CN103833867B - 葡聚糖的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含β‑葡聚糖的组合物。更具体地说，本发明涉及生产可溶性β‑葡聚糖的方法。

Description

葡聚糖的制备
本申请是申请日为2007年6月15日、申请号为200780029944.X、发明名称为“葡聚糖的制备”的发明专利申请的分案申请。
发明背景
本申请要求2006年6月15日提交的美国序列号60／813,971、题为葡聚糖的制备的权益。
本发明涉及包含β-葡聚糖的组合物。更具体地说，本发明涉及可溶性β-葡聚糖组合物及其在干细胞动员中的用途。
葡聚糖往往被描述为葡萄糖的聚合物，并衍生自酵母、细菌、真菌和植物，例如燕麦或大麦。已知含β(1-3)-连接的吡喃葡萄糖主链的葡聚糖具有生物学活性，尤其是，已经表明它们调节免疫系统，更近期地，介导造血干细胞和祖细胞(HSPC)的动员。
各种癌症的治疗日益涉及减少细胞数的治疗，包括高剂量化疗或放射疗法。这些治疗使患者的白细胞数下降，抑制骨髓造血活性，并增加他们感染和／或出血的风险。因此，接受减少细胞数的治疗的患者也必须接受治疗，以重新恢复骨髓功能(造血作用)。
尽管在干细胞动员和技术方面取得进展，高达20-25％的患者表现出不良的动员，并不能进行自体移植。PGGβ-葡聚糖是可溶性酵母衍生的多糖，先前已经表现出介导造血干细胞和祖细胞(HSPC)的动员。
发明概述
在本发明中，酵母被培养、收获和纯化，生成基本不含污染有挥发性有机化合物(VOCs)的微粒β-葡聚糖。通过使酵母细胞或其片段经受去除宿主细胞杂质的一系列的碱、表面活性剂和酸提取，制备微粒β-葡聚糖。
经以上工艺或经现有工艺方法生产的微粒β-葡聚糖在升高的温度和压力下可溶解于酸性溶液。然后，澄清和先后采用疏水相互作用的层析(HIC)、凝胶渗透层析(GPC)纯化所生成的可溶性β-葡聚糖。作为药剂，以较高剂量给予可溶性β-葡聚糖，而无增加的或实际上减少的可观察到的副作用或不利结果。
图的简述
图1是生产微粒β-葡聚糖的方法的示意图。
图2是生产可溶性β-葡聚糖的方法的示意图。
发明详述
微粒β-葡聚糖
图1是从酵母生产不溶的或微粒β-葡聚糖的方法10的概况，它包括步骤12-22。在步骤12中，酵母培养基典型地在摇瓶或发酵桶中生长。用于本发明的酵母株可为任何株，其实例包括酿酒酵母(Saccharomyces(S.)cerevisiae)、德尔布酵母(S.delbrueckii)、罗斯酵母(S.rosei)、小椭圆酵母(S.microellipsodes)、卡尔酵母(S.carlsbergensis)、二孢酵母(S.bisporus)、发酵性酵母(S.fermentati)、鲁酵母(S.rouxii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces(K.)lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)，多孢克鲁维酵母(K.polysporus)、白假丝酵母(Candida(C.)albicans).阴道假丝酵母(C.cloacae)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、温奇汉逊酵母(Hansenula(H.)wingei)、arni汉逊酵母(H.arni)、亨利汉逊酵母(H.henricii、美国汉逊酵母(H.americana)、加拿大汉逊酵母(H.canadiensis)、碎囊汉逊酵母(H.capsulata)、多形汉逊酵母(H.polymorpha)、克鲁弗毕赤酵母(Pichia(P.)kluyveri)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、多形毕赤酵母(P.polymorpha)、罗丹毕赤酵母(P.rhodanesis)、奥默毕赤酵母(P.ohmeri)、牛球拟酵母(Torulopsis(T.)bovina)和光滑球拟酵母(T.glabrata)。
在批量生产的一个实施方案中，从酵母培养开始，经摇动烧瓶培养基逐步扩大到250-L规模的生产发酵桶。酵母在富含维生素，例如叶酸、肌醇、烟酸、泛酸(钙和钠盐)、吡哆醇HCl和胸腺嘧啶HCl和来自化合物例如氯化铁六水合物；氯化锌；氯化钙二水合物；钼酸；硫酸铜五水合物和硼酸的微量金属的葡萄糖-硫酸铵培养基中生长。在约0.02％浓度时，也可加入消泡剂，例如防沫剂(Antifoam)204。
以补料分批培养方式(fed batch mode)将生产培养基维持在葡萄糖限制下。在种子发酵期间，在接种生产发酵桶之前，定时取样，测量培养基的光密度。在生产发酵期间，仍定时取样，以测量培养基的光密度。在发酵结束时，取样测量光密度、干重量和微生物纯度。
如果需要，可通过提高培养基pH到至少11.5或经离心培养基以从生长介质中分离细胞，终止发酵。此外，可根据想要得到的经纯化的β-葡聚糖的规格和形式，采取分裂或破碎酵母细胞的各个步骤。可采用任何已知的化学、酶或机械方法，或它们的任何组合，分裂或破碎酵母细胞。
在步骤14，收获含β-葡聚糖的酵母细胞。当批量生产β-葡聚糖时，典型地采用连续流式离心收获酵母细胞。
步骤16表示用一种或多种碱溶液、表面活性剂或它们的组合初步提取酵母细胞。例如，适用的碱溶液是0.1M-5M NaOH。适用的表面活性剂包括，例如，辛基硫葡糖苷、LubrolPX、Triton X-100、月桂基硫酸钠(SDS)、Nonidet P-40、吐温20等。也可采用离子型(阴离子、阳离子、两性)表面活性剂(例如，磺酸烷基酯、苯扎氯铵等)和非离子型表面活性剂(例如，聚氧乙烯氢化篦麻油、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基苯基醚等)。表面活性剂的浓度会有所不同，并部分地取决于所用的表面活性剂。酵母细胞材料可被提取一次或多次。
提取通常在介于约70℃-约90℃的温度下进行。根据温度、所用试剂及其浓度，每次提取的持续时间介于约30分钟-约3小时之间。
在每次提取后，采用离心或连续流式离心收集含有β-葡聚糖的固相，并为后继步骤而再悬浮。离心期间，在液相中除去已溶解的污染物，同时使β-葡聚糖保存于不溶的细胞壁材料中。
在一个实施方案中，进行四次提取。在第一次提取中，使已收获的酵母细胞与1.0MNaOH混合，并加热至90℃约60分钟。第二次提取是碱／表面活性剂提取，借此，使不溶材料再悬浮于0.1M NaOH和约0.5％-0.6％Triton X-100中，并加热至90℃约120分钟。第三次提取类似于第二次提取，除了Triton X-100浓度为约0.05％，和持续时间缩短至约60分钟之外。在第四次提取中，使不溶材料再悬浮于约0.5％Triton-X100中，并加热至75℃约60分钟。
碱和／或表面活性剂提取物溶解并去除某些无关酵母细胞材料。碱溶液水解蛋白、核酸、甘露聚糖和脂质。表面活性剂促进脂质和其它疏水杂质的去除，这为生成改进的β-葡聚糖产物提供额外的优点。
先前的纯化程序生成含有微量挥发性有机化合物(VOCs)的β-葡聚糖。在先研究已经表明，脂肪作为脂肪酸释放，再快速分解为各种VOCs，生成VOCs。大部分情况下，检测出的量不足以造成危害，但，给予人或其它动物的产物基本不含任何VOCs显然是有益的。
需氧和厌氧生长产生的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的脂肪含量介于约3％-约8％。脂肪含量随酵母的生长条件而变化。表1提供酿酒酵母的典型脂肪组成的概况。数据来自以下参考文献：
·Blagovic，B.，J.Rpcuc，M.Meraric，K.Georgia和V.Marie.2001.啤酒酵母的脂质组成.Food Technol.Biotechnol.39：175-181.
·Shulze.1995.酿酒酵母的厌氧生理学.哲学博士论文，丹麦科技大学.
·Van Der Rest，M.E.，A.H.Kamming，A Nakano，Y.Anrak，B.Poolman和W.N.Koning.1995.酿酒酵母的质膜：结构、功能和生物合成.Microbiol.Rev.59：304-322.
表1
*包括脂质10∶0-14∶1
根据酵母类型和生长条件，酵母细胞壁材料典型地含有10-25％脂肪。目前，在将酵母细胞壁材料加工成β-葡聚糖期间，某些，但不是全部脂肪经离心和洗涤步骤除去。因此，典型的产生可能得到3-7％的脂肪含量。
制备工艺典型地涉及去除酵母细胞壁的甘露糖蛋白(mannoproteins)、脂质和其它不希望的组分的步骤。常见于该方法的某些关键步骤是在各独立的洗涤步骤中采用酸和碱释放某些细胞壁成分的各种洗涤步骤。数种步骤采用碱洗涤工艺，其中碱，通常是氢氧化钠，被加至液体细胞壁悬液中。碱的用途之一是通过形成脂质的游离脂肪酸去除脂质。结果是β-葡聚糖的脂肪含量下降。
一般用于生产酵母β-葡聚糖的碱洗涤步骤留下残余的已经减少反应性的脂肪酸和部分降解的脂肪甘油三酯。碱洗涤工艺的直接的结果是释放反应性游离脂肪酸，其快速分解为脂肪分解的各种氧化产物。
大多数研究者已经详述多不饱和脂肪在贮存期间分解的事实。尽管甘油三酯可在氧气的存在下自氧化，但更常见的是游离脂肪酸经氧化分解。在脂质，也称为甘油三酯的分解中的正常步骤是从甘油三酯中释放游离脂肪酸。游离脂肪酸事实上不存在于活着的生物体的组织，而当有机体因进一步加工而死亡或收获时，例如随含油种子出现和在提练动物脂肪中，通常分解(Nawar，W.W.4章.脂质.在：食品化学.编辑者：OwenR.Fennema.MarcelDekker，Inc.；DeMan，J.M.2章.脂质.在：食品化学原理AVI Publishing Co.，Inc.)。在许多甘油三酯中，甘油酯分子的2-位被不饱和脂肪所占据。在碱处理β-葡聚糖的情况下，释放如下所述般分解的不饱和脂肪酸的皂化是熟知的工艺。
脂肪氧化过程有几种机理。最常见的机理是自氧化。该过程经从烯烃去除氢开始，产生自由基。氢的去除发生于脂肪中挨着双键的碳原子。通过各种自由基生成因素，例如UV光、金属、单线态氧等，诱发该反应。
RH→R.+H.(生成自由基电子)
第二个步骤是加入氧气，引起过氧自由基生成，其通过从另一个不饱和脂肪酸提取氢传递链式反应。
R.+O2→-RO2 .(生成反应性氧化自由基)
RO2 .+RH→ROOH+R.(ROOH是反应性过氧化氢，它分解为第二种反应产物，例如VOCs)
链式反应继续，直到自由基自身合并生成非反应性产物而终止。
R.+R.→R-R
R.+RO2 .→RO2R
以下是导致VOCs形成的化学反应。用亚油酸作为化学模型，但其它不饱和脂肪酸存在于酵母细胞壁和酵母β-葡聚糖制剂中，其产生相同的最终产物。
ROOH→RO.+OH-
RO.→裂解反应物形成醛、烷基(它形成烃和醇)、酯、醇和烃。
实例：
环氧化物的分解产生几种产物，包括
→C-C-C-C-C-C(己烷)+O=C-C=C-C=O(2-丁烯-1，4二醛)
同样地，如果环氧化物形成于2和3碳键之间，则化学导致：(2，4-癸二烯醛的2，3环氧化物)→乙醇和2-辛烯醛
以类似的方式，通过随脂肪酸氧化期间形成的反应性种类的过氧化物的分解而产生的自氧化反应，可引起β-葡聚糖制备中鉴定的VOCs的形成。因此，不仅就脂肪而言，而且就VOC污染而言，从β-葡聚糖生产中除去尽可能多的脂肪，产生更纯的产物。
回到图1，纯化工艺中的下一个步骤是示于步骤18的去除糖原的酸提取。通过调节碱／表面活性剂提取的材料的pH至介于约5和9之间，并于介于约70℃-100℃的温度下，使材料混合于约0.05M-约1.0M乙酸中约30分钟-约12小时，实现一种或多种酸提取。
在一个实施方案中，使碱／表面活性剂提取物离心后保留的不溶性材料再悬浮于水中，用浓HCl调节溶液的pH至约7。使材料与充足的冰醋酸混合，制备0.1M醋酸溶液，加热约5小时至90℃。
在步骤20，洗涤不溶性材料。在典型的洗涤步骤中，在约室温下，使材料混合于纯净水中最少约20分钟。用水洗涤两次。再如步骤22所示的那样，收集经纯化β-葡聚糖产物。此外，典型地通过离心或连续流式离心进行收集。
此时，生成经纯化的微粒β-葡聚糖产物。根据起始原料，产物可呈完整葡聚糖颗粒或其任何部分的形式。此外，大粒径颗粒可被破碎成更小的颗粒。产物范围包括已经在体内基本保持形态学(完整葡聚糖颗粒)下至亚微大小颗粒的β-葡聚糖颗粒。
如本领域所熟知的，微粒β-葡聚糖用于许多食品、补品和药品应用中。或者，微粒β-葡聚糖可进一步加工成含水的可溶性β-葡聚糖。
可溶性β-葡聚糖
图2是生产含水可溶性β-葡聚糖的方法24的概况，它包括步骤26-32。用于方法24的起始原料是微粒β-葡聚糖，它可通过方法10生产，或通过前面采用的多种方法中的任何一种生产。微粒β-葡聚糖起始原料的大小可介于完整葡聚糖颗粒下至亚微大小颗粒的范围。
在步骤26中，在减压和升高的温度下，微粒β-葡聚糖经酸处理，产生可溶性β-葡聚糖。在可密封的反应容器中，使小球状的微粒β-葡聚糖再悬浮并混合于缓冲溶液中，达到pH3.6。加入缓冲试剂，使每升总体积的最终悬液混合物含有约0.61g乙酸钠、5.24ml冰醋酸和430g小球状微粒β-葡聚糖。用氦气吹洗容器，除去氧气，并增加反应容器内的压力。
在特定实施方案中，使容器内的压力至35PSI，加热悬液至约135℃维持约4.5-5.5小时。发现在这些条件下，β-葡聚糖将溶解。随着温度从135℃下降，溶解量也下降。
应该注意，只在刚刚描述的实施方案中需要该温度和压力。如果改变任何反应条件和／或试剂，可能需要优化温度和压力。
通过实际上从工艺中消除对有害化学品的使用，增加的压力和温度赋予超过现有技术用于溶解β-葡聚糖的工艺的优点。先前已经采用的有害化学品包括，例如，易燃VOCs，例如醚和乙醇，极强酸，例如甲酸和硫酸和极高pH的苛性碱溶液。本方法不仅通过减少所用的大量不同化学品和所涉及的多个步骤而更加安全，而且更加经济。
典型地通过取样反应器内容物和进行凝胶渗透层析(GPC)分析，进行实验以确定热处理的精确的持续时间。目的是使满足高折分-GPC(HR-GPC)分布(profile)规格和杂质水平的可溶性材料的得率最大化，这在下面讨论。β-葡聚糖一旦溶解，就冷却混合物，停止反应。
此时，粗的经溶解的β-葡聚糖可被洗涤并用于某些用途，然而，药物用途需要进行进一步纯化。可采用一种或多种以下步骤的任何组合纯化可溶性β-葡聚糖。如需要，也可采用本领域已知的其它方法。在步骤28，澄清可溶性β-葡聚糖。适用的澄清方法包括，例如，离心或连续流式离心(continuous-f1ow centrifugation)。
接着，可如步骤30所示，过滤可溶性β-葡聚糖。在一个实施方案中，例如，先后经深度过滤器和0.2μm过滤器过滤所述材料。
步骤32采用层析法进一步纯化。在层析制备中的步骤28或步骤30期间的某些点，可调节可溶性β-葡聚糖。例如，如果层析步骤包括疏水相互作用层析(HIC)，则可用硫酸铵和醋酸钠溶液调节可溶性β-葡聚糖至适当的电导率和pH。用来调节pH至5.5的适用的溶液是3.0M硫酸铵、0.1M醋酸钠。
在一个HIC实例中，将柱用Tosah Toyopearl Butyl650M树脂(或等价物)填充。根据厂商的推荐，充填和修饰(qualified)柱。
在装填前，针对pH、电导率和内毒素分析对流经柱的平衡液取样。装填经用较高浓度的硫酸铵溶液调节过的可溶性β-葡聚糖，再洗涤。可溶性β-葡聚糖的性质使大多数产物结合至HIC柱。低分子量产物及某些高分子量产物被完全洗出。用缓冲液例如pH5.5的0.2M硫酸铵、0.1M醋酸钠洗脱保留于柱中的可溶性β-葡聚糖。可能需要多次循环，以确保己糖负荷未超出树脂的容量。收集流分，分析可溶性β-葡聚糖产物。
可能被采用的另一种层析步骤是凝胶渗透层析(GPC)。在GPC的一个实例中，TosahToyopearl HW55F树脂或等价物被采用，并如制造商所推荐的那样被填充和修饰。柱被平衡并用柠檬酸盐缓冲的盐水(0.14M氯化钠、0.011M柠檬酸钠，pH6.3)洗脱。在装填前，对柱洗出样品进行pH、电导率和内毒素分析。此外，可能需要多次层析循环，以确保负荷不超过柱的容量。
按流分收集洗脱液，分析来自各流分的样品的各种组合，以确定具有最佳分布的组合。例如，可经HR-GPC分析样品组合，得到具有最优化HR-GPC分布的组合。在一个最优化的分布中，超过380,000Da的可溶性β-葡聚糖的高分子量(HMW)杂质的量少于或等于10％。低于25,000Da的低分子量(LMW)杂质的量少于或等于17％。随后合并所选择的各流分的组合。
此时，纯化可溶性β-葡聚糖并备用。可进行进一步过滤以对产物杀菌。如需要，可用无菌柠檬酸盐缓冲盐水调节产物的己糖浓度至约1.0±0.15mg/ml。
上述纯化技术生成改进的可溶性β-葡聚糖，它具有作为药剂的特殊的优点(其在下文中讨论)。如经带多角度光散射的HR-GPC(HR-GPC／MALS)和差示折射率检测确认的那样，可溶性β-葡聚糖的平均分子量介于约120,000Da-约205,000Da之间，及分子量分布(多分散性)不大于2.5。粉末X-射线衍射和幻角(magic-angle)自旋NMR确认，产物由涉及三股螺旋的聚合物链组成。
可溶性β-葡聚糖典型地不带电荷，并因而不具有pKa。它可不受pH影响而溶于水，粘度随浓度增加而增加。
表2概述采用方法10生产的完整葡聚糖颗粒的可溶性β-葡聚糖产物中的杂质的典型水平。
表2
杂质 规格 3批中观察的水平范围
HMW(>380kD) ≤10％ 4-8％
LMW(<25kD) ≤17％ 8-13％
还原糖 0.7-1.6％总己糖* 1.0-1.1％总己糖
糖原 ≤10％总己糖 <5％总己糖
甘露聚糖(作为甘露糖) ≤1％回收己糖 <0.6-≤0.8％回收己糖
甲壳质(作为葡糖胺) ≤2％总己糖 0.2-0.5％总己糖
蛋白质 ≤0.2％总己糖 <0.2％总己糖
酵母蛋白 特征** <2ng/mg己糖
DNA 特征 <6.5-<50pg／mg己糖
麦角甾醇 特征 <10-<25μg/mg己糖
Triton X-100 特征 <1-<5μg/ng己糖
Antifoam204 特征 <10μg／mg己糖
*通过比色分析法确定总己糖。糖聚合物被水解于硫酸和蒽酮中，生成糠醛。糠醛与蒽酮共轭，生成经分光光度法测量的发色团。
**限度未规定。
涉及产物的杂质包括分子量大于380,000道尔顿或小于25,000道尔顿的材料，因为已经发现经改进的可溶性β-葡聚糖落在那些分子量范围之间。
与产物相关的杂质的其它测量是还原糖。每个葡聚糖多糖链以糖的醛形式(还原糖)结束。因此，还原糖的量在制备中用作链的数量的指标。因为新的还原末端随着每条链的裂解而生成，还原糖是链稳定性的监测器。还原糖可经本领域熟知的bicinchoninicacid(BCA)试验测量。
潜在的加工杂质包括其它酵母细胞成分，例如DNA、酵母细胞蛋白、脂质和其它多糖，例如糖原、甘露聚糖和甲壳质。可采用狭线杂交试验(MDS PanLabs，Seattle，WA)分析DNA水平。可通过对蛋白的比色分析法或通过测量酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞蛋白的更加敏感的商业上的酶联免疫吸附试验(ELISA)确定残余蛋白(Cygnus Technology，Southport，North Carolina)。可通过采用280nm下检测的反相高效液相色谱(RP-HPLC)评价麦角甾醇水平，监测残余脂质。
糖原是主要由α-1，4-连接的葡萄糖组成的多糖，可经酶试验确定它的存在。将该产物加至含有从糖原释放葡萄糖的淀粉葡萄糖苷酶的酶反应物中，生成还原糖。经BCA试验测定还原糖。
甘露聚糖是带α-1，2-和α-1，3-支链的α-1，6-连接的甘露糖的支链聚合物，它如甘露糖一样，通过其单糖组分监测。将产物加至反应物中，甘露糖经三氟乙酸水解并经HPLC分析。
甲壳质是用比色分析法监测的β-1,4-N-乙酰葡萄糖胺的聚合物。经硫酸水解可溶性β-葡聚糖，所生成的葡萄糖胺与Ehriich′s试剂形成经比色测量的复合物。这些和其它适用的试验为本领域技术人员所知。
源自制备过程中加入的组分的潜在的非酵母杂质包括Triton X-100(表面活性剂)和Antifoam204(消泡剂)。280nm下检测的反相HPLC(RP-HPLC)可用来鉴别任何残余的Triton X-100。用正模式电喷雾质谱检测器，经用选择性离子监测的RP-HPLC方法评价消泡剂(Antifoam204)。
某些产物规格建议采用可溶性β-葡聚糖作为药剂。这些规格列于表3。
表3
*菌落形成单位
**内毒素单位
如上所述，经方法10和24生产的可溶性β-葡聚糖是优于现有技术领域的可溶性β-葡聚糖材料的改进产物。改进见于临床试验结果，其中，与的现有技术的较低的最大剂量可溶性β-葡聚糖相比，以很高的最大剂量给出的本发明的可溶性β-葡聚糖表现相同或更少的不良事件(AEs)。结果列于表4。
表4
1最大单一剂量2.25mg／kg
2最大单一剂量6.0mg／kg
Bf1以商品名BetafectinTM，一种由Alpha-Beta Technology，Inc开发的可溶性β-葡聚糖产品而闻名。生产BetafectinTM的方法采用甲酸溶解微粒β-葡聚糖材料。此外，在其纯化过程中，Bf1不经任何层析。
用健康受治疗者的志愿人群进行研究。与Bf1相比，摄入改进的可溶性β-葡聚糖的研究参与者报告更少的不良事件，即使最大剂量为Bf1的2.5倍。因此，可给予甚高剂量的改进可溶性β-葡聚糖，可产生至少不会增加的，反而实际上可能降低的副作用。此外，改进的可溶性β-葡聚糖不会诱导引起炎性副作用的生物化学介质，例如，白介素-1β和肿瘤坏死因子-α。
本发明的方法提供超过现有技术方法的几个优点，并生成改进的β-葡聚糖产物。微粒β-葡聚糖基本不含有害VOCs。β-葡聚糖的溶解更加安全和更加经济。此外，经本方法制备的微粒β-葡聚糖的溶解生成具有改进的药物质量的可溶性β-葡聚糖。
尽管已经用参考具体实施方案说明或描述本发明，但本领域的技术技术人员会明白，可进行形式或细节方面的各种修改，而不背离所附权利要求书所囊括的本发明的精神和范围。

Claims (15)

1.一种生产具有免疫刺激性质的可溶性β-葡聚糖的方法，该方法包括：
向微粒β-葡聚糖和酸的悬液施加35 PSI压力；和
以足以形成可溶性β-葡聚糖的时间加热该悬液至135℃；
其中所述可溶性β-葡聚糖具有介于120,000 Da和205,000 Da之间的平均分子量。
2.权利要求1的方法，其还包括：
澄清可溶性β-葡聚糖。
3.权利要求2的方法，其中的可溶性β-葡聚糖经离心、过滤或它们的组合澄清。
4.权利要求1的方法，其中的悬液在基本除去所有氧气的容器中。
5.权利要求4的方法，其中的氧气通过用氮气吹洗容器除去。
6.权利要求1的方法，其还包括：
根据分子量分离进入各流分的可溶性β-葡聚糖。
7.权利要求6的方法，其中的可溶性β-葡聚糖经层析法分离。
8.权利要求1的方法，其中的酸是乙酸。
9.一种包含具有免疫刺激性质的未衍化的、可溶性β-葡聚糖的组合物，它可以以至多6mg/kg的最大单一剂量给予，其中在所述可溶性β-葡聚糖中，超过380,000 Da高分子量杂质的量少于或等于10%，低于25,000 Da的低分子量杂质的量少于或等于17%。
10.权利要求9的组合物，其中所述未衍化的、可溶性β-葡聚糖不会诱导引起炎性副作用的生物化学介质。
11.权利要求10的组合物，其中的生物化学介质是白介素-1β、肿瘤坏死因子-α或二者。
12.权利要求9的组合物，其中所述未衍化的、可溶性β-葡聚糖衍生自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
13.一种组合物，其包含具有120,000 Da-205,000 Da之间的平均分子量的未衍化的、可溶性β-葡聚糖，所述组合物可以以最高可达6 mg/kg的最大单一剂量给予人。
14.权利要求13的组合物，其中所述未衍化的、可溶性β-葡聚糖含有总己糖的0.7%-1.6%的还原糖。
15.权利要求13的组合物，其中所述未衍化的、可溶性β-葡聚糖在每mg己糖中含有少于25 μg麦角甾醇。
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