CN103834645B - 转基因水稻科丰2号外源插入基因和侧翼水稻序列的连接区序列及应用 - Google Patents
转基因水稻科丰2号外源插入基因和侧翼水稻序列的连接区序列及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了转基因水稻科丰2号外源插入基因和侧翼水稻序列的连接区序列及应用。本发明通过Hi-TAIL PCR获得外源插入基因载体和其两侧5’端及3’端侧翼水稻序列的连接区序列，其核苷酸为SEQ ID No.2所示；本发明进一步公开了外源插入载体和3’端侧翼水稻序列的连接区序列，其核苷酸序列为SEQ ID No.13所示。本发明进一步公开了所述连接区序列作为靶基因应用于转基因水稻科丰2号品系特异性的检测。本发明为建立转基因水稻科丰2号品系特异性PCR检测方法奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及转基因水稻的侧翼序列，尤其涉及转基因水稻科丰2号插入基因载体和侧翼水稻序列的连接区序列及其应用，属于转基因水稻品系特异性的检测领域。
背景技术
随着转基因植物的广泛种植，转基因食品的安全性问题也引起人们极大的关注，已有30多个国家相继实施转基因产品标识制度，包括中国。转基因标识制度的实施依赖于对转基因植物及其加工产品的成分检测。PCR技术是目前国内外检测转基因产品中应用最广泛的方法。在应用这种技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、构建特异性方法和品系特异性方法。品系特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，和前三种方法比较，品系特异性具有更高的特异性和准确性，最适合做转基因产品检测。
目前，已有部分专利和文献报道了转基因植物的品系特异性检测方法。例如：张大兵等人于2006年建立了转基因MON863玉米的品系特异性检测方法；谢家建等人建立了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号等一系列品系特异性检测方法；卢长明等人于2007年建立了一系列转基因油菜的品系特异性检测方法。但是，目前为止，尚未发现任何关于转基因水稻科丰2号的品系特异性PCR检测方法。确定外源插入基因和侧翼水稻序列的连接区序列是建立转基因水稻科丰2号的品系特异性PCR检测方法的前提。
发明内容
本发明的目的之一是获取转基因水稻科丰2号外源插入基因载体和侧翼水稻序列的连接区序列；
本发明的目的之二是将获取转基因水稻科丰2号外源插入基因载体和侧翼水稻序列的连接区序列作为靶基因应用于转基因水稻科丰2号品系特异性的定性检测。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明根据转基因水稻科丰2号品系中插入的目的基因为SCK基因（SEQ ID No.1）通过Hi-TAIL PCR获得外源插入基因5’端水稻侧翼序列和3’端水稻侧翼序列，最终所获得的含有SCK基因的外源插入基因载体及其两侧5’端和3’端侧翼水稻序列的连接区核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；本发明进一步根据科丰2号外源插入载体和5’端水稻侧翼序列形成的5段连接区序列设计了5对转化体引物，这5对转化体引物虽然均能特异性地从科丰2号样品中扩增出特异性片段，但是在华恢1号，抗优97，辽粳371，MON89788，H7-1等水稻品种也均有扩增条带，所以采用这些连接区作为靶基因设计的特异性引物检测的特异性不好。
本发明进一步根据科丰2号外源插入载体和3’端水稻侧翼序列所形成的连接区核苷酸序列（SEQ ID No.13）设计5对转化体特异性引物，5对引物的核苷酸序列分别为SEQ IDNo.3-SEQ ID No.12所示，应用常规的PCR反应条件，分别采用5对引物进行PCR扩增，设置2个重复；从扩增结果可见，这5对引物均能特异性地从科丰2号样品中扩增出预期片段，但是用SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物扩增的条带最为清晰；SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示的引物是以SEQ ID No.13所示的外源插入载体和3’端水稻侧翼序列所形成的连接区核苷酸序列为靶基因所设计的一对特异性检测引物，这说明以SEQ ID No.13所示的连接区核苷酸序列能够作为转基因水稻科丰2号品系特异性检测的靶基因，例如，以该靶基因设计检测引物，能够准确的对转基因水稻科丰2号品系特异性进行定性检测。
因此，本发明进一步将所获取的转基因水稻科丰2号外源插入基因和侧翼水稻序列的连接区序列应用于转基因水稻科丰2号的品系特异性的定性检测，包括：（1）提取待检测水稻样品的DNA；（2）以SEQ ID No.2或SEQ ID No.13为靶基因设计特异性检测引物，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；（3）如果从待检测的样品中扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品是转基因水稻科丰2号；如果从待检测的样品中未能扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品不是转基因水稻科丰2号。
其中，所述的从待检测水稻样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种方法。
PCR反应体系中引物的终浓度以及退火温度对于检测结果的特异性灵敏度均有一定的影响；本发明考察了PCR反应体系中引物的终浓度以及退火温度对于检测的特异性和灵敏度的影响，实验结果发现在引物终浓度为0.2μM、退火温度为58℃时，检测结果的特异性最强，灵敏度最高。
本发明中所述的PCR扩增体系可参考以下方法建立：反应体系的总体积为25.0μL，其中，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L氯化镁溶液1.5μL，dNTPs混合溶液（各2.5mmol/L）2μL，0.2μmol/L上游引物0.5μL，0.2μmol/L下游引物0.5μL，0.025U/μL Taq酶1.5μL，25mg/LDNA模板2.0μL，余量为双蒸水。
所述的PCR扩增条件优选为：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35个循环；94℃，2min。
本发明进一步的目的是提供一种转基因水稻科丰2号的品系特异性PCR定性检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，氯化镁溶液，dNTPs混合溶液，检测上下游引物对，Taq酶和双蒸水；其中，所述检测上下游引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
采用本发明建立的转基因水稻科丰2号的品系特异性PCR定性检测方法对转基因水稻Π优科丰6号、汕优10、汕优63、皖80-4B、抗优97、华恢1号、科丰2号、常规水稻明恢63以及其它转基因植物（例如：MON863玉米、GHB614棉花、MON89788大豆和油菜GT73等）进行了定性检测，定性PCR扩增结果表明，在科丰2号水稻基因组中扩增得到了目的片段大小的条带（201bp)，在其它转基因水稻Π优科丰6号、汕优10、汕优63、皖80-4B、抗优97、华恢1号和其它转基因植物（MON863玉米、GHB614棉花、MON89788大豆和油菜GT73）以及常规水稻明恢63等基因组中没有扩增得到目的片段大小的片段；通过测序分析表明科丰2号水稻基因组中扩增获得的序列与目的扩增片段序列一致。实验结果表明，本发明所建立的转基因水稻科丰2号品系特异性定性PCR检测方法具有较强的特异性。
灵敏度实验结果表明，科丰2号水稻成分为1%，0.5%，0.1%，0.05%，采用本发明建立的PCR反应都扩增出了目的片段大小的条带，说明本发明所建立的科丰2号水稻品系特异性PCR定性检测方法的灵敏度为0.05%，具有高度的灵敏性。
附图说明
图1 Hi-TAIL PCR扩增结果；M：1Kb plus Marker1：下游第二轮PCR产物2：下游第三轮PCR产物；3：上游第二轮PCR产物4：上游第三轮产物。
图2上下游测序拼接结果（2614bp）。
图3从已知序列的两端设计Hi-TAIL PCR的嵌套引物。
图4 Hi-TAIL PCR扩增结果；M：1Kb plus Marker1、上游第二轮PCR产物；2、上游第三轮产物；注：下游引物无条带。
图5上下游测序拼接结果。
图6 PCR扩增结果；M：1Kb plus Marker1:空白对照；2：明恢86阴性对照3：科丰2号。
图7长片段验证获得的整合结构；①、②、③、④、⑤分别代表：从所示意的位置设计长片段引物进行扩增。
图8 1号引物扩增结果：M：1Kb plus Marker；1:空白对照2：明恢86阴性对照3：科丰2号。
图9 2号引物扩增结果：M：100bp Marker；1:空白对照2：明恢86阴性对照3：科丰2号。
图10 3号引物扩增结果：M：1Kb plus Marker，1:空白对照2：明恢86阴性对照3：科丰2号。
图11 4号引物扩增结果：M：1Kb plus Marker，1:空白对照2：明恢86阴性对照3：科丰2号。
图12 5号引物扩增结果：M：1Kb plus Marker，1:空白对照2：明恢86阴性对照3：科丰2号。
图13科丰2号转化体5’端旁侧序列特异性引物筛选结果。
图14 5’端旁侧序列引物的特异性验证结果；A:M：100bp Marker；1：空白对照；2：明恢86阴性对照；3：科丰2号阳性对照；4-19分别是：明恢63、皖21-B、中花11、汕优63、科丰6号、II优科丰6号、II优明恢86、华恢1号、汕优10、bar68-1、皖80-4B、抗优97、东农、辽粳371、松粳6；B:M：100bp Marker；1：空白对照；2：明恢86阴性对照；3：科丰2号阳性对照；4-7分别为：玉米阴性、MON863、Bt176、MON810；8-10分别为：棉花阴性、LL25、MON15985；11-13分别为：大豆阴性、MON89788、40-3-2；14、15分别为：油菜T45、MS1；16、17分别为：甜菜GT73、H7-1。
图15科丰2号转化体3’端旁侧序列特异性引物筛选结果。
图16 PCR反应体系中引物的终浓度和退火温度优化结果；引物的终浓度为0.1μM/L；M：100bp Marker1：明恢86阴性对照，2：科丰2号a：54℃b：56℃c：58℃d：60℃e：62℃。
图17 PCR反应体系中引物的终浓度和退火温度优化结果；引物的终浓度为0.2μM/L；M：100bp Marker1：明恢86阴性对照；2：科丰2号a：54℃b：56℃c：58℃d：60℃e：62℃。
图18 PCR反应体系中引物的终浓度和退火温度优化结果；引物的终浓度为0.4μM/L；M：100bp Marker1：明恢86阴性对照；2：科丰2号；a：54℃b：56℃c：58℃d：60℃e：62℃。
图19 PCR反应体系中引物的终浓度和退火温度优化结果；引物的终浓度为0.8μM/L；M：100bp Marker1：明恢86阴性对照；2：科丰2号a：54℃b：56℃c：58℃d：60℃e：62℃。
图20科丰2号转化体方法特异性检测；M：100bp Marker1：空白对照2：明恢86阴性对照3：科丰2号阳性对照；4-19分别是：明恢63、皖21-B、中花11、汕优63、科丰6号、II优科丰6号、II优明恢86、华恢1号、汕优10、bar68-1、皖80-4B、抗优97、东农、辽粳371、松粳6。
图21科丰2号转化体方法特异性检测；M：100bp Marker1：空白对照2：明恢86阴性对照，3：科丰2号阳性对照，4-7分别为：玉米阴性、MON863、Bt176、MON810；8-10分别为：棉花阴性、LL25、MON15985；11-13分别为：大豆阴性、MON89788、40-3-2；14、15分别为：油菜T45、MS1；16、17分别为：甜菜GT73、H7-1。
图22科丰2号转化体方法灵敏度测试结果；M：100bp Marker1：空白对照2、阴性对照3、4、5、6、7、阳性100%、1%、0.5%、0.1%、0.05%。
图23检测限测试结果；M：100bp Marker A：空白对照B：阴性对照；1-10：阳性0.1%的10个平行11-20：阳性0.05%的10个平行；21-30：阳性0.01%的10个平行。
实施例1转基因水稻科丰2号品系中外源插入SCK基因的侧翼序列的获取
转基因水稻科丰2号品系外源插入目的基因为SCK基因，共415bp，其碱基序列为SEQ ID No.1所示。
通过Hi-TAIL PCR获得整合结构（外源插入基因侧翼序列）
1、第一步：在目的基因SCK上设计Hi-TAIL PCR的嵌套引物
①下游引物：
Sck-sp1 CTTTCTCATCATCTTCATCCCTGGACTTG
Sck-sp2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCGATTTGCAAGCCGAGTGACACGAATT
Sck-sp3 TTGATTTAGTGCAGATGCATGAATCGC
上游引物：
Sck-Ap1 GCACCATCTTCTTTGCTCTCTTTCTCTGT
Sck-Ap2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCTTTCGTTTTAAAGGTGTGTGTGCTGGTAC
Sck-Ap3 TGATGACTCAAGCGATGAACCTTCTGAG
随机引物：
AD1-1 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA
AD1-2 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT
AD1-3 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAA
AD1-4 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNAGGT
AD-C ACGATGGACTCCAGAG
②PCR结果见图1。
③上下游测序拼接结果（2614bp）见图2。
2、第二步：从已知序列的两端设Hi-TAIL PCR的嵌套引物
图3为嵌套引物设计的示意图。
①下游引物：
OSP-SP1 AGATTAAAATAGCTTTCCCCCGTTGTAGC
OSP-SP2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCAAAGTGCTATCCACGATCCATAGCAAGOSP-SP3CAATAGTCTCCACACCCCCCCACTATC
上游引物：
hptII-AP1 GCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATC
hptII-AP2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAG
hptII-AP3 CGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCG
随机引物：同上
②PCR结果见图4。
③上下游测序拼接结果（3840bp）见图5。
3.第三步：根据5’端获得的水稻序列，得到3’端水稻序列。然后，在水稻启动子上设上游引物，水稻3’端序列上设下游引物，通过长片段扩增得到3’端侧翼序列。
①下游引物：
OSJ-3'-AP：CGCTTTGACCTAAGTTTGCACGGAC
上游引物：
OSP-SP：CAATAGTCTCCACACCCCCCCACTATC
②PCR结果见图6。
③测序拼接结果（5423bp）见图7。
4、全部测序结果：全部的连接区序列（外源插入载体（含有SCK基因）和两侧的水稻侧翼序列的连接区）为SEQ ID No.2所示。
5、长片段验证获得的整合结构
按照图7中①、②、③、④、⑤分别代表所示意的位置设计长片段引物进行扩增，预期大小分别为：1.4Kb、1176bp、817bp、2.3kb、4443bp。扩增结果分别见图8、图9、图10、图11、图12。
实验例1转基因水稻科丰2号的品系特异性定性检测特异性引物的筛选和扩增条件的优化
一、5’端检测特异性定性检测特异性引物的筛选
1、引物的设计及筛选
在5’端侧翼序列设计了5对引物，引物序列如下：
引物a：扩增产物片段大小为202bp
F：GATTAACCATACTGGAAAATCTGGC
R：GTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC
引物b：扩增产物片段大小为156bp
F：GATTAACCATACTGGAAAATCTGGC
R：CGCAGGATAGCTAGTAGGATCG
引物c：扩增产物片段大小为142bp
F：CTTCCTGGATTTACAGCCTAAAGAT
R：GTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC
引物d：扩增产物片段大小为170bp
F：ACATCGTCAGTACCATAGTGATTGC
R：GTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC
引物e：扩增产物片段大小为197bp
F：CTTCCTGGATTTACAGCCTAAAGAT
R：TACTAAAATCCAGATCCCCCGA
应用通用的PCR反应条件（引物终浓度为0.2μM、退火温度为56℃），用上述5对引物进行PCR扩增，设置2个重复；上述5对引物的扩增结果见图13；从扩增结果可见，引物a的扩增效率较其他四对引物的扩增效率要好，因此选择扩增效率较好的引物a（202bp）作为候选引物进行下一步的特异性验证。
2、特异性验证
验证材料选择：
以转基因水稻科丰2号作为阳性对照，利用应用通用的PCR反应条件（引物终浓度为0.2μM、退火温度为56℃）检测以下30个品种
水稻：明恢63、皖21-B、中花11、汕优63、科丰6号、II优科丰6号、II优明恢86、华恢1号、汕优10、bar68-1、皖80-4B、抗优97、东农、辽粳371、松粳6
玉米：阴性、MON863、Bt176、MON810
棉花：阴性、LL25、MON15985
大豆：阴性、MON89788、40-3-2
油菜：GT73（有CTPI基因）、T45、MS1
甜菜：H7-1；
检测结果见图14。从检测结果可见，该对引物除在科丰2号有扩增条带外，在华恢1号，抗优97，辽粳371，MON89788，H7-1也均有扩增条带，所以采用该引物检测存在特异性不好的问题。
二、3’端旁侧序列检测特异性引物的筛选
1、引物的设计及扩增
根据科丰2号的插入基因载体和其3’端旁侧序列的连接区序列（SEQ ID No.13）为靶基因设计5对转化体特异性引物，引物序列如下：
引物1：扩增产物片段大小为132bp
F：TAGTGTATTGACCGATTCCTTGC（SEQ ID No.3）
R：GCACGGACTATACAAGTTGTGATGT（SEQ ID No.4）
引物2：扩增产物片段大小为172bp
F：TAGTGTATTGACCGATTCCTTGC（SEQ ID No.5）
R：CAATGAGCTATATGTGTTACAACCG（SEQ ID No.6）
引物3：扩增产物片段大小为201bp
F：TAGAGCAGCTTGAGCTTGGATC（SEQ ID No.7）
R：GCACGGACTATACAAGTTGTGATGT（SEQ ID No.8）
引物4：扩增产物片段大小为192bp
F：GCATATGAAATCACACCATGTAGTG（SEQ ID No.9）
R：CAATGAGCTATATGTGTTACAACCG（SEQ ID No.10）
引物5：扩增产物片段大小为152bp
F：GCATATGAAATCACACCATGTAGTG（SEQ ID No.11）
R：GCACGGACTATACAAGTTGTGATGT（SEQ ID No.12）
扩增外源插入载体和水稻基因组的连接区序列，扩增产物的大小均不小于100bp。应用通用的PCR反应条件，用5对引物进行PCR扩增，设置2个重复；从扩增结果可见，这5对引物均能特异性地从科丰2号样品中扩增出预期片段，但是用SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物扩增的201bp（SEQ ID No.13）的条带最为清晰（图15）；用SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示的引物在转基因科丰2号水稻含量为0.05%时在10个平行中均能稳定扩增出预期大小条带，说明该对引物检测的灵敏度达到了0.05%；因此，本发明优选采用SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示引物作为检测转基因水稻科丰2号的品系特异性PCR检测引物。
2.PCR反应体系和条件优化
调整优化PCR反应体系中引物的终浓度，设置0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM等4个浓度梯度，并以54℃、56℃、58℃、60℃、62℃为退火温度进行PCR反应的扩增，结果表明，在所设的不同引物浓度和不同退火温度条件下都能扩增出预期大小的片段，但在引物终浓度为0.2μM、退火温度为58℃时效果最好（图16：引物浓度为0.1μM/L，图17：引物浓度为0.2μM/L，图18：引物浓度为0.4μM/L，图19：引物浓度为0.8μM/L）。
实验例2转基因水稻科丰2号的品系特异性检测体系及反应程序的建立
一、植物基因组DNA的提取与检测
1植物DNA提取
1.1CTAB提取缓冲液的配制
600mL水中加入81.7g NaCl和20g CTAB,充分溶解后加入1mol/LTris-HCl（pH7.5）溶液100mL，0.5mol/L EDTA（pH8.0）溶液100mL,最后用HCl或NaOH溶液调pH至8.0，加水定容至1000mL。高温高压（103.4kPa/121℃）条件下灭菌20min后使用。
1.2提取方法
a.100mg样品，充分研磨成粉末后转移至2ml离心管中；
b.1ml预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样，并轻柔混合。
c.65℃水浴40min，期间颠倒混匀数次；
d.12000r/min离心15min。转移上清至一新离心管，加入等体积酚、氯仿-异戊醇（24：1），充分混合；
e.12000r/min离心10min。转移上清至一新离心管，加入等体积氯仿-异戊醇（24：1），充分混合；
f.12000r/min离心10min，取上清，加入2/3体积异丙醇，1/10体积乙酸钠。-20℃放置2小时或更长时间；
g.12000r/min离心10min；
h.弃上清，加入500μL，70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000r/min离心10min；
i.弃上清，将离心管倒立于吸水纸吸干，并使乙醇充分挥发，干燥DNA。
g.加100μl水溶解DNA；
k.用重蒸馏水将DNA溶液浓度调制为100ng/μl，储存于-20℃备用。
2DNA检测
取3ul提取的DNA溶液，以0.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来判断DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提DNA的浓度和纯度。二、科丰2号水稻品系特异性定性PCR检测体系及反应程序的建立
经过优化，科丰2号水稻品系特异性定性PCR检测的体系见表1，PCR反应程序见表2。
表1科丰2号水稻品系特异性定性PCR检测体系
表2科丰2号水稻品系特异性定性PCR反应程序
实验例3科丰2号水稻品系特异性定性PCR检测方法的特异性分析
一、实验材料
1、植物材料水稻
转基因水稻：Bar68-1、Π优明恢86、Π优科丰6号、汕优10、汕优63、皖80-4B、抗优97、华恢1号、皖21-B、科丰6号、东农等。
常规水稻：明恢63、中花11、辽粳371、松粳6
其它转基因植物：玉米：阴性、MON863、Bt176、MON810
棉花：阴性、LLcotton25、MON15985
大豆：阴性、MON89788、40-3-2
油菜：GT73（有CTPI基因）、T45、MS1
甜菜：H7-1
以上实验材料由农业部科技发展中心及中国农科院生物技术研究所提供。
二、实验方法及结果
以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8为特异性引物对，按照实验例2所建立的科丰2号水稻品系特异性定性PCR检测方法对各种材料进行扩增结果表明，在科丰2号水稻基因组中扩增得到了目的片段大小的条带（201bp)，在其他转基因水稻Π优科丰6号、汕优10、汕优63、皖80-4B、抗优97、华恢1号和其他转基因植物MON863玉米、GHB614棉花、MON89788大豆和油菜GT73，以及常规水稻明恢63等基因组中没有扩增得到目的片段大小的片段（图20、图21）。通过测序分析表明科丰2号水稻基因组中扩增获得的序列与目的扩增片段序列一致。上述结果表明引物Kefeng2-F和Kefeng2-R建立的转基因水稻科丰2号品系特异性定性PCR检测方法具有高度特异性。实验例4科丰2号水稻品系特异性定性PCR检测方法的灵敏度实验
以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8为特异性引物对，按照实验例3所建立的科丰2号水稻品系特异性定性PCR检测方法进行灵敏度扩增实验。
科丰2号阳性DNA和明恢86阴性DNA按不同质量比混合，制备科丰2号质量分数分别为1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%的样品，按照特异性测试的反应体系及反应程序进行PCR扩增，实验结果表明，转基因水稻科丰2号水稻成分为1%，0.5%，0.1%，0.05%的PCR反应体系中都扩增出了大小为201bp的目的片段，说明科丰2号水稻品系特异性定性PCR检测方法的灵敏度可达到0.05%（图22）。
实验例5科丰2号水稻品系特异性定性PCR检测方法的检测限实验
科丰2号阳性DNA和明恢86阴性DNA按不同质量比混合，制备科丰2号质量分数分别为0.1%、0.05%、0.01%的样品，按照特异性测试的反应体系及反应程序进行PCR扩增，由实验结果可见（图23），科丰2号水稻的含量为0.1%和0.05%时，在10个平行中均能稳定扩增出预期大小条带，而该条带在阳性0.01%的10个平行中扩增呈现不稳定性，因此本发明科丰2号水稻品系特异性定性PCR检测方法的检测限为0.05%。
Claims (5)
1.转基因水稻科丰2号外源插入基因载体和其两端侧翼水稻序列形成的连接区序列，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的连接区序列作为靶基因应用于转基因水稻科丰2号品系特异性定性检测中的应用。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：(1)提取待检测水稻样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以SEQ ID No.2为靶基因设计检测引物，建立PCR反应体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品是转基因水稻科丰2号；如果从待检测的样品中未能扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品不是转基因水稻科丰2号。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR反应体系为：反应体系的总体积为25.0μL，其中，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L氯化镁溶液1.5μL，dNTPs混合溶液2μL，0.2μmol/L SEQ ID No.7所示的引物0.5μL，0.2μmol/L SEQ ID No.8所示的引物0.5μL，0.025U/μLTaq酶1.5μL，25mg/L DNA模板2.0μL，余量为双蒸水。
5.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增条件为：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35个循环；94℃，2min。
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