬浮液、乳状液或糖锭。

49.用于治疗、预防和/或减轻过敏的药剂，其包含至少乳酸细菌，其中所述乳酸细菌组成型分泌异源抗原，所述抗原涉及过敏的诱导。

50.根据权利要求49的药剂，其中所述过敏是变态反应、变应性哮喘或食物过敏。

51.根据权利要求49的药剂，其中所述乳酸细菌是乳酸乳球菌（LL）。

52.用于治疗、预防和/或减轻过敏的医学食物，其包含至少乳酸细菌，其中所述乳酸细菌组成型分泌异源抗原，所述抗原涉及过敏的诱导。

53.根据权利要求52的医学食物，其中所述过敏是变态反应、变应性哮喘或食物过敏。

54.根据权利要求52的医学食物，其中所述乳酸细菌是乳酸乳球菌（LL）。

55.用于治疗、预防和/或减轻过敏的营养食品，其包含至少乳酸细菌，其中所述乳酸细菌组成型分泌异源抗原，所述抗原涉及过敏的诱导。

56.根据权利要求55的营养食品，其中所述过敏是变态反应、变应性哮喘或食物过敏。

57.根据权利要求55的营养食品，其中所述乳酸细菌是乳酸乳球菌（LL）。