CN103926207A - 一种纯化抗体中制备纯化曲线的方法 - Google Patents

一种纯化抗体中制备纯化曲线的方法 Download PDF

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高旭哲
张玥
刘畅
战辛
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Abstract

一种纯化抗体中制备纯化曲线的方法，其特点是：A）对经过饱和硫酸铵沉淀的兔抗乙脑病毒血清选用蛋白A柱纯化；B）同时用多个0.5ml离心管接收流出组分；C）用Bindingbuffer清洗柱；<b/>使纯化样品进入柱内，连续接收流出组分；D）使用Bindingbuffer清洗柱，连续接收流出组分；E）使用Elutionbuffer洗脱柱，连续接收流出组分；F）每个收集管中取50μl分别加入384孔板中。本方法利用酶标仪，对每个洗脱组分在280nm波长下检测其吸收值，进而检测其IgG含量，并得到最终纯化组分曲线，可替代自动检测器描述整个过程纯化。

Description

一种纯化抗体中制备纯化曲线的方法
技术领域
本发明涉及一种生物制备中的实验方法，特别是涉及一种纯化抗体中制备纯化曲线的方法，主要应用于实验室内抗体（蛋白）制备，可以代替检测器制备纯化曲线。
背景技术
紫外检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。
酶标仪实际上就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计,其基本工作原理与主要结构和光电比色计基本相同, 可以同时对几十或上百个样品进行检测。
微孔板是一种经事先包理专用于放置待测样本的透明塑料板,板上有多排大小均匀一致的小孔,微孔板上每个小孔可盛放10-100微升的溶液。可以快速、平行检测大量的样品。
蛋白质纯化是生物实验的基础技术，实验室内经常制备少量纯化抗体用于实验应用。由于样品量少，多采用注射器加压的手动进样方式代替进样泵，并且一般不需检测器检测流出各组分。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的上述不足，公开一种纯化抗体中制备纯化曲线的方法。本发明在少量制备抗体时，可以代替实验室昂贵的纯化设备，用手动的方法绘制整个纯化过程曲线图谱。
本发明利用实验室常用仪器——酶标仪，以蛋白A 亲和柱纯化兔抗乙脑病毒多克隆抗体为例对每个洗脱组分在280nm波长下检测其吸收值，进而检测其IgG含量，并得到最终纯化组分曲线，替代自动检测器描述整个过程纯化。
本发明给出的技术方案是：这种纯化抗体中制备纯化曲线的方法，其特征在于有以下步骤。
A）对经过饱和硫酸铵沉淀的兔抗乙脑病毒血清选用蛋白A柱纯化，选择纯化柱的体积是1ml。
B）同时用多个0.5ml离心管接收流出组分，每个管内收集0.2ml流出组分。
C）首先平衡柱：用Binding buffer清洗柱，清洗5个柱体积（取最后1个柱体积的流出组分作为实验空白）。
D）使用注射器注射1ml待纯化样品进入柱内，连续接收流出组分。
C）使用5个柱体积的Binding buffer清洗柱,连续接收流出组分。
E）使用3个柱体积的Elution buffer 洗脱柱，连续接收流出组分。
F）每个收集管中取50μl分别加入384孔板中.（此板需适合紫外检测，加样时避免产生气泡）；设定平衡柱的流出组分为空白。同时设定酶标仪波长280nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是。
本发明在少量制备抗体时，可以代替实验室昂贵的纯化设备，用手动的方法直接绘制整个纯化过程曲线图谱，不必使用专用设备绘制纯化曲线。
附图说明
图1是亲和纯化抗体的曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明给出的技术方案做出进一步说明。
这种纯化抗体中制备纯化曲线的方法有以下步骤。
A）对经过饱和硫酸铵沉淀的兔抗乙脑病毒血清选用蛋白A柱纯化。选择纯化柱的体积是1ml。
B）同时用多个0.5ml离心管接收流出组分，每个管内收集0.2ml流出组分。
C）首先平衡柱：用Binding buffer清洗柱，清洗5个柱体积（取最后1个柱体积的流出组分作为实验空白）。
D）使用注射器注射1ml待纯化样品进入柱内，连续接收流出组分。
C）使用5个柱体积的Binding buffer清洗柱,连续接收流出组分。
E）使用3个柱体积的Elution buffer 洗脱柱，连续接收流出组分。
F）每个收集管中取50μl分别加入384孔板中.（此板需适合紫外检测，加样时避免产生气泡）；设定平衡柱的流出组分为空白。同时设定酶标仪波长280nm。
亲和纯化检测A280数据列表。
 图1是亲和纯化抗体的曲线，图中可见：在0-4个柱体积清洗可以完全去除杂质，6-8柱体积回收抗体，在过多回收会降低抗体浓度。从图中的两个峰面积粗略估算杂质与抗体的含量比例。

Claims (1)

1.一种纯化抗体中制备纯化曲线的方法，其特征在于有以下步骤：
A）对经过饱和硫酸铵沉淀的兔抗乙脑病毒血清选用蛋白A柱纯化，选择纯化柱的体积是1ml；
B）同时用多个0.5ml离心管接收流出组分，每个管内收集0.2ml流出组分；
C）首先平衡柱：用Binding buffer清洗柱，清洗5个柱体积（取最后1个柱体积的流出组分作为实验空白）；
D）使用注射器注射1ml待纯化样品进入柱内，连续接收流出组分；
C）使用5个柱体积的Binding buffer清洗柱,连续接收流出组分；
E）使用3个柱体积的Elution buffer 洗脱柱，连续接收流出组分；
F）每个收集管中取50μl分别加入384孔板中.（此板需适合紫外检测，加样时避免产生气泡）；设定平衡柱的流出组分为空白，同时设定酶标仪波长280nm。
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