CN103911364A - 一种专用药材pcr反应增强剂 - Google Patents

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黄璐琦
袁媛
李旻辉
蒋超
崔占虎
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Abstract

本发明属于分子生物学技术和实验方法领域，具体涉及中药材领域，特别涉及一种中药材PCR扩增反应液。其特征在于包含PCR扩增反应增强剂，具体为1-10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)和5-100mg/ml聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。使用以上混合试剂可以明显增强中药材DNA条形码通用引物PCR扩增的成功率，进而提高PCR扩增效率。

Description

一种专用药材PCR反应增强剂
技术领域
本发明属于分子生物学技术和实验方法领域，具体涉及中药材领域，涉及一种中药材PCR扩增反应液。特别用于药材通用引物PCR的扩增。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。
近年来，分子鉴定技术已被应用于药材鉴别，其中以PCR技术为核心的药材鉴定方法已较为成熟。如RAPD和AP-PCR等方法，Cheung等人采用AP-PCR法建立能够区别人参和西洋参的DNA指纹图谱(Cheung K S，Kwan H S，But P P H et al.Pharmacognostical identificationof American and oriental ginseng roots by genomic fingerprinting using arbitrarily primedpolymerase chain reaction(AP-PCR).Journal of Ethnopharmacology，1994，42(1)：67-69)。曹辉等人用该方法成功的鉴定了中药材地胆草与白花地胆草混淆品(曹辉，毕培曦，邵鹏柱.中药材苦地胆的DNA指纹鉴定.中药材，1996，19(12)：608-612)及蒲公英与6种土公英混淆品(曹辉，毕培曦，邵鹏柱.香港市蒲公英及其混淆品土公英的DNA指纹鉴别研究.1997，22(4)：197-200)。
但由于药材来源复杂，其DNA纯度和浓度往往不能满足PCR的需求，严重制约了药材分子鉴定的效率。研制药材专用PCR增强剂，提高药材DNA的PCR成功率，对于节约研究成本、缩短实验周期、促进药材分子鉴定技术的推广具有重要的意义。
PCR增强剂包括二甲基亚砜(DMSO)，牛血清白蛋白(BSA)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，甜菜碱等。
本研究筛选获得一种含有BSA和PVP等成分的PCR增强剂，并分别采用碱裂解法和CTAB法提取180种中药材DNA，利用DNA条形码通用引物ITS2、rbcL、psbA-trnH、trnL-trnF和matK进行PCR扩增，并对本发明的PCR增强剂进行了适用性分析，建立了一种药材专用PCR反应液。
发明内容
本发明的目的是提供一种中药材PCR扩增反应液。使用本发明混合试剂可以明显增强中药材PCR扩增的成功率，进而提高扩增效率。
所述PCR扩增反应液，其特征在于包含PCR扩增反应增强剂，具体为牛血清白蛋白(BSA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
其中，牛血清白蛋白和聚乙烯吡咯烷酮都能够提高PCR反应的扩增效率，同时减少体系中PCR抑制物对反应的影响。
在本发明的实施方案中，牛血清白蛋白的浓度为1-10μg/μl，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为2-50μg/μl。
本发明筛选获得一种PCR增强剂，并分别采用碱裂解法和CTAB法提取180种中药材DNA，利用DNA条形码通用引物ITS2、rbcL、psbA-trnH、trnL-trnF和matK进行PCR扩增，对PCR增强剂的适用性进行了分析，建立了一种药材专用PCR反应液。本PCR反应增强剂可以应用于中药材ITS2、rbcL、psbA-trnH等DNA barcoding通用条形码的扩增。
附图说明
图1：10种药材PCR扩增对照试验结果
1.玉竹；2.天葵子；3.黄芪；4.地骨皮；5.天葵子；6.紫菀；7.猫爪草；8.莲须；9.黑豆；10.荔枝核；11.玉竹；12.天葵子；13.黄芪；14.地骨皮；15.天葵子；16.紫菀；17.猫爪草；18.莲须；19.黑豆；20.荔枝核；M.DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp
具体实施方式
1材料
2012年自安徽亳州药材市场，随机收集市售药材178份，其中包括50个果实种子类、22个叶及全草类、20个花类、6个茎木类、57个根及根茎类、3个动物类药材以及20个其它类药材。
2药材DNA提取将药材研磨成粉末，取0.03g粉末，利用改良CTAB法提取药材总DNA，提取缓冲液为2×CTAB提取缓冲液(pH8.0)，包括100mM Tris、25mM EDTA、1.4M NaCl、2％CTAB。
3药材DNA快速提取将药材研磨成粉末，取0.001g粉末，利用碱裂解法提取药材总DNA，提取缓冲液为0.1M Tris-Hcl，0.5M NaOH，1％PVP，1％Triton-100几种混合溶液。
4PCR反应
以药材DNA为模版，分别利用DNA条形码通用引物ITS2、rbcL、psbA-trnH、trnL-trnF和matK进行PCR扩增，引物见表1。PCR反应体系包括：模板DNA 1μL(100mmol·L-1)，2×Taq PCR MasterMix 13μL(10mmol·L-1)，引物(10pmol·L-1)1μL，牛血清白蛋白(1-10μg/μl)0.5μL，聚乙烯吡咯烷酮(2-50μg/μl)1μL，0.5U Taq酶，加入ddH2O补足到25μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，47℃-56℃退火1min，72℃延伸1min40s，循环40次；72℃后延伸7min。反应结果后，取PCR反应液各5μL经1.2％琼脂糖凝胶电泳1h，溴化乙锭染色，SYNGENE型凝胶成像系统检测照相。
表1引物序列
5结果与分析
5.1增强剂对PCR反应成功率的影响
本研究选择DNA条形码通用引物片段对采用碱裂解法和CTAB法提取的药材DNA进行了扩增，通过比较使用增强剂与未使用增强剂扩增效果，来评价使用增强剂的效率。
表2增强剂对PCR反应成功率的影响
根据表2可以看出，使用本发明增强剂可以明显增加ITS2、rbcL、psbA-trnH三个片段PCR扩增的成功率。而对于trnL-trnF和matK也可以增加PCR扩增的成功率，而trnL-trnF和matK两个片段本身就是比较难扩增，相比没有ITS2、rbcL、psbA-trnH三个片段增强效果明显，因此，无论采用碱裂解法还是CTAB法提取的药材DNA，都能够通过使用增强剂来增加PCR扩增的成功率。

Claims (5)

1.一种专用药材PCR反应液，其特征在于所述反应液中包含牛血清白蛋白(BSA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或两种。 
2.权利要求1的反应液，其特征在于所述反应液中包含牛血清白蛋白(BSA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。 
3.权利要求1的反应液，其还包含DNA聚合酶，所用DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。 
4.一种专用药材PCR反应液，其特征在于反应液的成分包含10-50mM T ris-Hcl(pH8.0)、20-60Mm KCl、2.0-5.0mM Mg2+、0.2-0.4mM dNTP、0.1％-1％BSA、0.5％-5％PVP、0.04U-0.4UTaq DNA聚合酶。 
5.一种专用药材PCR方法，其特征在于所述方法包含使用权利要求1-4任一项所述的反应液的步骤。 
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111733219A (zh) * 2020-06-19 2020-10-02 安徽微分基因科技有限公司 一种从土壤样本中高效扩增微生物dna的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191309A (zh) * 2010-03-01 2011-09-21 北华大学 柴胡dna鉴定试剂盒及鉴定方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191309A (zh) * 2010-03-01 2011-09-21 北华大学 柴胡dna鉴定试剂盒及鉴定方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
于永洲: "白花蛇舌草DNA指纹图谱与体外抗肿瘤活性的相关性研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）》 *
于永洲: "白花蛇舌草DNA指纹图谱与体外抗肿瘤活性的相关性研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）》, no. 01, 15 January 2007 (2007-01-15) *
李佳等: "不同分子量PVP对PCR扩增反应效率的影响", 《江汉大学学报（自然科学版）》 *
李佳等: "不同分子量PVP对PCR扩增反应效率的影响", 《江汉大学学报（自然科学版）》, vol. 40, no. 2, 30 April 2012 (2012-04-30) *
王亚明等: "中药材龟板和鳖甲中DNA的提取与扩增", 《药学学报》 *
陈永久等: "随机扩增多态DNA影响因素的研究", 《动物学研究》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111733219A (zh) * 2020-06-19 2020-10-02 安徽微分基因科技有限公司 一种从土壤样本中高效扩增微生物dna的方法

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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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