CN109912830A - 多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法 - Google Patents
多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109912830A CN109912830A CN201910177835.7A CN201910177835A CN109912830A CN 109912830 A CN109912830 A CN 109912830A CN 201910177835 A CN201910177835 A CN 201910177835A CN 109912830 A CN109912830 A CN 109912830A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dopamine
- bacterial cellulose
- gel
- cellulose gel
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
本发明属于生物材料制备领域，尤其涉及多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法。细菌纤维素(BC)材料具有优异的力学性能，如高强度，高柔韧性，高持水性等。而且在体内不降解，但是它在体内诱导组织生长的能力很差，而且难以加工。针对以上问题，本发明提供的多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法将细菌纤维素制备成为凝胶状态，然后通过材料的表面改性，涂覆一层多巴胺(PDA)膜，提高凝胶的诱导组织生长能力。
Description
技术领域
本发明属于生物材料制备领域，尤其涉及多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法。
背景技术
随着生活水平的提高，人们越来越注重对于外在美的追求，注射美容术因为手术危险性低、并发症少，恢复时间短而备受推崇。注射美容术是将可注射材料直接注射于人体特定部位，使人体的容貌或体形有所改观，起到增进容貌美或同时改善功能的方法。注射美容材料多种多样，有神经肌肉毒素，既肉毒素；有软组织填充材料，如胶原蛋白、玻尿酸、自体细胞等；还有磷脂酰胆碱、生长激素、富血小板血浆等作用机制各异的材料。以上材料在体内会发生降解，国外最长是17月，国内最长是8个月，之后要再进行注射，这样费用会造成患者的痛苦和经济负担。
细菌纤维素(BC)材料具有优异的力学性能，如高强度，高柔韧性，高持水性等。而且在体内不降解，但是它在体内诱导组织生长的能力很差，而且难以加工。针对以上问题，本发明将细菌纤维素制备成为凝胶状态，然后通过材料的表面改性，涂覆一层多巴胺(PDA)膜，提高凝胶的诱导组织生长能力。
发明内容
本发明提供一种多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)取100g冻干的细菌纤维素，用高速万能粉碎机将干态细菌纤维素粉碎。
2)将上述细菌纤维素粉末中加入NaOH、尿素和水，置于冰箱静置，形成透明均一凝胶状体系。
3)将上述步骤2)获得的凝胶状体系，离心除去气泡，得到透明的细菌纤维素溶液。
4)将环氧氯丙烷(ECH)作为交联剂加入到上述细菌纤维素溶液中，室温下搅拌后，在70℃下反应得到细菌纤维素凝胶。
5)将上述细菌纤维素凝胶在水中透析。
6)取0.5ml tir-HCl(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)加入50ml去离子水。
7)取30ml上述体系(6)，加入50mg多巴胺，30s变粉红色。
8)在步骤7)获得的产物中放入透析好的细菌纤维素凝胶(4)，搅拌，得到多巴胺/细菌纤维素凝胶。
本发明提供的制备方法制备的多巴胺/细菌纤维素凝胶在体内不降解，可以保持长期的填充效果。与其他类似专利相比，其他专利采用的是细菌纤维素浆料(打碎后的分散体系)，本发明提供的是透明均一的体系，可以保证多巴胺均匀分散在凝胶中。本发明提供的多巴胺/细菌纤维素凝胶与细胞共培养时，细胞活力高。
附图说明
图1为多巴胺和细菌纤维素交联的示意图；
图2为本发明一实施例制备得到的多巴胺/细菌纤维素凝胶与细胞共培养共聚焦显微照片；
图3为本发明一实施例制备得到的多巴胺/细菌纤维素凝胶与细胞共培养随时间增长的存活率测试结果图。
具体实施方式
本发明实施例中所使用的细菌纤维素与中国专利，申请号为201410089918.8中公开的细菌纤维素基本相同，均是由醋酸杆菌属中的木醋杆菌(Acetobacter xylinum)代谢产物制得，化学成分为吡喃型葡萄糖单体(β－D－葡萄糖)通过β－1，4－糖苷键连接而形成的一种无分支、大分子支链聚合物，由独特的丝状纤维组成，纤维直径在3～4nm之间，每一丝状纤维带宽度可达30～100nm，并且纯度可达达到99％，不含半纤维素、木质素、果胶和其他细胞壁成份。
具体实施例涉及的细胞和试剂信息如下：
大鼠成纤维细胞系(RFL-6)购于威斯腾生物医药科技，DMEM培养基购于美国Gibco公司，胰蛋白酶购于中国碧云天公司，胎牛血清购于美国Gibco公司，PBS购于北京中杉公司，青霉素-链霉素溶液(100X)购于中国碧云天公司，DMSO购于美国Amresco公司，CCK8试剂盒购于美国Sigma公司。
实施例一
一、长效型多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备
包括以下步骤：
1)取100g冻干的细菌纤维素，先用高速万能粉碎机将干态细菌纤维素粉碎，粉碎机搅拌速度为8000rmp。
2)将上述细菌纤维素粉末中加入NaOH、尿素和水，重量比例为BC:NaOH:尿素:水＝1：10：12:77，置于-24℃冰箱中，24小时，形成透明均一凝胶状体系.
3)将上述步骤2)获得的凝胶状体系，在-4℃,4000rpm转速下离心20min出去气泡，得到透明的细菌纤维素溶液。
4)将3ml环氧氯丙烷(ECH)作为交联剂加入到上述细菌纤维素溶液中，室温下搅拌20min后，在70℃下反应6h得到细菌纤维素凝胶。
5)上述细菌纤维素凝胶在在超纯水中，透析4天，每12小时换水一次。
6)取0.5ml tir-HCl(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)加入50ml去离子水。测ph＝8.47。
7)取30ml上述体系(6)，加入55mg多巴胺，30s变粉红色。
8)在步骤7)获得的产物中放入透析好的细菌纤维素凝胶(4)，搅拌20min，得到多巴胺/细菌纤维素凝胶.
二、显微观察制备得到的多巴胺/细菌纤维素凝胶与细胞共培养的情况
(一)细胞培养
RFL-6细胞培养于含青、链霉素(各1U/mL，0.1mg/mL)10％FBS的DMEM培养基中，放置在37℃、5％CO2、相对湿度为100％的细胞培养箱中培养，细胞贴壁生长，经过传代培养用于后续实验。
(二)凝胶溶液配制
将凝胶推出注射器100ul至含有10mL培养基的离心管中进行溶解，配制成浓度为1％的母液，使用时进行稀释。
(三)细胞与凝胶共培养
(四)染色
(1)将生长状态良好的RFL-6细胞接种于细胞培养板，置于培养箱中培养(37℃，5％CO2)。
(2)待细胞完全贴壁，正常组常规培养，实验分组分别加入0.05％的凝胶材料作用于细胞48h。
(3)消化收集细胞，将105～106个细胞悬浮于1mL培养基中，再加入10μL Heochest33342染液，混匀，37℃孵育5-15min。
(4)细胞于4℃，500-1000r/min离心5min弃去上清液。
(5)加入1mL Buffer A工作液(用双蒸水将10×Buffer A稀释10倍)悬浮细胞，加入5μL PI染液，室温避光放置5-15min后混匀；
(6)共聚焦显微镜观察拍照：Heochest 33342用氪激光激发的紫外光，激发波长为352nm，发射波长为400～500nm，产生蓝色荧光；PI利用氩离子激光激发荧光，激发光波长为488nm，发射光波长大于630nm，产生红色荧光。
显微镜拍照的图片如图2所示，。
三、存活率实验
(1)取消化后的细胞，计数调整细胞浓度至1×105/mL。
(2)分别接种于96孔板中，每孔100μL，每组细胞设3个复孔。待细胞完全贴壁后正常细胞组常规培养，实验组分别加入0.05％的凝胶。
(3)将96孔板移入培养箱中培养(37℃，5％CO2)，培养24h、48h、72h后进行CCK-8检测。
(4)每孔加入10μL CCK-8溶液(注意不要产生气泡)，于培养箱内孵育1-4h。
(5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度值。
(6)同时设置空白孔(培养基、CCK)，对照孔(未经处理的细胞、培养基、CCK)。
细胞活力(％)＝[A(实验组)-A(空白组)]/[A(对照组)-A(空白组)]×100％
细胞抑制率(％)＝[A(对照组)-A(实验组)]/A(对照组)＝1-细胞活力
A(实验组)：具有经过处理的细胞、CCK溶液的吸光度值
A(空白组)：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度值
A(对照组)：具有未经过处理的细胞、CCK溶液的吸光度值。
测试结果如图3所示，说明本发明提供的多巴胺/细菌纤维素凝胶诱导细胞生长的能力很好。
Claims (8)
1.一种多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取100g冻干的细菌纤维素，用高速万能粉碎机将干态细菌纤维素粉碎。
2)将上述细菌纤维素粉末中加入NaOH、尿素和水，置于冰箱静置，形成透明均一凝胶状体系。
3)将上述步骤2)获得的凝胶状体系，离心除去气泡，得到透明的细菌纤维素溶液。
4)将环氧氯丙烷(ECH)作为交联剂加入到上述细菌纤维素溶液中，室温下搅拌后，在70℃下反应得到细菌纤维素凝胶。
5)将上述细菌纤维素凝胶在水中透析。
6)取0.5ml tir-HCl(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)加入50ml去离子水。
7)取30ml上述体系(6)，加入50mg多巴胺，30s变粉红色。
8)在步骤7)获得的产物中放入透析好的细菌纤维素凝胶(4)，搅拌，得到多巴胺/细菌纤维素凝胶。
2.如权利要求1所述的一种多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中细菌纤维素:NaOH:尿素:水(重量比)＝1：10：12:77，冰箱温度设置为-24℃，静置时间为24小时。
3.如权利要求1或2所述的一种多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中离心转速为4000rpm，在-4℃下离心20min。
4.如权利要求1或2所述的一种多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中环氧氯丙烷的用量为3ml，反应时间为6h。
5.如权利要求3所述的一种多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中环氧氯丙烷的用量为3ml，反应时间为6h。
6.如权利要求1或2所述的一种多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中的透析在超纯水中进行，透析时间为4天，每12小时换水一次。
7.如权利要求3所述的一种多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中的透析在超纯水中进行，透析时间为4天，每12小时换水一次。
8.如权利要求4所述的一种多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中的透析在超纯水中进行，透析时间为4天，每12小时换水一次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910177835.7A CN109912830A (zh) | 2019-03-10 | 2019-03-10 | 多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910177835.7A CN109912830A (zh) | 2019-03-10 | 2019-03-10 | 多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109912830A true CN109912830A (zh) | 2019-06-21 |
Family
ID=66963992
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910177835.7A Pending CN109912830A (zh) | 2019-03-10 | 2019-03-10 | 多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109912830A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115721767A (zh) * | 2022-12-12 | 2023-03-03 | 广东省人民医院 | 一种抗菌促愈合富孔医用敷料及其制备方法 |
| CN116942915A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-10-27 | 山东大学齐鲁医院 | 骨细胞凝胶培养方法及其在骨包虫病骨缺损中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101445609A (zh) * | 2008-11-14 | 2009-06-03 | 武汉大学 | 一种吸水性纤维素水凝胶及其制备方法 |
| CN103861146A (zh) * | 2014-03-13 | 2014-06-18 | 海南光宇生物科技有限公司 | 一种细菌纤维素生物补片及其制造方法 |
| CN106076283A (zh) * | 2016-06-11 | 2016-11-09 | 华南理工大学 | 一种纳米纤维素/聚多巴胺水凝胶吸附剂及其制备方法与应用 |
| CN108359056A (zh) * | 2018-03-06 | 2018-08-03 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种纤维素-多巴胺-聚合物复合材料的自愈合水凝胶及其制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-03-10 CN CN201910177835.7A patent/CN109912830A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101445609A (zh) * | 2008-11-14 | 2009-06-03 | 武汉大学 | 一种吸水性纤维素水凝胶及其制备方法 |
| CN103861146A (zh) * | 2014-03-13 | 2014-06-18 | 海南光宇生物科技有限公司 | 一种细菌纤维素生物补片及其制造方法 |
| CN106076283A (zh) * | 2016-06-11 | 2016-11-09 | 华南理工大学 | 一种纳米纤维素/聚多巴胺水凝胶吸附剂及其制备方法与应用 |
| CN108359056A (zh) * | 2018-03-06 | 2018-08-03 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种纤维素-多巴胺-聚合物复合材料的自愈合水凝胶及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CHUNYU CHANG ET AL.: ""Structure and properties of hydrogels prepared from cellulose in NaOH/urea aqueous solutions"", 《CARBOHYDRATE POLYMERS》 * |
| YINGYING LIU ET AL.: ""A physically crosslinked polydopamine/nanocellulose hydrogel as potential versatile vehicles for drug delivery and wound healing"", 《CARBOHYDRATE POLYMERS》 * |
| 韩璐: ""仿贻贝多功能水凝胶及其生物医学应用的研究"", 《中国优秀博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115721767A (zh) * | 2022-12-12 | 2023-03-03 | 广东省人民医院 | 一种抗菌促愈合富孔医用敷料及其制备方法 |
| CN115721767B (zh) * | 2022-12-12 | 2024-03-12 | 广东省人民医院 | 一种抗菌促愈合富孔医用敷料及其制备方法 |
| CN116942915A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-10-27 | 山东大学齐鲁医院 | 骨细胞凝胶培养方法及其在骨包虫病骨缺损中的应用 |
| CN116942915B (zh) * | 2023-08-09 | 2024-02-13 | 山东大学齐鲁医院 | 骨细胞凝胶培养方法及其在骨包虫病骨缺损中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Akins et al. | Cardiac organogenesis in vitro: reestablishment of three-dimensional tissue architecture by dissociated neonatal rat ventricular cells | |
| Black III et al. | Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel–based engineered myocardium via gap junction modification | |
| Radisic et al. | Cardiac tissue engineering using perfusion bioreactor systems | |
| Kolan et al. | Bioprinting with human stem cell-laden alginate-gelatin bioink and bioactive glass for tissue engineering | |
| Yadav et al. | In vitro chondrogenesis with lysozyme susceptible bacterial cellulose as a scaffold | |
| CN105254917B (zh) | 一种利用海藻酸钠水凝胶制备细胞膜片的方法 | |
| Song et al. | Three‐dimensional fabrication of engineered bone with human bio‐derived bone scaffolds in a rotating wall vessel bioreactor | |
| CN102858380A (zh) | 胰岛细胞片、制造方法及其利用方法 | |
| CN105749350B (zh) | 一种心肌补片及其制备方法 | |
| CN109912830A (zh) | 多巴胺/细菌纤维素凝胶的制备方法 | |
| Wang et al. | Biomimetic poly (γ-glutamic acid) hydrogels based on iron (III) ligand coordination for cartilage tissue engineering | |
| CN101624473B (zh) | 一种规模化培养肝细胞的方法 | |
| CN107475179A (zh) | 一种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法 | |
| Song et al. | Fabrication and detection of tissue‐engineered bones with bio‐derived scaffolds in a rotating bioreactor | |
| Takahama et al. | Biofabrication of a hyaluronan/bacterial cellulose composite nanofibril by secretion from engineered gluconacetobacter | |
| Ergene et al. | 3D cellular alignment and biomimetic mechanical stimulation enhance human adipose-derived stem cell myogenesis | |
| Sylvester et al. | Cell-Laden bioactive poly (ethylene glycol) hydrogels for studying mesenchymal stem cell behavior in myocardial infarct-stiffness microenvironments | |
| JP2009538854A (ja) | 単離された天然に等しいコラーゲン | |
| CN107185047A (zh) | 组织工程化软骨移植物及其制备方法 | |
| CN104826162B (zh) | 抗肝细胞衰老的pcl‑pla组织工程复合支架的制备和应用 | |
| Kimura et al. | Covalent Cell‐Loading Injectable Hydrogel Scaffold Significantly Promotes Tissue Regeneration In Vivo Compared with a Conventional Physical Cell‐Loading Hydrogel Scaffold | |
| US6645488B2 (en) | Microencapsulated pheochromocyte of ox adrenal medulla as medicine for curing pain | |
| CN106512088B (zh) | 磷脂-糖胺聚糖仿生细胞外基质纳米膜及其制备方法与应用 | |
| Guo et al. | Three‐Dimensional Geometry of Honeycomb Collagen Promotes Higher Beating Rate of Myocardial Cells in Culture | |
| Hou et al. | Excellent effect of three-dimensional culture condition on pancreatic islets |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190621 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |