CN103926338A - 一种测定色胺含量的高效液相色谱方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定色胺含量的高效液相色谱法，流动相：甲醇-乙腈-乙酸铵溶液（5-30-65，体积比；乙酸铵为0.025mol/L）；流速：1.0ml/min；色谱柱：C₁₈（4.6×250mm5μm）；柱温：25℃；进样量：5μl；紫外检测器；检测波长：280nm。色胺在进样量0.05~5μg内与峰面积呈良好线性关系，线性相关系数r=1.0000。采用本发明的高效液相方法检测色胺含量，具有样品分析时间短；检测成本低；准确性和精确性高；稳定性好；检测有效范围广等优点。

Description

一种测定色胺含量的高效液相色谱方法

技术领域

本发明涉及一种测定色胺含量的高效液相色谱方法。 

背景技术

色胺是一种重要的医药中间体。是一种见于植物、动物和真菌的单胺生物碱，它以痕量存在于哺乳动物脑中，有研究认为色胺起神经调质和神经递质的作用。色胺含有一个吲哚核，结构与色氨酸类似并因此得名。 

色胺是由色氨酸脱羧形成或由胺氧化酶氧化形成，为哈尔满形成的前体。色胺是一种吲哚衍生物，吲哚以其独有的化学结构，使其衍生物在许多方面具有独有的生理活性，在医药方面许多天然药物中均有吲哚结构，许多生物碱中含有吲哚环系，吲哚及其衍生物可以合成解热镇痛剂、兴奋药、降压药、血管扩张药、抗阻胺药等。色胺类化合物是吲哚最重要的衍生产品，也是主要消费吲哚的领域，色胺类是以色胺为母结构的一类化合物，含许多具生物活性的物质，这类吲哚衍生物与人类的生命活动密切相关，其中5-羟基色胺是一种重要的神经介质，是维持人体精神的和思维正常活动的不可缺少的物质；褪黑素及其衍生物在睡眠、调节生理节奏，抗肿瘤等方面十分有效；5-甲氧基色胺盐酸盐则是一种镇定剂和防射线剂。 

5-羟色胺是一种重要的色胺类化合物，是最受关注的一种神经递质。5-羟色胺最早是从血清中发现，又名血清素，广泛存在于哺乳动物组织中。5-羟色胺在大脑皮层质及神经突触内含量很高，是一种能产生愉悦情绪的信使，几乎影响到大脑活动的每一个方面：从调节情绪、精力、记忆力到塑造人生观等；在外周组织，5-羟色胺是一种强血管收缩剂和平滑肌收缩刺激剂。 

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、分离效果好、精密度和准确性高的色胺含量的检测方法。为达到上述目的，本方法采用了如下技术方案： 

（1）色谱条件：

色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物，分别选用Thermo C₁₈柱 (4.6×250mm 5μm)、Thermo C₁₈柱 (4.6×150mm 5μm)和Thermo C₁₈柱 (4.6×100mm 5μm)进行试验，优选Thermo C18柱 (4.6×250mm 5μm)，具有更好的分离效果。

流动相为甲醇-乙腈-乙酸铵溶液，其中甲醇的体积分数为5%~30%，优选体积为5%；乙腈为20~50%，优选体积为30%；乙酸铵溶液的浓度为0.01~0.05mol/L，优选浓度为0.025mol/L；流速0.6~1.5ml/min；柱温20~40℃，优选流速为1ml/min，柱温为25℃。 

本发明使用Agilent-1260高效液相色谱仪，采用紫外检测器，检测波长280nm。 

（2）样品处理： 

精确称量标准品约50mg，放入50ml容量瓶中，加入色谱甲醇适量超声溶解后定容至刻度线，摇匀后用0.2μm有机滤头过滤。

精确称量相同质量的供试品，放入50ml容量瓶中，加入色谱甲醇适量超声溶解后定容至刻度线，摇匀后用0.2μm有机滤头过滤。 

（3）测定法： 

采用自动进样方法分别取5μl标准品与供试品溶液，按外标法以峰面积计算色胺的含量。

本发明经过精密度试验、线性关系实验、线性范围实验和加样回收实验等试验对方法进行验证，结果表明该方法准确可靠，检测迅速；成本低廉；检测范围大；灵敏度、精确性高。 

附图说明

图1为色胺的结构式。 

图2为色胺标准品的HPLC检测图谱。 

图3为色胺的线性关系图与回归方程。 

具体实施方式

下面具体实施例进一步说明本发明的详细分析方法，但本发明并不局限于权利要求所保护的范围的限定。 

实施例1 

精密称取标准品适量，置于50ml容量瓶中，加色谱甲醇超声使样品溶解后稀释定容至刻度线，用1ml注射器取溶液经0.2μm，13mm的一次性有机滤头过滤，得标准品溶液；精密称取相同重量的供试品，置于50ml容量瓶中，加色谱甲醇超声使样品溶解后稀释定容至刻度线，用1ml注射器取溶液经0.2μm，13mm的一次性有机滤头过滤，即得供试品溶液。标准品和供试品各配置5个

色谱条件：用Agilent-1260高效液相色谱仪，用C₁₈反相色谱柱（Thermo C₁₈  4.6x250mm 5μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.025mol/L乙酸铵溶液（5-30-65 V/V/V）；流速：1ml/min；检测波长：280nm；检测器：紫外检测器；采集时间：40min；柱温：25℃。

按上述色谱条件，分别对5个标准品和供试品进样，所得峰面积值如表1. 

表1标准品和供试品峰面积

标准品溶液5个样品分别进样所得峰面积平均值为8527.44102，RSD值为0.11%；供试品溶液5个样品分别进样所得峰面积平均值为8450.15629，RSD值为0.14%。

    根据公式： 

色胺含量（%）=（待测样品峰面积/标准峰面积）*（标准品浓度/待测样品浓度）*100%

    采用外标法将标准品与供试品平均值代入即可色胺的含量为99.09%。

    通过上述实例表明本发明稳定性好，精确度高，适用于色胺的含量测定。 

本发明的方法学考察

    (1)线性关系实验

    根据发明所述方法，用50ml的容量瓶配置浓度为1mg/ml的储备液，加甲醇分别稀释成1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml的标准溶液，按照本发明分析方法，对进样量（X）和峰面积（Y）进行数据回归分析（线性关系图见图3），回归方程为：Y=1708.9X-0.3994，r=1.0000。结果表明，色胺在0.05μg~5μg浓度范围内，峰面积和进样量呈良好的线性关系。

(2)精密度考察 

称取同一色胺样品，进行6次重复试验，峰面积如表2：

表2 色胺样品6次重复试验的峰面积

次数	1	2	3	4	5	6
							峰面积	8534.06127	8530.13923	8538.99123	8529.12137	8533.65291	8525.74523

峰面积RSD值为0.05%。结果表明，本HPLC法检测色胺含量精密度很高，重现性很好。

（3）稳定性试验 

取色胺样品，按本发明方法配置，室温下放置0、4、8、12、24、48h后，采用安捷伦高效液相色谱仪设置进样量5μl，依法测定，计算色胺峰面积的相对标准偏差，结果RSD为0.41%，结果表明色胺样品溶液在48h内稳定性较好。

（4）加样回收率试验 

准确称取已知含量的色胺样品适量，再分别精密加入一定量的色胺样品80％、100％、120％，使供试品溶液中的色胺浓度分别在色胺标准曲线的高、中、低区域各2份，按本发明项下的操作，依法测定，计算回收率，结果平均回收率为99.49％，RSD为0.33％，表明该方法加样回收率好。

Claims (6)

1.一种测定色胺含量的高效液相色谱法，其特征在于色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物的反相色谱柱；流动相为甲醇-乙腈-乙酸铵溶液；检测器为紫外检测器。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于流动相为甲醇、乙腈与乙酸铵溶液组成的混合溶液，其中甲醇的体积分数为5%~30%，优选体积为5%；乙腈为20~50%，优选体积为30%；乙酸铵溶液的浓度为0.01~0.05mol/L，优选浓度为0.025mol/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充物，流动相流速为0.6~1.5ml/min，柱温20~40℃，其中最佳流速为1ml/min，柱温为25℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用紫外检测器，检测波长为280nm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于样品用甲醇溶解，进样量为5μl。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于本高效液相色谱法采用外标法对色胺的含量进行测定；进样量与峰面积线性关系中浓度范围为0.25μg~25μg。