CN103908427A - 一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液及其制备方法。所述注射液由mPEG20000-rhG-CSF、稳定剂、等渗剂、pH3.5～4.5的缓冲液及注射用水组成，其中，每毫升注射液中含mPEG20000-rhG-CSF的量为1～8mg，所述稳定剂为吐温80。将本发明的注射液灌装于玻璃瓶或塑料瓶中，在运输和贮藏过程中，性质稳定。因此，本发明的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液成本低廉、性质稳定，提高了患者临床用药的顺应性。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液及其制备方法。
背景技术
粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor，G-CSF)是刺激骨髓细胞集落形成的集落刺激因子之一，它能够特异性地刺激和调节粒细胞系统的增殖、分化、存活和活化，对于各种原因引起的中性粒细胞减少症具有潜在的、巨大的应用价值.但是重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)在体内循环半衰期短，t1/2仅为1.3～4.2h，作用时间短暂，需天天注射，限制了疗效。
2002年FDA批准美国Amgen公司用PEG-rhG-CSF(通用名pegfilgrastim，商品名Neulasta)治疗中性粒细胞减少症，只需两周注射1次，大大提高了患者临床用药的顺应性。
Neulasta是以0.6mL的预充式注射器形式提供的。每支注射器中包含6mg的PEG-rhG-CSF、0.35mg醋酸、30.0mg山梨醇、0.02mg的吐温20和0.02mg的钠，pH为4.0。Neulasta采用预充式注射器形式包装，成本高，患者临床用药顺应性差，且造成资源浪费，不利于环保。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种成本低廉且性质稳定的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液，来提高患者临床用药的顺应性。
玻璃瓶或塑料瓶为小容量注射液常用的包装容器，相较于预充式注射器，成本低廉。本发明人尝试将Neulasta采用玻璃瓶或塑料瓶包装，但经过模拟运输稳定性试验发现，这两种包装下的Neulasta注射剂不稳定，出现蛋白质沉淀，活性明显降低，不再适合临床应用。
为了得到稳定的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射剂，本发明人对处方工艺进行了大量试验，发现在这两种包装容器中，当每毫升注射液含mPEG20000-rhG-CSF的量(蛋白质浓度)为
1～8mg，所含稳定剂为吐温80时，稳定性显著提高，不再出现蛋白质沉淀，活性提高到标准值5.0×107(IU/mg)以上。为了得到了更为稳定、活性更高的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射剂，本发明人对每毫升注射液含mPEG20000-rhG-CSF的量及吐温80的用量，以及其它药用辅料的种类及用量进行了更为细微的考察，发现：
①当每毫升注射液中含mPEG20000-G-CSF的量为2～5mg时，制剂稳定性更高。从稳定性、 制剂成本、患者用药方便等多方面综合考虑，每毫升注射液中含mPEG20000-rhG-CSF的量为3mg时，为最佳蛋白质浓度。
②当每毫升注射液中含吐温80的量为0.02～0.05mg时，制剂稳定性更高；当每毫升注射液中含吐温80的量为0.04mg时，制剂稳定性最高。
③等渗剂的种类对mPEG20000-rhG-CSF注射剂的稳定性也有一定影响。当等渗剂为山梨醇或甘露醇时，制剂稳定性较佳；当等渗剂为山梨醇时，制剂稳定性最佳；当等渗剂为其它等渗剂时，mPEG20000-rhG-CSF注射剂的稳定性降低。
因此，本发明一方面提供了一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液，每毫升注射液由mPEG20000-rhG-CSF、稳定剂、等渗剂、pH3.5～4.5的缓冲液及注射用水组成，其特征在于，每毫升注射液中含mPEG20000-G-CSF的量为1～8mg，所述稳定剂为吐温80。
其中：
每毫升注射液中含mPEG20000-G-CSF的量优选为2～5mg，更优选为3mg。
每毫升注射液中含稳定剂的量为0.02～0.05mg，优选为0.04mg；
所述等渗剂优选为5％的山梨醇或甘露醇。
所述缓冲液为醋酸钠-醋酸缓冲液。
进一步地，本发明提供一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液，每毫升注射液由以下组分组成：
更进一步地，本发明提供一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液，每毫升注射液由以下组分组成：
另一方面，本发明还提供一种上述的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液的制备方法，包括如下步骤：
①将处方量的稳定剂、等渗剂和缓冲液配制成稀释剂；
②取处方量的mPEG20000-rhG-CSF用第①步所配制的稀释剂稀释至所需浓度；
③过滤除菌。
另一方面，本发明还提供一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射剂，其特征在于，将上述的注射液灌装于注射剂瓶中，每注射剂瓶装量为1mL。
优选地，所述注射剂瓶选自玻璃安瓿瓶或塑料安瓿瓶，规格为2或3mL。
本发明的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射剂以注射剂瓶形式提供，成本低廉，且在运输和贮藏过程中，性质稳定，提高了患者临床用药的顺应性。
附图说明
图1：本发明制备例离子交换色谱法层析洗脱示意图
图2：本发明制备例分子筛层析洗脱示意图
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明所述内容做进一步详细的说明。
本发明中所使用mPEG20000-G-CSF原液可参照现有技术如CN1139932A、CN1687106A、Pharmacutical research Vol.13No.71996，“Characterization and Stability ofN-terminally PEGylated rhG-CSF”等公开方法制备所得，也可参照以下制备例进行制备：
制备例：mPEG20000-rhG-CSF原液的制备
1、mPEG20000-rhG-CSF粗品的制备
在10mL含有0.1M NaH2PO4(pH5.0)的浓度为5mg/mL的rhG-CSF溶液中，4℃下，加入摩尔数为rhG-CSF摩尔数7.5倍量的20kDa的mPEG，溶解，加入NaCNBH3。反应液于4℃下搅拌反应16h，然后将反应液用1M HCl调节pH为3.5。将所得溶液进行浓缩，得mPEG20000-rhG-CSF粗品。
2、纯化
(1)离子交换色谱法层析：将制备1所得mPEG20000-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP(直径300mm，高12cm)的离子交换色谱法层析：
①上样：将mPEG20000-rhG-CSF粗品以缓冲液A(pH4.0±0.5)稀释至100～200μg/mL，以340mL/min±10％流速上样，上样量3mg蛋白/ml填料；
②冲洗：以缓冲液A400mL/min±10％流速冲洗3个柱体积；
③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B以90mL/min±10％的流速洗脱梯度洗脱6个柱体积(梯度从0％至40％)，收集洗脱峰1、2、3；
(2)分子筛层析：
①将离子交换层析收集峰2用Superdex75柱(直径200mm，高60cm)以120mL/min±10％的流速上样，上样体积为柱体积的5％；
②以缓冲液A以120mL/min±10％的流速洗脱，收集洗脱峰4和洗脱峰5，洗脱峰5即mPEG20000-rhG-CSF。
将所得流分进行浓缩至5mg/mL，得mPEG20000-rhG-CSF原液，HPLC纯度为99.8％。
实施例1：mPEG20000-rhG-CSF注射剂的制备
处方组成(规格3.0mg(ml/支))：
稀释液配方：
| 组分 | 每升用量 | 实际用量 |
| 醋酸钠 | 1.36g | 1.36×Yg |
| 吐温80 | 40mg | 40×Yg |
| 冰醋酸 | 适量 | 调pH3.5～4.5 |
| 山梨醇 | - | 5％×(批灌装支数M×规格装量)g |
| 注射用水 | 最后补足体积至Y升 |
备注：M表示批灌装支数。
设所需原液体积为X(mL)、所需加入的制剂稀释液体积为Y(mL)，则
Y＝批灌装支数M×该规格装量-原液体积X(mL)
制备工艺：
①将处方量的醋酸钠、吐温80、冰醋酸、山梨醇和注射用水配制成稀释液；
②取处方量的mPEG20000-G-CSF原液，用配制好的稀释液稀释至所需浓度；
③过滤除菌；
④将所得注射液按注射剂规格装量分装于玻璃瓶或塑料瓶中；
⑤加盖药用溴化丁基橡胶塞。
实施例2～6：蛋白质浓度考察
参照实施例1的处方及其制备工艺，只是将注射剂规格分别改为1、2、5、8、10mg/mL。
实施例7～10：稳定剂种类的考察
参照实施例1的处方及其制备工艺，只是将稳定剂分别改为吐温20、吐温40、吐温60、吐温85。
实施例11～14：稳定剂浓度的考察
参照实施例1的处方及其制备工艺，只是将稳定剂投料量分别改为每升10、20、50、60mg。
实施例15～20：等渗剂的考察
参照实施例1的处方及其制备工艺，只是将等渗剂分别改为5％的甘露醇、葡萄糖、甘油、木糖醇、乳糖，0.9％的氯化钠。
实施例21：mPEG20000-rhG-CSF注射剂的制备(Neulasta的注射剂瓶包装)
处方组成(规格6.0mg(0.6ml/支))：
稀释液配方：
| 组分 | 每升用量 | 实际用量 |
| 醋酸钠 | 1.36g | 1.36×Yg |
| 吐温20 | 33mg | 33×Yg |
| 冰醋酸 | 适量 | 调pH4.0 |
| 山梨醇 | - | 5％×(批灌装支数M×规格装量)g |
| 注射用水 | 最后补足体积至Y升 |
M、X、Y表示同实施例1.
制备工艺基本同实施例1，只是将吐温80替换为吐温20。
实施例22：稳定性实验
实验目的：考察不同处方的mPEG20000-rhG-CSF注射剂的稳定性差别
实验药品：实施例1～21所得mPEG20000-rhG-CSF注射剂
实验设备：模拟运输试验机(东莞市源科检测仪器有限公司生产)
参数：速度：100-300RPM；振幅：1英寸25.4mm，最大载重：100Kg；工作时间：9999H/M/S；电机功率：1HP；最大电流：4A；工作台尺寸：100cm*120cm。
实验方法：将实施例1～20所得mPEG20000-rhG-CSF注射剂，在温度2～8℃下，置于模拟运输试验机上进行模拟运输试验，振幅为25.4mm、频率4Hz，试验速度240CPM，测试时间1小时。在实验前和实验结束静置30min，取样，检验样品的外观、可见异物、生物学活性、HPLC纯度。
实验结果：见下表。
结论：
1、蛋白质浓度对mPEG20000-rhG-CSF注射剂的稳定性影响很大，浓度越小，其稳定性越好，每毫升注射液中含mPEG20000-rhG-CSF的量为1～8mg时，制剂稳定性合格；每毫升注射液中含mPEG20000-rhG-CSF的量为2～5mg时，制剂稳定性较佳。从稳定性、制剂成本、患者用药方便等多方面综合考虑，每毫升注射液中含mPEG20000-rhG-CSF的量为3mg时，为最佳蛋白质浓度。
2、稳定剂种类对mPEG20000-rhG-CSF注射剂的稳定性也有一定影响。当稳定剂为吐温80、吐温85和吐温20时，制剂稳定性较好；当稳定剂为吐温80时，制剂稳定性最佳。
3、稳定剂浓度对mPEG20000-rhG-CSF注射剂的稳定性也有一定影响。当稳定剂浓度为每毫升注射液中含稳定剂的量为0.02～0.05mg时，制剂稳定性较佳；当每毫升注射液中含稳定剂的量为0.04mg时，制剂稳定性最佳。
4、等渗剂的种类对mPEG20000-rhG-CSF注射剂的稳定性也有一定影响。当等渗剂为山梨醇或甘露醇时，制剂稳定性较佳；当等渗剂为山梨醇时，制剂稳定性最佳；当等渗剂为其它等渗剂时，mPEG20000-rhG-CSF注射剂的稳定性降低。
5、注射剂瓶包装的Neulasta注射剂不稳定，出现蛋白质沉淀，活性明显降低，不再适合临床应用。
实施例23：长期稳定性试验
将实施例1所得mPEG20000-rhG-CSF注射液，贮存在冷藏柜中，温度保持在2～8℃，于0个月，3个月，6个月，9个月，12个月，18个月，24个月，36个月进行取样，检验其外观、可见异物、pH值、生物学活性、纯度(HPLC法)、蛋白质含量，实验结果如下：
结论：本发明所提供的mPEG20000-rhG-CSF注射液于2～8℃贮存3年，各项指标无明显变化，稳定性良好。
Claims (10)
1.一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液，每毫升注射液由mPEG20000-rhG-CSF、稳定剂、等渗剂、pH3.5～4.5的缓冲液及注射用水组成，其特征在于，每毫升注射液中含mPEG20000-G-CSF的量为1～8mg，所述稳定剂为吐温80。
2.权利要求1所述的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液，其特征在于，每毫升注射液中含mPEG20000-rhG-CSF的量为2～5mg，优选为3mg。
3.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液，其特征在于，每毫升注射液中含稳定剂的量为0.02～0.05mg，优选为0.04mg。
4.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液，其特征在于，所述等渗剂为5％的山梨醇或甘露醇。
5.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液，其特征在于，所述缓冲液为醋酸钠-醋酸缓冲液。
6.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液，其特征在于，每毫升注射液由以下组分组成：
7.如权利要求6所述的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液，其特征在于，每毫升注射液由以下组分组成：
8.一种如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射液的制备方法，包括如下步骤：
①将处方量的稳定剂、等渗剂和缓冲液配制成稀释剂；
②取处方量的mPEG20000-rhG-CSF用第①步所配制的稀释剂稀释至所需浓度；
③过滤除菌。
9.一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射剂，其特征在于，将如权利要求1至7任一所述的注射液灌装于注射剂瓶中，每注射剂瓶装量为1mL。
10.如权利要求9所述的聚乙二醇修饰的rhG-CSF注射剂，其特征在于，所述注射剂瓶选自玻璃瓶或塑料瓶，所述注射剂瓶规格为2或3mL。
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