CN103898020A - 一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物发酵工程领域，特别是涉及一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法。本发明提供一种乳酸菌发酵的方法，包括如下步骤：1）将活化后的乳酸菌接种于乳酸菌培养基中，所述乳酸菌培养基的溶剂为水，所述乳酸菌培养基中的水预先经过分子共振材料处理；2）进行发酵培养。本发明将物理知识和微生物发酵知识结合，简单易行，在原来的基础上进一步提高乳酸菌的发酵密度。

Description

一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法

技术领域

本发明涉及为生物发酵工程领域，特别是涉及一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法。

背景技术

乳酸菌是被各国批准使用的最大一类和最早使用的益生菌。该菌作为人和动物的有益菌（或称为益生菌）广泛用于发酵乳制品（如益生菌酸奶、益生菌发酵乳饮料、益生菌奶酪）、发酵豆乳制品、功能性食品配料和食品添加剂（如在婴儿配方乳粉、中老年乳粉、果蔬汁等中的添加等）、膳食补充剂（片剂、胶囊等）以及饲料微生态制剂中。

消费者对益生菌概念的加强，乳酸菌制品的市场日渐扩大，随之对乳酸菌发酵菌剂的需求量日益加大。因此，乳酸菌菌剂的发酵时间也成为影响企业经济效益的重要因素。

为了加速乳酸菌的发酵，目前的措施主要集中于培养基配方和发酵条件的优化，操作起来费时、费工、费料、费力，直接影响企业的经济效益。

分子共振板是分子共振的应用，其工作原理是复合稀土材料经超微物理粉碎，分子结构被破坏，获得以及失去电子的元素产生高频振动，导致邻近物质的分子从混乱和不安定状态重新整齐排列，变成为有秩序的分子状态，从而减小空间和所占体积，使物质呈安定状态。目前其被应用于各种领域，备受瞩目。

乳酸菌是被各国批准使用的最大一类和最早使用的益生菌。该菌作为人和动物的有益菌（或称为益生菌）广泛用于发酵乳制品（如益生菌酸奶、益生菌发酵乳饮料、益生菌奶酪）、发酵豆乳制品、功能性食品配料和食品添加剂（如在婴儿配方乳粉、中老年乳粉、果蔬汁等中的添加等）、膳食补充剂（片剂、胶囊等）以及饲料微生态制剂中。

消费者对益生菌概念的加强，乳酸菌制品的市场日渐扩大，产品中乳酸菌的活菌数日益成为焦点，2003年欧洲食品与饲料菌种协会（EFFCA）对益生菌进行了如下定义：指当摄入充足的数量后，能对宿主产生一种或多种有功能性健康益处的微生物，实验表明，益生菌摄入量达10⁹-10¹¹cfu/天的水平，可起到降低某些肠道疾病的发病率、持续时间和病情严重性的效果。所以，无论是乳酸菌饮料，益生菌酸奶等发酵食品，还是微生态制剂，实现益生菌体的高密度是首要条件。

由于乳酸菌生长的营养要求较高，需要一些特殊的营养组分；同时，乳酸菌在生长过程中分泌有机酸类代谢产物，使培养液中的pH值不断下降，当pH值降至4.10以下时，菌体的生长繁殖就会受到抑制，因此目前主要是针对乳酸菌的培养基配方、培养条件补料分批培养技术和发酵工艺进行探究，工作繁琐复杂而且很难在原有基础上实现新的突破。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种将物理知识和微生物发酵知识相结合的简单易行的加速乳酸菌发酵的方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，包括如下步骤：

1）将活化后的乳酸菌接种于乳酸菌培养基中，所述乳酸菌培养基的溶剂为水，所述乳酸菌培养基中的水经过分子共振材料处理；

2）进行发酵培养。

所述培养步骤中乳酸菌的活化采用常规方法活化即可。

所述乳酸菌培养基可为本领域各种常用的乳酸菌培养基，本领域技术人员可根据经验选择合适的培养基用于本发明中乳酸菌的培养，具体例如MRS培养基、APT培养基、改良的同型腐酒培养基、SL培养基、酪朊水解物山梨酸钾培养基、番茄汁聚胨培养基、蔗糖抑菌剂培养基、TPY培养基、PTYG培养基、卡那霉素七叶灵培养基、月示胨甘油磷酸钠培养基、M17培养基、FT培养基、葡萄汁培养基、乙酸盐培养基、蔗糖硫胺培养基或TM培养基等本领域现有技术中各种普通乳酸菌营养培养基或上述培养基的改良培养基。

本领域技术人员可根据经验使用适当方法，使用分子共振材料对培养基中的水进行处理。

优选的，培养基中的水预先经过分子共振材料处理的具体方法选自：将水通过外壁包裹有分子共振板的管道、将水通过由分子共振材料制备的管道、将水置于分子共振材料制成的容器中、将水置于分子共振板包裹的容器中，此外，还可将分子共振材料直接置于水中。

优选的，将水通过外壁包裹有分子共振板的管道时，分子共振板的包裹长度≥2m，分子共振板厚度和管道直径比为1:8-12。

优选的，将水通过由分子共振材料制成的管道时，管壁厚度与管道直径比例为1:4-6，管道长度≥1m。

优选的，将水置于分子共振材料制成的容器中或将水置于分子共振板包裹的容器中时，所述分子共振板厚度或分子共振材料制成的容器壁厚与培养器皿的体积比为1cm：15-35L。

优选的，水在容器或者管道中的停留时间≥0.5min，优选为0.5-1min。

管道中的停留时间具体为：水在包裹有分子共振板的管道部分1min左右、或由分子共振材料制成的管道部分的水力停留时间0.5min左右。

优选的，所述乳酸菌选自嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）中的一种或多种的组合。

优选的，所述乳酸菌接种的接种量为6-10%。

优选的，所述发酵培养的培养温度为32-42℃。

优选的，所述发酵培养中，调节起始pH值为7.0-7.2；在培养过程中流加碱使培养基的pH值稳定在6.0-6.8。

本领域技术人员可根据经验选择合适的试剂对pH值进行调节，可使用的酸包括但不限于：稀盐酸，磷酸，乳酸，柠檬酸；可使用的碱包括但不限于：稀氢氧化钠，碳酸氢钠。

优选的，在培养过程中流加的碱为Na₂CO₃、KOH、NaOH或氨水中的一种或多种的选择。

所述流加的碱为碱的水溶液。

更优选的，在培养过程中流加的碱为Na₂CO₃水溶液、KOH水溶液、NaOH水溶液或氨水中的一种或多种的选择。

进一步优选的，所述Na₂CO₃水溶液的浓度为25-35%，所述KOH水溶液的浓度为15-25%，NaOH水溶液的浓度为15-25%。所述乳酸菌培养基的溶剂为水。

优选的，进行发酵培养时，还在培养器皿外设置分子共振材料。

所述培养器皿可以是各种体积的发酵器皿，如发酵罐、摇瓶等。

优选的，所述分子共振材料为分子共振板，所述分子共振板包裹于所述乳酸菌培养器皿外壁。

进一步优选的，所述分子共振板的厚度与培养器皿的体积比为1cm：15-35L，更优选为1cm：20-30L。

优选的，乳酸菌培养基配方：10g/L大豆蛋白胨、10g/L酵母浸提粉、10g/L葡萄糖、3mL/L无机盐溶液、0.050g/L半胱氨酸盐酸盐，溶剂为水。所述无机盐溶液的具体配方按由如下组分组成：无水CaCl₂0.2g/L；MgSO₄·7H₂O0.48g/L；磷酸氢二钾1g/L；磷酸二氢钾1g/L；碳酸氢钠10g/L；NaCl2g/L；溶剂为水。

本发明第二方面提供所述的利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法在乳酸菌培养领域的用途。

分子共振板是分子共振的应用，其工作原理是复合稀土材料经超微物理粉碎，分子结构被破坏，获得以及失去电子的元素产生高频振动，导致邻近物质的分子从混乱和不安定状态重新整齐排列，变成为有秩序的分子状态，从而减小空间和所占体积，使物质呈安定状态。

本发明使用分子共振板对培养基中的水进行分子共振处理，并在培养罐外包裹分子共振材料，大大优化了嗜酸乳杆菌的高密度发酵，本领域技术人员可根据经验在培养过程中进行实时采样，对发酵周期进行判断。

如上所述，所述的分子共振板使得发酵罐内乳酸菌的分子由混乱和不安定状态重新整齐排列，变为有秩序的分子状态，从而减小空间和所占体积，进而使乳酸菌菌体呈现安定状态。同理，乳酸菌呈安定状态，所占的空间和体积减少，单位体积内乳酸菌菌体的数量增多。

本发明将物理知识和微生物发酵知识结合，简单易行，在原来的基础上进一步提高乳酸菌的发酵密度。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

本发明实施例中以嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、发酵乳杆菌（Lactobacillusfermentum）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）为菌种，经常规方法活化后、接种于乳酸菌培养基（配方如下），调节起始pH值为7.0-7.2；在培养过程中流加碱使培养液的pH值稳定在6.0-6.8。

乳酸菌培养基配方：10g/L大豆蛋白胨、10g/L酵母浸提粉、10g/L葡萄糖、3mL/L无机盐溶液、0.050g/L半胱氨酸盐酸盐，溶剂为水。

所述无机盐溶液的具体配方按重量份计由如下组分组成：

所述培养基中的溶剂为水，水经过分子共振材料处理，具体方法如下：采用分子共振板（由南京千人慧生物科技有限公司提供，下同）包裹在管道外壁，包裹长度为2m，分子共振板厚度和管道直径比为1:10，水在管道中的停留时间为0.5-1min。

实施例1

1.实验组

1.1在发酵罐的外壁上包裹一层分子共振板（发酵罐体积为5L，分子共振板厚度为0.2cm）；

1.2活化过程：将冷冻保存的嗜酸乳酸杆菌在MRS琼脂平板活化3次（平板划线活化），挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养12h，以6%的接种量接种到含乳酸菌培养基的发酵罐中（发酵罐中的培养基参照为上文给出的乳酸菌培养基配方），培养基起始pH值为7.0，当pH值低于6.6时流加30%Na₂C0₃溶液，保持培养液pH值稳定在6.7±0.1，37℃培养24h，得到嗜酸乳杆菌活菌数达1.9×10¹²cfu/g的发酵液。

2.对照组

2.1不对发酵罐做任何处理；

2.2挑取活化的嗜酸乳杆菌于MRS液体培养基中，37℃培养12h，以6%的接种量接种到含乳酸菌培养基的发酵罐中，培养基起始pH值为7.0，当pH值低于6.6时流加30%Na₂C0₃溶液，保持培养液pH值稳定在6.7±0.1，37℃培养24h，得到嗜酸乳杆菌活菌数达2.3×10¹¹cfu/g的发酵液。

3.结果分析：利用分子共振板，可以得到嗜酸乳杆菌活菌达1.9×10¹²cfu/g的发酵液，而不使用分子共振板，得到的嗜酸乳杆菌发酵液的活菌数仅为2.3×10¹¹cfu/g。实验证明利用分子共振板进行发酵得到的嗜酸乳杆菌活菌数为不利用的8倍，优化了嗜酸乳杆菌的高密度发酵。

实施例2

1.实验组

1.1在发酵罐的外壁上包裹一层分子共振板（发酵罐体积为5L，分子共振板厚度为0.2cm）；

1.2活化过程：将冷冻保存的发酵乳杆菌在MRS琼脂平板活化3次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养12h，以10%的接种量接种到含乳酸菌培养基的发酵罐中（发酵罐中的培养基参照为上文给出的乳酸菌培养基配方），培养液起始pH值为7.2，当pH值低于6.0时流加30%Na₂C0₃溶液，保持培养液pH值稳定在6.2±0.2，42℃培养24h，得到发酵乳杆菌活菌数达1.7×10¹²cfu/g的发酵液。

2.对照组

2.1不对发酵罐做任何处理；

2.2挑取活化的发酵乳杆菌于MRS液体培养基中，3℃培养1h，以10%的接种量接种到含乳酸菌培养基的发酵罐中，培养液起始pH值为7.2，当pH值低于6.0时流加30%Na₂C0₃溶液，保持培养液pH值稳定在6.2±0.2，42℃培养24h，得到发酵乳杆菌活菌数达3.1×10¹¹cfu/g的发酵液。

3.结果分析：利用分子共振板，可以得到发酵乳杆菌活菌达1.7×10¹²cfu/g的发酵液，而不使用分子共振板，得到的发酵乳杆菌发酵液的活菌数仅为3.1×10¹¹cfu/g。实验证明利用分子共振板进行发酵得到的发酵乳杆菌活菌数为不利用的5倍，优化了发酵乳杆菌的高密度发酵。

实施例3

1.实验组

1.1在发酵罐的外壁上包裹一层分子共振板（发酵罐体积为5L，分子共振板厚度为0.2cm）；

1.2活化过程：将冷冻保存的粪肠球菌在MRS琼脂平板活化3次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养12h，以6%的接种量接种到含乳酸菌培养基的发酵罐中，培养液起始pH值为7.2，当pH值低于6.4时流加30%Na₂C0₃溶液，保持培养液pH值稳定在6.5±0.1，32℃培养24h，得到粪肠球菌活菌数达3.7×10¹²cfu/g的发酵液。

2.对照组

2.1不对发酵罐做任何处理；

2.2挑取活化的粪肠球菌于MRS液体培养基中，32℃培养12h，以6%的接种量接种到含乳酸菌培养基的发酵罐中（发酵罐中的培养基参照为上文给出的乳酸菌培养基配方），培养液起始pH值为7.2，当pH值低于6.4时流加30%Na₂C0₃溶液，保持培养液pH值稳定在6.5±0.1，32℃培养24h，得到粪肠球菌活菌数达2.6×10¹¹cfu/g的发酵液。

3.结果分析：利用分子共振板，可以得到粪肠球菌活菌达3.7×10¹²cfu/g的发酵液，而不使用分子共振板，得到的粪肠球菌发酵液的活菌数仅为1.8×10¹¹cfu/g。实验证明利用分子共振板进行发酵得到的粪肠球菌活菌数为不利用的14倍，优化了粪肠球菌的高密度发酵。

实施例4

在发酵罐的外壁上包裹一层分子共振板（发酵罐体积为5L，分子共振板厚度为0.2cm）；

活化过程：将冷冻保存的嗜酸乳酸杆菌在MRS琼脂平板活化3次（平板划线活化），挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养12h，以6%的接种量接种到含乳酸菌培养基的发酵罐中（发酵罐中的培养基为MRS培养基），培养基起始pH值为7.0，当pH值低于6.6时流加30%Na₂C0₃溶液，保持培养液pH值稳定在6.7±0.1，37℃培养24h，得到嗜酸乳杆菌活菌数达1.5×10¹²cfu/g的发酵液。

实施例5

在发酵罐的外壁上包裹一层分子共振板（发酵罐体积为5L，分子共振板厚度为0.2cm）；

活化过程：将冷冻保存的嗜酸乳酸杆菌在MRS琼脂平板活化3次（平板划线活化），挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养12h，以6%的接种量接种到含乳酸菌培养基的发酵罐中（发酵罐中的培养基为APT培养基），培养基起始pH值为7.0，当pH值低于6.6时流加30%Na₂C0₃溶液，保持培养液pH值稳定在6.7±0.1，37℃培养24h，得到嗜酸乳杆菌活菌数达1.6×10¹²cfu/g的发酵液。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (15)

1.一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，包括如下步骤：

1）将活化后的乳酸菌接种于乳酸菌培养基中，所述乳酸菌培养基的溶剂为水，所述乳酸菌培养基中的水预先经过分子共振材料处理；

2）进行发酵培养。

2.如权利要求1所述的一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，其特征在于，所述培养基选自MRS培养基、APT培养基、改良的同型腐酒培养基、SL培养基、酪朊水解物山梨酸钾培养基、番茄汁聚胨培养基、蔗糖抑菌剂培养基、TPY培养基、PTYG培养基、卡那霉素七叶灵培养基、月示胨甘油磷酸钠培养基、M17培养基、FT培养基、葡萄汁培养基、乙酸盐培养基、蔗糖硫胺培养基、TM培养基或上述培养基的改良培养基。

3.如权利要求1所述的一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，其特征在于，所述培养基中的水预先经过分子共振材料处理的具体方法选自：将水通过外壁包裹有分子共振板的管道、将水通过由分子共振材料制备的管道、将水置于分子共振材料制成的容器中、将水置于分子共振板包裹的容器中。

4.如权利要求3所述的一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，其特征在于，水在容器或者管道中的停留时间为≥0.5min。

5.如权利要求3所述的一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，其特征在于，将水通过外壁包裹有分子共振板的管道时，分子共振板的包裹长度≥2m，分子共振板厚度和管道直径比为1:8-12。

6.如权利要求3所述的一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，其特征在于，将水通过由分子共振材料制成的管道时，管壁厚度与管道直径比例为1:4-6，管道长度≥1m。

7.如权利要求3所述的一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，其特征在于，将水置于分子共振材料制成的容器中或将水置于分子共振板包裹的容器中时，所述分子共振板厚度或分子共振材料制成的容器壁厚与培养器皿的体积比为1cm：15-35L。

8.如权利要求1所述的一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，其特征在于，所述乳酸菌选自嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、粪肠球菌中的一种或多种的组合。

9.如权利要求1所述的一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，其特征在于，所述乳酸菌接种的接种量为6-10%。

10.如权利要求1所述的一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，其特征在于，所述发酵培养的培养温度为32-42℃。

11.如权利要求1所述的一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，其特征在于，所述发酵培养中，调节起始pH值为7.0-7.2；在培养过程中流加碱使培养基的pH值稳定在6.0-6.8。

12.如权利要求1所述的一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，其特征在于，进行发酵培养时，还在培养器皿外设置分子共振材料。

13.如权利要求12所述的一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，其特征在于，所述分子共振材料为分子共振板，所述分子共振板包裹于所述乳酸菌培养器皿外壁。

14.如权利要求13所述的一种利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法，其特征在于，所述分子共振板的厚度与培养器皿的体积比为1cm：15-35L。

15.如权利要求1-14任一权利要求所述的利用分子共振材料优化乳酸菌高密度培养的方法在乳酸菌培养领域的用途。