CN103889993B - 修饰的肌酸化合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了式(I)、式(II)和式(III)表示的肌酸衍生物，其中Z是官能团；Y是线粒体靶向剂、阳离子铵基或含至少一个带正电荷的氨基酸残基的多肽；R₁各自独立地是氢、烷基或磷酸酯基；R₂是连接基；R₃是间隔基；R₄是氢、烷基、芳基或杂环基；或R₄和R₁或R₄和R₃与它们所连接的氮原子一起形成杂环，且W是氢或烷基。

Description

修饰的肌酸化合物

发明领域

本发明涉及肌酸衍生物，包括用一种或多种线粒体靶向剂官能团化的肌酸衍生物，以及制备和使用肌酸衍生物的方法。

发明背景

肌酸(Cr)或2-(甲脒基-甲基-氨基)乙酸是自然存在的含氮有机酸，其在脊椎动物的肝脏中合成，并帮助向肌肉和神经细胞提供能量。肌酸由氨基酸精氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸使用S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体、通过胍基乙酸酯的甲基化、经由涉及GAMT(胍基乙酸N-甲基转移酶，也称为甘氨酸脒基转移酶)的两步骤的酶过程而合成。胍基乙酸酯自身由氨基酸精氨酸和甘氨酸在肾脏中形成。一旦在肝脏中形成或通过消化获得肌酸，则其存储在包括肌肉和脑细胞的细胞中。

酶肌酸(phospho)激酶(CPK或CK)催化磷酸盐由ATP至肌酸的胍盐的转移，形成磷酸肌酸(PCr)。该反应是可逆的，使得当能量需求高时(例如，在肌肉用力或大脑活动期间)，CPK可以使磷酸肌酸脱去磷酸，并将磷酸盐转移回形成ADP的ATP。这能使得肌酸作为其中磷酸盐可以不依赖于ATP而存储的能量存储分子而发挥作用。

紊乱的线粒体功能可以导致ATP消耗，导致明显的生理问题。一个解决ATP消耗的潜在的方法是增加磷酸肌酸(PCr)存储，例如通过施用可以通过CPK磷酸化的肌酸。存在若干种形式的CPK，但所述酶的最普遍的形式位于线粒体中，在这里其由线粒体-产生的ATP和来自细胞溶胶的肌酸生成磷酸肌酸。然而，至线粒体的肌酸转运是需能量过程。因此，对靶向至线粒体以避免与内源性肌酸转运相关的能量损失、并在肌酸作用的亚细胞部位提供肌酸的肌酸类似物仍然有需 求。

发明概述

本发明提供了式I化合物

或其可药用盐，其中

Z是-C(＝O)NR₅-、-OC(＝O)NR₅-、-NR₅C(＝O)O-、-NR₅C(＝O)NR₅-、-SO₂NR₅-、-NR₅SO₂-、-O-、-S-或-S-S-；其中R₅各自独立地是氢、烷基、芳基或杂环基；

Y是阳离子鏻基或含至少一个带正电荷的氨基酸残基的多肽；

R₁各自独立地是氢、烷基或磷酸酯基；

R₂不存在、或是烷基、环烷基、杂环烷基、烷基芳基、烷基芳基烷基或芳基；

R₃是烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、烷基杂环烷基、烷基芳基或烷基芳基烷基；

R₄是氢、烷基或芳基；或

R₄和R₁基团与它们所连接的氮原子一起形成含至少5个原子的杂环；或

R₄和R₃与它们所连接的氮原子一起形成含至少5个原子的杂环；

在每次存在时，烷基任选地被1-3个独立地选自卤素、卤代烷基、羟基、氨基、硫代、醚、酯、羧基、氧代、醛、环烷基、腈、脲、酰胺、氨基甲酸酯和芳基的取代基所取代；或

在每次存在时，芳基任选地被1-5个独立地选自卤素、叠氮、烷 基、卤代烷基、芳烷基、链烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、硫氢基、亚氨基、酰氨基、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰胺、酮、醛、酯、杂环基和腈的取代基所取代；且W是氢或烷基；

条件是当Y是阳离子鏻基时，Z和Y不在相同的R₂碳上取代，且Z和–NR₄-基团不在相同的R₃碳上取代。

本发明还提供了式II或式III的化合物

或其可药用盐，其中:

Z是官能团、诸如-C(＝O)NR₅R₅、-NR₅C(＝O)OR₅、-NR₅C(＝O)NR₅R₅、-O(C＝O)NR₅R₅、-SO₂NR₅R₅、-NR₅SO₂R₅、-OR₅、-SR₅、-S-SR₅、-CR₅OH或-CR₅SH₂，条件是当Z是-NR₅C(＝O)OR₅、-NR₅C(＝O)NR₅R₅、-O(C＝O)NR₅R₅、-SO₂NR₅R₅、-NR₅SO₂R₅、-OR₅、-SR₅或-S-SR₅时，Z和–NR₄-基团不在相同的R₃碳上取代；且其中R₅各自独立地是氢、烷基、芳基或杂环基；

Y是线粒体靶向剂、诸如阳离子鏻基、阳离子铵基或含至少一个带正电荷的氨基酸残基的多肽；

R₁各自独立地是氢、烷基或磷酸酯基；

R₂不存在，或是选自烷基、环烷基、杂环烷基、烷基芳基、烷基芳基烷基或芳基的连接基，条件是当Y是阳离子鏻基时，胍氮和Y不在相同的R₂碳上取代；

R₃是选自烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、烷基杂环烷基、烷基芳基或烷基芳基烷基的间隔基，条件是Z和胍氮不在相同的R₃碳上取代；

R₄是氢、烷基、芳基或杂环基；或

R₄和R₁基团与它们所连接的氮原子一起形成含至少5个原子的杂环；或

R₄和R₃与它们所连接的氮原子一起形成含至少5个原子的杂环；在每次存在时，烷基任选地被1-3个独立地选自卤素、卤代烷基、羟基、氨基、硫代、醚、酯、羧基、氧代、醛、环烷基、腈、脲、酰胺、氨基甲酸酯和芳基的取代基所取代。

在每次存在时，芳基任选地被1-5个独立地选自卤素、叠氮、烷基、卤代烷基、芳烷基、链烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、硫氢基、亚氨基、酰氨基、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰胺、酮、醛、酯、杂环基和腈的取代基所取代；且W是氢或烷基。

本发明还提供了:

含式I、II或III的化合物的药物组合物；

在有需要的患者中增强线粒体功能的方法，其包括施用对于在患者中增强线粒体功能有效的量的式I、II或III的药物组合物；

在患者的线粒体中增加ATP生成的方法，其包括施用对于在受试者的线粒体中增加ATP生成有效的量的式I、II或III的药物组合物；和

在有需要的患者中治疗线粒体相关障碍的方法，其包括施用对于在患者中治疗线粒体相关障碍的一种或多种症状有效的量的式I、II或III的药物组合物。

本发明还提供了制备和使用本发明的肌酸化合物的方法。

附图简述

图1描述了标绘ATP消耗(在向ATP和重组CPK的溶液中添加肌酸(5mM)和肌酸化合物1(5mM、2.5mM和1mM)之后)的速度的柱状图。肌酸的添加引起ATP水解/消耗的增加。等摩尔浓度的Mito- 肌酸(化合物1)比肌酸具有显著更高的ATP水解/消耗速度，证实了其对重组CPK具有改善的活性。

图2描述了标绘氧消耗速度(％OCR)的增加百分比(在添加10μM未修饰的肌酸和5nM、10nM、50nM和500nM的浓度的化合物1(“Mito-肌酸”)之后)的柱状图。与未修饰的肌酸相比，浓度从5nM增加至500nM的化合物1在治疗的30分钟内引起氧消耗速度显著增加。

图3描述了标绘氧消耗速度(％OCR)的增加百分比(在添加25nM的化合物1(“Mito-肌酸”)和化合物2(“N-甲基Mito-肌酸”)之后)的柱状图。将氧消耗速度的增加绘制为与加入10μM肌酸后所测定的氧消耗速度相比的氧消耗的增加百分比。

图4描述了标绘复合体I活性(表示为每分钟的光密度变化)(在添加化合物1(“Mito肌酸”；25nM)和未修饰的肌酸(10μM)之后)的柱状图。与未修饰的肌酸相比，用化合物1温育在30分钟内诱导复合体I活性显著增加。

发明详述

提供了含与一个或多个活性剂、诸如线粒体靶向剂可操作地连接的肌酸亚单元的修饰的肌酸化合物。示例性的修饰的肌酸化合物由以下所示的通式表示:

其中A、B和C组合表示肌酸亚单元，A表示胍或修饰的胍基团，B表示间隔基，且C表示官能团；D表示任选的连接基；且E表示活性剂。

如以上通式所述，活性剂E通常通过连接基D连接于肌酸亚单元A-B-C。在一些情况中，连接基D可以不存在，且活性剂E可以直接连接于肌酸亚单元A-B-C。活性剂E可以任选地通过连接基D连接于肌酸亚单元的任何部分，即连接于胍基团A、间隔基B或官能团C。

在一个方面，修饰的肌酸化合物由式I表示

或其可药用盐，其中Z是-C(＝O)NR₅-、-OC(＝O)NR₅-、-NR₅C(＝O)O-、-NR₅C(＝O)NR₅-、-SO₂NR₅-、-NR₅SO₂-、-O-、-S-或-S-S-，其中R₅各自独立地是氢、烷基、芳基或杂环基；Y是阳离子鏻基、阳离子铵基或含至少一个带正电荷的氨基酸残基的多肽；R₁各自独立地是氢、烷基或磷酸酯基；R₂不存在、或是烷基、环烷基、杂环烷基、烷基芳基、烷基芳基烷基或芳基，条件是当Y是阳离子鏻基时，Z和Y不在相同的R₂碳上取代；R₃是烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、烷基杂环烷基、烷基芳基或烷基芳基烷基，条件是Z和–NR₄-基团不在相同的R₃碳上取代；R₄是氢、烷基或芳基；或R₄和R₁基团与它们所连接的氮原子一起形成含至少5个原子的杂环；或R₄和R₃与它们所连接的氮原子一起形成含至少5个原子的杂环；在每次存在时，烷基任选地被1-3个独立地选自卤素、卤代烷基、羟基、氨基、硫代、醚、酯、羧基、氧代、醛、环烷基、腈、脲、酰胺、氨基甲酸酯和芳基的取代基所取代；或在每次存在时，芳基任选地被1-5个独立地选自卤素、叠氮、烷基、卤代烷基、芳烷基、链烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、硫氢基、亚氨基、酰氨基、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰胺、酮、醛、酯、杂环基和腈的取代基所取代；且W是氢或烷基。

特别地，本发明提供了式I化合物，其中Z是-C(＝O)NR₅-、-OC(＝O)NR₅-、-NR₅C(＝O)O-或-NR₅C(＝O)NR₅-；其中R₅各自独立地是氢或C_1-6烷基；Y是阳离子鏻基；R₁各自独立地是氢、烷基或磷酸酯基；R₂是烷基、环烷基、杂环烷基或烷基芳基；R₃是烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、烷基杂环烷基或烷基芳基；R₄是氢或C_1-6烷 基；且W是氢。

特别地，本发明提供了式I化合物，其中Z是-C(＝O)NR₅-，其中R₅是氢或C_1-6烷基；Y是–P⁺(R′)₃X^ˉ，其中R′是烷基或芳基；且X^ˉ是阴离子；R₁各自独立地是氢或–PO₃ ^2-M，其中M是可药用阳离子，其包括具有一个或两个正电荷的金属阳离子、诸如M⁺或M²⁺；R₂是直链或支链的C_1-8烷基；R₃是烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基或烷基杂环烷基，其中烷基是直链或支链的C_1-12烷基，环烷基包含3-8个碳原子，杂环烷基是具有至少一个选自硫、非-过氧化物氧或氮的杂原子的5-10个原子的环；R₄是氢或C_1-4烷基；且W是氢。

特别地，本发明提供了式I化合物，其中Z是-C(＝O)NH，Y是–P⁺(苯基)₃X^ˉ，其中X^ˉ是氯离子或三氟乙酸根；R₁是氢；R₂是C_1-8烷基；R₃是C_1-6烷基、C_1-6烷基环烷基，其中环烷基包含3-6个碳原子，或C_1-6烷基杂环烷基，其中杂环烷基是具有氮原子的5-6个原子的环；且R₄是甲基。

特别地，式I化合物，其中Z是-C(＝O)NR₅-，且R₅是氢或C_1-6烷基。

特别地，式I化合物，其中Z是-C(＝O)NH-。

特别地，式I化合物，其中阳离子鏻基选自–P⁺(R′)₃X^ˉ，其中R′是烷基或芳基；且X^ˉ是阴离子。

特别地，式I化合物，其中R′是苯基；且X^ˉ是氯离子或三氟乙酸根。

特别地，式I化合物，其中至少一个R₁是氢。

特别地，式I化合物，其中两个R₁都是氢。

特别地，式I化合物，其中一个R₁是氢，另一个R₁是–PO₃ ^2-M；

特别地，式I化合物，其中R₂是直链或支链的C_1-20烷基。

特别地，式I化合物，其中R₂是C_3-8烷基。

特别地，式I化合物，其中R₃是烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基或烷基杂环烷基，其中烷基是直链或支链的。

特别地，式I化合物，其中R₃是C_1-8烷基。

特别地，式I化合物，其中R₃是C_1-6烷基环烷基，其中环烷基包含3-8个碳原子。

特别地，式I化合物，其中R₃是C_1-6烷基环烷基，其中环烷基包含3-6个碳原子。

特别地，式I化合物，其中R₃是C_1-6烷基杂环烷基，其中杂环烷基是具有至少一个选自硫、非-过氧化物氧或氮的杂原子的3-10个原子的环。

特别地，式I化合物，其中R₃是C_1-6烷基杂环烷基，其中杂环烷基是5-6个原子的环。

特别地，式I化合物，其中R₄是氢或C_1-4烷基。

特别地，式I化合物，其中R₄是甲基。

本发明还提供了式I化合物，其是式IX的可药用盐

其中X^ˉ是阴离子。

本发明还提供了式II或III的化合物

或其可药用盐，其中Z是官能团；Y是线粒体靶向剂、阳离子铵基或含至少一个带正电荷的氨基酸残基的多肽；R₁各自独立地是氢、烷基 或磷酸酯基；R₂不存在，或是连接基；R₃是间隔基；R₄是氢、烷基、芳基或杂环基；或R₄和R₁基团与它们所连接的氮原子一起形成含至少5个原子的杂环；或R₄和R₃与它们所连接的氮原子一起形成含至少5个原子的杂环；在每次存在时，烷基任选地被1-3个独立地选自卤素、卤代烷基、羟基、氨基、硫代、醚、酯、羧基、氧代、醛、环烷基、腈、脲、酰胺、氨基甲酸酯和芳基的取代基所取代；在每次存在时，芳基任选地被1-5个独立地选自卤素、叠氮、烷基、卤代烷基、芳烷基、链烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、硫氢基、亚氨基、酰氨基、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰胺、酮、醛、酯、杂环基和腈的取代基所取代；且W是氢或烷基；条件是当Z是-NR₅C(＝O)OR₅、-NR₅C(＝O)NR₅R₅、-O(C＝O)NR₅R₅、-SO₂NR₅R₅、-NR₅SO₂R₅、-OR₅、-SR₅或-S-SR₅时，Z和–NR₄-基团不在相同的R₃碳上取代；且当Y是阳离子鏻基时，氮和Y不在相同的R₂碳上取代。

特别地，式II或III的化合物，其中Z是-C(＝O)N(R₅)₂、-C(＝O)N(R₅)₂、-NR₅C(＝O)O(R₅)、-NR₅C(＝O)N(R₅)₂、-SO₂N(R₅)₂、-NR₅SO₂R₅、-O(R₅)、-S(R₅)、-S-S(R₅)、-C(R₅)₂OH或–C(R₅)₂SH；其中R₅是氢、烷基、芳基或杂环基；Y是阳离子鏻基、阳离子铵基或含至少一个带正电荷的氨基酸残基的多肽；R₁独立地是氢、烷基或磷酸酯基；R₂不存在、或是烷基、环烷基、杂环烷基、烷基芳基、烷基芳基烷基或芳基；R₃是烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、烷基杂环烷基、烷基芳基或烷基芳基烷基；R₄是氢、烷基或芳基；且W是氢或烷基；条件是当Y是阳离子鏻基时，Z和Y不在相同的R₂碳上取代；且条件是Z和胍氮不在相同的R₃碳上取代。

特别地，式II或III的化合物，其中Z是-C(＝O)N(R₅)₂、-C(＝O)N(R₅)₂、-NR₇C(＝O)O(R₅)或-NR₅C(＝O)N(R₅)₂、-SO₂N(R₅)₂，其中R₅各自独立地是氢或C_1-6烷基；Y是阳离子鏻基；R₁各自独立地是氢、烷基或磷酸酯基；R₂是烷基、环烷基、杂环烷基或烷基芳基；R₃是烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、烷基杂环烷基或烷基芳 基；且R₄是氢或C_1-6烷基；且W是氢；条件是当Y是阳离子鏻基时，Z和Y不在相同的R₂碳上取代；且条件是Z和胍氮不在相同的R₃碳上取代。

特别地，式II或III的化合物是式IIX或IIIX的可药用盐

其中X^ˉ是阴离子。

本文描述了用于测定修饰的肌酸化合物对重组CPK的活性的体外试验，以及用于测定修饰的肌酸化合物在细胞中增加氧消耗速度(OCR)和复合体I(CI)活性的能力的试验。

在一些方面中，还描述了使用含一种或多种肌酸化合物和一种或多种可药用赋形剂和/或载体的药物组合物来改变线粒体功能或治疗线粒体障碍的一种或多种症状。本文描述的化合物可以配制用于多种施用途径，包括肠内(例如，口服)、胃肠外(例如，静脉内)或局部(例如，透皮)。

在一些方面中，可施用药物组合物以治疗多种线粒体的疾病或障碍。示例性的疾病和障碍包括但不限于线粒体肌病(例如，克-塞综合征、利氏综合征、线粒体DNA缺乏综合征(MDS)、线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作(MELAS))、肌阵挛癫痫伴破碎红纤维(MERRF)、线粒体神经胃肠脑肌病(MNGIE)、神经病、共济失调、色素性视网膜炎(NARP)和进行性外眼肌麻痹(PEO)。

此外，在另一个方面，本文公开的化合物可以用于治疗肌酸缺乏综合征、关节炎、充血性心力衰竭、废用性萎缩、环状萎缩(gyrate atrophy)、亨延顿舞蹈病、帕金森病和麦卡德病的一种或多种症状。

在其它方面中，公开了合成式I、II和III的化合物的方法。

在描述所公开主题和要求保护所公开主题时，将根据下文陈述的定义来使用以下术语。

应当注意到，除非文中另外明确指出，否则用于本说明书和所附权利要求的单数形式包括其复数指示物。因此，例如，提及含“化合物”的组合物时，其包括两个或多个化合物的混合物。还应注意除非在文中另外清楚地指出，否则术语“或”通常以其包括“和/或”的含义使用。

各种含烃部分的碳原子含量由指定在该部分中最小和最大碳原子数的前缀表示，即，前缀C_i-j或C_i-C_j表示整数“i”至整数“j”个(包括i和j在内)碳原子的部分。因此，例如，C_1-4烷基是指1至4个(包括1和4在内)碳原子的烷基。

如本文使用的“烷基”是指饱和的和不饱和的脂族基，其包括直链烷基、链烯基或炔基、支链烷基、链烯基或炔基、环烷基、环烯基或环炔基(脂环)、烷基取代的环烷基、环烯基或环炔基和环烷基取代的烷基、链烯基或炔基。除非另外指出，否则直链或支链烷基在其主链具有30个或更少的碳原子(例如，对于直链为C₁-C₃₀，对于支链为C₃-C₃₀)、更特别具有20个或更少的碳原子、更特别具有12个或更少的碳原子，且最特别具有8个或更少的碳原子。同样地，一些环烷基在它们的环结构中具有3-10个碳原子、且更特别在环结构中具有5、6或7个碳。上文提供的范围包括最小值和最大值之间的所有值。

烷基还可被一个或多个包括但不限于卤素、羟基、氨基、硫代、醚、酯、羧基、氧代和醛基的基团所取代。烷基还可以在碳主链中包含一个或多个杂原子。特别地引入碳主链中的杂原子为氧、氮、硫及其组合。在某些实施方案中，烷基包含1至4个杂原子。

如本文使用的“链烯基”和“炔基”是指含一个或多个双键或叁键的在长度上类似(例如，C₂-C₃₀)的不饱和的脂族基，且可能取代为如上文所述的烷基。

如本文使用的“芳基”是指5-、6-和7-元的芳环。所述环可以是碳环、杂环、稠合碳环、稠合杂环、二碳环或二杂环系统，其任选地被 卤素、烷基-、链烯基-和炔基-所取代。广义上，用于本文的“Ar”包括可包含0至4个杂原子的5-、6-和7-元的单环芳族基团，例如，苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。这些在环结构中具有杂原子的芳基还可被称为“杂芳基”、“芳基杂环”或“杂芳族基”。芳环可以在一个或多个环位置被如上文所述的此类取代基所取代，所述取代基为例如，卤素、叠氮、烷基、卤代烷基、芳烷基、链烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、硫氢基、亚氨基、酰氨基、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰氨基、酮、醛、酯、杂环基、芳族或杂芳族基团、--CF₃、--CN等。术语“Ar”还包括其中至少一个环是芳族的、具有两个或多个环的多环环系统，其中两个相邻的环(这两个环是“稠环”)共用两个或多个碳，例如，另外的环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环。杂环的实例包括但不限于苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH咔唑基、咔啉基、苯并二氢吡喃基、色烯基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、亚吲哚基(indolenyl)、二氢吲哚基、中氮茚基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基(isatinoyl)、异苯并呋喃基、异苯并二氢吡喃基、异吲唑基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲基二氧基苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、phenoxathinyl、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、 奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、苯硫基和呫吨基。

如本文使用的“烷基芳基”是指被芳基(例如，芳族或杂芳族基团)取代的烷基。

如本文使用的“杂环”或“杂环的”是指经由单环或双环的环上的碳或氮连接的环状基，其包含3-10个环原子、且特别是5-6个环原子，由碳原子和1-4个各自选自非过氧化物氧、硫和N(Y)(其中Y不存在或是H、O、(C_1-4)烷基、苯基或苄基)的杂原子组成，且任选地包含一个或多个双键或叁键，且任选地被一个或多个取代基所取代。术语“杂环”还包括取代的和未被取代的杂芳基环。杂环的实例包括但不限于苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、苯并二氢吡喃基、色烯基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3-b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、亚吲哚基(indolenyl)、二氢吲哚基、中氮茚基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基(isatinoyl)、异苯并呋喃基、异苯并二氢吡喃基、异吲唑基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲基二氧基苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、phenoxathinyl、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹 啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、苯硫基和呫吨基。

如本文使用的“杂芳基”是指单环的芳环，其包含5或6个由碳及1、2、3或4个各自选自非过氧化物氧、硫和N(Y)的杂原子组成的环原子，其中Y不存在或是H、O、(C₁-C₈)烷基、苯基或苄基。杂芳基的非限制性实例包括呋喃基、咪唑基、三唑基、三嗪基、噁唑基(oxazoyl)、异噁唑基(isoxazoyl)、噻唑基、异噻唑基(isothiazoyl)、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、四唑基、吡啶基、(或其N-氧化物)、噻吩基、嘧啶基(或其N-氧化物)、吲哚基、异喹啉基(或其N-氧化物)、喹啉基(或其N-氧化物)等。术语"杂芳基"可以包括由约8至10个环原子的单边稠(ortho-fused)二环杂环获得的基团、特别是苯并-衍生物或通过将丙烯、三甲烯或四甲烯双自由基稠合至其而衍生的物质。杂芳基的实例可以是呋喃基、咪唑基、三唑基、三嗪基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基(pyraxolyl)、吡咯基、吡嗪基、四唑基、吡啶基(或其N-氧化物)、噻吩基(thientyl)、嘧啶基(或其N-氧化物)、吲哚基、异喹啉基(或其N-氧化物)、喹啉基(或其N-氧化物)等。

“卤素”如本文使用的是指氟、氯、溴或碘。

如本文使用的术语“取代的”是指本文所述的化合物的所有容许的取代基。在最广泛的含义中，容许的取代基包括有机化合物的非环的和环的、支链的和直链的、碳环的和杂环的、芳族的和非芳族的取代基。例示性的取代基包括但不限于卤素、羟基或任何其他含任意数目的碳原子、特别是1-14个碳原子的有机基团，且任选地包括一个或多个杂原子、诸如氧、硫或氮，其为直链、支链或环结构形式。代表性的取代基包括烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、 羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C₃-C₂₀环基、取代的C₃-C₂₀环基、杂环基、取代的杂环基、氨基酸、肽和多肽基团。

杂原子诸如氮可具有氢取代基和/或满足杂原子的化合价的本文所述的有机化合物的任何容许的取代基。应理解“取代”或“取代的”包括内在的条件，即该取代与被取代的原子和取代基所容许的化合价一致，且取代产生稳定的化合物，即不会自发转变(诸如通过重排、环化、消除反应等)的化合物。

如本文使用的术语“可药用盐”是指本文定义的化合物的衍生物，其中通过制备为其酸盐或碱盐来修饰母体化合物，和/或存在鏻或铵阳离子。可药用盐的实例包括但不限于碱性残基诸如胺类的无机酸盐或有机酸盐；和酸性残基诸如羧酸的碱或有机盐。可药用盐包括例如从无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规的无毒的盐或季铵盐。此类常规的无毒的盐包括源自无机酸的那些，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸；和从有机酸制备的盐，诸如醋酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、乙醇酸盐、硬脂酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、双羟萘酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、苯乙酸盐、谷氨酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、对氨基苯磺酸盐、2-乙酰氧基苯甲酸盐、富马酸盐、甲苯磺酸盐、萘磺酸盐、甲磺酸盐、乙烷二磺酸盐、草酸盐和羟乙磺酸盐。

可以通过常规化学方法从包含碱性或酸性基团的母体化合物合成化合物的可药用酸盐或碱盐。通常，此类盐可以通过这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适合的碱或酸在水或有机溶剂或在两者的混合物中进行反应来制备；通常，非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈为实例。当选择存在这种情况时，可通过多种方法制备鏻离子的阴离子抗衡离子，包括所述季化所述膦的直接结果和应用离子交换来将一种抗衡离子替换为另一种。适合的盐和抗衡离子的列表见Remington’s Pharmaceutical Sciences,第20版,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2000,第704页；和“Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,”P.Heinrich Stahl和CamilleG.Wermuth编撰,Wiley-VCH,Weinheim,2002。

如本文中一般使用的“可药用”是指在合理的医学判断范围内、适合用于与人和动物的组织接触而没有过多的毒性、刺激性、变应性反应或其他问题或并发症(具有合理的益处/风险比例)的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。可药用载体和/或赋形剂包括包含美国食品药品管理局认为安全的(GRAS)化合物或物质的那些。

如本文使用的术语“宿主”是指具有线粒体的多细胞生物，其包括但不限于哺乳动物诸如灵长类、人、狗、猫、牛、猪、绵羊等。

如本文使用的术语“线粒体谢物”是指有机化合物，其是线粒体中的起始物质、中间体或线粒体中存在的代谢的最终产物。

如本文使用的术语"可操作地连接"是指各组分被配制成并列(juxtaposition)以执行其常见功能。例如，可操作地连接于化合物的线粒体靶向剂会使连接的化合物指向定位于线粒体。在一些实施方案中，连接的化合物在线粒体中保留生物活性。或者，所述化合物可以通过使化合物与靶向剂结合的连接基或官能团的裂解而释放。所述官能团或连接基可以通过包括水解和酶法裂解在内的多种机制裂解。

如本文使用的术语“前药”是指以无活性(或活性显著低)形式施用的药理学物质(药物)。一旦施用后，前药在体内(体内)代谢为活性化合物。

如本文使用的术语“肌酸亚单元”是指具有源自肌酸的化学结构的化合物的一部分。肌酸亚单元通常包括胍或修饰的胍基团、间隔基和官能团。代表性的肌酸亚单元如下所示:

其中变量如上文所定义。

如本文使用的术语“间隔基”是指使胍或修饰的胍基团与官能团连接的肌酸亚单元的一部分。

如本文使用的术语“连接基”或“连接基团”是指最少为二价并连接肌酸亚单元与活性剂的基团或部分。连接基可以由原子的任何集合(包括低聚和多聚体链)组成；然而，间隔基中原子的总数特别为3至200个原子、更特别3至150个原子、更特别3至100个原子、最特别3至50个原子。在一些实施方案中，连接基是亲水性的。在一些实施方案中，连接基是烷基、烷基芳基、寡-或聚乙二醇链或寡-或聚(氨基酸)链。在一些实施方案中，连接基还可包含一个或多个可裂解亚单元、诸如二硫基，一个或多个可水解官能团、诸如酯或酰胺，一个或多个金属络合物、诸如聚组氨酸-镍螯合物，一个或多个氢键供体-受体对，一个或多个生物分子/生物结合物对(诸如生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素对)以及其组合。

如本文使用的术语“治疗有效的”意指使用的组合物的量足以改善疾病或障碍的一种或多种病因或症状。所述改善仅需要减少或改变，不一定消除。如本文使用的术语“治疗有效量”、“治疗量”和“药用有效量”含义相同。本领域技术人员可以容易地决定适合的治疗量。

用于本文的术语“类似物”和“衍生物”可交换使用，且是指具有与母体化合物类似结构的化合物，但与母体化合物不同之处在于在一个或多个某些组分上有差别。类似物或衍生物与母体化合物的不同之处在于一个或多个原子、官能团或子结构不同，其被其他原子、基团或子结构代替。至少在理论上可以设想类似物或衍生物由母体化合物通过一些化学或物理过程形成。

通常，连接基(D)使单个活性剂(E)连接于肌酸亚单元。在其它情况中，肌酸亚单元与多个活性剂连接。在此类化合物中，所述多个活 性剂可以是相同或不同的。在一些实施方案中，多个活性剂连接于与肌酸亚单元连接的单一连接基。在其他实施方案中，肌酸亚单元在多个位置被一个或多个任选地经由连接基连接的活性剂取代。

在修饰的肌酸化合物的情况中，肌酸亚单元、连接基和一个或多个活性剂可以是下文所述的任何一种。在一些情况中，活性剂是功能为在细胞内使修饰的肌酸部分选择性定位的靶向剂。在一些实施方案中，修饰的肌酸化合物包含与线粒体靶向剂可操作地连接的肌酸亚单元。

在一些实施方案中，修饰的肌酸化合物包含连接于线粒体靶向剂的肌酸亚单元。在一些情况中，所述肌酸亚单元直接连接于线粒体靶向剂。在其他实施方案中，所述线粒体靶向剂通过连接基连接于肌酸亚单元。所述连接基可以连接于肌酸亚单元的任何部分、诸如连接于胍基团、间隔基或官能团。

可以通过将肌酸化合物连接于靶向剂来导向修饰的肌酸化合物以使其在细胞内选择性定位。在一个实施方案中，修饰的肌酸化合物包含与一个或多个线粒体靶向剂连接、附着、缀合、联合或与其官能团化的肌酸亚单元。在一些情况中，当连接于靶向剂时，肌酸部分保留其生物活性。

在一些实施方案中，一旦进入线粒体之后，肌酸部分从靶向剂分离。肌酸部分可以通过包括简单的水解或酶促在内的多种机制释放。在一个实施方案中，肌酸部分直接结合于靶向剂，且肌酸部分以水解和/或酶促的方式释放。在另一个实施方案中，肌酸部分通过连接基结合于靶向剂，且连接基以水解和/或酶促的方式裂解。

在一些实施方案中，连接基是在线粒体中裂解的非-肽连接基。在其他实施方案中，连接基是在线粒体中裂解的肽连接基。在又其他的实施方案中，肌酸部分不从靶向剂裂解，条件是肌酸部分保留所需的生物活性。

示例性的修饰的肌酸化合物包括但不限于:

其中n是1至12、更特别是1至8、最特别是1至6的整数；R₅如上文所定义；J和K当存在时是指如上文定义的X；且M当存在时 是如上文定义的可药用阳离子。

其他修饰的肌酸化合物包括但不限于:

其中M、J和K如上文所定义。

在一些实施方案中，在表1找到修饰的肌酸式I化合物。

表1

在某些实施方案中，修饰的肌酸化合物以它们的剂量结构形式时是治疗有效的。在一些情况中，所述剂量结构形式以前药形式使用，其在体内反应或被代谢以形成治疗有效的化合物。在此类情况中，前药和释放的药物二者可能均各自内在地具有活性，尽管通常效力处于显著不同的水平。例如，本领域中已知酯和酰胺基可以在体内反应以形成羧酸。已知胍基(诸如肌酸的胍基)可以在体内发生磷酸化。

修饰的肌酸化合物可能由于线粒体靶向剂而具有阳离子性质。例如，在一些实施方案中，修饰的肌酸化合物包含线粒体靶向剂，所述线粒体靶向剂包含阳离子鏻基(例如，被四个碳基团取代的三价磷原 子)。在季阳离子的原子是修饰的肌酸化合物的内在组成部分的情况中，会存在互补的阴离子抗衡离子。在一些情况中，阴离子抗衡离子也是修饰的肌酸化合物的内在组成部分(即，化合物是内盐)。例如，修饰的肌酸化合物还可包含带电荷的羧酸盐或磷酸盐基团。在一些情况中，不同的离子种类会用作阴离子抗衡离子。在存在不同的阴离子抗衡离子的实施方案中，根据所述修饰的肌酸化合物，阴离子抗衡离子可以是所选择来赋予期望的药物性质、诸如溶解度的可药用的阴离子抗衡离子。在某些此类实施方案中，阴离子抗衡离子是氯阴离子。

修饰的肌酸化合物包含胍部分。胍部分是碱性的，且可通过用可药用的布朗斯台德酸处理而质子化。

上文提供的修饰的肌酸化合物可具有一个或多个手性中心，且因此以一个或多个立体异构体存在。此类含立体异构体的化合物可以以单一的对映异构体、对映异构体的混合物、非对映异构体的混合物或外消旋混合物存在。

修饰的肌酸化合物可由任何适合的肌酸亚单元制备。在一些实施方案中，肌酸亚单元与线粒体靶向剂以共价键方式连接。包括但不限于以下表2中显示的类似物的肌酸类似物可以在官能团化的肌酸化合物中用作肌酸亚单元。在式I的某些实施方案中，线粒体靶向剂经由羧酸基团共价偶联至肌酸或肌酸类似物。在式I的一些实施方案中，肌酸或肌酸类似物经由酯或酰胺键共价偶联至线粒体靶向剂。在式I的某些实施方案中，肌酸或肌酸类似物经由仲酰胺键或叔酰胺键共价偶联至线粒体靶向剂。

表2

表2，续。

表2，续。

可以修饰以包含线粒体靶向剂的其他示例性的肌酸类似物包括但不限于环肌酸(1-羧甲基-2-亚氨基咪唑烷)、N-磷肌酸(N-磷酰基肌酸)、磷酸环肌酸(3-磷酰基-1-羧甲基-2-亚氨基咪唑烷)、1-羧甲基-2-氨基咪唑、1-羧甲基-2,2-亚氨基甲基咪唑烷、1-羧乙基-2-亚氨基咪唑烷、N-乙基-N-脒基甘氨酸和β-胍基丙酸。

治疗、诊断、预防和/或靶向剂

官能团化的肌酸化合物包含与一个或多个活性剂连接或缔合的肌酸亚单元。通常，使用单个活性剂官能团化肌酸化合物。或者，可以使用多于一个活性剂官能团化肌酸化合物。例如，肌酸化合物可以结合于任选地包含一个或多个分支点的连接基，所述分支点连接多个活性剂。

在含多个活性剂的肌酸化合物的情况中，所述活性剂可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，用相同活性剂的多个复制品官能团化肌酸化合物。在供选择的实施方案中，使用具有相同功能的多个活性剂(即，多个线粒体靶向剂或多个治疗剂)官能团化肌酸化合物。在某些实施方案中，使用具有至少两个不同功能的多个活性剂(即，多个活性剂，其包含一个或多个靶向剂、例如线粒体靶向剂，以及一个或多个治疗剂)官能团化肌酸化合物。

所述活性剂可以是在体内或体外具有生理学活性或药理学活性 的任何物质。所述活性剂可以是例如用于治疗(例如，治疗剂)、预防(例如，预防剂)、诊断(例如，诊断剂)、治愈或减轻病症或疾病的物质、影响身体的结构或功能的物质、在置于预定的生理环境之后变得具有生物活性或生物活性增加的前药或者靶向剂。实例包括但不限于有机小分子、肽类、蛋白质、抗体、糖、多糖及其组合。

在一些实施方案中，使用一个或多个将肌酸化合物导向至线粒体的线粒体靶向剂官能团化肌酸化合物。线粒体靶向剂在本领域中已知，且包括在生理条件下将正电荷传输至化合物的亲脂性阳离子、诸如阳离子的鏻和铵基。

在阳离子的鏻和铵基的情况中，阳离子的原子上碳取代基的选择会影响靶向活性、治疗性药物定位于线粒体内的能力和药物的药物动力学特性(ADME)。通常，选择在阳离子上的取代基以分配正电荷的定位，并在正电荷的附近提供亲脂性环境以屏蔽阳离子与亲脂性生物屏障的直接作用。包括口服生物利用度、分布容积和清除率在内的另外的药物动力学特性也依赖于亲脂性和亲水性之间的平衡。

代表性的线粒体靶向剂可以包括但不限于通式-P(R′)₃ ⁺X^-表示的鏻基，其中X是阴离子，且R′每次出现时独立地可以是烷基、烷基芳基、烷基环烷基、杂环烷基、烷基杂环烷基和芳基，其任选地被1至5个选自烷基、烷基芳基、环烷基、芳基、羟基、烷基醚、芳基醚、腈、氟、氯、溴、CF₃、硫醚、酰胺、脲、酯和氨基甲酸酯的取代基所取代。特别地，R基团中的2至3个为芳基。在烷基芳基和/或芳基取代基连接于鏻离子的情况中，芳基组分特别是苯基或5-6元的杂芳基环，其任选地被1至2个诸如卤素、烷基、烷氧基、CF₃和腈的取代基所取代。在一个实施方案中，线粒体靶向剂是烷基三苯基鏻、四苯基鏻或四烷基鏻基。适合的烷基三苯基鏻基包括但不限于那些含具有1至6个碳的C₁-C₆直链亚烷基的烷基三苯基鏻基，所述C₁-C₆直链亚烷基为诸如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基。适合的四烷基鏻基包括但不限于那些含一个具有1至6个碳的C₁-C₆直链亚烷基和3个C₁-C₁₈直链、支链或环状烷基的烷基三苯基鏻基团，所述C₁-C₆直 链亚烷基为诸如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基。

其它的线粒体靶向剂包括通式-N(R′)₃ ⁺X^-表示的季铵基，其中X是阴离子，且R′每次出现时独立地可以是烷基、烷基芳基、烷基环烷基、杂环基、烷基杂环基和芳基，其任选地被1至5个选自烷基、烷基芳基、环烷基、芳基、羟基、烷基醚、芳基醚、腈、氟、氯、溴、CF₃、硫醚、酰胺、脲、酯和氨基甲酸酯的取代基所取代，其包括四烷基铵基、四苯基铵基和烷基三苯基铵基。线粒体靶向剂也可以是四苯砷(tetraphenylarsonium)、罗丹明G及其衍生物、寡-或聚精氨酸、寡-或聚赖氨酸以及离域亲脂性阳离子，其包含1至3个甲亚氨基(carbimino)、硫亚氨基(sulfimino)或膦亚氨基(phosphinimino)单元，如Kolomeitsev等,Tet.Let.,第44卷,第33期,5795-5798(2003)中所述。在一些实施方案中，线粒体靶向剂包含阳离子三苯基鏻基。

亲脂性阳离子是线粒体靶向剂的实例，因为它们可以不需要特别的吸收机制而直接穿过磷脂双层，且它们由于大的膜电位而在线粒体内大量累积。三苯基膦(TPP)阳离子的大的疏水半径使得它相对于其它阳离子能够容易地穿过磷脂双层。在一个实施方案中，公开的化合物包括经修饰以增加疏水性的TPP衍生物。例如，可以通过增加碳链连接基的长度来增加靶向剂的疏水性，如Asin-Cayuela等,FEBS Lett.,30:571(1-3),9-16(2004)中所述。

不希望受一种理论所束缚，人们认为亲脂性阳离子从带正电荷的细胞区室被摄取至带负电荷的区室中，直至形成足够大的浓度梯度以使两个区室中的分子的电化电位相等。膜电位每增加60mV，线粒体内将有约十倍的亲脂性阳离子的积累。由于质膜内部具有负的30-60mV的电位，所以亲脂性阳离子将在细胞溶胶内积累5至10倍。细胞溶胶内的亲脂性阳离子将在线粒体内积累，这是因为线粒体膜电位通常为约140至180mV。

线粒体靶向剂还可以是多肽、诸如带正电荷的氨基酸。蛋白质转导域(PTD)也称为细胞渗透肽(CPP)，是包含带正电荷的氨基酸的多肽。因此，线粒体靶向剂可以是PTD或CPP。“蛋白质转导域”是指 有助于穿过脂双层、微胞、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、碳水化合物或有机或无机化合物。PTD连接于本文公开的化合物有助于其穿过膜，例如，由细胞外间隙进入细胞内间隙、或由细胞溶胶进入细胞器诸如线粒体内。PTD在本领域中已知，且包括但不限于能以不依赖于受体的机制穿越细胞膜的蛋白质的小区域(Kabouridis,P.,Trends in Biotechnology(11):498-503(2003))。尽管文献已经证实了若干PTD，但两种最常使用的PTD源自HIV的TAT蛋白质(Frankel和Pabo,Cell,55(6):1189-93(1988))和来自果蝇的触角足转录因子，其PTD被称为穿膜肽(Penetratin)(Derossi等,J Biol Chem.,269(14):10444-50(1994))。

触角足同源异型域长度为68个氨基酸残基，且含四个α螺旋。

穿膜肽是该蛋白质的活性结构域，其由来源于触角足的第三个螺旋的具有16个氨基酸的序列组成。TAT蛋白质由86个氨基酸组成，并涉及HIV-1的复制。TAT PTD由母蛋白质的11氨基酸的序列结构域(残基47至57；YGRKKRRQRRR(SEQ.ID.NO.1))组成，其似乎对于吸收至关重要。此外，已显示碱性结构域Tat(49-57)或RKKRRQRRR(SEQ.ID NO.2)为PTD。在目前的文献中，TAT偏向与供细胞输入的相关蛋白融合。已证实在哺乳动物细胞中，针对TAT的若干修饰，包括谷氨酰胺取代为丙氨酸，即，Q→A，可使任一处的细胞吸收从90％(Wender等,Proc Natl Acad Sci U S A.,97(24):13003-8(2000))增加到最高达原来的33倍。(Ho等,Cancer Res.,61(2):474-7(2001))。通过TAT-PTD诱变实验揭露了修饰蛋白最有效的吸收，试验显示，11个精氨酸的片段的效率比细胞内传递工具高几个数量级。因此，一些实施方案包括阳离子型或两亲型PTD。另外的示例性的PTD包括但不限于聚-Arg-RRRRRRR(SEQ.ID.NO.:3)；PTD-5-RRQRRTSKLMKR(SEQ.ID.NO.:4)；细胞穿透肽(Transportan)GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ.ID.NO.:5)；KALA-WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA(SEQ.ID.NO.:6)；和RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ.ID.NO.: 7)。

线粒体靶向剂可以包括短的肽序列(Yousif,等,Chembiochem.,10(13):2131(2009))，例如线粒体转运子-合成细胞-穿透肽，也称为线粒体-穿透肽(MPPs)，其能进入线粒体的。MPPs通常是阳离子的，但也是亲脂性的；这些特征的组合有助于穿透疏水性线粒体膜。例如，MPPs可以包括交替的阳离子和疏水性残基(Horton,等,Chem Biol.,15(4):375-82(2008))。一些MPPs在肽序列中包含离域亲脂性阳离子(DLCs)，而不包含或另外地包含天然阳离子氨基酸(Kelley等,Pharm.Res.,2011Aug11[Epub ahead of print])。其它变型可以基于低聚碳水化合物骨架，例如其由于它们的离域阳离子形式连接胍盐部分(Yousif等,Chembiochem.,10(13):2131(2009)。

线粒体靶向剂还包括线粒体定位信号或线粒体导向信号。许多线粒体蛋白质被合成为含前导序列的胞质的前体蛋白，也称为前序列或肽信号序列。通常，胞质的侣伴蛋白将前体蛋白递送至线粒体受体和外膜的共同输入通道(GIP)(受体和GIP统称为外膜转位酶或TOM)。通常，前体蛋白通过TOM和膜间隙通过小的TIM移动至在内膜的TIM23或22(内膜转位酶)。在线粒体基质内，导向序列由mtHsp70裂解。

线粒体定位/导向信号通常具有带高正电荷的氨基酸的前导序列。这使得蛋白质被导向至带高正电荷的线粒体。与受体:配体途径不同，配体接近受体依赖于随机的布朗运动，而一些实施方案的线粒体定位信号由于电荷被吸引至线粒体。

如上文所讨论，为进入线粒体，蛋白质通常必须与线粒体输入系统相互作用，所述输入系统由TIM和TOM复合体(线粒体内/外膜的转位酶)组成。对于线粒体导向信号而言，正电荷将连接的蛋白质吸引至复合体，继续将蛋白质吸引至线粒体。Tim和Tom复合体允许蛋白质穿过膜。因此，本发明的一个实施方案利用带正电荷的导向信号和线粒体输入系统将本发明的组合物递送至线粒体内腔。在另一个实施方案中，含线粒体定位信号的连接PTD的化合物进入线粒体基质似乎 不利用TOM/TIM复合体，参见Del Gaizo等Mol GenetMetab.80(1-2):170-80(2003)。线粒体定位信号在本领域中已知，参见例如，美国公布的申请编号2005/0147993。

其他线粒体靶向剂包括主动转运进入线粒体中的、结合于线粒体-特异的蛋白质的和/或对线粒体-特异的脂质诸如磷脂CL显示优先亲和力的化合物。例如，线粒体靶向剂可以是膜-活化环肽抗生素、诸如短杆菌肽S或其片段。该类型的抗生素对于细菌膜具有高亲和力。因此，由于细菌膜和线粒体膜之间的密切的关系，膜-活化环肽抗生素或其片段对线粒体膜也具有高亲和力，且可以用于优先地将运载物靶向至线粒体(Fink,等,Crit.Care.Med.,35(Suppl):S461-7(2007)。

其他适合的线粒体靶向剂在本领域中已知，参见例如，Frantz和Wipf,EnvironMol Mutagen.,51(5):462–475(2010),(Yousif等,Chembiochem.,10(13):2131(2009)和Galley,Crit Care,14(4):230(第1-9页)(2010)。特别地，线粒体靶向剂不永久性损伤线粒体，例如线粒体膜或另外损伤线粒体功能。

公开的修饰的肌酸化合物可以任选地包含将肌酸亚单元连接于活性剂的连接基。所述连接基可以是惰性的，或所述连接基可以具有生物活性。所述连接基必须最少是二价的；然而，在一些实施方案中，所述连接基可以结合于多于一个活性剂，在这种情况中，所述连接基是多价的。

所述连接基可以由原子的任何集合组成，包括功能为将活性剂连接于酸亚单元的低聚和多聚链。在一些情况中，连接基是低聚和多聚链、诸如寡-或聚乙二醇链或寡-或聚(氨基酸)链。肽连接基包括一旦化合物进入线粒体后可以被裂解的肽。例如，在一些情况中，所述肽连接基是如上文所详细讨论的线粒体定位信号。在其他情况中，所述连接基是非-聚合有机官能团、诸如烷基或烷基芳基。在这些实施方案中，连接基中原子的总数小于250个原子、为3至200个原子或3至150个原子或3至100个原子或3至50个原子或3-12个原子。在一些实施方案中，所述连接基是亲水性的以有助于肌酸化合物穿过生物膜。

在许多情况中，连接基是直链。然而，在一些实施方案中，连接基包含一个或多个分支点。在支链连接基的情况中，各分支点的末端可以被活性剂官能团化。在一个此类实施方案中，使用树枝状的连接基，肌酸亚单元结合于树枝状聚合物的焦点，且多个活性剂结合于树枝状的末端。

在一些实施方案中，连接基包含一个或多个可裂解的亚单元、诸如二硫基、腙基或肽基团，其可以在细胞内被蛋白水解酶所裂解。在供选择的实施方案中，连接基包含一个或多个可水解的亚单元、诸如酯基。所述连接基还可以包含一个或多个共价的或非共价的官能团以有助于肌酸亚单元与连接的活性剂的装配和/或分离，所述活性剂包括但不限于一个或多个金属络合物、诸如多组氨酸-镍螯合物、一个或多个杂芳环(诸如炔和叠氮化物的环加成形成的三唑环)、一个或多个氢键供体-受体对和一个或多个生物分子/生物结合物对(诸如生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素对)及其组合。

修饰的肌酸化合物包含用于赋予肌酸-样活性的和/或用作连接基的附着点的官能团。在其用作连接基的附着点的情况中，其最少是二价的，且可产生固有活性的化合物或可用作前药。

在一些实施方案中，所述官能团包含一个或多个选自氧、氮、硫、磷及其组合的杂原子。代表性的官能团包括酯、醚、酮、酰胺、脲、氨基甲酸酯、硫代酯(thioester)、硫醚、二硫键、硫代酰胺、硫酮、硫代碳酸酯(thionoester)、三唑环和二硫代酸酯。在一些实施方案中，所述官能团是仲酰胺、叔酰胺或酯。

化合物活性的体外试验

可以使用多种体外试验以测定修饰的肌酸化合物调节线粒体功能的能力。

本文公开了用于测定重组CPK对于修饰的肌酸化合物的活性的体外试验。将重组CPK与ATP及感兴趣的修饰的肌酸化合物混合。ATP水解，是γ磷酸基从ATP转移至肌酸亚单元的胍基的速度的衡 量，使用萤光素酶对其进行测定。然后将修饰的肌酸化合物的ATP水解/消耗的速度与肌酸的ATP水解/消耗的速度进行比较。

在一些实施方案中，修饰的肌酸化合物比等摩尔浓度的肌酸诱导更高的速度的ATP水解/消耗。更特别地，修饰的肌酸化合物诱导ATP水解/消耗的速度相比对于等摩尔浓度的肌酸诱导的ATP水解/消耗所测定的速度高至少25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％或300％。

还描述了测定修饰的肌酸化合物改变线粒体活性和功能的能力的试验。在一个试验中，测定了修饰的肌酸化合物增加细胞氧消耗速度(OCR)的能力。在一些实施方案中，与等摩尔浓度的未修饰的肌酸相比，修饰的肌酸化合物诱导细胞氧消耗速度更大的增加。在一些实施方案中，5nM浓度的修饰的肌酸化合物诱导细胞氧消耗速度的增加相比对于10μM浓度的肌酸所测定的OCR的增加，高至少25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％或200％。

还描述了用于测定修饰的肌酸化合物在细胞中增加复合体I(CI)活性的能力的试验。在一些实施方案中，与等摩尔浓度的肌酸相比，修饰的肌酸化合物在细胞中使复合体I活性增加至更高的程度。在一些实施方案中，25nM浓度的修饰的肌酸化合物诱导复合体I活性的增加相比10μM浓度的肌酸所诱导的增加，高至少25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％或200％。

制剂和剂量

含本文所述的化合物的一种或多种或其前药的制剂可使用由被认为是安全和有效的材料组成的可药用载体来制备，且可施用于个体而引起不期望的生物学副作用或不需要的相互作用。所述载体包含药物制剂中除一种或多种活性成分之外存在的所有成分。如本文所通常使用的，“载体”包括但不限于稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填充剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、溶解度增强剂和包衣组合物。

载体还包括包衣组合物的所有成分，其可包括增塑剂、色素、着 色剂、稳定剂和助流剂。缓释、延时释放和/或脉冲式释放制剂可以如标准参考文献中所述来制备，所述参考文献诸如“Pharmaceutical dosage form tablets”,Liberman等编撰(New York,MarcelDekker,Inc.,1989),“Remington–The science and practice of pharmacy”,第20版,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2000和“Pharmaceutical dosage formsand drug delivery systems”,第6版,Ansel等,(Media,PA:Williams和Wilkins,1995)。这些参考文献提供了关于用于制备片剂和胶囊以及片剂、胶囊和颗粒剂的缓释剂型的载体、材料、设备和方法的信息。

适合的包衣材料的实例包括但不限于纤维素聚合物、诸如醋酞纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素酞酸酯和醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯；聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物和商购可得的商品名为(Roth Pharma,Westerstadt,德国)的异丁烯酸树脂、玉米醇蛋白、虫胶和多糖。

此外，包衣材料可包含常规载体、诸如增塑剂、色素、着色剂、助流剂、稳定剂、成孔剂和表面活性剂。

存在于包含药物的片剂、小球、颗粒剂或微粒中的任选的可药用赋形剂包括但不限于稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、稳定剂和表面活性剂。稀释剂也称"填充剂"，通常其对于增加固体剂型的松密度(bulk)以便为片剂的压缩或小球和颗粒剂的形成提供实用的尺寸是必需的。合适的稀释剂包括但不限于二水磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素、微晶纤维素、高岭土、氯化钠、干淀粉、水解淀粉、预糊化淀粉、二氧化硅(silicone dioxide)、氧化钛、硅酸镁铝和糖粉。

粘合剂用于为固体剂型赋予粘聚性，并因此确保片剂或小球或颗粒剂在形成剂型之后保持完整。合适的粘合剂材料包括但不限于淀粉、预糊化淀粉、明胶、糖(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨糖醇)、聚乙二醇、蜡、天然树胶和合成树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶、藻酸钠、包括羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素的纤维素及硅酸 镁铝、以及合成聚合物例如丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚丙烯酸/聚甲基丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。

润滑剂用于促进片剂的制备。适合的润滑剂的实例包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、山萮酸甘油酯(glycerolbehenate)、聚乙二醇、滑石和矿物油。

崩解剂用于促进剂型在施用后崩解或"分解"，且通常包括但不限于淀粉、淀粉乙醇酸钠(sodium starch glycolate)、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、预糊化淀粉、粘土、纤维素、藻蛋白碱、树胶或交联聚合物、诸如交联PVP(来自GAF化学公司的Polyplasdone XL)。

稳定剂用于抑制或延迟药物分解反应，所述分解反应包括例如氧化反应。

表面活性剂可以是阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性表面活性剂或非离子型表面活性剂。适合的阴离子型表面活性剂包括但不限于含有羧酸根离子、磺酸根离子和硫酸根离子的那些阴离子型表面活性剂。阴离子型表面活性剂的实例包括长链的烷基磺酸和烷基芳基磺酸的钠盐、钾盐、铵盐、诸如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基丁二酸钠、诸如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基丁二酸钠、诸如双-(2-乙基亚硫酰)-磺基丁二酸钠(sodium bis-(2-ethylthioxyl)-sulfosuccinate)；以及烷基硫酸盐、诸如月桂基磺酸钠。阳离子型表面活性剂包括但不限于季铵化合物、诸如苯扎氯铵、氯化苄乙铵、西曲溴铵、十八烷基二甲基苄基氧化铵、聚氧乙烯和椰油胺。非离子型表面活性剂的实例包括乙二醇单硬脂酸酯、丙二醇肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯、硬脂酸甘油酯、聚甘油基-4-油酸酯、脱水山梨糖醇酰化产物(sorbitan acylate)、蔗糖酰化产物(sucrose acylate)、PEG-150月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨糖醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、PEG-1000十六烷基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁基醚、401、硬脂酰单异丙醇酰胺(stearoyl monoisopropanolamide)和聚氧乙烯氢化牛脂酰胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-β-丙氨酸钠、N-月桂基-β-亚氨基二丙酸钠、肉豆寇酰两性基乙酸盐(myristoamphoacetate)、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱。

如果需要，片剂、小球、颗粒剂或微粒还可以含有少量的无毒的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、染料、pH缓冲剂或防腐剂。

所述组合物任选地包含一种或多种另外的活性剂。适合类别的活性剂包括但不限于抗生素剂、抗微生物剂、抗痤疮剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、甾类抗炎剂、非甾类抗炎剂、麻醉剂、止痒剂、抗原虫剂、抗氧化剂、抗组胺剂、维生素和激素。

代表性的抗生素包括但不限于过氧化苯酰、羟甲辛吡酮、红霉素、锌、四环素、三氯生、壬二酸及其衍生物、苯氧乙醇和苯氧丙醇(phenoxy proponol)、乙酸乙酯、克林霉素和甲氯环素；sebostat、诸如黄酮类(flavinoid)；α羟基酸和β羟基酸；以及胆汁盐、诸如鲨胆甾醇硫酸盐及其衍生物、脱氧胆酸盐和胆酸盐。抗生素可以是抗真菌剂。适合的抗真菌剂包括但不限于克霉唑、益康唑、酮康唑、伊曲康唑、咪康唑、奥昔康唑、硫康唑、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、十一碳烯酸(undecylinic acid)、托萘酯和制霉菌素。

在一个实施方案中，抗生素的浓度以最终组合物的重量计为约0.01％至约20％，特别地为约1％到约15％，更特别地为约6％到约12％。

非甾类抗炎剂的代表性的实例包括但不限于昔康类，诸如毗罗昔康、伊索昔康、替诺昔康、舒多昔康；水杨酸酯类(salicylates)，诸如阿司匹林、双水杨酯、贝诺酯、三水杨酸胆碱镁、safapryn、阿司匹林(solprin)、二氟尼柳和芬度柳；乙酸衍生物，诸如双氯芬酸、芬氨酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、伊索克酸、呋罗芬酸、硫平酸、齐多美辛、阿西美辛(acematacin)、芬替酸、佐美酸、clindanac、奥昔平酸、联苯乙酸和酮咯酸；芬那酸类(fenamates)，诸如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、尼氟灭酸和托芬那酸；丙酸衍生物，诸如布洛 芬、萘普生、苯噁洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、非诺洛芬、芬布芬、吲哚洛芬(indopropfen)、吡洛芬、卡洛芬、噁丙嗪、普拉洛芬、咪洛芬、硫噁洛芬、舒洛芬、阿明洛芬和噻洛芬酸(tiaprofenic)；吡唑类，诸如保泰松、羟基保泰松、非普拉宗、阿扎丙宗和三甲保泰松。还可以使用这些非甾类抗炎剂的混合物以及这些药物的皮肤病学可接受的盐和酯。例如，氟芬那酸衍生物依托芬那酯对于局部施用特别有用。

在一个实施方案中，非甾类抗炎剂的浓度以最终组合物的重量计为约0.01％至约20％，特别地为约1％到约15％，更特别地为约6％到约12％。

甾类抗炎剂的代表性实例包括但不限于皮质甾类诸如氢化可的松、羟基-去炎松、α-甲基地塞米松、地塞米松磷酸盐、倍氯米松二丙酸酯、氯倍他索戊酸酯、地奈德、去氧米松、乙酸脱氧皮质酮、地塞米松、二氯松、双醋二氟拉松、戊酸二氟米松、氟氢缩松(fluadrenolone)、氟氯奈德、氟氢可的松、特戊酸氟地塞米松、氟西奈德(fluosinoloneacetonide)、醋酸氟轻松、flucortine butylester、氟可龙、醋酸氟甲叉龙(氟泼尼定)、氟氢缩松、哈西奈德、醋酸氢化可的松、氢化可的松丁酸酯、甲泼尼龙、曲安奈德、可的松、可托多松、flucetonide、氟氢可的松、双醋二氟拉松(difluorosone diacetate)、氟氢缩松、氟氢可的松、双醋二氟拉松(diflurosone diacetate)、fluradrenolone acetonide、甲羟松、安西法尔(amcinafel)、安西非特、倍他米松及其酯的平衡、氯泼尼松、醋酸氯泼尼松(chlorprednisone acetate)、氯可托龙(clocortelone)、地西龙(clescinolone)、二氯松、二氟泼尼酯(diflurprednate)、氟二氯松、氟尼缩松、氟米龙(fluoromethalone)、氟培龙、氟泼尼龙、戊酸氢化可的松、氢化可的松环戊丙酸酯、氢可他酯、甲泼尼松、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、丙酸倍氯米松、去炎松及其混合物。

在一个实施方案中，甾类抗炎剂的浓度以最终组合物的重量计为约0.01％至约20％，特别地为约1％到约15％，更特别地为约6％到约12％。

适合的抗微生物剂包括但不限于抗细菌剂、抗真菌剂、抗原虫剂和抗病毒剂，诸如β-内酰胺药物、喹诺酮药物、环丙沙星、诺氟沙星、四环素、红霉素、阿米卡星、三氯生、多西环素、卷曲霉素、氯己定、金霉素、土霉素、克林霉素、乙胺丁醇、甲硝唑、喷他脒、庆大霉素、卡那霉素、林可霉素(lineomycin)、美他环素、乌洛托品、米诺环素、新霉素、奈替米星、链霉素、妥布霉素和咪康唑。还包括盐酸四环素、金合欢醇(famesol)、无味红霉素、红霉素硬脂酸盐、硫酸阿米卡星、盐酸多西环素、葡萄糖酸氯己定、盐酸氯己定、盐酸金霉素、盐酸土霉素、盐酸克林霉素、盐酸乙胺丁醇、甲硝唑盐酸盐、盐酸喷他脒、硫酸庆大霉素、硫酸卡那霉素、盐酸林可霉素、盐酸美他环素、马尿酸乌洛托品、杏仁酸乌洛托品、盐酸米诺环素、硫酸新霉素、硫酸奈替米星、硫酸巴龙霉素、硫酸链霉素、硫酸妥布霉素、盐酸咪康唑、盐酸金刚胺(amanfadine hydrochloride)、硫酸金刚胺、三氯生、羟甲辛吡酮、制霉菌素、托萘酯、克霉唑、阿尼芬净、米卡芬净、伏立康唑、拉诺康唑、环吡酮及其混合物。

在一个实施方案中，抗微生物剂的浓度以最终组合物的重量计为约0.01％至约20％，特别地为约1％到约15％，更特别地为约6％到约12％。

当进行进一步的研究时，对于所有所公开的肌酸化合物，将显示关于治疗不同患者的各种状况的适当的剂量水平的信息，且普通技术人员考虑到接受者的治疗情况、年龄和一般健康状况，将能够确定合适的剂量。所选择的剂量取决于所期望的治疗效果、施用途径和所期望的治疗持续时间。通常，对哺乳动物施用每天0.001到10mg/kg体重的剂量水平。通常，对于静脉注射或输注，剂量可以更低。

治疗方法

本发明的实施方案提供了用于将化合物靶向递送至线粒体以调节线粒体功能或治疗线粒体障碍的一种或多种症状的组合物和方法。可使用本发明公开的组合物治疗的适合的线粒体障碍包括但不限于线 粒体肌病。线粒体肌病包括克-塞综合征、利氏综合征、线粒体DNA缺乏综合征(MDS)、线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作(MELAS)、肌阵挛癫痫伴破碎红纤维(MERRF)、线粒体神经胃肠脑肌病(MNGIE)、神经病、共济失调和色素性视网膜炎(NARP)和进行性外眼肌麻痹(PEO)。

所公开的组合物可以用于治疗脑肌酸缺乏综合征的一种或多种症状，其包括胍基乙酸甲基转移酶缺乏(GAMT缺乏)、L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶缺乏(AGAT缺乏)和SLC6A8-相关肌酸转运体缺乏(SLC6A8缺乏)。

所公开的组合物可以用于通过改变磷酸肌酸/肌酸的比例来调节线粒体中的ATP的生成。通过施用所公开的化合物中的一种或多种，可以相对于对照增加磷酸肌酸/肌酸的比例。增加线粒体内的磷酸肌酸的量增加了线粒体生成ATP的能力。因此，另一个实施方案提供了通过向宿主施用有效量的所公开的组合物增加宿主内的线粒体的ATP生成的方法。增加ATP-生成能力允许细胞更好地处理能量挑战(energetic challenge)，由此预防细胞损伤或死亡、改善细胞功能、增强细胞的修复和替换、以及预防肿瘤发生。

所公开的组合物还可以用于治疗与以下病症相关的一种或多种症状：关节炎、充血性心力衰竭、废用性萎缩、环状萎缩、亨延顿舞蹈病、麦卡德病、亚力山大病、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、氨基酸障碍、共济失调、Barth病症、Tafazzins病症、心肌病、肉碱障碍、软骨-毛发发育不良、先天性肌营养不良症、痛性痉挛、HAM、非综合征性耳聋和氨基-糖苷诱发性耳聋、DIDMOAD、耳聋-张力障碍、糖尿病、张力障碍、脑病、失明、黄斑变性、视神经萎缩、沃尔弗拉姆综合征、外眼肌麻痹、甲状腺功能亢进、疲劳、运动不耐受、弗里德赖希共济失调、低血糖症、脑白质营养不良、枫糖尿病、门克斯病、多发性对称性脂肪过多症、肌痛、肌红蛋白尿、包涵体肌炎、感觉神经病、枕角综合征、副神经节瘤、皮尔逊综合征、横纹肌溶解、痉挛性轻截瘫、脊髓性肌萎缩、Stuve-Wiedemann综合 征、婴儿猝死综合征(SIDS)、肝豆状核变性、COPD、中风、心脏梗塞、缺血、糖尿病和炎症。

所公开的组合物还可以用于医源性适应症–HAART疗法、氨基-糖苷抗生素、COX-2抑制剂相关的心脏病、抑制素肌病和癌症恶病质。

一个实施方案提供了包括所公开的靶向线粒体的化合物中的一种或多种的功能性食品。所述功能性食品可用于例如高水平运动员(performance athlete)的耐力训练、肌肉/力量构建、骨密度增加、认知功能、伤口愈合、抗衰老、抗肥胖/重量减轻及抗ROS。所述功能性食品可以施用于健康个体和生病个体。

增加ATP的线粒体生成可用于改善运动耐受力或耐力和/或肌肉强度或耐力。例如，可以将本发明公开的组合物施用于受试者以增强在大强度运动期间维持高ATP转换率的能力，以得到与对照相比延迟的神经肌肉疲劳、改善的肌肉强度、改善的肌力输出、改善的运动恢复、增加的体重和增加的肌肉质量或其组合。在一些实施方案中，施用组合物以抑制或降低少肌症的影响和作为老年特征的典型的肌肉质量损失。例如，与对照相比所述组合物可在受试者中缓解年龄相关的肌肉萎缩和/或强度损失。

还可以将本发明公开的组合物施用于受试者以改善或增加脑或认知能力。脑/认知能力包括但不限于对精神功能的有益作用、诸如对于精神训练或挑战的应答的增加、减少的精神疲劳、任务诱发的氧气利用的增加改善、改善的认知记忆、增加的计算速度、增加的计算能力和改善的总体能力(Rae,等,Proc.R.Soc.Lond.270:2147-2150(2007))。增加细胞外ATP还可在受试者中增强脑血流量和代谢、增加心智灵敏并潜在地减少疲劳的感觉和/或运动-相关的疼痛。

提供了了包含公开的化合物的药物组合物。所述药物组合物可用于通过口服、胃肠外(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、透皮(被动或使用离子电渗法或电致孔法)或透粘膜(鼻内、阴道、直肠或舌下)施用途径或通过使用生物溶蚀来施用，并可以被配制为适用于各种施用途径的剂型。在一个实施方案中，化合物经口服施用。在另一个实 施方案中，化合物以水溶液形式胃肠外施用。通常，提供包含有效量的肌酸化合物或类似物的药物组合物。

可以配制所述组合物用于口服递送。口服固体剂型通常描述于Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版，1990(Mack Publishing Co.Easton Pa.18042)第89章中，将其引入本文作为参考。固体剂型包括片剂、胶囊、丸剂、口含片或锭剂、扁囊剂、小丸、粉剂或颗粒剂。此外，可以使用脂质体或类蛋白包囊来配制本组合物(如，例如美国专利编号4,925,673中所报导的类蛋白微球体)。可以使用脂质体包囊且所述脂质体可以用多种聚合物来衍生(例如，美国专利编号5,013,556)。用于治疗的可能的固体剂型的描述由Marshall,K.在:G.S.Banker和C.T.Rhodes编撰的Modern Pharmaceutics第10章,1979中给出，将其引入本文作为参考。通常，该制剂将包含ABC转运蛋白配体(或其化学修饰形式)以及允许免受胃部环境影响并在肠中释放生物学活性物质的惰性成分。

另一个实施方案提供了用于口服施用的液体剂型，液体剂型包括可药用的乳剂、溶液剂、悬浮剂和糖浆剂，液体剂型可以包含有其他组分，其他组分包括惰性稀释剂；辅助剂如润湿剂、乳化剂和助悬剂；以及甜味剂、调味剂和芳香剂。

所述组合物可以经化学改性以使得衍生物的口服输送有效。通常，涉及的化学改性是使至少一部分附着到组分分子本身，其中所述部分允许(a)抑制蛋白水解；以及(b)从胃或肠摄取到血流中。还期望的是增加一种或多种组分的总稳定性和增加在体内的循环时间。PEG化是用于制药应用的化学改性的实例。可以使用的其它基团包括：丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸、聚-1,3-二氧戊环和聚-1,3,6-三氧戊环(poly-1,3,6-tioxocane)[参见，例如Abuchowski和Davis(1981)"Soluble Polymer-Enzyme Adducts"，在Hocenberg和Roberts编辑的EnzymesasDrugs(Wiley-Interscience:New York,N.Y.)第367-383页中；以及Newmark等(1982)]J.Appl.Biochem。 4:185-189]。

对于口服制剂，释放位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠(jejunem)、或回肠)或大肠。本领域技术人员可获得在胃中不溶解然而在十二指肠或肠中的其它位置中释放物质的制剂。特别地，通过保护肽(或衍生物)或者在胃部环境之外(诸如在肠中)释放肽(或衍生物)会避免胃部环境的有害作用。

为确保完全的抗胃液性，对于至少pH5.0不渗透的包衣是必要的。被用作肠溶衣的更普通的惰性成分的实例是乙酸-1,2,4-苯三酸纤维素(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP50、HPMCP55、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、醋酞纤维素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和虫胶。这些包衣可以作为混合膜使用。

包衣或包衣混合物还可以在片剂上使用，它们并不是用来免受胃部的影响。这可以包括糖衣、或使片剂更容易吞咽的包衣。胶囊可以由用于输送干治疗物质(即粉剂)的硬壳(例如明胶)组成。对于液体形式，可以使用软明胶壳。扁囊剂的壳材料可以是稠淀粉或其它可食用的纸。对于丸剂、锭剂、模制片或模印片，可以使用水分聚集技术(moist massingtechnique)。

活性成分(或衍生物)可以以粒度约1mm的颗粒或小丸形式作为精细多颗粒(finemultiparticulate)被包括在制剂中。用于胶囊施用的材料的制剂还可以是如粉剂、微压的填料(lightly compressed plug)或如片剂那样。这些治疗物质可以通过压缩来制备。

还可以包括着色剂和/或调味剂。例如，可以配制组合物(诸如通过脂质体或微球体包囊)，随后进一步地将组合物包含于可食用产品中，例如含有着色剂和调味剂的冷冻饮料。

本文公开的用于胃肠外施用的制剂包括无菌的水溶液或非水溶液、悬浮液或乳液。非水溶剂或介质的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油、诸如橄榄油和玉米油、明胶以及可注射的有机酯如油酸乙醋。此类剂型还可以包含诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂的辅助 剂。它们可以通过例如经穿过滤菌过滤器(bacteria retaining filter)过滤、通过将杀菌剂掺入到组合物中、通过辐照组合物、或通过加热组合物来灭菌。它们还可以在即将应用前使用无菌水或一些其它无菌可注射介质来制备。

用于直肠或阴道施用的组合物特别为栓剂，除了活性物质之外其可以包含赋形剂、诸如可可脂或栓剂蜡。用于鼻内或舌下施用的组合物还使用本领域众所周知的标准赋形剂来制备。

化合物的制备

烷基三苯基鏻阳离子的合成在本领域中已知。参见，例如，MP Murphy和RASmith.Annu Rev Pharmacol Toxicol.2007；47:629-56(2007)。肌酸类似物在本领域中也是已知的。参见，例如，Kaddurah-Daouk等的美国专利申请公开号US2006/0128671。

用一种或多种线粒体靶向剂官能团化的肌酸化合物可以通过将肌酸或肌酸类似物与亲脂性阳离子反应来合成。在一些实施方案中，肌酸亚单元和线粒体靶向剂通过连接基以共价方式连接。

多种合成方法可用于制备本文公开的化合物。下文讨论了用于制备肌酸化合物的代表性的方法。可以根据期望的连接基团、期望的间隔基和化合物的总体上的结构选择给出的肌酸化合物的适合的合成途径，因为其涉及官能团的相容性、保护基团策略和不稳定的键的存在。

除下文讨论的合成方法之外，可用于制备本文公开的肌酸化合物的供选择的反应和策略在本领域中是已知的。参见，例如，March,“Advanced Organic Chemistry,”第5版,2001,Wiley-Interscience Publication,纽约。

以下的反应流程阐述了本发明的化合物的通用合成方法。所有的原料通过这些流程中描述的方法或通过本领域普通技术人员已知的方法来制备。

流程1

在流程1中，R₂、R₃和R₄如之前所定义。鏻盐63可以从商购可得的62使用本领域中熟知的方法制备。然后结构63可以与Boc-肌氨酸60在若干常用的用于合成酰胺的偶联试剂之一的存在下偶联，所述偶联试剂包括在二甲基甲酰胺(DMF)或THF中的羰二咪唑(CDI)、碳二亚胺试剂(例如EDC)和PyBOP。使用LiCl和四丁基氯化铵的水溶液进行的后处理可用于分离Boc-保护的64(为盐酸盐)。用在醚中的酸、诸如HCl处理64、随后用甲醇氨中和对Boc-保护的胺进行脱保护，得到65。将65与1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐66在DMF中反应，得到结构1的化合物(Castillo-Meléndez等Synthesis,10,1655(2004))。

可以修改流程1中所述的合成方法以制备叔胺、诸如结构2的化 合物，如流程2中所示。

流程2

在流程2中，R₂、R₃、R₄和R₅如之前所定义。鏻盐67可以与Boc-肌氨酸60在若干常用的用于合成酰胺的偶联试剂之一的存在下偶联，形成68，所述偶联试剂包括在溶剂、诸如DMF中的羰二咪唑(CDI)、碳二亚胺试剂(例如EDC)和PyBOP。用三氟乙酸(TFA)处理68除去BOC-基团，得到胺69。将69与70在N,N-二异丙基乙胺的存在下反应，得到化合物71，随后可以使用TFA将其脱保护，得到结构2的化合物。

可以通过多种方法制备式II范围内的肌酸化合物。例如，可以使用流程3中描述的合成策略制备含酯官能团的结构5的化合物。

流程3

结构5的化合物的合成从73的制备开始，通过使用二溴丁烷进行LDA-诱导的72的烷基化来制备73。随后，可以使用微波辐照将73与三苯基膦在二甲苯或二甲氧基乙烷(DME)中加热形成鏻盐。然后通过用含四丁基氯化铵的LiCl水溶液洗涤可以将溴化物抗衡离子与氯离子交换，得到74。用2.0M在二噁烷中的HCl处理74、随后用甲醇氨中和，得到脱保护的胺75。将75与1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐在DMF中反应，得到修饰的肌酸5。

使用相似的策略，可以使用流程4中描述的合成策略制备含叔酰胺官能团的化合物6。

流程4

结构6的化合物的合成从77的制备开始，通过使用二溴丁烷进行LDA-诱导的BOC-肌氨酸二甲基酰胺76的烷基化制备77。随后可以将中间体77与三苯基膦在二甲苯或二甲氧基乙烷(DME)中使用微波辐照加热，得到鏻盐。然后通过用含四丁基氯化铵的LiCl水溶液洗涤可以将溴化物抗衡离子与氯离子抗衡离子交换，得到78。用2.0M在二噁烷中的HCl处理78、随后用甲醇氨中和，将得到脱保护的胺79。将79与1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐在DMF中反应会形成修饰的肌酸6。

可以通过本领域已知的多种方法制备式III范围内的修饰的肌酸化合物。例如，可以如流程5中描述制备结构7的肌酸的肌酸化合物。

流程5

结构7的化合物的合成可以从胺81的制备开始，通过将80与三苯基膦在正丁醇中在120oC进行反应制备81。纯化后，可以在二异丙基乙胺的存在下使用乙腈作为溶剂用溴乙酸乙酯处理81。后处理后，可以使用含四丁基氯化铵的LiCl水溶液交换抗衡离子。这样得到化合物82。将82与1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐在DMF中反应会得到修饰的肌酸化合物7。

使用相似的策略，可以使用流程6中描述的合成策略制备含叔酰胺官能团的化合物8。

流程6

8的合成可以从胺81的制备开始，通过将80与三苯基膦在正丁醇中在120℃进行反应制备81。纯化后，可以在二异丙基乙胺的存在下使用2-溴-N,N-二甲基乙酰胺处理81。后处理后，可以使用含四丁基氯化铵的LiCl水溶液交换抗衡离子。这样会得到化合物83。将83与1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐在DMF中反应会得到修饰的肌酸化合物8。

实施例

实施例1N²-[铵基(亚氨基)甲基]-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺双(三氟乙酸盐)的制备

步骤1.(3-氨基丙基)(三苯基)鏻溴化物氢溴酸盐的制备。

将(3-溴丙基)(三苯基)鏻溴化物(4.9g，10.0mmol)在密封管中用7M在甲醇中的氨(97mL，680mmol)处理。将该混合物在85℃加热4小时，并冷却至室温。除去挥发物，并将得到的半固体经硅胶柱纯化(首先用20％在二氯甲烷中的甲醇洗脱，随后用25％1M在甲醇和二氯甲烷中的氨洗脱)，得到标题化合物(2.07g)，41％收率。

步骤2.N-{(E)-[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚氨基]甲基}-N-甲基甘氨酸乙酯的制备。

将{[(三氟甲基)磺酰基]碳酰亚胺基(carbonimidoyl)}二氨基甲酸二叔丁基酯(二-Boc-三氟甲磺酰基胍)(738mg，1.88mmol)装入火焰干燥的烧瓶中，并溶于无水1,2-二氯乙烷(7.4mL)中。然后加入三乙胺(579μL，4.15mmol)和N-甲基甘氨酸乙酯盐酸盐(312mg，2.03mmol)。将该混合物在50℃搅拌5小时，并冷却至室温。将该反应混合物用二氯甲烷稀释，用2M硫酸氢钠水溶液、碳酸氢钠水溶液洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将有机物浓缩，并将粗制的产物经硅胶柱用50％在己烷中的乙酸乙酯洗脱纯化，得到标题化合物，71％收率。

步骤3.N-{(E)-[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚氨基]甲基}-N-甲基甘氨酸的制备。

在室温将N-{(E)-[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚氨基]甲基}-N-甲基甘氨酸乙酯(630mg，1.75mmol)溶于四氢呋喃(6.3mL)中。向其中加入1.0M氢氧化钠水溶液(.75mL，1.75mmol)。将该混合物在室温搅拌1小时，然后在真空下浓缩以除去四氢呋喃。将该混合物在冰浴中冷却，并用1M硫酸水溶液(1.72mL，1.75mmol)酸化。将该混合物用二氯甲烷稀释，然后使用无水硫酸镁除去水。过滤后，在真空下除去二氯甲烷，得到标题化合物，定量收率。

步骤4.N²-{(E)-[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚氨基]甲基}-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺溴化物的制备。

将N-{(E)-[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚氨基]甲基}-N-甲基甘氨酸(304mg，0.63mmol)和(3-氨基丙基)(三苯基)鏻溴化物氢溴酸盐(209mg，0.63mmol)溶于二氯甲烷(3.0mL)中，并用N,N-二异丙基乙胺(340μL，1.96mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(101mg，0.66mmol)处理。所有的固体溶解后，将该反应混合物用N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(375mg，1.96mmol)处理，并在室温搅拌过夜。将该反应混合物用二氯甲烷稀释，并将有机层用碳酸氢钠水溶液和水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥。过滤后，浓缩有机物，得到粗制的N²-{(E)-[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚氨基]甲基}-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺溴化物(390m_g)，68％收率，将其以粗品形式用于下一个步骤。

步骤5.N²-[铵基(亚氨基)甲基]-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺双(三氟乙酸盐)的制备。

将N²-{(E)-[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚氨基]甲基}-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺溴化物(290mg，0.41mmol)溶于三氟乙酸(1ml，10mmol)中。在室温20分钟后，在真空下除去挥发物，并将粗品用反相制备型HPLC纯化，得到标题化合物，收率31％。

¹H NMR(D₂O)δ7.87(m,3H),7.73(m,12H),3.9(s,2H),3.41(m,2H),3.23(m,2H),2.85(s,3H),1.68(m,2H)；MS(ESI+)C₂₅H₃₁N₄OP m/z433.2(M⁺)和MS(ESI+)C₂₅H₃₁N₄OP m/z217.2(M+H)²⁺。

实施例2N²-[铵基(亚氨基)甲基]-N,N²-二甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺双(三氟乙酸盐)的制备

步骤1.[3-(甲基氨基)丙基](三苯基)鏻溴化物氢溴酸盐的制备。

在密封管中将(3-溴丙基)(三苯基)鏻溴化物(5.7g，12mmol)用33％在乙醇中的甲胺(40mL，400mmol)处理。将该混合物在100℃加热1.5小时，并冷却至室温。除去挥发物，将得到的半固体溶于甲醇(23mL)中，并在50℃加热，在此时所有的固体溶解。将温度降至40℃，并滴加甲基叔丁基醚(68mL)，得到浆体。将该浆体冷却至室温，并过滤，用甲基叔丁基醚(20mL)洗涤产物滤饼，得到标题化合物(4.0g)，66％收率，为白色固体。

步骤2.N²-(叔丁氧基羰基)-N,N²-二甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺溴化物的制备。

将N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基甘氨酸(309mg，1.63mmol)溶于二氯甲烷(7.8mL)中，并用N,N-二异丙基乙胺(1.0mL，5.7mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(233mg，1.52mmol)处理。在室温10分钟后，加入[3-(甲基氨基)丙基](三苯基)鏻溴化物氢溴酸盐(933mg，1.88mmol)，随后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(353mg，1.84mmol)和4-二甲基氨基吡啶(145mg，0.11mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜。通过用NaHCO₃水溶液和水洗涤将该反应混合物分离，得到粗制的产物，将其经硅胶柱用5-10％1M在甲醇和二氯甲烷中的NH₃洗脱纯化，得到标题化合物(739mg)，76％收率。

步骤3.N,N²-二甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]-甘氨酰胺三氟乙酸盐的制备。

在室温将N²-(叔丁氧基羰基)-N,N²-二甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺溴化物(280mg，0.48mmol)溶于三氟乙酸(1.9mL，25mol)中。30分钟后，在高真空下除去挥发物，并将粗制的产物溶于二氯甲烷中，并用NaHCO₃水溶液洗涤。然后将有机层用水洗涤，并浓缩，得到标题化合物，定量收率。

步骤4.N²-{(E)-[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚氨基]甲基}-N,N²-二甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺三氟乙酸盐的制备。

在氮气下将{[(三氟甲基)磺酰基]碳酰亚胺基}二氨基甲酸二叔丁基酯(二-Boc-三氟甲磺酰基胍)(34mg，0.087mmol)装入火焰干燥的烧瓶中，并用无水1,2-二氯乙烷(0.24mL)和三乙胺(25μL，0.18mmol)处理。向该反应混合物中加入N,N²-二甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺三氟乙酸盐(48mg，0.08mmol)，并将该混合物在50℃搅拌5小时，并冷却至室温。将该反应混合物用二氯甲烷稀释，并用NaHCO₃水溶液洗涤。将有机层浓缩，并经硅胶柱用5-20％1M在甲醇和二氯甲烷中的NH₃洗脱纯化，得到标题化合物，30％收率。

步骤5.N²-[铵基(亚氨基)甲基]-N,N²-二甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺双(三氟乙酸盐)的制备。

将N²-{(E)-[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚氨基]甲基}-N,N²-二甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺三氟乙酸盐(330mg，0.43mmol)溶于三氟乙酸(1.6ml)中，并在室温搅拌15分钟，并在除去挥发物之后，将粗品分离。经制备型HPLC纯化，冻干后，得到标题化合物，为白色固体(18％收率)。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ7.91(m,3H),7.78(m,12H),7.38(bs,4H),4.27(s,1.5H),4.22(s,0.5H),3.51(m,4H),2.90(s,2.2H),2.87(s,3H),2.75(s,0.8H),1.78(m,2H)；MS(ESI+)C₂₆H₃₃N₄OP m/z224.2(M+H)²⁺。

实施例3N²-[氨基(亚氨基)甲基]-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)-丙基]甘氨酰胺氯化物的制备。

步骤1.(3-氨基丙基)(三苯基)鏻二溴化物)的制备。

向3-溴丙胺氢溴化物(25.1g，115mmol)在1-丁醇(210mL)中的搅拌过的脱气溶液中加入三苯基膦(42.1g，160mmol)。通过将氮气通入其中达10分钟将该溶液再次脱气，然后在120℃加热过夜。将该溶液冷却，并倾入甲基叔丁基醚(700mL)和甲苯(400mL)的搅拌的溶液中。在室温搅拌直至得到均质的浆体后，将固体过滤，并将产物滤饼用甲基叔丁基醚(2x100mL)冲洗两次，得到标题化合物(54g，84％)，为白色固体。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ7.81(m,15H),3.74(m,2H),2.99(m,2H),1.84(m,2H)。

步骤2.N²-(叔丁氧基羰基)-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺溴化物的制备。

向N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基甘氨酸(1.96g，10.4mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(9.8mL)中的搅拌过的溶液中加入N,N-羰二咪唑(1.68g，10.4mmol)。在室温1小时后，加入(3-氨基丙基)(三苯基)鏻二溴化物(5.02g，10.4mmol)，并将该混合物在室温搅拌过夜。将该反应混合物用二氯甲烷(20mL)稀释，并将有机层用5重量百分比的氯化锂水溶液(2x10mL)和0.5M柠檬酸(10mL)洗涤。将有机层浓缩，得到标题化合物(4.0g，65％)，为白色固体。

MS(ESI+)C₂₉H₃₆N₂O₃P m/z491.4(M)⁺。

步骤3.N²-(叔丁氧基羰基)-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺氯化物的制备。

将N²-(叔丁氧基羰基)-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺溴化物(53.7g，93.9mmole)在二氯甲烷(450mL)中的溶液与含2重量百分比的四丁基氯化铵的20重量百分比的氯化锂水溶液(4x150 mL/g)一起搅拌。将有机层浓缩至干燥，得到标题化合物，定量收率。

MS(ESI+)C₂₉H₃₆N₂O₃P m/z491.4(M)⁺。

步骤4.N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺氯化物的制备。

向N²-(叔丁氧基羰基)-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺氯化物(7.6g，14mol)在二氯甲烷(38mL)和甲醇(4.2mL)中的溶液中加入2.0M在乙醚中的HCl(16mL，32mmol)，并将该混合物在室温搅拌过夜。将该溶液冷却至0℃，并用7M在甲醇中的氨(6.0mL，42mmol)处理，得到立即出现的(immediate)白色沉淀。30分钟后，将该浆体过滤，并将烧瓶和滤饼用二氯甲烷(68mL)冲洗。将滤液浓缩，得到标题化合物(6.2g，100％)，为粗制的白色固体。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ7.69(m,15H),3.81(s,2H),3.35(m,2H),3.27(m,2H),1.86(m,2H)。

步骤5.N²-[氨基(亚氨基)甲基]-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)-丙基]甘氨酰胺氯化物的制备。

向N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺氯化物(7.65_g，17.9mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(15mL)中的溶液中加入1-H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(2.76g，18.8mmol)和N,N-二异丙基乙胺(3.28mL，18.8mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜。搅拌过夜后，反应没有完成，并加入另外的1-H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(394mg，2.69mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.47mL，2.69mmol)。8小时后，再次加入另外的1-H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(338mg，2.3mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.40mL，2.3mmol)。将该混合物再次搅拌过夜。将该反应混合物用二氯甲烷(30mL)稀释，然后将该溶液加入含快速搅拌的二氯甲烷(15mL)和甲基叔丁基醚(61mL)的混合物的烧瓶中以沉淀出产物。将上清液倒出，并将产物在35℃在高真空下干燥，得到标题化合物(9.4g，100％收率，约80％纯度)，为粗制的淡黄色固体。

¹H NMR(D₂O)δ7.67(m,15H),4.00(s,2H),3.27(m,2H),3.19 (m,2H),2.88(s,3H),1.83(m,2H)。

步骤6.N²-[氨基(亚氨基)甲基]-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)-丙基]甘氨酰胺氯化物的结晶。

将N²-[氨基(亚氨基)甲基]-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺氯化物(10.1g，17.9mmol)溶于二氯甲烷(40mL)中，并在室温搅拌24小时，得到白色固体的浆体。将固体过滤，并干燥，得到标题化合物(3.6g，43％收率，>95％纯度)。

¹H NMR(D₂O)δ7.67(m,15H),4.00(s,2H),3.27(m,2H),3.19(m,2H),2.88(s,3H),1.83(m,2H)；C₂₅H₃₀N₄OP的MS(ESI+)m/z433.3(M)⁺。

实施例4N²-[铵基(亚氨基)甲基]-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺二氯化物的制备

使用下文所述的合成方法从实施例3的产物制备实施例4的修饰的肌酸化合物。

将N²-[铵基(亚氨基)甲基]-N²-甲基-N-[3-(三苯基膦鎓基)丙基]甘氨酰胺双(三氟乙酸盐)(100mg，0.15mmol)溶于过量的盐酸甲醇中，并除去挥发物，得到标题化合物(75mg)，定量收率。

¹H NMR(D₂O)δ7.89(m,3H),7.76(m,12H),3.99(s,2H),3.52(m,2H),3.25(m,2H),2.87(s,3H),1.68(m,2H)；MS(ESI+)C₂₅H₃₁N₄OP m/z433.2(M⁺)和MS(ESI+)C₂₅H₃₁N₄OP m/z217.2(M+H)²⁺。

实施例5N³-[铵基(亚氨基)甲基]-N³-甲基-N-[4-(三苯基膦鎓基)丁基]-β-丙氨酰胺双(三氟乙酸盐)的制备。

步骤1.N³-(叔丁氧基羰基)-N³-甲基-N-[4-(三苯基膦鎓基)丁基]-β-丙氨酰胺溴化物的制备。

将N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-β-丙氨酸(Matrix Scientific,368mg，1.81mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3.7mL)中，并用N,N-羰二咪唑(308mg，1.90mmol)处理。将该反应混合物在室温搅拌30分钟。加入(4-氨基丁基)(三苯基)鏻溴化物(1.12g，2.72mmol)，并将该反应混合物在室温搅拌过夜。然后将该反应混合物用二氯甲烷稀释，并用5％氯化锂水溶液(3次)、1N氯化氢水溶液和饱和的碳酸氢钠洗涤。将该有机溶液经无水硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，得到标题化合物(1.26g，100％,86％纯度)，为白色泡沫。将样品以粗品形式用于下一步骤。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ7.85(m,16H),3.58(m,2H),3.28(m,2H),3.07(m,2H)2.72(bs,3H),2.20(m,2H),1.57(m,4H),1.37(bs,9H)。MS(ESI+)C₃₁H₄₀N₂O₃P m/z519.4(M)⁺。

步骤2.N³-甲基-N-[4-(三苯基膦鎓基)丁基]-β-丙氨酰胺溴化物的制备。

将N³-(叔丁氧基羰基)-N³-甲基-N-[4-(三苯基膦鎓基)丁基]-β-丙氨酰胺溴化物(1.08g，1.80mmol)溶于二氯甲烷(5.4mL)和甲醇(0.54mL)中。将该溶液在室温用2.0M在乙醚中的氯化氢(1.98mL，3.96mmol)处理。将该混合物在室温搅拌过夜，然后用冰浴冷却，并用7N在甲醇中的氨(0.75mL，5.22mmol)处理。30分钟后，将得到的浆体过滤，并将固体用二氯甲烷洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物(980mg，110％,84％纯度)，为白色泡沫。将步骤2的产物以粗品形式用于下一个步骤。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ7.91(m,17H),3.58(m,2H),3.07(m,2H)2.66(m,2H),2.27(s,3H),2.20(m,2H),1.57(m,4H)。MS(ESI+)C₂₆H₅₂N₂OP m/z419.3(M)⁺。

步骤3.N³-[氨基(亚氨基)甲基]-N³-甲基-N-[4-(三苯基膦鎓基)丁基]-β-丙氨酰胺溴化物的制备。

将N³-甲基-N-[4-(三苯基膦鎓基)丁基]-β-丙氨酰胺溴化物(980mg，2.0mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中。将得到的溶液用1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(315mg，2.15mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.39mL，2.26mmol)处理。将该反应混合物在室温搅拌过夜。可以加入更多的1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺以进行进一步的转化。将在N,N-二甲基甲酰胺中的该反应混合物未经后处理地用于下一个步骤中。

步骤4.N³-[氨基(亚氨基)甲基]-N³-甲基-N-[4-(三苯基膦鎓基)丁基]-β-丙氨酰胺三氟乙酸盐-三氟乙酸(1:1)的制备。

将N³-[氨基(亚氨基)甲基]-N³-甲基-N-[4-(三苯基膦鎓基)丁基]-β-丙氨酰胺溴化物在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液经C18柱直接纯化(用水(带有0.1％TFA)和乙腈(带有0.07％TFA)梯度洗脱)以分离N³-[氨基(亚氨基)甲基]-N³-甲基-N-[4-(三苯基膦鎓基)丁基]-β-丙氨酰胺三氟乙酸盐-三氟乙酸(1:1)(800mg)，60％纯化的收率。

¹H NMR(DMSO-d₆with D₂O)δ7.85(m,15H),3.55(m,2H),3.46(b,2H),3.08(m,2H),2.86(s,3H),2.34(m,2H),1.57(m,4H)。MS(ESI+)C₂₇H₃₄N₄OP m/z461.2(M)⁺。

实施例6{4-[(4-{[铵基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}丁酰基)氨基]丁基}(三苯基)鏻双(三氟乙酸盐)的制备。

步骤1.11,14,14-三甲基-7,12-二氧代-1,1,1-三苯基-13-氧杂-6,11-二氮杂-1-鏻十五烷溴化物的制备。

将4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]丁酸(J.Organic Chemistry, 1985,50,1302-1304,349mg，1.61mol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3.5mL)中，并用N,N-羰二咪唑(273mg，1.69mmol)处理。将该混合物在室温搅拌30分钟。加入(4-氨基丁基)(三苯基)鏻溴化物(929mg，1.40mmol)，并将该反应混合物在室温搅拌过夜。将该反应混合物用二氯甲烷稀释，并用5％氯化锂水溶液(3次)、1N氯化氢水溶液和饱和的碳酸氢钠洗涤。将该有机溶液经无水硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，得到标题化合物(0.91g，92％,83％纯度)，为白色泡沫。将样品以粗品形式用于下一个步骤中。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ7.81(m,16H),3.55(m,2H),3.07(m,4H),2.72(s,3H),1.94(m,2H),1.57(m,6H),1.37(s,9H)。MS(ESI+)C₃₂H₄₂N₂O₃P m/z534.4(M)⁺。

步骤2.(4-{[4-(甲基氨基)丁酰基]氨基}丁基)(三苯基)鏻溴化物的制备。

将11,14,14-三甲基-7,12-二氧代-1,1,1-三苯基-13-氧杂-6,11-二氮杂-1-鏻十五烷溴化物(910mg，1.50mmol)溶于二氯甲烷(4.6mL)和甲醇(0.50mL)中。将该溶液在室温用2.0M在乙醚中的氯化氢(1.63mL，3.26mmol)处理。将该混合物在室温搅拌过夜，然后用冰浴冷却，并用7N在甲醇中的氨(0.61mL，4.30mmol)处理。30分钟后，将得到的浆体过滤，并将固体用二氯甲烷洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物(690mg，91％,91％纯度)，为白色泡沫。将步骤2的产物以粗品形式用于下一步骤中。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ7.81(m,17H),3.58(m,2H),3.06(m,2H),2.39(m,2H),2.32(s,3H),2.01(m,2H),1.54(m,6H)。MS(ESI+)C₂₇H₃₄N₂OP m/z433.3(M)⁺。

步骤3.{4-[(4-{[氨基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}丁酰基)氨基]丁基}(三苯基)鏻溴化物的制备。

将(4-{[4-(甲基氨基)丁酰基]氨基}丁基)(三苯基)鏻溴化物(690mg，1.30mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1.4mL)中。将得到的溶液用1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(216mg，1.47mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.27 mL，1.54mmol)处理。将该反应混合物在室温搅拌过夜。可以加入更多的1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺以进行进一步的转化。将在N,N-二甲基甲酰胺中的该反应混合物未经分离地用于纯化步骤中。

步骤4.{4-[(4-{[氨基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}丁酰基)氨基]丁基}(三苯基)鏻三氟乙酸盐-三氟乙酸(1:1)的制备。

将N³-[氨基(亚氨基)甲基]-N³-甲基-N-[4-(三苯基膦鎓基)丁基]-β-丙氨酰胺溴化物在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液经C18柱直接纯化(用水(带有0.1％TFA)和乙腈(带有0.07％TFA)梯度洗脱)以分离标题化合物(630mg)，67％纯化的收率。

¹H NMR(DMSO-d₆，含D₂O)δ7.83(m,15H),3.58(m,2H),3.20(m,2H),3.08(m,2H),2.91(3,3H),2.03(m,2H),1.61(m,6H)。MS(ESI+)C₂₈H₃₆N₄OP m/z475.2(M)⁺。

实施例7{4-[(4-{[铵基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}-2,2-二甲基丁酰基)氨基]丁基}(三苯基)鏻双(三氟乙酸盐)的制备。

步骤1.8,8,11,14,14-五甲基-7,12-二氧代-1,1,1-三苯基-13-氧杂-6,11-二氮杂-1-鏻十五烷溴化物的制备。

将4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]-2,2-二甲基丁酸(Organic and MolecularChemistry,2011,9,1846-1854，117mg，0.48mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1.2mL)中，并用N,N-羰二咪唑(104mg，0.64mmol)处理。将该混合物在室温搅拌30分钟。加入(4-氨基丁基)(三苯基)鏻溴化物(277mg，0.67mmol)，并将该反应混合物在室温搅拌过夜。然后将该反应混合物用二氯甲烷稀释，并用5％氯化锂水溶液(3次)、1N氯化氢水溶液和饱和的碳酸氢钠洗涤。将该有机溶液经无水硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，得到标题化合物(210mg，69％)，为白色泡沫。 将样品以粗品形式用于下一个步骤中。

MS(ESI+)C₃₄H₄₆N₂O₃P m/z561.5(M)⁺。

步骤2.(4-{[2,2-二甲基-4-(甲基氨基)丁酰基]氨基}丁基)(三苯基)鏻溴化物的制备。

将8,8,11,14,14-五甲基-7,12-二氧代-1,1,1-三苯基-13-氧杂-6,11-二氮杂-1-鏻十五烷溴化物(205mg，0.32mmol)溶于二氯甲烷(1.0mL)和甲醇(0.10mL)中。将该溶液在室温用2.0M在乙醚中的氯化氢(0.36mL，0.71mmol)处理。将该反应混合物在室温搅拌过夜，用冰浴冷却，并用7N在甲醇中的氨(0.13mL，0.93mmol)处理。30分钟后，将得到的浆体过滤，并将固体用二氯甲烷洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物(170mg，98％)，为白色泡沫。将步骤2的产物以粗品形式用于下一步骤中。

MS(ESI+)C₂₉H₃₈N₂OP m/z460.9(M)⁺。

步骤3.{4-[(4-{[氨基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}-2,2-二甲基丁酰基)氨基]丁基}(三苯基)鏻溴化物的制备。

将(4-{[2,2-二甲基-4-(甲基氨基)丁酰基]氨基}丁基)(三苯基)鏻溴化物(171mg，0.32mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(0.34mL)中。将得到的溶液用1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(65mg，0.44mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.083mL，0.47mmol)处理。将该反应混合物在室温搅拌过夜。可以加入更多的1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺以进行进一步的转化。将在N,N-二甲基甲酰胺中的该反应混合物未经分离地用于纯化步骤中。

步骤4.{4-[(4-{[氨基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}-2,2-二甲基丁酰基)氨基]丁基}(三苯基)鏻三氟乙酸盐-三氟乙酸(1:1)的制备。

将N³-[氨基(亚氨基)甲基]-N³-甲基-N-[4-(三苯基膦鎓基)丁基]-β-丙氨酰胺溴化物在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液经C18柱直接纯化(用水(带有0.1％TFA)和乙腈(带有0.07％TFA)梯度洗脱)以分离{4-[(4-{[氨基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}丁酰基)氨基]丁基}(三苯基)鏻三氟乙酸盐-三氟乙酸(1:1)(99mg，43％)。

¹H NMR(DMSO-d₆，含D₂O)δ7.83(m,17H),3.56(m,2H),3.07(m,4H),2.91(s,3H),1.61(m,4H),1.49(m,2H),1.00(s,6H)。MS(ESI+)C₃₀H₄₀N₄OP m/z503.1(M)⁺。

实施例8[3-({[1-({[铵基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}甲基)环丙基]羰基}氨基)丙基](三苯基)鏻双(三氟乙酸盐)的制备。

步骤1.1-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}环丙烷甲酸甲酯的制备。

将1-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}环丙烷甲酸(Chem-Impex International,Inc.,682mg，3.17mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(6.8mL)中，并用冰浴冷却。向该溶液中加入60％在矿物油中的氢化钠(279mg，6.97mmol)。30分钟后，将该混合物用甲基碘(0.592mL，9.5mmol)处理，并温至室温。2小时后，将该反应混合物倾入1N氯化氢水溶液(13.9mL)和饱和的氯化钠(13.9mL)的冷(冰浴温度)的混合液中。将该产物用乙酸乙酯萃取(3次)。浓缩有机层，得到标题化合物(1.1g)，将其直接用于下一个步骤中。

MS(ESI+)C₁₂H₂₁NO₄m/z266.1(M+Na)⁺。

步骤2.1-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}环丙烷甲酸的制备。

将1-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}环丙烷甲酸甲酯溶于甲醇(6.8mL)和水(5.8mL)中，并用10M氢氧化钠(0.98mL，9.82mmol)处理。将该溶液在50℃加热。30分钟后，将该反应混合物用冰浴冷却，并在1N氯化氢(19.6mL)和饱和的氯化钠(19.6mL)的冷的(冰浴温度)的混合物中淬灭。将该产物用乙酸乙酯萃取(3次)。将该有机溶液经无水硫酸钠干燥，并过滤。将有机溶液浓缩，得到标题化合物(680mg，94％收率)，将其以粗品形式用于下一个步骤中。

MS(ESI-)C₁₁H₁₉NO₄m/z228.3(M-H)^-。

步骤3.(3-{[(1-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}环丙基)羰基]氨基}丙基)(三苯基)鏻溴化物的制备。

将1-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}环丙烷甲酸(680mg，3.0mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(6.8mL)中，并用N,N-羰二咪唑(571mg，3.52mmol)处理。将该混合物在室温搅拌30分钟。向该溶液中加入(3-铵基丙基)(三苯基)鏻二溴化物(1.93g，4.00mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜，然后用二氯甲烷稀释，并用5％氯化锂水溶液(3次)、1N氯化氢水溶液和饱和的碳酸氢钠洗涤。将该有机溶液经无水硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，得到粗制的标题化合物。将粗制的产物经硅胶柱纯化(用0-20％的甲醇与二氯甲烷的梯度洗脱)以分离标题化合物(810mg，40％，91％纯度)。

MS(ESI+)C₃₂H₄₀N₂O₃P m/z531.5(M)⁺。

步骤4.{3-[({1-[(甲基氨基)甲基]环丙基}羰基)氨基]丙基}(三苯基)鏻溴化物的制备。

将(3-{[(1-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}环丙基)羰基]氨基}-丙基)(三苯基)鏻溴化物(809mg，1.32mmol)溶于二氯甲烷(4.0mL)和甲醇(0.4mL)中。将该溶液在室温用2.0M在乙醚中的氯化氢(1.7mL，3.44mmol)处理。将该混合物在室温搅拌过夜。向该未完成的反应中加入另外的2.0M在乙醚中的氯化氢(0.36mL，0.71mmol)。再过3小时后，将该反应混合物用冰浴冷却，并用7N在甲醇中的氨(0.77mL，5.42mmol)处理。30分钟后，将得到的浆体过滤，并将固体用二氯甲烷洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物(760mg，110％,85％纯度)。将步骤4的产物以粗品形式用于下一步骤中。

MS(ESI+)C₂₇H₃₂N₂OP m/z431.2(M)⁺。

步骤5.[3-({[1-({[氨基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}甲基)环丙基]羰基}氨基)丙基](三苯基)鏻溴化物的制备。

将{3-[({1-[(甲基氨基)甲基]环丙基}羰基)氨基]丙基}(三苯基)-鏻溴化物(229mg，0.45mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(0.46mL)中。将得到的溶液用1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(92mg，1.4mmol)和N,N-二异丙 基乙胺(0.12mL，0.67mmol)处理。将该反应混合物在室温搅拌过夜。可以向反应中加入另外的1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺以进行进一步的转化。将在N,N-二甲基甲酰胺中的该反应混合物未经分离地用于纯化步骤中。

步骤6.[3-({[1-({[氨基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}甲基)环丙基]羰基}氨基)丙基](三苯基)鏻三氟乙酸盐-三氟乙酸(1:1)的制备。

将[3-({[1-({[氨基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}甲基)环丙基]羰基}氨基)-丙基](三苯基)鏻溴化物在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液经C18柱直接纯化(用水(带有0.1％TFA)和乙腈(带有0.07％TFA)梯度洗脱)，以分离[3-({[1-({[氨基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}甲基)环丙基]-羰基}氨基)丙基](三苯基)鏻三氟乙酸盐-三氟乙酸(1:1)(144mg，46％收率)。

¹H NMR(DMSO-d₆with D₂O)δ7.83(m,16H),3.50(m,4H),3.17(m,2H),2.86(s,3H),1.62(m,2H),1.11(m,2H),0.88(m,2H)。MS(ESI+)C₂₈H₃₄N₄OP m/z473.1(M)⁺。

实施例9[3-({[4-({[铵基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}甲基)四氢-2H-吡喃-4-基]羰基}氨基)丙基](三苯基)鏻双(三氟乙酸盐)的制备。

步骤1.4-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}四氢-2H-吡喃-4-甲酸的制备。

将4-氨基甲基四氢吡喃-4-甲酸(AstaTech,Inc.,478mg，3.00mmol)溶于1,4-二噁烷(8.5mL)和水(4.2mL)中。向该溶液中加入碳酸钾(664mg，4.80mmol)和二碳酸二叔丁酯(918mg，4.20mmol)。在室温搅拌过夜后，将该反应混合物用水稀释，并用乙酸乙酯(2次)洗涤。然后将水层用1N盐酸水溶液酸化，并将该产物用乙酸乙酯萃取(3次)。浓缩有机层，得到标题化合物(729mg，94％收率)。将样品直接用于 下一个步骤中。

MS(ESI-)C₁₂H₂₁NO₅m/z258.3(M-H)^-。

步骤2.4-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}四氢-2H-吡喃-4-甲酸甲酯的制备。

将4-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}四氢-2H-吡喃-4-甲酸(729mg，2.81mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(7.3mL)中，并用冰浴冷却。向该溶液中加入60％在矿物油中的氢化钠(337mg，8.43mmol)，并将该溶液温至室温。加入硫酸二甲酯(612μL，6.47mmol)，并将该混合物在50℃加热。30分钟后，将该反应混合物冷却至室温，并加入另外的60％在矿物油中的氢化钠(56.2mg，1.40mmol)和硫酸二甲酯(133μL，1.40mmol)。然后将该混合物在50℃加热1小时。将该反应混合物用冰浴冷却，并在1N氯化氢(19.7mL)和饱和的氯化钠(19.7mL)的冷(冰浴温度)的混合物中淬灭。将该产物用乙酸乙酯萃取(3次)。将该有机溶液经无水硫酸钠干燥，并过滤。将有机溶液浓缩，得到标题化合物，将其以粗品形式用于下一个步骤中。

MS(ESI+)C₁₄H₂₅NO₅m/z288.2(M+H)⁺。

步骤3.4-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}四氢-2H-吡喃-4-甲酸的制备。

将4-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}四氢-2H-吡喃-4-甲酸甲酯(2.81mmol)溶于甲醇(7.3mL)和水(5.9mL)中，并用10M氢氧化钠(1.40mL，14.0mmol)处理。将该溶液在60℃加热过夜。将该反应混合物冷却至室温，并在旋转蒸发仪上除去挥发物。将剩余的溶液用水稀释，并用乙酸乙酯洗涤(2次)。将水层用冰浴冷却，然后用1N HCl水溶液(28.1mL)和饱和的氯化钠(28.1mL)的混合物酸化。将该产物用乙酸乙酯萃取(3次)，将该有机溶液经无水硫酸钠干燥，并过滤。将有机溶液浓缩，得到标题化合物(750mg，97％收率)，将其以粗品形式用于下一个步骤中。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ3.89(m,2H),3.48(m,4H),2.90(s,3H),2.07(m,2H),1.62(m,2H),1.46(s,9H)；MS(ESI-)C₁₃H₂₃NO₅m/z 272.4(M-H)^-。

步骤4.(3-{[(4-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}-四氢-2H-吡喃-4-基)羰基]氨基}丙基)(三苯基)鏻溴化物的制备。

将4-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}四氢-2H-吡喃-4-甲酸(549mg，2.01mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5.5mL)中。向该溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(385μL、2.21mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(323mg，2.11mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(578mg，3.01mmol)和(3-铵基丙基)(三苯基)鏻二溴化物(1.16g，2.41mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜，然后用二氯甲烷稀释，并用5％氯化锂水溶液(3次)、1N氯化氢水溶液和饱和的碳酸氢钠洗涤。将该有机溶液经无水硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，得到粗制的标题化合物。将粗制的产物经硅胶柱用10％的甲醇与二氯甲烷洗脱纯化以分离标题化合物(729mg，55.4％收率)。

MS(ESI+)C₃₄H₄₄N₂O₄P m/z575.5(M)⁺。

步骤5.(3-{[(4-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}-四氢-2H-吡喃-4-基)羰基]氨基}丙基)(三苯基)鏻溴化物的制备。

将(3-{[(4-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}四氢-2H-吡喃-4-基)羰基]氨基}丙基)(三苯基)鏻溴化物(83mg，0.13mmol)溶于二氯甲烷(0.42mL)和甲醇(42μL)中。在室温向该溶液中加入2.0M在乙醚中的氯化氢(158mL，0.32mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜。如果该反应没有完成，可以加入另外的2.0M在乙醚中的氯化氢。将该反应混合物用冰浴冷却，并用7N在甲醇中的氨(70μL，0.49mmol)处理。30分钟后，将得到的浆体过滤，并将固体用二氯甲烷洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物(70mg)，将其以粗品形式用于下一步骤中。

MS(ESI+)C₂₉H₃₆N₂O₂P m/z475.3(M)⁺。

步骤6.[3-({[4-({[氨基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}甲基)四氢-2H-吡喃-4-基]羰基}氨基)丙基](三苯基)鏻溴化物的制备。

将(3-{[(4-{[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]甲基}四氢-2H-吡喃-4-基)羰基]氨基}丙基)(三苯基)鏻溴化物(71mg，0.13mmol)溶于N,N-二甲 基甲酰胺(140μL)中。向得到的溶液中加入1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(22mg，0.15mmol)和N,N-二异丙基乙胺(29μL，0.17mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。如果反应未完成，可以向反应混合物中加入另外的1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺。将在N,N-二甲基甲酰胺中的该反应混合物未经分离地用于纯化步骤中。

步骤7.[3-({[4-({[氨基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}甲基)四氢-2H-吡喃-4-基]羰基}氨基)丙基](三苯基)鏻三氟乙酸盐-三氟乙酸(1:1)的制备。

将[3-({[4-({[氨基(亚氨基)甲基](甲基)氨基}甲基)四氢-2H-吡喃-4-基]羰基}氨基)丙基](三苯基)鏻溴化物在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液经C18柱直接纯化(用水(带有0.1％TFA)和乙腈(带有0.07％TFA)梯度洗脱)以分离标题化合物(1:1)(3mg，3.1％收率)。

¹H NMR(DMSO-d₆，含D₂O)δ7.74(m,16H),3.67(m,2H),3.53(m,4H),3.26(m,2H),3.12(m,2H),2.76(s,3H),1.91(m,2H),1.71(m,2H),1.48(m,2H)。MS(ESI+)C₃₀H₃₈N₄O₂P m/z517.0(M)⁺。

生物学活性

实施例1:CPK活性的测定。

进行体外试验以测定重组CPK对修饰的肌酸化合物(CK,天然人肌酸激酶，来自Cell Sciences目录号:CSI14786B)的活性。将重组CPK(10单位/孔)与1mM ATP和不同浓度的(5mM、2.5mM和1mM)实施例1的化合物(化合物1)或肌酸(5mM)混合。然后使用萤光素酶测定各样品的ATP水解(为γ磷酸基从ATP转移至肌酸亚单元的胍基的速度的衡量)。然后根据生厂商说明加入萤光素酶(来自Promega的GLO试剂盒)。随ATP被消耗，发射出光。每2分钟我们收集读板器中的发射光，以流明计。收集数据超过30分钟以生成斜率。所述斜率是ATP消耗的衡量。更负的斜率表示通过CK(CPK)向肌酸或实施例1的化合物转移ATP更大。将实施例1的化合物的ATP水解/消耗的速度与肌酸(5mM)的ATP水解/消耗的速度进行比较。

试验的结果在图1中显示。加入肌酸引起如预期一样的ATP水解/消耗的增加。在加入等摩尔浓度的化合物1(“Mito-肌酸”)后，相对于肌酸观测到更高的ATP水解/消耗的速度，表明对于CPK具有改善的活性。

实施例2:氧消耗速度(OCR)的分析。

通过测定感兴趣的肌酸化合物对细胞OCR的作用来评估它们对于线粒体生物能的效应。

在该试验中，使用XF24细胞外流量分析仪(Seahorse Bioscience,NorthBillerica,MA)测定在完整细胞中线粒体的氧消耗。XF24分析仪在专用微孔板中产生暂时的7μl的空间，其允许通过用XF24装置测量氧敏感染料来实时测定氧和质子浓度。OCR测量之前24小时，将成纤维细胞接种至24孔组织培养板中的20个孔中，同时将1ml XFCalibrant溶液(Seahorse Bioscience,North Billerica,MA)加入24孔双重-分析物传感器盒(Seahorse Bioscience,North Billerica,MA)的每个孔中。在24孔校准板上改变传感器盒的位置，并将板在37℃温育过夜而不添加另外的CO₂。

在实验当天，将传感器(sensor cartridge)上的进样口中装入化合物1或肌酸，如所示在10×浓度，并置于XF24Flux分析仪中以自动校准。在传感器校准期间，将各组织培养孔中的细胞在1mL无缓冲培养基中漂洗一次。然后将675μL无缓冲培养基加入各孔中，并将板在没有另外的CO₂的情况下温育1小时。随后将板置于已校准的海马XF24通量分析仪中进行生物能分析。使用细胞计数器将相当数量的细胞铺至每个孔。在逐孔的基础上通过采取OCR的基线测量完成进一步的归一化，且观测到的增加是治疗前的相同孔的对比。由此将各孔用作其自身的对照。

5nM、10nM、50nM和500nM浓度的化合物1(“Mito-肌酸”)的试验的结果在图2中显示，作为未处理的对照的变化百分比。为了比较，将对于化合物1得到的结果与在一加入10μM肌酸之后测量的

使用相同的方法，测定浓度为25nM的化合物1(“Mito-肌酸”)和实施例2的化合物(“N-甲基Mito-肌酸”)的氧消耗速度。将两个化合物得到的结果作为相对于加入10μM肌酸后测量的氧消耗速度所增加的氧消耗百分比在图3中标绘。

使用相同的方法，在HepG2人肝癌细胞中测量另外的化合物的氧消耗速度(OCR)。将化合物以0.25nM至200nM的范围的浓度加入。所有的化合物均证实增加了氧消耗速度，如表3所示，表示为相对于对照的增加百分比(其中对照在所示浓度为100)。

表3

实施例	浓度(nM)	OCR
			1	10	124
2	10	106
			5	10	117.9
6	0.25	121
			7	20	112
8	2.5	115.7
			9	2.5	121.9

实施例3:复合体I(CI)活性的分析。

使用感兴趣的肌酸化合物在细胞中对复合体I(CI)活性的作用测定化合物改变线粒体呼吸的能力。

根据制造商方案使用来自MitoSciences(Eugene,OR)的CI微孔板试验(MS141)测定复合体I活性。将成纤维细胞铺在T75培养瓶中。铺后24小时，将细胞在培养基中用多种浓度的实施例1的化合物处理30分钟。然后将细胞裂解，并根据制造商方案使用在CI试验试剂盒中提供的试剂分离线粒体。在测定蛋白质浓度后，将总体积200μl的 20μg的纯化的线粒体一式四份地加入96-孔微孔板中，并在细胞中免疫捕获CI酶。在将NADH氧化为NAD+、且同时染料被还原(导致在450nm的吸收度随时间流逝(0–105分)增加)之后吸光度发生变化，用PHERAstar FS(BMG LABTECH Inc,Cary,NC,美国)通过色度法测定CI活性。标绘每个时间点和治疗组的一式四份值的平均值±SD，并通过起始斜率(即，20至50分钟的线性范围的值)测定CI活性的比率(rate)，表示为每分钟光密度的变化。

图4显示在30分钟内化合物1(25nM)对复合体I活性的作用。用于比较，标绘加入10μM未修饰的肌酸之后所测量的复合体I活性。用化合物1孵育在30分钟内诱导复合体I活性显著的增加。

将本说明书中引述的全部公开文献和专利引入本文作为参考，就如同具体地和分别地指明将每篇公开文献或专利引入作为参考一样。如果引入作为参考的任意专利或公开文献的术语与本说明书中使用的术语含义发生矛盾，则应将本说明书中的术语含义视为加以控制。此外，上述讨论仅公开和描述了本发明的示例性实施方案。本领域技术人员从这种讨论和附图和权利要求中易于认为可以在不脱离如所附权利要求中所定义的本发明精神和范围的情况下对其中进行不同的改变、变型和变化。

Claims (17)

1.式I化合物

或其可药用盐，其中

Z是-C(＝O)NR₅-；

其中R₅是氢或烷基；

Y是鏻基；

R₁各自是氢；

R₂不存在或是烷基；

R₃是烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基或烷基杂环烷基；

R₄是烷基；和

W是氢；

在每次存在时，烷基任选地被1-3个独立地选自卤素、卤代烷基、羟基、氨基、硫代、醚、酯、氧代、醛、环烷基、腈、脲、酰胺、氨基甲酸酯和芳基的取代基所取代；

条件是Z和Y不在相同的R₂碳上取代；且Z和–NR₄-基团不在相同的R₃碳上取代。

2.权利要求1的化合物，其中

Z是-C(＝O)NR₅-；其中R₅是氢；

Y是鏻基；

R₁各自是氢；

R₂是烷基；

R₃是烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基或烷基杂环烷基；

R₄是氢或C_1-6烷基；且W是氢。

3.权利要求2的化合物，其中鏻基选自

–P⁺(R′)₃X^-，其中R′是烷基或芳基；且X^-是阴离子。

4.权利要求3的化合物，其中R′是苯基；且X^-是氯离子或三氟乙酸根。

5.权利要求2的化合物，其中R₂是C_3-8烷基。

6.权利要求2的化合物，其中R₃是C_1-8烷基，或R₃是C_1-6烷基杂环烷基，其中杂环烷基是具有至少一个选自非-过氧化物氧或氮的杂原子的3-10个原子的环。

7.权利要求2的化合物，其中R₄是C_1-4烷基。

8.权利要求2的化合物，其中R₄是甲基。

9.权利要求2的化合物，其中

Z是-C(＝O)NH-，

Y是–P⁺(苯基)₃X^-，其中X^-是氯离子或三氟乙酸根；

R₁是氢；

R₂是C_1-8烷基；

R₃是C_1-6烷基、C_1-6烷基环烷基，其中环烷基包含3-6个碳原子，或是C_1-6烷基杂环烷基，其中杂环烷基是具有氮原子的5-6个原子的环；且R₄是甲基。

10.化合物，其选自:

或其可药用盐。

11.权利要求1的化合物，其选自:

其中，X^-是氯离子或三氟乙酸根。

12.权利要求11的化合物，其是：

其中，X^-是氯离子或三氟乙酸根。

13.权利要求11的化合物，其是：

其中，X^-是氯离子或三氟乙酸根。

14.药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项所述的化合物。

15.权利要求14的药物组合物在制备用于增强线粒体功能的药物中的用途。

16.权利要求14的药物组合物在制备用于在线粒体中增强ATP生成的药物中的用途。

17.权利要求14的药物组合物在制备用于治疗线粒体相关障碍的药物中的用途。