CN103861146B - 一种细菌纤维素生物补片及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细菌纤维素生物补片及其制造方法，该生物补片由细菌纤维素膜即BC膜构成，而所述细菌纤维素的聚合度在2000～20000范围，该纤维素结晶的晶型为I型，结晶指数为50～95%，晶胞参数中a=0.815nm，b=1.025nm,c=0.832nm,β=85度。本发明细菌纤维素生物补片能够在腹腔环境中具有良好的力学性能、更好的生物适应性、更好的防粘连性和抗微生物性，且能够便利地制得合适的面积。

Description

一种细菌纤维素生物补片及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种细菌纤维素产品，更具体地说，本发明涉及一种医用细菌纤维素及其制造方法。

背景技术

腹内腔某些外科手术需要采用生理和机械特性均衡优良的补片来修补筋膜或肌腱，典型而常见的如腹壁疝这种外科疾病，各国人群的发病率一直较高，约为12%。特别是切口疝，由于会引起局部慢性疼痛、腹胀不适，以及绞窄性肠梗阻、肠穿孔等严重的并发症，往往会长期影响着患者的生活质量，甚至会威胁到患者的生命，临床上采用补片来修补疝。我国较大规模的使用补片也已经有十多年，而且，补片的需求量也在逐渐增加。

目前，国内上市的补片由包括欧美等12家公司提供，共20余种。这些补片主要是人工合成材料，会不同程度的引起一些并发症：

聚丙烯补片会与腹腔内组织产生严重的粘连、消化道梗阻甚至肠瘘。膨化聚四氟乙烯补片修补后的牢固性和抗感染能力较差，一旦发生感染必须去除修补材料才能控制感染。聚羟基乙酸网、聚乳酸羟基乙酸网等可吸收材料具有较好的抗感染能力，可促进胶原的增殖。聚丙烯与膨化聚四氟乙烯以及与可吸收材料相结合的复合型疝修补材料既能使组织很好的长入，又能防止与内脏的粘连。但是，这些高分子补片置入腹内后仅仅起到阻挡作用，不能机体组织有机结合，同时，作为异物，置入后会引起局部组织炎症以及感染。

因此，进一步研发能够实现内源性组织再生的生物活性材料，提高国内疝修补的医疗水平，改善治疗效果，降低国内的医疗费用，乃至发明一种如同筋膜或肌腱样的人工材料，完全治愈疝，已经成为疝修补材料领域的一个重要方向。

作为理想的生物活性补片，疝修补材料必须满足的条件：

（1）抗张强度大于人体承受的最大腹内压16N/cm，相应的弹性变形大于14%。

（2）与腹壁组织和内脏的局部炎症范围和持续性异物反应的程度越小越好；与高分子补片组织修补过程相比，能够通过内源性组织再生对缺损组织进行修复。这种内源性组织再生过程更接近于生命组织的自然修复过程，修复后的组织没有过量的瘢痕组织，没有聚合体异物存留在体内而发生的长期慢性炎症过程。

（3）抗微生物性：补片材料性能和结构应更符合生理需求，质量更轻，并发症应更少，适用于腹腔内的移植，可优化疤痕形成过程，适应被污染或有被污染风险的伤口。

（4）较好的防粘连性。

（5）补片的大小要足够适应缺损区域面积。

发明内容

针对传统技术的上述问题，本发明提供一种细菌纤维素生物补片及其制造方法，其具有如下优点：能够在腹腔环境中具有良好的力学性能、更好的生物适应性、更好的防粘连性和抗微生物性，且能够便利地制得合适的面积。

为此，本发明的技术解决方案之一是一种细菌纤维素生物补片，该生物补片由细菌纤维素膜即BC膜构成，而所述细菌纤维素的聚合度在2000～20000范围，该纤维素结晶的晶型为I型，结晶指数为50～95%，晶胞参数中a=0.815nm，b=1.025nm,c=0.832nm,β=85度。

本发明的细菌纤维素（Bacterialcellulose，BC）由醋酸杆菌属中的木醋杆菌（Acetobacterxylinum）代谢产物制得，这种菌属具有最高的纤维素生产能力，因此能够轻易获得合适面积的补片制品。

本发明细菌纤维素与其它来源纤维素在化学组成上相同，都是有吡喃型葡萄糖单体（β－D－葡萄糖）通过β－1，4－糖苷键连接而形成的一种无分支、大分子支链聚合物，但是在微观结构上有着明显的区别。由于本发明细菌纤维素BC特殊的微观结构获得如下很多优异的性能：

本发明细菌纤维素由独特的丝状纤维组成，纤维直径在3～4nm之间，每一丝状纤维带宽度可达30～100nm,厚度可达3～8nm，结构非常致密；本发明细菌纤维素非常纯净（达到99%），不含半纤维素、木质素、果胶和其他细胞壁成份；同时细菌纤维素还具有高结晶度和聚合度。这种特殊的结构使得细菌纤维素具有极其优异的机械性能，其弹性模量高达1.5×10¹⁰Pa,与金属铝相当，远大于目前已知的有机聚合物。并且单根细菌纤维素纤维丝的抗拉强度与钢以及克维拉纤维（Kevlar，杜邦公司的产品，用于防弹衣的制备）相当。因此它具有极佳的抗撕拉能力和形状维持能力，便于制成各种形状，适用于人体不同部位肌腱的修补例如：用于包括各种原发性及复发性腹股沟斜疝、直疝及股疝的疝病修补、食道癌切除后修补、胸膜修复、颅骨修复、隆胸手术后以及女性盆腔脏器脱垂的修复，以及用作心脏血管补片、内脑膜补片。

同时本发明细菌纤维素的纤维网状结构使其具有非凡的持水性，能结合比自身干重大60～700倍的水份。而且，同是细胞外基质的细菌纤维素与胶原具有相似的结构，都具有100nm的直径，在很多情况下细菌纤维素可以代替胶原使用在生物组织工程材料中。它的纳米纤维结构可以刺激细胞的接触诱导机制，使得细胞可以沿着材料表面的突起部分或是纤维进行取向和迁移。从远景来看，本发明这种由自然生物合成的神奇纤维素将会对生物组织工程材料的发展做出长远的贡献。

如后面实测数据证明，本发明细菌纤维素BC，具有如下优点：

（1）BC具有利于新生腹壁组织的再生的三维网络纳米纤维结构。

（2）BC的含水率不低于94％。

（3）BC材料在拉伸速度为80mm/min时的抗张强度为27.87N/cm，弹性应变为54.8％，大于体内环境需要的临界值，符合补片所应具有的力学性能和要求。

BC和传统PP的防粘连性体外研究表明：本发明BC补片材料在防止腹膜和腹腔脏器的粘连方面即具有以下优点：

（5）具有促进腹膜间皮细胞生长的生物学特性，有利于形成生物屏障；

（6）具有抑制成纤维细胞增殖与分化的作用；

（7）抑制血小板的聚集，防止凝血；

（8）抑制纤维蛋白原的沉积。

由上可见，本发明细菌纤维素非常适合代替传统补片、用于腹腔内外科手术修补。

为了进一步优化微观结构、提高细菌纤维素力学和生理性能和效果，本发明纤维素产品还包括如下结构性能改进：

I晶型中Iα型态的比率为50–85%。

所述细菌纤维素膜干膜密度为1.08–2.35gcm^-3；而其持水水份润湿后，细菌纤维素的重量比率为0.14-15%，水份比率为85–99.86%（wt）。

水份润湿后所述纤维素膜的厚度为：0.1～1.0mm，单根纤维素的直径为5～20nm，纤维素束的直径在10～80nm范围。

水份润湿后所述细菌纤维素膜的最大应变εm:45.7～54.8%,最大断裂强度σm：8.24～11.940Mpa，最大抗拉强度Sm：20.73～27.865N/cm。

水份润湿后，所述BC膜对白蛋白的吸附量与其对纤维蛋白原的吸附量之比为0.86～1.72；所述BC膜吸附白蛋白和纤维蛋白原的吸附平衡时间为1-2小时。

相应地，本发明的另一技术解决方案是一种如上所述细菌纤维素生物补片的制造方法，其是选择变形菌门(Proteobacteria)下属的α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)下属的红螺菌目即Rhodospirillales下属的醋杆菌科即Acetobacteraceae下属的醋杆菌属即Acetobacter下属的木醋杆菌Acetobacterxylinum作为菌株，所述制造方法包括如下步骤：

A）振荡培养：将正常活化菌株接入灭菌冷却后的培养基中，在30℃±2℃下振荡培养24–36小时；

B）分散菌株：振荡培养之后，培养基置于摇床以转速为150～200rpm,，充分分散菌株；

C）静置培养：分散操作之后，培养基在30℃±2℃下恒温静置培养3～4周；

D）过滤取膜：静置培养后，再从培养基中取出BC生成膜，通过不锈钢丝网膜过滤得BC滤后膜；

E）清洗制膜：BC滤后膜浸泡在1–4%（wt）NaOH溶液中，在90–100℃沸水中加热1–3小时，去除菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，用稀盐酸中和，继而用去离子水反复冲洗至中性，制得所述BC膜成品。

本发明细菌纤维素的制造方法优选具有很高的纤维素生产能力、在纤维素合成、结晶过程和结构性质方面优异的菌株，采用针对诱导性的培养方法步骤，促使菌株代谢生产出力学和生物性能均衡优良的纤维素。

为了更充分发挥和优化本发明方法在纤维素微观结构上的生产优点，进一步提高本发明方法的适应性和效益，本发明制造方法还包括如下改进：

所述步骤A之前还包括如下步骤A0）菌株活化：将冷冻保藏菌株，在盛有活化营养液培养基中进行活化，然后进行后续培养；所述步骤E中清洗操作后，还包括干燥操作。

所述步骤A的培养基营养液包括如下组份：(NH₂)₂SO₄：2～4g/L,MgSO₄：0.1～0.6g/L,KH₂PO₄：1～3g/L,NaAc：1～2g/L,蔗糖：10～40g/L，椰子水：400～600g/L；上述培养基营养液控制pH=4.2、100℃下灭菌15min。

所述步骤A0的活化营养液包括如下组份：蔗糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氢二钠0.27%，柠檬酸0.115%；上述活化营养液控制pH＝6.0、115℃下灭菌15min。

以下结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为本发明BC实施例的透射电镜照片示意图。

图2为传统PP的透射电镜照片示意图。

图3为本发明BC实施例的力学测试性能曲线示意图。

图4为传统PP的力学测试性能曲线示意图。

图5为本发明BC实施例与传统PP上间皮细胞相对增殖率RGR值对比图。

图6为本发明BC实施例与传统PP上L929细胞相对增殖率RGR值对比图。

图7为本发明BC实施例与传统PP上白蛋白/纤维蛋白吸附量比值对比图。

图8为本发明BC实施例与传统PP体外动态凝血时间对比图。

图9为本发明BC实施例修补手术8周粘连状况照相图。

图10为传统PP修补手术8周粘连状况照相图。

图11为本发明BC实施例修补手术8周组织病理学显微照相图。

图12为传统PP修补手术8周组织病理学显微照相图。

图13为本发明BC实施例修补手术8周间皮细胞显微照相图。

图14为传统PP修补手术8周间皮细胞显微照相图。

图15为本发明BC实施例修补手术8周细胞内部显微照相图。

图16为传统PP修补手术8周细胞内部显微照相图。

具体实施方式

选择变形菌门(Proteobacteria)下属的α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)的红螺菌目Rhodospirillales下属的醋杆菌科Acetobacteraceae下属的醋杆菌属Acetobacter下属的木醋杆菌Acetobacterxylinum作为菌株，所述制造方法包括如下步骤：

A0）菌株活化：将冷冻保藏菌株，在盛有活化营养液培养基中进行活化，活化营养液包括如下组份：蔗糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氢二钠0.27%，柠檬酸0.115%；上述活化营养液控制pH＝6.0、115℃下灭菌15min。然后进行后续培养；

A）振荡培养：将正常活化菌株接入灭菌冷却后的培养基中，在30℃±2℃下振荡培养24–36小时；培养基营养液包括如下组份：(NH₂)₂SO₄：2～4g/L,MgSO₄：0.1～0.6g/L,KH₂PO₄：1～3g/L,NaAc：1～2g/L,蔗糖：10～40g/L，椰子水：400～600g/L；上述培养基营养液控制pH=4.2、100℃下灭菌15min。

B）分散菌株：振荡培养之后，培养基置于摇床以转速为150～200rpm,，充分分散菌株；

C）静置培养：分散操作之后，培养基在30℃±2℃下恒温静置培养3～4

D）过滤取膜：静置培养后，再从培养基中取出BC生成膜，通过不锈钢丝网膜过滤得BC滤后膜；

E）清洗制膜：BC滤后膜浸泡在1–4%（wt）NaOH溶液中，在90–100℃沸水中加热1–3小时，去除菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，用稀盐酸中和，继而用去离子水反复冲洗至中性，再进行干燥操作，制得所述BC膜成品。

经过上述操作步骤制得的细菌纤维素即BC膜构成的生物补片，经过理化测试测得：所述细菌纤维素的聚合度在2000～20000范围，结晶指数为50～95%（XRD分析），纤维素结晶的晶型为I型，晶胞参数中a=0.815nm，b=1.025nm,c=0.832nm,β=85度。I晶型中Iα型态的比率为50–85%（NMR分析）。

所述细菌纤维素膜干膜密度为1.08–2.35gcm^-3；而其持水润湿后，细菌纤维素的重量比率为0.14-15%，水份比率为85–99.86%（wt）。

水份润湿后所述纤维素膜的厚度为：0.1～1.0mm，单根纤维素的直径为5～20nm，纤维素束的直径在10～80nm范围（电镜测试）。

水份润湿后所述细菌纤维素膜的最大应变εm:45.7～54.8%,最大断裂强度σm：8.24～11.940Mpa，最大抗拉强度Sm：20.73～27.865N/cm（力学测试）。

水份润湿后，所述BC膜对白蛋白的吸附量与其对纤维蛋白原的吸附量之比为0.86～1.72；所述BC膜吸附白蛋白和纤维蛋白原的吸附平衡时间为1-2小时（体外培养测试）。

为了比较本发明BC作为生物补片的效果，我们采用PP(聚丙烯)材料的补片来作为比较。以下是本发明实施例BC补片与传统聚丙烯PP补片的系列对比测试：

如图1、2，所示分别为本发明BC实施例与传统PP的透射电镜照片示意图。传统PP聚丙烯补片由聚丙烯单丝纤维编织而成，有很好的强度和刚性。其空隙率达85%，密度为18.9g/m²。

（一）吸水量实验：

因为PP的湿性小，是基本不吸水的材料，因此未对它的含水率进行测定。本实验只对BC做了吸水实验：

在预先恒重的表面皿中称取细菌纤维素，在100℃烘箱中烘至恒重；

含水率(%)=（烘干前样品质量(g)-烘干后样品质量(g)×100%/烘干前样品质量(g)

表1

含水率(%)=（12.1236-0.6283）×100%/12.1236=94.82%

（二）力学性能实验：

如图3、4，所示分别为本发明BC实施例与传统PP的力学测试性能曲线示意图。

2种材料学性能由测试曲线及下表2可见：不管在哪个拉伸速度下BC的伸长率均低于PP的伸长率。在拉伸速度Pullingspeed从10mm/min增加到200mm/min的过程中，80mm/min时的断裂应变最高，BC的为54.8%，PP的为109.6%，BC的最大应变εm（54.8%）、断裂强度σm（11.940MPa）、抗张强度sm（27.865N/cm）虽然均小于已上市的PP补片，但是均大于体内环境需要的临界值（16N/cm），符合所用要求。

处于润湿状态下的BC在被夹具夹紧时和拉伸过程中都有少量水分挤出。BC和PP的拉伸过程均符合薄片塑性变形规律，试样标线的近中位置宽度逐渐变窄，直至最终断裂，不可回复。

表2

小结：

（1）BC具有利于新生腹壁组织的再生的三维网络纳米纤维结构。

（2）BC的含水率为94.82％。

（3）BC材料在拉伸速度为80mm/min时的抗张强度为27.87N/cm，弹性应变为54.8％，大于体内环境需要的临界值，符合所用要求。具有补片所应具有的力学性能。

（三）BC和PP体外的防粘连性实验：

如图5，所示为本发明BC实施例与传统PP两种不同实验材料（materials）上间皮细胞相对增殖率RGR（relativegrowthrate）值的对比图。

间皮细胞与BC、PP共培养2d(天)时，细胞的相对增殖率均低于阴性（Negative）对照组细胞的相对增殖率，尤其是BC组的值仅为51.76%，可以看出间皮细胞在BC表面的增殖较慢。而由于PP宏观网孔较大，细胞基本能穿过PP编丝而在培养板底部粘附生长增殖，不受编丝表面的影响，因此，PP组的细胞相对增殖率较高为82.49%。而随着培养时间的延长，BC和PP共培养4d时的细胞相对增殖率均有所提高，分别为77.26%和90.22%，并且BC表面的细胞相对增殖率提高幅度高于PP组的。因此，在一定程度上可以说BC是能促进间皮细胞增殖的。

间皮细胞与材料共培养4d(天)后，对照组细胞生长状态良好，而BC表面的细胞数量较对照组少，PP组细胞基本完全贴附培养板底部生长，基本不受编丝表面的影响，总体的细胞数量比BC组细胞数量多，接近于对照组细胞数量。而在扫描电镜下，BC表面的间皮细胞状态良好，呈椭圆形或圆形，细胞表面有大量密集的微绒毛，细胞周围高密度的绒毛在背景中形成高密度的晕圈.

如图6，所示为本发明BC实施例与传统PP两种不同实验材料上小鼠成纤维细胞L929相对增殖率RGR值对比图。

与BC和PP共培养后，L929细胞的RGR值均小于阴性（Negative）对照组，PP组中RGR值与阴性对照组接近，BC组的RGR值最小，说明BC阻碍了L929的增殖，并且随着时间的延长，BC和PP组细胞RGR值均降低，抑制了L929的增殖。说明BC可以抑制L929的增殖。

BC和PP的RGR值均小于阴性对照组，PP组中RGR值与阴性对照组接近，BC的RGR值最小，说明BC阻碍了L929的增殖，并且随着时间的延长，BC和PP均阻碍了L929的增殖，尤以BC阻碍的更严重。说明BC可以抑制L929的增殖。

上述图5实验证明：BC材料表面贴附的间皮细胞的数量随着培养时间的延长而增多，对间皮细胞有促进生长的作用；上述图6实验证明：BC材料表面的成纤维细胞随培养时间的延长而减少，对成纤维细胞有抑制生长的作用。

从而说明：本发明BC补片材料具有防粘连性，即具有以下特点：

（1）具有促进腹膜间皮细胞生长的生物学特性，有利于形成生物屏障作用；

（2）具有抑制成纤维细胞增殖与分化的作用，具有防组织粘连性作用。

如图7，所示为Absorptiontime即连续吸附时间下本发明BC实施例与传统PP上白蛋白/纤维蛋白的吸附量比值R（A/F）的对比图。

由于补片材料表面吸附白蛋白可以抑制血小板黏附和血栓形成，而吸附纤维蛋白原易于使血小板黏附材料表面，进而导致血小板变性聚集，继发凝血形成。

实验采用牛血清白蛋白（Albuminfrombovineserum,简称BSA）和纤维蛋白原（Fibrin，简称FN）在材料表面的吸附量之比R(A/F)来测试两种材料的防粘连性。图7上的R(A/F)的值越高，表示材料对血小板的粘附和聚集的抑制就越强，防粘连效果就越好。

图7上的数值经过计算可以得出本发明BC补片与传统PP补片两种材料表面对BSA（牛血清白蛋白）和FN（纤维蛋白原）的吸附量之比R(A/F)的对比数据如下表3：

表3本发明BC与传统PP补片上BSA与FN吸附量比值R(A/F)对比

Time(min)	10	30	60	120	360
						BC	1.556	1.595	1.761	1.717	1.672

PP

0.361

0.579

0.659

0.653

0.682

由上可见：总体上，BC表面的R(A/F)值高于PP表面。

以上实验证明：

本发明补片材料具有防粘连性，即具有以下特点：

（3）能够抑制纤维蛋白原的沉积；

（4）能够抑制血小板的聚集，防止凝血。

如图8，所示为吸光度OD反映的本发明BC实施例与传统PP体外动态凝血时间对比图。实验可证，BC补片的动态凝血时间比PP补片的动态凝血时间延长，说明BC的抗凝血性能提高，血液相容性较好，可阻止粘连的发生。本试验的结果与蛋白吸附试验中白蛋白吸附量较高和纤维蛋白原的吸附量较低而不易发生凝血的结果是一致的。

BC和PP体外的防粘连性实验小结：

（1）BC材料表面贴附的间皮细胞的数量随着培养时间的延长而增多，对间皮细胞有促进生长的作用；而表面的成纤维细胞随培养时间的延长而减少，对成纤维细胞有抑制生长的作用。

（2）BC材料对牛血清白蛋白和纤维蛋白原的吸附在2h左右达到平衡，而两种蛋白的吸附量之比R(A/F)为0.86～1.72，大于聚丙烯的0.65，可以抑制血小板粘附和血栓形成。

（3）BC材料具有较好的抗凝血性。

（四）BC和PP的动物腹壁缺损修补试验：

方法：取5只SD雄性大鼠（rat；rattusnorregicus的一个品系，又称：Sprague-Dawley大鼠），大鼠秤取体重后，以10%水合氯醛麻醉成功后，取平卧位，固定大鼠，常规皮肤准备，消毒，铺无菌巾。取旁正中切口，逐层切开腹壁各层结构至腹筋膜；切除大鼠中腹部肌肉组织1.5cm×1.5cm,予以结扎止血,逐层进腹，注意保护好肠管及其他腹腔内容物，同时保留腹壁表面皮肤及皮下组织。于中腹壁处置入2种补片材料：2cm×2cm，选用可吸收线，将置入的两种补片材料四角缝合固定于腹壁肌肉组织。选用可吸收线逐层缝合关腹。同时，取5只正常大鼠同时饲养，作为空白对照组。

评判标准：

◇术后将实验大鼠置于温度和湿度适宜的动物房内分笼饲养，观察动物的一般情况。分别于术后2w、4w、8w分批处死大鼠（w即英文week周时）；

◇观察补片表面粘连情况；

◇扫描、透射电镜检查表面间皮细胞存活和再生情况；

◇组织病理学检查补片与周围组织长合情况。

一般观察：修补术后实验组大鼠少许进食进水，第3天进食量基本恢复正常，并且该组大鼠均无感染，未出现明显术后并发症，无死亡。对该实验组大鼠体重变化进行统计学分析可知，与空白组大鼠比较，前两周体重变化有显著性差异（P<0.05），以后至八周时间内均无显著性差异（P>0.05）。BC组大鼠初始体重增长缓慢主要是由大鼠对手术过程中植入异物稍有不适引起的。

如图9，所示为本发明BC实施例修补手术8周粘连状况照相图。（图中深色四边形表示补片的大小和位置，内有“×”交叉的浅色直线框表示粘连面积和部位。）

BC组大鼠，术后体温正常，进食进水正常，全部无感染，未出现明显术后并发症。修补术后2w，4w，8w处死大鼠后使用剖腹探查、取材，可见缺损修补处腹壁结构理想；修补术后8w取材，可以观察到大鼠腹壁缺损处被修补的组织结构，BC表面覆盖生长着半透明的纤维组织，并且薄层组织中有微血管生长，与周围组织无明显粘连，同时观察到腹腔脏器表面光滑，未见明显炎症粘连反应，无瘢痕及肉芽组织生长。

切除腹壁肌肉组织后，腹壁缺损模型基本形成，饲养一月后，腹壁缺损大小稍有扩大。术后有一只大鼠并发皮下血肿，但术后3周可完全吸收。腹壁缺损动物模型制作成功后，腹腔内粘连较少发生，5只大鼠实验后的平均粘连比例为3.275%。

如图10，所示为传统PP修补手术8周粘连状况照相图。（图中深色四边形表示补片的大小和位置，内有“×”交叉的浅色直线框表示粘连面积和部位。）

同样腹壁缺损修补手术后大鼠进食进水量正常，该PP组大鼠修补手术后共有2只死亡，剖腹检查发现大鼠体内肠管与补片粘连致密引起肠道梗阻导致死亡。其余大鼠在规定时间时解剖取材，发现PP补片表面周围组织均有大面积粘连。修补术后2w，4w，8w分别取材，可以观察到大鼠腹壁缺损处PP材料表面周围组织均有大面积粘连，如图10所示。

如图11，所示为本发明BC实施例修补手术8周组织病理学显微照相图。

图中均匀稀疏分布深色小点主要是纤维细胞，密集分布深色区域是炎症细胞，浅色圈点是血细胞。

术后2w和8w后，BC表面主要是间皮细胞、脂肪细胞和纤维细胞组成。2w时间皮细胞层较薄，部分区域有炎症反应，有少许多核巨细胞和中性粒细胞浸润，炎症2－3级，纤维化2级。有新生的毛细血管。8w时，炎症反应大部分消失，间皮细胞层增厚，排列状态良好，连续性好，细胞与BC紧密结合。

因此，BC的生物相容性好，能促进间皮细胞的再生。

如图12，所示为传统PP修补手术8周组织病理学显微照相图。

图中均匀稀疏分布深色小点主要是纤维细胞，密集分布深色区域是炎症细胞，浅色圈点是血细胞。

同样腹壁缺损修补手术后2w和8w后，PP表面及周围组织主要是中性粒细胞、淋巴细胞和多核巨细胞组成，仅有少量间皮细胞形成，炎症级别较高，炎症2-3级，有大量细胞坏死，脓肿。8w时，炎症仍未消失，仍以中性粒细胞和淋巴细胞为主，并且有成纤维组织形成，未见典型的间皮细胞排列形态，有少量脂肪细胞，和脂肪细胞形成一层纤维结缔组织，属于高度分化的纤维粘连。因此，PP材料植入腹腔直接修补缺损会引起严重的炎症异物排斥反应，刺激周围成纤维组织生长，并有大量多核巨细胞和中性粒细胞，抗原反应明显。

图13为本发明BC实施例修补手术8周间皮细胞SEM电镜照相图。

扫描电镜下可观察到术后2w时BC表面间皮细胞比较稀疏，排列方向较差，表面有较多分泌物附着，部分区域裸露，4w是间皮细胞生长状态较好，表面分泌物减少，但仍较稀疏，部分区域裸露，8w时间皮生长致密，细胞间连接密集，排列方向性较好，同时有胶原纤维分布期间。

如图14，所示为传统PP修补手术8周间皮细胞SEM电镜照相图。

扫描电镜下可观察到PP植入的8w时间内，均没有发现典型的间皮细胞的新生，仅有部分区域少量状态较差的间皮生长，结构也较疏松，8w时，有纤维组织形成，胶原形成的瘢痕组织。

图15为本发明BC实施例修补手术8周细胞内部TEM电镜照相图。

图中纯黑色的是血细胞。透射电镜下观察到细胞表面存在大量多少不等的微绒毛，细胞浆内有丰富的内质网和线粒体，同时，细胞周围有微血管生长（图18）。

如图16，所示为传统PP修补手术8周细胞内部TEM电镜照相图。

透射电镜下观察到PP表明少量的间皮细胞状态较差，表面的微绒毛较小，细胞核肿大。

（五）腹壁缺损修补BC和PP的表面粘连性质对比：

补片表面粘连面积和粘连程度计算：

用BC和PP补片分别对3组、每组各5只大鼠进行腹壁缺损修补手术，术后2、4、8周分组进行表面粘连性质取样，采用网格法计算补片表面粘连面积（0—100%），剪去补片表面多余的粘连组织，将补片九等分后，每一小格再次九分，记录粘连面积并计算材料表面粘连比例；再参照KA.LeBlanc等学者的方法进行分析，以0-3的数字评分表示补片表面粘连程度。

表4材料表面的粘连比例

BC和PP表面的粘连比例如表4所示。在修补8w时间内，BC表面粘连比例最大的一组是8w取材组，为(8.50±0.49)%，而PP表面粘连比例最大的一组是4w取材组，为(41.53±0.35)%。同一时间点，BC和PP组的粘连比例相比有显著性差异，有统计学意义（P<0.05）。

表5材料表面的粘连程度

由于腹壁初始缺损面积有限，根据粘连程度分级标准，BC和PP表面的粘连程度均没有出现4级。总体上BC表面基本没有粘连或轻微粘连，而PP表面与脏器组织有较严重粘连。

小结：

（1）修补术后2w，4w，8w时，观察到BC组大鼠腹壁缺损处被修补的组织结构，BC表面覆盖生长着半透明的纤维组织，并且薄层组织中有微血管生长，并且与周围组织无明显粘连。同时观察到腹腔脏器表面光滑，未见明显炎症粘连反应，无瘢痕及肉芽组织生长。组织病理学和电镜观察发现，随着植入时间的延长，BC表面再生的间皮细胞数量增多，细胞间连接密集，排列方向性较好，状态转好，并且毛细血管丰富。而PP组大鼠腹壁修补处主要是中性粒细胞、淋巴细胞和多核巨细胞组成，仅有少量间皮细胞形成，炎症级别较高，粘连炎症，少量的间皮细胞状态较差。

（2）在修补8w时间内，BC表面粘连比例最大为(8.50±0.49)%，粘连程度为0～1级；而PP表面粘连比例最大为(41.53±0.35)%。粘连程度为2级。

（六）总结：

（1）BC具有有利于新生腹壁组织再生的三维网络纳米纤维结构。BC材料在拉伸速度为80mm/min时的抗张强度为27.87N/cm，弹性应变为54.8％，大于体内环境需要的临界值，符合所用要求。具有补片所应具有的力学性能。

（2）BC材料表面贴附的间皮细胞的数量随着培养时间的延长而增多，对间皮细胞有促进生长的作用；而表面的成纤维细胞随培养时间的延长而减少，对成纤维细胞有抑制生长的作用。

（3）BC对牛血清白蛋白和纤维蛋白原的吸附在2h左右达到平衡，而两种蛋白的吸附量之比为0.86～1.72，大于聚丙烯的0.65，可以抑制血小板粘附和血栓形成。

（4）BC与周围组织具有较好的组织相容性，腹腔粘连程度较低，并且能促进新生间皮细胞的再生。BC表面粘连比例最大为(8.50±0.49)%，粘连程度为0—1级；而PP表面粘连比例最大为(41.53±0.35)%。粘连程度为2级。

因此可见：本发明BC能够便利地制得合适的面积，在人体腹腔等腔体环境中具有良好的力学性能、更好的生物适应性、更好的防粘连性和抗微生物性。

Claims (3)

1.一种细菌纤维素生物补片，该生物补片由细菌纤维素膜即BC膜构成，其特征在于：所述细菌纤维素的聚合度在2000～20000范围，该纤维素结晶的晶型为I型，结晶指数为50～95％，晶胞参数中a＝0.815nm，b＝1.025nm,c＝0.832nm,β＝85度；I晶型中Iα型态的比率为50–85％；所述细菌纤维素膜干膜密度为1.08–2.35gcm^-3；而其持水润湿后，细菌纤维素的重量比率为0.14-15％，水份比率为85–99.86％(wt)；水份润湿后所述纤维素膜的厚度为：0.1～1.0mm，单根纤维素的直径为5～20nm，纤维素束的直径在10～80nm范围；水份润湿后所述细菌纤维素膜的最大应变εm:45.7～54.8％,最大断裂强度σm：8.24～11.940Mpa，最大抗拉强度Sm：20.73～27.865N/cm；水份润湿后，所述BC膜对白蛋白的吸附量与其对纤维蛋白原的吸附量之比为0.86～1.72；所述BC膜吸附白蛋白和纤维蛋白原的吸附平衡时间为1-2小时。

2.一种如权利要求1所述细菌纤维素生物补片的制造方法，是选择红螺菌目即Rhodospirillales下属的醋杆菌科即Acetobacteraceae下属的醋杆菌属即Acetobacter下属的木醋杆菌Acetobacterxylinum作为菌株，所述制造方法包括如下步骤：

A)振荡培养：将正常活化菌株接入灭菌冷却后的培养基中，在30℃±2℃下振荡培养24–36小时；

B)分散菌株：振荡培养之后，培养基置于摇床以转速为150～200rpm,，充分分散菌株；

C)静置培养：分散操作之后，培养基在30℃±2℃下恒温静置培养3～4周；

D)过滤取膜：静置培养后，再从培养基中取出BC生成膜，通过不锈钢丝网膜过滤得BC滤后膜；

E)清洗制膜：BC滤后膜浸泡在1–4％(wt)NaOH溶液中，在90–100℃沸水中加热1–3小时，去除菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，用稀盐酸中和，继而用去离子水反复冲洗至中性，制得所述BC膜成品；

所述步骤A的培养基营养液包括如下组份：(NH₂)₂SO₄：2～4g/L,MgSO₄：0.1～0.6g/L,KH₂PO₄：1～3g/L,NaAc：1～2g/L,蔗糖：10～40g/L，椰子水：400～600g/L；上述培养基营养液控制pH＝4.2、100℃下灭菌15min。

3.如权利要求2所述细菌纤维素生物补片的制造方法，其特征在于：所述步骤A之前还包括如下步骤A0)菌株活化：将冷冻保藏菌株，在盛有活化营养液培养基中进行活化，然后进行后续培养；所述步骤E中清洗操作后，还包括干燥操作。