CN103849657A - 一种生物柴油油脂的生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物柴油油脂的生产方法，按如下步骤：（1）将微生物提油后剩余物质用细胞溶解酶酶解，得到微生物提油后剩余物质酶解液（2）将水与上述酶解液按5~3:1的质量比，并加入硫酸镁、氯化铁和磷酸二氢钠，配制异养微生物发酵培养基；（3）将产油异养微生物接种于步骤（2）的发酵培养基中三阶段发酵；将产油自养微生物经无菌操作接种于灭菌f/2培养基中三阶段培养；（4）收集步骤（3）中产油微生物生物质，先预处理，再按正己烷、乙醇和预处理后的微生物生物质体积比1：1：1~3，提取油脂，有机相经30~50℃，20~80转/分钟旋转蒸发，去溶剂，去杂，干燥，得到微生物油脂。本发明提高了产油效率，降低了生产成本，环境友好，节约用地，保护环境。
Description
技术领域
本发明涉及化工技术领域。
背景技术
产自微生物的可再生生物能源可作为化石能源的有益补充和替代品之一，但目前还没有充分发挥其潜力。微生物油脂，又称单细胞油脂，是制备生物柴油的良好原料。微生物油脂作为能源原料具有以下优势：保障能源安全和减少对储备石化能源的依赖。与陆生植物相比，利用微生物生产生物能源具有以下优势：首先，微生物生长繁殖快、培养所需占地面积少，同时微生物培养可以利用滩涂地、荒废地等非耕地，因此利用微生物生产生物能源不会导致世界粮食供应问题。再者，微生物生长过程能利用废水中的N、P等物质，可以实现废水的净化，微生物生物能源还是可再生能源。利用微生物培养生产生物能源不受季节和地点的限制。微生物还能将一些废弃物转化成制备生物能源的原料。微生物油脂制备的生物柴油与其他油料作物制备的生物柴油及石油基柴油在性能方面差异不大。利用微生物油脂这一新的油脂资源，可实现能源和环境的和谐而可持续发展。
微生物提油后剩余物质含有大量的碳水化合物，蛋白质等物质，因此在微生物制备高品质生物柴油生产系统中，若对以上提油后剩余物质不加以利用将造成微生物提油后剩余物质高价值多元组成的浪费和环境污染。实际上，微生物提油后剩余物质是重要的生物质资源。通过合适的化学、生物等方法可以将微生物提油后剩余物质转化成CO、沼气、乙醇、生物柴油、生物油等能源产品以及蛋白饲料、色素、多糖等资源产品。
微生物生物质能源的研究始于20世纪50年代。Golueke等人于1957年发表了第一篇关于微藻厌氧发酵制备沼气方面研究工作的论文。在随后的1960年里，他们成功开发出利用开放式大池培养微藻处理废水与微藻厌氧发酵制备沼气的集成系统。20世纪70年代中东战争等因素导致国际原油供应紧张。美国、日本、澳大利亚等西方国家为了减少对进口原油的依赖，大力资助微生物（微藻）生物能源项目。20世纪70年代至90年代之间，美国能源部可再生能源实验室启动了一项名为“水生生物种计划”（Aquatic Species Program, ASP），旨在开发微藻生物能源。经过多年的努力，该计划取得了一系列研究成果，收集了3000株藻种，从中筛选出300株有培养潜力的藻种，它们大都属于绿藻和硅藻。虽然利用微藻生产生物能源工艺在当时是可行的，但生产生物能源的成本比当时石油价格高出好几十个百分点。1995年，美国能源部终止了对该计划的资助，微藻生物能源的研究不再继续。21世纪初，世界经济的快速发展，石油枯竭和价格上涨，因化石能源大量消耗导致的全球气候变暖等环境问题加剧，全球再次掀起可再生的微生物生物能源研究热潮。2009年美国科学家在藻类生物能源路线图中明确提出了藻类（大藻和微藻）生产生物质能源的工艺路线，为往后微生物生物能源的发展指明了方向。我国微生物生物能源起步较晚，尤其是微生物生物柴油项目。目前微生物生产生物柴油尚未实现工业化生产，主要是成本偏高。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种利用微生物提油后剩余物质生产微生物油脂的方法，该方法酶解效率高、副产物少、高效产油、微生物油脂生产成本大大降低、反应条件温和、生产过程绿色环保、操作过程简单。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
一种生物柴油油脂的生产方法，其特征在于按以下步骤。
（1）将微生物提油后剩余物质（干物质）与细胞溶解酶以10~100∶1的质量比混匀，置于反应器中，磁力搅拌下反应，温度30~50℃，初始pH 5.0~7.0，搅拌转速50~300转/分钟，时间3~6小时，反应结束后105℃处理10~30分钟，得到微生物提油后剩余物质酶解液。
（2）将水与微生物提油后剩余物质酶解液按5~3:1的质量比，并加入25~100mg/L的硫酸镁，50~150mg/L的氯化铁和0~75mg/L的磷酸二氢钠，经115~121℃,15~30分钟灭菌，作为异养微生物发酵培养基，用于发酵。
（3）将产油异养微生物接种于步骤（2）的异养微生物发酵培养基中，置于发酵罐中生长，发酵过程中温度30~40℃、采用基于pH调控策略的三阶段培养法：第一阶段pH为5.0~6.0，第二阶段pH为6.0~7.0，第三阶段pH为7.0~8.0，三阶段时间相同、通气量0.1~1.0vvm、总发酵时间48~120小时；将产油自养微生物经无菌操作接种于灭菌f/2培养基，置于密闭光生物反应器中培养，培养温度25℃~30℃、采用基于pH调控策略的三阶段培养法：第一阶段pH为6.0~7.0，第二阶段pH为7.0~8.0，第三阶段pH为8.0~9.0，三阶段时间相同、自然光或人工光光照强度500~5000lx、光暗周期12/12、总培养时间7~15天。发酵罐的进出气口与光生物反应器的进出气口通过PVC塑料管相连。
（4）收集步骤（3）中的自养和异养产油微生物生物质，用水冲洗。经细胞溶解酶预处理：产油微生物生物质（干物质）与细胞溶解酶以10~100∶1的质量比混匀，30~50℃，初始pH 5.0~7.0，搅拌转速50~300转/分钟，3~6小时。按正己烷、乙醇和预处理后的微生物生物质体积比为1：1：1~3，用正己烷和乙醇提取油脂，有机相经温度30~50℃，转速20~80转/分钟旋转蒸发，去除有机溶剂后，去杂，干燥，即得到微生物油脂。
本发明步骤（1）和（4）所述的细胞溶解酶预处理的最优方案是45℃，初始pH6.0，搅拌转速150转/分钟，时间4小时。
本发明细胞溶解酶的主要作用于微生物细胞壁葡聚糖等的多聚β-1,3-糖苷键，细胞溶解酶对细胞壁碎片等微生物提油后主要剩余物质定向酶解成主要含糖和蛋白质的酶解液，且酶解条件温和，不产生或较少产生抑制剂；酶解效率高，酶解过程除酶外无其他物质加入，而酶本身是蛋白质，灭活后可被微生物利用，因此酶解液无需其他预处理，可直接用于微生物培养产油，免除了酶解液预处理成本。
本发明利用高效液相色谱仪检测微生物提油后剩余物质酶解液中糖含量，用凯氏定氮仪测定微生物提油后剩余物质酶解液中蛋白质含量，用正己烷和乙醇提取油脂，烘干后用电子天平测油脂重量。
本发明微生物油脂的生产是将微生物提油后剩余物质通过生物法转化成油脂，串联自养和异养产油微生物，提高产油效率，降低生产成本，环境友好，此外可以节约用地，保护环境，提供一种新的微生物产油模式，是一种满足工业化需求的新方法。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
以下实施例所用到的富含油脂小球藻（Chlorella vulgaris），可从中国典型微生物保藏中心（武汉）获得，其保藏编号为CCTCC M209256；所用到的产油自养微生物为富含油脂微拟球藻（Nannochloropsis oculata）和富含油脂原核小球藻（Chlorella protothecoides ），可从美国德州大学UTEX藻种库获得，其保藏编号分别为LB2164和256；所用到的产油异养微生物为富含油脂弯曲隐球酵母（Cryptococcus curvatus）和富含油脂粘红酵母（Rhodotorula glutinis），可从德国DSMZ菌种保藏中心获得，其保藏编号分别为DSMZ 70022和10134；所用到的产油异养微生物为富含油脂高山被孢霉（Mortierella alpina），可从中国工业微生物菌种保藏中心获得，其保藏编号为CICC 2258。
以下实施例所用的细胞溶解酶为购自生化制剂公司Sigma的市售商品酶L2524-25KU或L2524-10KU或L4025-25KU或L4025-100KU。
实施例1。
将富含油脂小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌f/2培养基，置于光照培养箱中培养，培养温度25℃，光照强度2000lx，培养10天。将富含油脂弯曲隐球酵母菌种经无菌操作接种于灭菌摇瓶培养液中（mg/L）：酵母抽提物 3000，麦芽抽提物 3000，蛋白胨 5000和葡萄糖 20000，置于摇床中培养，转速200转/分钟，培养温度35℃，培养72小时。分别将在光照培养箱中生长的50g富含油脂小球藻和摇床中发酵的50g富含油脂弯曲隐球酵母，离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得生物质，用蒸馏水冲洗5次。经细胞溶解酶L2524-25KU预处理：产油微生物生物质（干物质）与细胞溶解酶L2524-25KU以100∶1的质量比混匀，45℃，初始pH 6.0，搅拌转速150转/分钟，4小时。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的微生物生物质浆体积比为1：1：1，水相经离心（15000转/分钟，10分钟）后，用蒸馏水冲洗5次，冷冻干燥12小时后得到微生物提油后剩余物质。
将微生物提油后剩余物质与细胞溶解酶L2524-25KU以100∶1的质量比混匀，置于反应器中，磁力搅拌下反应，温度45℃，初始pH 6.0，搅拌转速150转/分钟，时间4小时，反应结束后105℃处理15分钟，得到微生物提油后剩余物质酶解液，检测其中糖和蛋白质含量。
将微生物提油后剩余物质酶解液作为富含油脂弯曲隐球酵母的发酵液：蒸馏水与酶解液之比为4:1，并加入50mg/L的硫酸镁，100mg/L的氯化铁和50mg/L的磷酸二氢钠，置于5L发酵罐中。发酵过程中温度35℃、发酵时间72小时，通气量0.2vvm。将富含油脂小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌f/2培养基，置于密闭圆柱状反应器生长，培养温度30℃，人工光光照强度3000lx，光暗周期12/12，培养周期为9天。发酵罐的进出气口与光生物反应器的进出气口通过PVC塑料管相连。富含油脂弯曲隐球酵母发酵结束后接入下一批继续发酵，富含油脂小球藻培养结束后进行下一批培养；采用基于微生物油脂合成规律的三阶段培养法，富含油脂弯曲隐球酵母和小球藻前、中、后三阶段（三阶段具有相同的培养或发酵时间），pH值分别为：6.0，6.5和8.0；6.5，7.0和9.0，培养结束后，离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得微生物生物质，用水冲洗3次。经细胞溶解酶预处理：产油微生物（干物质）与细胞溶解酶L2524-25KU以100∶1的质量比混匀，45℃，初始pH 6.0，搅拌转速150转/分钟，4小时。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的微生物生物质浆体积比为1：1：1，其中有机相经温度35℃，转速20转/分钟旋转蒸发去除有机溶剂后，去杂，干燥，即得到微生物油脂。结果见表1。
实施例2。
将富含油脂原核小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌f/2培养基，置于光照培养箱中培养，培养温度28℃，光照强度5000lx，培养10天。将富含油脂粘红酵母菌种经无菌操作接种于灭菌摇瓶培养液中：土豆浸出液 1000mL(200g土豆去皮，切小块后加水煮沸1小时，5层纱布过滤，定容至1000mL)和葡萄糖 20000 mg/L，置于摇床中培养，转速150转/分钟，培养温度37℃，培养72小时。分别将在光照培养箱中生长的50g富含油脂原核小球藻和在摇床中发酵的50g富含油脂粘红酵母，离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得生物质，用蒸馏水冲洗5次。经细胞溶解酶L2524-10KU预处理：产油微生物生物质（干物质）与细胞溶解酶L2524-10KU以500∶1的质量比混匀，45℃，初始pH 6.0，搅拌转速150转/分钟，4小时。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的微生物生物质浆体积比为1：1：2，水相经离心（15000转/分钟，10分钟）后，用蒸馏水冲洗5次，冷冻干燥12小时后得到微生物提油后剩余物质。
将微生物提油后剩余物质与细胞溶解酶L2524-10KU以500∶1的质量比混匀，置于反应器中，磁力搅拌下反应，温度45℃，初始pH 6.0，搅拌转速150转/分钟，时间4小时，反应结束后105℃处理15分钟，得到微生物提油后剩余物质酶解液，检测其中糖和蛋白质含量。
将微生物提油后剩余物质酶解液作为富含油脂粘红酵母的发酵液：自来水与酶解液之比为4:1，并加入60mg/L的硫酸镁和80mg/L的氯化铁置于5L发酵罐中。发酵过程中温度37℃、发酵时间72小时，通气量0.2vvm。将富含油脂原核小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌f/2培养基，置于密闭圆柱状反应器生长，培养温度30℃，人工光光照强度3000lx，光暗周期12/12，培养周期为9天。发酵罐的进出气口与光生物反应器的进出气口通过PVC塑料管相连。富含油脂粘红酵母发酵结束后接入下一批继续发酵，富含油脂原核小球藻培养结束后进行下一批培养；采用基于微生物油脂合成规律的三阶段培养法，富含油脂粘红酵母和原核小球藻前、中、后三阶段（三阶段具有相同的培养或发酵时间），pH值分别为：5.5，6.0和7.5；6.5，7.0和8.5，培养结束后；离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得微生物生物质，用水冲洗3次。经细胞溶解酶L2524-10KU预处理：产油微生物生物质（干物质）与细胞溶解酶L2524-10KU以500∶1的质量比混匀，45℃，初始pH 6.0，搅拌转速150转/分钟，4小时。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的微生物生物质浆体积比为1：1：2，其中有机相经温度35℃，转速20转/分钟旋转蒸发去除有机溶剂后，去杂，干燥，即得到微生物油脂。结果见表1。
实施例3。
将富含油脂微拟球藻藻种经无菌操作接种于灭菌f/2培养基，置于光照培养箱中培养，培养温度25℃，光照强度2000lx，培养10天。将富含油脂高山被孢霉菌种经无菌操作接种于灭菌摇瓶培养液中（mg/L）：酵母抽提物 10000，蛋白胨 10000和葡萄糖 30000，置于摇床中培养，转速180转/分钟，培养温度37℃，培养72小时。分别将在光照培养箱中生长的50g富含油脂微拟球藻和摇床中发酵的50g富含油脂高山被孢霉，离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得生物质，用蒸馏水冲洗5次。经细胞溶解酶L4025-100KU预处理：产油微生物生物质（干物质）与细胞溶解酶L4025-100KU以50∶1的质量比混匀，45℃，初始pH 6.0，搅拌转速150转/分钟，4小时。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的微生物生物质浆体积比为1：1：1，水相经离心（15000转/分钟，10分钟）后，用蒸馏水冲洗5次，冷冻干燥12小时后得到微生物提油后剩余物质。
将微生物提油后剩余物质与细胞溶解酶L4025-100KU以50∶1的质量比混匀，置于反应器中，磁力搅拌下反应，温度45℃，初始pH 6.0，搅拌转速150转/分钟，时间4小时，反应结束后105℃处理15分钟，得到微生物提油后剩余物质酶解液，检测其中糖和蛋白质含量。
将酶解液作为富含油脂粘红酵母的发酵液：蒸馏水与酶解液之比为3:1，并加入75mg/L的硫酸镁和100mg/L的氯化铁置于5L发酵罐中。发酵温度37℃、发酵时间72小时，通气量0.2vvm。将富含油脂微拟球藻藻种经无菌操作接种于灭菌f/2培养基，置于密闭圆柱状反应器生长，培养温度25℃，人工光光照强度2000lx，光暗周期12/12，培养周期为9天。发酵罐的进出气口与光生物反应器的进出气口通过PVC塑料管相连。富含油脂粘红酵母发酵结束后接入下一批继续发酵，富含油脂原核小球藻培养结束后进行下一批培养；采用基于微生物油脂合成规律的三阶段培养法，富含油脂粘红酵母和微拟球藻前、中、后三阶段（三阶段具有相同的培养或发酵时间），pH值分别为：5.0，6.0和8.0；6.0，7.0和9.0，培养结束后，离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得微生物生物质，用水冲洗3次。经细胞溶解酶L4025-100KU预处理：产油微生物（干物质）与细胞溶解酶L4025-100KU以50∶1的质量比混匀，45℃，初始pH 6.0，搅拌转速150转/分钟，4小时。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的微生物生物质浆体积比为1：1：1，其中有机相经温度35℃，转速20转/分钟旋转蒸发去除有机溶剂后，去杂，干燥，即得到微生物油脂。结果见表1。
对比例1。
将富含油脂小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌f/2培养基，置于光照培养箱中培养，初始pH 7.0，培养温度25℃，光照强度2000lx，培养10天。分析油脂产率，结果见表1。
对比例2。
将富含油脂微拟球藻藻种经无菌操作接种于灭菌f/2培养基，置于光照培养箱中培养，初始pH 7.0，培养温度25℃，光照强度2000lx, 通气量0.5vvm，CO2浓度为2%，培养10天。分析油脂产率，结果见表1。
对比例3。
将富含油脂粘红酵母菌种经无菌操作接种于摇瓶中：土豆浸出液 1000mL(200g土豆去皮，切小块后加水煮沸1小时，5层纱布过滤，定容至1000mL)和葡萄糖 15000 mg/L，置于摇床中培养，初始pH 6.0，转速150转/分钟，培养温度37℃，培养72小时。分析油脂产率，结果见表1。
对比例4。
将富含油脂高山被孢霉菌种经无菌操作接种于摇瓶中（mg/L）：酵母抽提物 10000，蛋白胨 10000和葡萄糖 15000，置于摇床中培养，初始pH 6.0，转速180转/分钟，培养温度37℃，培养72小时。分析油脂产率，结果见表1。
表1 实施例及对比结果
Claims (2)
1.一种生物柴油油脂的生产方法，其特征是按如下步骤：
（1）将微生物提油后剩余物质与细胞溶解酶以10~100∶1的质量比混匀，置于反应器中，磁力搅拌下反应，温度30~50℃，初始pH 5.0~7.0，搅拌转速50~300转/分钟，时间3~6小时，反应结束后105℃处理10~30分钟，得到微生物提油后剩余物质酶解液；
（2）将水与微生物提油后剩余物质酶解液按5~3:1的质量比，并加入25~100mg/L的硫酸镁，50~150mg/L的氯化铁和0~75mg/L的磷酸二氢钠，经115~121℃,15~30分钟灭菌，作为异养微生物发酵培养基，用于发酵；
（3）将产油异养微生物接种于步骤（2）的异养微生物发酵培养基中，置于发酵罐中生长，发酵过程中温度30~40℃、采用基于pH调控策略的三阶段培养法：第一阶段pH为5.0~6.0，第二阶段pH为6.0~7.0，第三阶段pH为7.0~8.0，三阶段时间相同、通气量0.1~1.0vvm、总发酵时间48~120小时；将产油自养微生物经无菌操作接种于灭菌f/2培养基，置于密闭光生物反应器中培养，培养温度25℃~30℃、采用基于pH调控策略的三阶段培养法：第一阶段pH为6.0~7.0，第二阶段pH为7.0~8.0，第三阶段pH为8.0~9.0，三阶段时间相同、自然光或人工光光照强度500~5000lx、光暗周期12/12、总培养时间7~15天；发酵罐的进出气口与光生物反应器的进出气口相连；
（4）收集步骤（3）中的自养和异养产油微生物生物质，用水冲洗；经细胞溶解酶预处理：产油微生物生物质与细胞溶解酶以10~100∶1的质量比混匀，30~50℃，初始pH 5.0~7.0，搅拌转速50~300转/分钟，3~6小时；按正己烷、乙醇和预处理后的微生物生物质体积比为1：1：1~3，用正己烷和乙醇提取油脂，有机相经温度30~50℃，转速20~80转/分钟旋转蒸发，去除有机溶剂后，去杂，干燥，即得到微生物油脂。
2.根据权利要求书1所述的生产生物柴油油脂的方法，其特征是步骤（1）和（4）所述的酶解预处理条件为：45℃，初始pH 6.0，搅拌转速150转/分钟，时间4小时。
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