CN103897007B

CN103897007B - 高纯度5‑氟‑脱氧尿嘧啶核苷的制备方法

Info

Publication number: CN103897007B
Application number: CN201210585243.7A
Authority: CN
Inventors: 孙波; 朱勇
Original assignee: Hongene Biotechnology Ltd
Current assignee: Hongene Biotechnology Ltd
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2032-12-28
Also published as: CN103897007A

Abstract

本发明公开了一种高纯度5‑氟‑脱氧尿嘧啶核苷的制备方法。所述方法包括步骤：（A）将如结构式B所示的5‑氟‑脱氧尿嘧啶核苷衍生物和能够脱除羟基保护基的试剂混合，在5‑40℃反应，得到反应体系A；（B）使反应体系A溶解于有机溶剂中，在0‑15℃结晶得到如结构式A所示的5‑氟‑脱氧尿嘧啶核苷；所述脱除羟基保护基的试剂选自氨水及甲醇胺溶液、氢氧化钠及氢氧化钾的水溶液、冰醋酸、三氟醋酸或四丁基氟化铵。

Description

高纯度5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的制备方法

技术领域

本发明涉及核苷的制备和纯化，尤其涉及一种5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的制备及其纯化方法

背景技术

以5-氟尿嘧啶为碱基而形成的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷，是具有代表性的代谢颉颃物质，具有很强的抑制增殖细胞作用，在生物体内经胸腺嘧啶核苷激酶（thyimidi-nekinase）的作用，变成氟脱氧尿嘧啶核苷酸，这种酸可颉颃地抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，认为这是切断了作为DNA合成前体物质的胸腺嘧啶脱氧核苷酸的供给所致。同时，临床证实5-氟-脱氧尿苷对肝癌、直肠癌、结肠癌、食道癌、乳腺癌、胃癌和肺癌以及对无法手术切除的原发性肝癌有效，已上市销售，并有多种剂型可选择，有较大的市场前景。因而如何工业化大量生产5-氟-脱氧尿苷就摆到了化学工作者的面前；另一方面，在医药品的用途中，为了极力抑制由含有的杂质生成的副生成物或副作用，有必要使用非常高纯度的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷。

因此，本领域迫切需要提供一种工业化大量生产高纯度的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种制备高纯度的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物的制备方法，所述方法包括步骤：

（Ⅰ）将含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品和羟基保护基试剂混合，反应得到溶液Ⅰ；

（Ⅱ）将溶液Ⅰ和水混合进行淬灭，并分出有机层溶液Ⅱ；和

（Ⅲ）将有机层溶液Ⅱ用水萃取后弃去水相后，得到如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物；

以5-氟-脱氧尿嘧啶核苷计的含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品与羟基保护基试剂的摩尔比为1.0∶1.0－2.5；

所述羟基保护基选自乙酰基、4,4’-二甲氧基-三苯基氯甲烷、三苯基氯甲烷、苯甲酰基、叔丁基二苯基硅基或三甲基硅基；

步骤（Ⅰ）的反应和步骤（Ⅱ）的淬灭在0-10℃进行；

；其中R1表示乙酰基(AC)，4,4’-二甲氧基-三苯基氯甲基（DMT），三苯基氯甲基（Tr），苯甲酰基（Bz）,叔丁基二苯基硅基(TBDMS)，三甲基硅基(TMS)；

R₂表示乙酰基(AC)，苯甲酰基（Bz）,叔丁基二苯基硅基(TBDMS)，三甲基硅基(TMS)。

在另一优选例中，含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品与羟基保护基试剂的摩尔比为1.0∶1.0－2.5；更佳地为1.0∶1.0－1.2。

在另一优选例中，所述以所述含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品总重量计，其中的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷含量为70-99.5％，其中5-氟-尿嘧啶有0.5-30％。

在另一优选例中，所述含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品通过下述步骤制备得到：

（i）将β-胸苷、5-氟-尿嘧啶、磷酸或磷酸盐和核苷磷酸化酶在pH6.5-6.7及45-55℃混合、反应完全，得到反应体系i；和

（ii）将反应体系i冷却、离心、去除不溶物后用强碱性树脂进行纯化，得到含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品。

在本发明的第二方面，提供了一种如结构式A所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的制备方法，所述方法包括步骤：

（A）将如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物和能够脱除羟基保护基的试剂混合，在5-40℃反应，得到反应体系A；和

（B）使反应体系A溶解于有机溶剂中，在0-15℃结晶得到如结构式A所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷；

所述脱除羟基保护基的试剂选自氨水及甲醇胺溶液、氢氧化钠及氢氧化钾的水溶液、冰醋酸、三氟醋酸或四丁基氟化铵；

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

（A）将如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物和能够脱除羟基保护基的试剂混合，在5-40℃反应，得到反应体系A；

（B1）将反应体系A和水混合，使得到的水相pH为6-7，得到溶液B1；和

（B2）用选自二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或乙酸乙酯的溶剂萃取溶液B1，得到的水相溶解于有机溶剂中，在0-15℃结晶得到如结构式A所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷；

所述有机溶剂选自下述的一种或一种以上的混合：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水。

在另一优选例中，所述如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物通过如上所述的本发明提供的制备方法获得。

在本发明的第三方面，提供了一种羟基保护基试剂在制备如结构式A所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷中的应用；所述羟基保护基选自乙酰基、4,4’-二甲氧基-三苯基氯甲烷、三苯基氯甲烷、苯甲酰基、叔丁基二苯基硅基或三甲基硅基。

在本发明的第四方面，提供了一种羟基保护基试剂在制备如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物中的应用，所述羟基保护基选自乙酰基、4,4’-二甲氧基-三苯基氯甲烷、三苯基氯甲烷、苯甲酰基、叔丁基二苯基硅基或三甲基硅基。

据此，本发明提供了一种工业化大量生产高纯度的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的方法。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现可以通过几种保护试剂，简便，经济，合理地大量合成羟基取代的5-氟脱氧尿嘧啶核苷中间体，然后通过萃取去除杂质，再通过脱保护，萃取或结晶，可以获得非常高纯度的目标化合物，从而完成了本发明。

本发明将含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品进行羟基保护后通过萃取得到高纯度的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物，然后将所获得的高纯度5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物进行脱保护后，经过结晶或萃取和结晶得到高纯度5-氟-脱氧尿嘧啶核苷。

所述含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品可以通过本领域常规的方法得到，例如但不限于生物法，在一较佳实施例中，以5-氟-尿嘧啶为起始原料，与β-胸苷、磷酸或磷酸盐在核苷磷酸化酶的存在下进行反应，离心去除不溶物后的混合物经强碱性树脂纯化得到；更佳地，所述5-氟-尿嘧啶和β-胸苷的摩尔比为0.3-0.8∶1；更佳地，强碱性树脂纯化时使用水作为洗脱液；更佳地，经强碱性树脂纯化后收集含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷并且β-胸苷含量小于3%的部分，使用HPLC监控产物。

如本文所用，“含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品”是指一种混合物，以该混合物的总重量计，其中含有99.5－70％如结构式A所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷，含有0.5－30％5-氟尿嘧啶。

如本文所用，“高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）纯度”是指将制备得到的产品，经过HPLC检测，根据所得到的色谱图谱，进行面积归一法而得到的目标化合物的峰面积在所有峰面积总和中所占有的百分数。例如本发明的式A（或B）化合物和杂质的含量（纯度）使用HPLC测定，它们的含量以其峰面积和各成分峰面积之和的百分比表示。

所述的HPLC检测方法如下：

固定相：YMC-AQ 250*4.6mm；

柱温：25℃；

流动相：梯度条件

A液：纯化水,然后用0.22μm水膜过滤。

B液：色谱级甲醇

流速：1.0ml/min

检测器：紫外检测（260nm）

检测限：100ng

本发明提供的一种如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物的制备方法包括步骤：

第一步，将含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品和羟基保护基试剂混合，反应得到溶液Ⅰ；

第二步，将溶液Ⅰ和水混合进行淬灭，并分出有机层溶液Ⅱ；

第三步，将有机层溶液Ⅱ用水萃取后弃去水相后得到如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物。

上述第一步中，以5-氟-脱氧尿嘧啶核苷计的含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品与羟基保护基试剂的摩尔比为1.0∶1.0－2.5；较佳地为1.0∶1.0－1.5；更佳地为1.0∶1.0－1.2。

在本发明的一个优选实施例中，上述第一步是将含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品和有机溶剂、有机碱混合后降温至零下10至10℃，然后加入羟基保护基的试剂，并控温在0-10℃进行反应，得到溶液Ⅰ；所述羟基保护基选自乙酰基、4,4’-二甲氧基-三苯基氯甲烷、三苯基氯甲烷、苯甲酰基、叔丁基二苯基硅基或三甲基硅基。针对不同的羟基保护基可以选择不同的反应温度以使原料完全转化为目标中间体；所述有机溶剂选自二氯甲烷,三氯甲烷,乙酸乙酯；所述有机碱是为了中和反应中形成的酸，选自三乙胺、吡啶。

上述第二步中进行的淬灭反应的温度与第一步中的反应温度大致相同，例如在0-10℃进行.

上述第三步中用水萃取1-5次，去除可水溶的杂质，浓缩有机相得到如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物，所述可水溶的杂质为如下式中的一种或几种：

在一较佳实施例中，用HPLC监控所得到的有机相，保证得到的产品中5-氟尿嘧啶的HPLC纯度小于0.01％。

本发明提供的一种如结构式A所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的制备方法包括步骤：

第A步，将如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物和能够脱除羟基保护基的试剂混合，在5-40℃反应，得到反应体系A；

第B步，使反应体系A溶解于有机溶剂中，在0-15℃结晶得到如结构式A所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷。

上述第A步中，所述脱除羟基保护基的试剂可以针对如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物所具有的羟基保护基做不同的选择，以使保护基脱除完全，例如可以选自氨水及甲醇胺溶液、氢氧化钠及氢氧化钾的水溶液、冰醋酸、三氟醋酸或四丁基氟化铵。

上述第A步中的反应用HPLC监控至主原料反应完全。

根据如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物所具有的羟基保护基种类，上述第B步可以有两种方式进行：

第一种是将第A步反应完全所得到的反应体系A浓缩后和有机溶剂混合，加热溶解，然后降温结晶，得到如结构式A所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷；所加热的温度低于有机溶剂的回流温度，但需足以使获得澄清溶液；所述有机溶剂选自下述的一种或一种以上的混合：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水；降温至0-10℃进行结晶。

第二种是将第A步反应完全所得到的反应体系A和水混合，然后使得到的水相pH为6-7，得到溶液B1；再用有机萃取溶剂萃取1-5次，去除有机相杂质，水相浓缩后和有机溶剂混合，加热溶解，然后降温结晶，得到如结构式A所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷；所使用的有机萃取溶剂针对如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物所具有的羟基保护基种类进行选用，例如但不限于二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或乙酸乙酯；用于结晶的有机溶剂、加热温度和结晶温度与上述第一种方式中的相同。

本发明涉及的式A化合物和式B化合物的结构如下：

式中，R1表示乙酰基(AC)，4,4’-二甲氧基-三苯基氯甲基（DMT），三苯基氯甲基（Tr），苯甲酰基（Bz）,叔丁基二苯基硅基(TBDMS)，三甲基硅基(TMS)；

本发明以5-氟-尿嘧啶为起始原料，通过下列反应，简便地制得目标产物。在本发明的一个实施例中，具体步骤为：

1、将β-胸苷，5-氟-尿嘧啶加入到磷酸盐缓冲液中溶解，调pH=6－8，然后将核苷磷酸化酶加入，然后体系于30－55℃搅拌反应，20小时后，HPLC监控至转化结束。反应结束后离心，去除不溶物，离心母液调pH=8－10,用Cl-型强碱性树脂进行纯化，去除绝大部分的胸腺嘧啶和β-胸苷，然后收集含有5-氟尿嘧啶和5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的部分，此部分收集液于60℃下浓缩干，即得含有式（A）化合物的粗品。

2、得到粗品后，将粗品用保护基保护，形成脂溶性的中间体。此处保护基优选乙酰基(AC)，4,4’-二甲氧基-三苯基氯甲基（DMT），三苯基氯甲基（Tr），苯甲酰基（Bz）,叔丁基二苯基硅基(TBDMS)，三甲基硅基(TMS)；

3、然后通过萃取，去除水溶性的杂质，接着脱除保护基。此处脱除试剂优选氨水及甲醇胺溶液，氢氧化钠及氢氧化钾的水溶液，冰醋酸，三氟醋酸，四丁基氟化铵。

4、再通过结晶或萃取加结晶，可得高纯度（HPLC>99.9%）目标物A。此处结晶溶剂优选：甲醇，乙醇，乙腈，丙酮以及水。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、制备目标物的原料已大规模工业化，来源广泛，价格低廉。

2、制备过程无需特殊或危险性试剂，对设备，人员素质等无高等级要求。

3、工艺过程简单，便捷，可通过三步反应即可制的目标化合物。

4、提供的纯化方法简便，无需特殊设备，成本低廉。

5、提供的纯化方法效果显著，目标化合物的含量均可以达到99.99%以上。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

下述实施例中的HPLC条件

机器：Waters 2695/PDA996

柱：YMC-AQ 250*4.6mm

流速：1.0ml/min

柱温：25℃

检测波长：260nm

流动相：梯度条件

A液：纯化水,然后用0.22μm水膜过滤。

B液：色谱级甲醇

流速：1.0ml/min

检测器：紫外检测（260nm）

检测限：100ng

分析过程中A液，B液在线脱气，氦气流速50ml/min.

实施例1

5-氟-脱氧尿嘧啶核苷粗品的制备

1．5-氟-脱氧尿嘧啶核苷粗品的制备

将35Kgβ-胸苷,21Kg5-氟尿嘧啶，8.4Kg磷酸二氢铵用1750L纯水搅拌悬浮，用2.8L浓氨水调节pH=6.6，加入0.75Kg工业核苷磷酸化酶，搅拌，控温45－55℃反应。反应45小时后，HPLC监控至反应完全。

2.5-氟-脱氧尿嘧啶核苷粗品的纯化

反应完全后，将反应体系冷却至室温，离心，去除不溶物，离心母液调节pH=8－9，然后将其用900L Cl-型强碱性树脂进行纯化（使用去离子水进行洗脱），收集含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷并且β-胸苷含量小于3%的部分，然后将此部分收集液于60℃下减压浓缩至干，取出固体，于60－65℃下鼓风干燥至水分小于1%，此即为5-氟-脱氧尿嘧啶核苷粗品，HPLC纯度90.5%，MS（ESI）m/z(M+H)246.12

实施例2

3’,5’-Di-Ac-5-氟-尿嘧啶核苷的制备

1．3’,5’-Di-Ac-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的合成

将10Kg（40.61mol）上述生物法制得的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷粗品加入100L无水二氯甲烷中，再加入16.96Kg（121.85mol）三乙胺，0.1Kg4-甲胺基吡啶，固体搅拌悬浮，体系冷浴降温至-10-0℃，搅拌下滴加入8.437Kg（89.34mol）乙酸酐，控内温不超过5℃，当固体全溶后，HPLC监控至主原料反应完全。

2.3’,5’-Di-Ac-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的纯化

上述反应完全后，向体系中滴加入50L去离子水，控内温不超过5℃，滴完后，分出下层，下层再用50L水萃一次，水相弃去，下层于40-45℃下减压浓缩干，即得较纯的3’,5’-Di-Ac-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷中间体,HPLC纯度99.91%,MS（ESI）m/z(M+H)330.09；

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ11.80（1H，brs）,8.21(1H,d,J=14Hz),6.10(1H,t,J=12Hz),4.21(1H,t,J=7Hz),3.78(1H,dd,J=6Hz.6Hz),2.21(6H,s)

实施例3

5’-DMT--5-氟脱氧尿嘧啶核苷的制备

1.5’-DMT-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的合成

将10Kg（40.61mol）上述生物法制得的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷粗品加入100L无水二氯甲烷中，再加入4.92Kg（48.72mol）三乙胺，固体搅拌悬浮，体系冷浴降温至0-10℃，搅拌下分批加入15.1Kg（44.67mol）DMT-Cl体系保温0-10℃搅拌密闭反应，固体全溶后，HPLC监控至主原料反应完全。

2.5’-DMT-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的纯化

上述反应完全后，向体系中滴加入50L去离子水，控内温不超过10℃，滴完后，分出下层，下层再用50L水萃一次，水相弃去，下层于40-45℃下减压浓缩干，即得较纯的5’-DMT-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷中间体，HPLC纯度99.95%，MS（ESI）m/z(M+H)548.34,¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ11.79（1H,brs）8.31(1H,d,J=14Hz),6.15(1H,t,J=12Hz),4.21(1H,t,J=7Hz),3.83（6H，s）3.78(1H,dd,J=6Hz.6Hz)

实施例4

5’-Tr-5-氟脱氧尿嘧啶核苷的制备

1.5’-Tr-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的合成

将10Kg（40.61mol）上述生物法制得的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷粗品加入100L无水二氯甲烷中，再加入4.92Kg（48.72mol）三乙胺，固体搅拌悬浮，体系冷浴降温至0-10℃，搅拌下分批加入12.45Kg（44.67mol）Tr-Cl体系保温0-10℃搅拌密闭反应，固体全溶后，HPLC监控至主原料反应完全。

2.5’-Tr-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的纯化

上述反应完全后，向体系中滴加入50L去离子水，控内温不超过10℃，滴完后，分出下层，下层再用50L水萃一次，水相弃去，下层于40-45℃下减压浓缩干，即得较纯的5’-Tr-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷中间体，HPLC纯度99.93%MS（ESI）m/z(M+H)488.14,¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ11.89（1H,brs）8.33(1H,d,J=14Hz),6.15(1H,t,J=12Hz),4.21(1H,t,J=7Hz),3.78(1H,dd,J=6Hz.6Hz)

实施例5

3’,5’-di-Bz-5-氟脱氧尿嘧啶核苷的制备

1.3’,5’-di-Bz-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的合成

将10Kg（40.61mol）上述生物法制得的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷粗品加入100L无水二氯甲烷中，再加入16.96Kg（121.85mol）三乙胺，固体搅拌悬浮，体系冷浴降温至-10-0℃，搅拌下滴加入12.55Kg（89.34mol）苯甲酰氯，体系保温0-10℃搅拌密闭反应，固体全溶后，HPLC监控至主原料反应完全。

2.3’5’-di-Bz-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的纯化

上述反应完全后，向体系中滴加入50L去离子水，控内温不超过10℃，滴完后，分出下层，下层再用50L水萃一次，水相弃去，下层于40-45℃下减压浓缩干，即得较纯的3’,5’-di-Bz-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷中间体，HPLC纯度99.95%MS（ESI）m/z(M+H)454.19,

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ11.87（1H,brs）8.31(1H,d,J=14Hz),6.17(1H,t,J=12Hz),4.11(1H,t,J=7Hz),3.77(1H,dd,J=6Hz.6Hz)

实施例6

3’,5’-di-TBDMS-5-氟脱氧尿嘧啶核苷的制备

1.3’,5’-di-TBDMS-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的合成

将10Kg（40.61mol）上述生物法制得的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷粗品加入100L无水二氯甲烷中，再加入16.96Kg（121.85mol）三乙胺，固体搅拌悬浮，体系冷浴降温至-10-0℃，搅拌下分批加入13.46Kg（89.34mol）TBDMS-Cl，体系保温0-10℃搅拌反应，固体全溶后，HPLC监控至主原料反应完全。

2.3’5’-di-TBDMS-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的纯化

上述反应完全后，向体系中滴加入50L去离子水，控内温不超过10℃，滴完后，分出下层，下层再用50L水萃一次，水相弃去，下层于40-45℃下减压浓缩干，即得较纯的3’,5’-di-TBDMS-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷中间体，HPLC纯度99.96%MS（ESI）m/z(M+H)474.35,

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ11.89（1H,brs）8.33(1H,d,J=14Hz),6.15(1H,t,J=12Hz),4.21(1H,t,J=7Hz),3.78(1H,dd,J=6Hz.6Hz),0.98(18H,s)

实施例7

3’,5’-di-TMS-5-氟脱氧尿嘧啶核苷的制备

1.3’,5’-di-TMS-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的合成

将10Kg（40.61mol）上述生物法制得的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷粗品加入100L无水二氯甲烷中，再加入16.96Kg（121.85mol）三乙胺，固体搅拌悬浮，体系冷浴降温至-10-0℃，搅拌下滴加入9.738Kg（89.34mol）TMS-Cl，体系保温0-10℃搅拌反应，固体全溶后，HPLC监控至主原料反应完全。

2.3’5’-di-TMS-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的纯化

上述反应完全后，向体系中滴加入50L去离子水，控内温不超过10℃，滴完后，分出下层，下层再用50L水萃一次，水相弃去，下层于40-45℃下减压浓缩干，即得较纯的3’,5’-di-TMS-5-氟-脱氧尿嘧啶核苷中间体，HPLC纯度99.94%MS（ESI）m/z(M+H)390.45,

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ11.85（1H,brs）8.30(1H,d,J=14Hz),6.13(1H,t,J=12Hz),4.22(1H,t,J=7Hz),3.76(1H,dd,J=6Hz.6Hz),0.21(18H,s)

实施例8

由3’,5’-di-AC-5-氟脱氧尿嘧啶核苷制备5-氟脱氧尿嘧啶核苷

1.5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的合成

将10Kg（30.28mol）上述方法制得的3’,5’-di-AC-5-氟脱氧尿嘧啶核苷加入到100L甲醇中，再加入10L浓氨水，体系密闭保温20-40℃搅拌反应，固体全溶后，HPLC监控至主原料反应完全。

2.5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的纯化

上述反应完全后，将体系于40-55℃下减压浓缩干，再加入70L甲醇加热至60℃，搅拌溶解固体，过滤，去除少量不溶物，然后2-8℃，保温结晶12小时，离心，即得5-氟-脱氧尿嘧啶核苷，固体于50－60℃下鼓风干燥12小时后打粉，混匀，HPLC纯度为99.99%，MS（ESI）m/z(M+H)246.10,¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ11.79（1H，brs）8.21(1H,d,J=14Hz),6.15(1H,t,J=12Hz),4.21(1H,t,J=7Hz),3.78(1H,dd,J=6Hz.6Hz),2.11(2H,dd,J=10Hz,9Hz)，符合目标物，此样品作为标准品。

实施例9

由3’,5’-di-Bz-5-氟脱氧尿嘧啶核苷制5-氟脱氧尿嘧啶核苷

1.5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的合成

将10Kg（22mol）上述方法制得的3’,5’-di-Bz-5-氟脱氧尿嘧啶核苷加入到100L甲醇中，再加入10L1N的NaOH，体系密闭保温20-30℃搅拌反应，固体全溶后，HPLC监控至主原料反应完全。

2.5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的纯化

上述反应完全后，用6N盐酸将体系调pH=6－7之间，然后将体系于40-55℃下减压浓缩干，再加入100L乙醇加热至70℃，搅拌溶解固体，过滤，去除少量不溶物，然后10-15℃，保温结晶12小时，离心，即得5-氟-脱氧尿嘧啶核苷，固体于50—60℃下鼓风干燥12小时后打粉，混匀，HPLC纯度为99.99%，MS（ESI）m/z(M+H)246.15,，HPLC与标准品对照一致。

实施例10

由5’-DMT-5-氟脱氧尿嘧啶核苷制5-氟脱氧尿嘧啶核苷

1.5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的合成

将10Kg上述方法制得的5’-DMT-5-氟脱氧尿嘧啶核苷加入到100L二氯甲烷中，再加入5L三氟醋酸，体系密闭保温5-10℃搅拌反应，两小时后，HPLC监控至主原料反应完全。

2.5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的纯化

上述反应完全后，向体系中滴加入50L去离子水，控内温不超过10℃，滴完后，分出下层，上层水相用6N NaOH将体系调pH=6—7之间，然后再用20L二氯甲烷对水相萃一次，二氯甲烷相弃去，水相于45-55℃下减压浓缩干，再加入100L乙腈加热至70℃，补加5L水，搅拌溶解固体，过滤，去除少量不溶物，然后10-15℃，保温结晶10小时，离心，即得5-氟-脱氧尿嘧啶核苷，固体于50－60℃下鼓风干燥12小时后打粉，混匀，HPLC纯度为99.99%，MS（ESI）m/z(M+H)246.12,HPLC与标准品对照一致。

实施例11

由5’-Tr-5-氟脱氧尿嘧啶核苷制5-氟脱氧尿嘧啶核苷

1.5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的合成

将10Kg上述方法制得的5’-Tr-5-氟脱氧尿嘧啶核苷加入到100L二氯甲烷中，再加入10L醋酸，体系密闭保温25-30℃搅拌反应，两小时后，HPLC监控至主原料反应完全。

2.5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的纯化

上述反应完全后，向体系中滴加入50L去离子水，控内温不超过30℃，滴完后，分出下层，上层水相用6N NaOH将体系调pH=6－7之间，然后再用20L二氯甲烷对水相萃一次，二氯甲烷相弃去，水相于45-55℃下减压浓缩干，再加入100L丙酮加热至60℃，补加15L水，搅拌溶解固体，过滤，去除少量不溶物，然后5-10℃，保温结晶10小时，离心，即得5-氟-脱氧尿嘧啶核苷，固体于50－60℃下鼓风干燥12小时后打粉，混匀，HPLC纯度为99.99%，MS（ESI）m/z(M+H)246.20,HPLC与标准品对照一致。

实施例12

由3’,5’-di-TBDMS-5-氟脱氧尿嘧啶核苷制5-氟脱氧尿嘧啶核苷

1.5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的合成

将10Kg上述方法制得的3’,5’-di-TBDMS-5-氟脱氧尿嘧啶核苷加入到100L二氯甲烷中，再加入10L四丁基氟化铵，体系密闭保温25-30℃搅拌反应，两小时后，HPLC监控至主原料反应完全。

2.5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的纯化

上述反应完全后，向体系中滴加入50L去离子水，控内温不超过20℃，滴完后，分出下层，上层水相用6N HCl将体系调pH=6－7之间，然后再用20L二氯甲烷对水相萃一次，二氯甲烷相弃去，水相于45-55℃下减压浓缩干，再加入100L乙醇加热至70℃，补加5L水，搅拌溶解固体，过滤，去除少量不溶物，然后5-10℃，保温结晶10小时，离心，即得5-氟-脱氧尿嘧啶核苷，固体于50－60℃下鼓风干燥12小时后打粉，混匀，HPLC纯度为99.99%，MS（ESI）m/z(M+H)246.25,HPLC与标准品对照一致。

实施例13

由3’,5’-di-TMS-5-氟脱氧尿嘧啶核苷制5-氟脱氧尿嘧啶核苷

1.5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的合成

将10Kg上述方法制得的3’,5’-di-TMS-5-氟脱氧尿嘧啶核苷加入到100L二氯甲烷中，再加入5L四丁基氟化铵，体系密闭保温25-30℃搅拌反应，两小时后，HPLC监控至主原料反应完全。

2.5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的纯化

上述反应完全后，向体系中滴加入50L去离子水，控内温不超过20℃，滴完后，分出下层，上层水相用6N HCl将体系调pH=6－7之间，然后再用20L二氯甲烷对水相萃一次，二氯甲烷相弃去，水相于45-55℃下减压浓缩干，再加入70L乙醇加热至70℃，补加5L水，搅拌溶解固体，过滤，去除少量不溶物，然后5-10℃，保温结晶10小时，离心，即得5-氟-脱氧尿嘧啶核苷，固体于50－60℃下鼓风干燥12小时后打粉，混匀，HPLC纯度为99.99%，MS（ESI）m/z(M+H)246.15,HPLC与标准品对照一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.一种如结构式A所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

获得如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物；和(A)将如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物和能够脱除羟基保护基的试剂混合，在5-40℃反应，得到反应体系A；

(B)使反应体系A溶解于有机溶剂中，在0-15℃结晶得到如结构式A所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷；所述脱除羟基保护基的试剂选自氨水及甲醇胺溶液、氢氧化钠及氢氧化钾的水溶液、冰醋酸、三氟醋酸或四丁基氟化铵；

所述获得如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物的步骤为：

(Ⅰ)将含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品和羟基保护基试剂混合，反应得到溶液Ⅰ；

(Ⅱ)将溶液Ⅰ和水混合进行淬灭，并分出有机层溶液Ⅱ；

(Ⅲ)将有机层溶液Ⅱ用水萃取后弃去水相后，得到如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物；

所述羟基保护基选自乙酰基、4,4’-二甲氧基-三苯基甲基、三苯基甲基、苯甲酰基、叔丁基二苯基硅基或三甲基硅基；

步骤(Ⅰ)的反应和步骤(Ⅱ)的淬灭在0-10℃进行；

所述含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品通过下述步骤制备得到：

(i)将β-胸苷、5-氟-尿嘧啶、磷酸或磷酸盐和核苷磷酸化酶在pH 6.5-6.7及45-55℃混合、反应完全，得到反应体系i；

(ii)将反应体系i冷却、离心、去除不溶物后用强碱性树脂进行纯化，得到含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品；

以所述含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品总重量计，其中的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷含量为70-99.5％，其中5-氟-尿嘧啶有0.5-30％；

其中R1表示乙酰基(AC)，4,4’-二甲氧基-三苯基甲基(DMT)，三苯基甲基(Tr)，苯甲酰基(Bz),叔丁基二苯基硅基(TBDMS)，三甲基硅基(TMS)；

R₂表示乙酰基(AC)，苯甲酰基(Bz),叔丁基二苯基硅基(TBDMS)，三甲基硅基(TMS)。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，含有5-氟-脱氧尿嘧啶核苷的粗品与羟基保护基试剂的摩尔比为1.0∶1.0－1.2。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(A)将如结构式B所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷衍生物和能够脱除羟基保护基的试剂混合，在5-40℃反应，得到反应体系A；

(B1)将反应体系A和水混合，使得到的水相pH为6-7，得到溶液B1；

(B2)用选自二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或乙酸乙酯的溶剂萃取溶液B1，得到的水相溶解于有机溶剂中，在0-15℃结晶得到如结构式A所示的5-氟-脱氧尿嘧啶核苷。

4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自下述的一种或一种以上的混合：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮。