CN103827316B - 测定dna错配修复功能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于测定人受试者是否具有损伤的DNA错配修复功能的定量方法；提供取自所述人的诊断样品及自所述样品产生核提取物；提供MMR充足的和MMR的缺陷核提取物分别作为阳性和阴性对照；组合各核提取物与至少一个带有错配的底物DNA分子；实施错配修复测定；及测定所述样品核提取物是否能修复所述底物DNA分子；其中所述样品包含正常、非恶性的组成性细胞，诸如成纤维细胞。本发明还涉及试剂盒，其提供用于所述方法的必需试剂。

Description

测定DNA错配修复功能的方法
【技术领域】
此项研究得到了欧盟第七届框架计划的资助，拨款协议号为232635。
本发明涉及癌诊断学，并提供基于DNA错配修复测定的方法，其用于测定是否人受试者具有损伤的DNA错配修复功能；及用于鉴定具有缺陷功能的错配修复基因、由此发展遗传性癌，尤其结直肠癌的增加的风险。该方法也提供诊断Lynch综合征的新方法。所述方法在源于正常组织的样品（诸如成纤维细胞）上实施。
【背景技术】
结直肠癌（CRC）是美国和欧洲内癌相关死亡的第2大常见原因。根据由Pino,M.S.and Chung,D.D.in Expert Rev Mol Diagn,10(5):651-665,2010的新近综述，CRC在USA导致了每年约52,000例死亡，在EU导致了每年约146,000例死亡。CRC的大致2～5%的新诊断病例可归因于Lynch综合征。
Lynch综合征（LS）也常被称为遗传性非息肉病结直肠癌综合征（HNPCC），其显现为早期发作结直肠和子宫内膜癌，及特定结肠外癌（包括在消化道其它处（例如,胃,小肠,胆道），尿收集系统（肾盂,输尿管）和女性生殖系统（卵巢））的肿瘤的增加风险。
选定的LS家族的研究估计了结肠癌的70～80%终生危险，诊断出的平均年龄是四十五岁上下。LS中第2大常见的癌是子宫内膜癌，患LS的女性具有发展子宫内膜和卵巢癌的累积终生危险，诊断出的平均年龄相比散发性情况大致早10年。LS患者中胃癌的终生风险随不同人群而不同，在诸如中国和韩国的地区有特别高的发生率，这些地区有胃癌的高地方性风险，有大致30%的终生风险。在这些地区，胃癌的风险超过子宫内膜癌的风险。
Lynch综合征与作为DNA错配修复（MMR）机理基础的基因中突变的常染色体显性遗传高度相关，且其由4种DNA错配修复（MMR）基因即MLH1，MSH2，MSH6和PMS2之一中的种系突变造成。而且，25%的散发性结肠肿瘤，以及子宫内膜、卵巢和一些其他器官和组织的许多肿瘤是MMR缺陷的。MMR蛋白正常识别及修复在被称为微卫星的短重复序列复制期间由DNA聚合酶的滑动导致的错配的核苷酸和插入/缺失环。
参与人错配修复（MMR）机理而作为异源二聚体维持基因组完整性功能的5种蛋白质是MutLα（MLH1+PMS2），MutSα（MSH2+MSH6）和MutSβ（MSH2+MSH3）。MMR蛋白校正在DNA复制和重组期间在新合成的链上出现的碱基/碱基错配和小插入/缺失环（IDL）。
最常被影响的基因包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2，其种系改变在LOVD数据库（http://www.insight-group.org/;http://www.lovd.nl/）中有报导。尽管影响MMR基因的大多数突变是截短，但有显著比例的突变导致单氨基酸取代或框内缺失，其难以与无害的多态性区别。该改变由于变异对多肽功能的效应尚未被表征而常常被称为不确定意义的变体（VUS）。
MMR-缺陷型肿瘤与微卫星不稳定性（MSI）强烈相关。但是，MSI的程度和类型依赖于被影响的MMR基因而不同（Kantelinen et al.,British J Cancer,1-6,2010）。
基于这样的事实，即在LS中，个体已通过突变的等位基因而遗传了易感性，仅需要在体细胞中的第2击即失去MMR活性及起始肿瘤发生，因此LS中癌发作的平均年龄显著地低于散发性结直肠癌。因此，LS肿瘤特征在于成因性MMR蛋白的缺乏或水平降低以及导致MSI的DNA修复损伤。
LS的及时识别对于鉴定需要加强癌监护的高风险患者是必要的。结肠镜检筛选及前体损伤、腺瘤的除去，显著地减少MMR基因突变携带者的癌症发病率和死亡率（等人,Gastroenterology118：829～834,2000）。成本效益分析指示，MMR基因突变携带者中的结 直肠癌监护相比于无监护的结果是有效的，并且花费显著更少。美国疾病控制和预防中心（CDC）建议，新诊断结直肠癌的全部个体，无论其年龄或家族史怎样，均应被提供对于Lynch综合征的遗传测试。CDC报道还指出，对比替代性的策略而建议任何特定筛选策略目前证据并不足。
但是，各种各样的临床表型使LS诊断学变得复杂，且已建立几种临床指南以区别LS家族与一般CRC负担。目前，LS的临床诊断大大依赖于阿姆斯特丹标准或修改的Bethesda指南，其考虑了癌发作年龄，家族中受影响的个体数和分离情况，及MSI水平（Pino&Chung,见上）。但是，许多推定的LS家族不符合这些标准，且可仅通过表征它们中的病原性种系MMR基因突变而被识别为LS家族。
鉴定MMR基因突变携带者，即，受Lynch综合征折磨的受试者的传统诊断流程，包括几个阶段，诸如肿瘤研究，DNA分析，突变致病性的体外测试及自检测遗传缺陷推进到评价是否其与减少的MMR能力相关。诊断LS关联的肿瘤中的第1临床步骤包括免疫组织化学（IHC）和MSI分析，之后是由IHC和MSI结果确定的突变筛选。筛选突变的一种策略是分析全部4种MMR基因（MLH1,MSH2,MSH6和PMS2）。当发现致病性突变时，可确认LS，或在缺乏MMR基因变异下，LS可视为不可能但不排除（由于无论单独或组合使用，均没有哪种方法是100%灵敏和特异性的）。
本发明人的新近出版物（Kansikas等人,Hum Mutat32:107-115,2011）公开了，测试体外合成的突变蛋白的MMR能力构成了致病性测试的基石。该公开的体外MMR测定研究了同源人MMR系统中LS突变的表型结果。LS突变蛋白的构建需要发现目标遗传缺陷并在DNA序列水平上将其完全表征。由此推荐了3-步骤决定树（Couch等人，Hum Mutat29:1314-1326，2008）：
但是，用于建立临床诊断的本测试有几个缺点：
MSI测试是人力-密集性的，需要专业分子病理学服务，并且尽管其是LS的标志。但对LS并不特异。大致10～25%的散发性CRC和许多结肠外癌也呈现MSI。此外，LS-相关的和散发性的MSI-阳性CRC具有许多共同的组织病理学特征，但在散发性MSI CRC与阳性家族史无关联方面有不同。
IHC测试的固有潜在缺点是技术多少有些主观，且依赖于组织制备物的质量、染色及结果解析。有趣的是，异常染色图案可能是组织保存和肿瘤微环境所致。例如，组织低氧或氧化应激可降低MMR蛋白的功能，甚至在遗传性MMR-活性组织中也如此，导致病灶损失或弱染色。MMR基因的继发异常也可导致罕见染色图案。
但是，与诊断LS的该方法相关的最明显的限制是，该测试基于对来自具有已知的或怀疑有LS历史的家族的受试者或者对已患癌的受试者进行的遗传测试和突变分析。此事实使该诊断方法并不适合于怀疑是携带者的健康受试者的常规筛选。此外，该测试方案是非常费力的，需要良好装备的实验室以及高度熟练的实验室人员。已估计这 些步骤，包括IHC、MSI和突变分析的花费为每测试约这对于常规测试来说是昂贵的。
因此，一直以来公认需要有准确、更简单、但更廉价并且在临床适合的测试以用于鉴定一个人是否是与Lynch综合征相关的MMR基因突变的携带者、因而具有结直肠癌以及其他癌的高风险。
【发明概述】
本发明旨在提供无需受试者中LS历史或癌的初步知识而能够实现准确、简单、廉价和临床适合的用于检测MMR效率降低的测试的新方法和手段，由此解决了现有诊断学方法的问题。本发明涉及用于测定人受试者是否具有损伤的DNA错配修复功能的定量方法，其中所述方法包括：（a）从自所述人受试者获得的样品产生核提取物，（b）提供MMR充足的（MMRproficient）和MMR缺陷的（MMR deficient）核蛋白提取物分别作为阳性和阴性对照，（c）在分开的瓶中组合各核提取物与至少一种带有错配的异源双链体DNA底物，（d）对所述样品和对照核蛋白提取物及所述底物实施错配修复测定，及（e）测定所述样品核提取物是否能修复所述底物DNA分子。优选所述样品包含自组成性组织获得的正常细胞，更优选成纤维细胞或源于血的细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述底物源于具有SEQ ID NO:1的质粒，优选所述底物还包含选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
在另一实施方式中，所述MMR缺陷的核提取物源于选自下列的细胞系：HCT116和LoVo细胞。在一个特定实施方式中，每瓶中核提取物的总量在以下范围内：50～500μg，优选50～200μg，更优选75～100μg。
本发明还涉及鉴定具有缺陷功能的错配修复基因的定量方法，其中所述方法包括：（a）从自人受试者获得的样品产生核蛋白提取物，（b）提供MMR充足的和MMR缺陷的核蛋白提取物分别作为阳性 和阴性对照，（c）混合至少一种MMR缺陷的核蛋白提取物与所述样品提取物，（d）在分开的瓶中组合步骤（a）～（c）中提供的每一种核提取物与至少一种带有错配的异源双链体DNA底物，（e）对所述核提取物及所述底物实施错配修复测定，及（f）通过测定所述样品核提取物是否能修复所述底物及弥补所述MMR缺陷的核提取物而鉴定所述缺陷基因。优选所述样品包含自组成性组织获得的正常细胞，更优选成纤维细胞或源于血的细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述底物源于具有SEQ ID NO:1的质粒，优选所述底物还包含选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
在另一实施方式中，所述MMR缺陷的核提取物源于选自下列的细胞系：HCT116和LoVo细胞。在一个特定实施方式中，每瓶中核提取物的总量在以下范围内：50～200μg，优选75～100μg。
此外，本发明涉及诊断人中的Lynch综合征的新方法，所述方法基于使用本发明的MMR测定，从自人受试者的组成性组织获得的临床样品鉴定缺陷DNA错配修复基因。
本发明也涉及用于本发明的方法的试剂盒，其包含至少一种带有错配的异源双链体DNA底物，至少一种MMR缺陷的核提取物，及作为阳性对照的MMR充足的核提取物。优选所述MMR缺陷的核提取物源于就MLH1，MSH2或MSH6而言具有MMR缺乏的细胞系，优选源于HCT116或LoVo细胞。
在本发明的一个特定实施方式中，所述试剂盒包含至少2种MMR缺陷的核提取物。
在又一个实施方式中，所述试剂盒也可包含对于实施MMR测定必需的另外的试剂，诸如10×MMR缓冲剂，所述MMR缓冲剂包含200mM Tris-HCL pH7.6，400mM KCl，50mM MgCl2,10mM谷胱甘肽，BSA500μg/ml，1mM每种dNTP和15mM ATP；及用于MMR测定的停止溶液，所述停止溶液包含42mM EDTA，1.2%SDS，50.4μg/ml蛋白酶K。任选地，所述试剂盒可包含用于澄清样品的试剂， 诸如TE缓冲剂，苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿；用于沉淀所述样品的试剂，诸如NaCl和乙醇；及用于检测修复的试剂，诸如RNA酶A和限制性酶BglII和Eco31I，以及缓冲剂及装载染料。
【附图说明】
下面通过优选的实施方式、参照附图更详细地描述本发明，附图说明如下：
图1是本发明的方法的概图；
图2是相比自MMR充足的细胞系（HeLa）和无核蛋白的MMR缺陷测定对照（MOCK）获得的核提取物，健康成纤维细胞核提取物（FB-WT,野生型）的MMR分析；
图3是蛋白印迹分析，其显示：（a）相比其中MLH1已被部分沉默的成纤维细胞衍生细胞系FB-M1而言，健康成纤维细胞核提取物（FB-WT）的MMR蛋白含量（MLH1和其对应物PMS2），及（b）相比其中MSH2已被部分沉默的成纤维细胞衍生细胞系FB-SH13而言，FB-WT的MMR蛋白含量（MSH2和其对应物MSH6）。
图4是定量MMR分析，其显示FB-M1中MLH1的缺乏和FB-SH13中MSH2的缺乏被检测为修复效率降低，其强度各异。显示相对于FB-WT的修复效率而言的相对修复百分率；以及
图5是定量MMR分析，显示当与MLH1缺陷的核提取HCT116组合使用时可检测到FB-WT和FB-M1的不同MMR能力；以及
图6是底物制备物的示意图，包括pGEM-IDL40，pGEM-IDLGT和pGEM-IDL39的质粒图，及它们的衍生物构建体5’IDLGT和5’IDL1。
【发明详述】
现在已意外地发现，DNA错配修复（MMR）效率的功能评定可用于识别具有遗传性MMR缺乏、由此处于发展癌的显著风险的个体。本发明提供了一种旨在鉴定MMR的缺陷能力的新MMR测定（图1）。 本发明的测定无需任何关于潜在MMR基因序列或调控变化、家族史、癌历史或IHC结果的已有知识即可应用，由此构成了用于诊断目的的新方法。此测定可理想地用于大群体中MMR突变携带者的筛选目的，因此可理想地用于发现具有癌发展高风险的人。
本发明涉及仅由一个测定组成的简单测试流程，而鉴定MMR基因（Lynch综合征）突变携带者的传统诊断流程涉及数个测试，包括自检测遗传缺陷到评价其是否与降低的MMR能力相关。本发明提供通过定量MMR测定而评价个体是否在种系中携带MMR缺陷的一步操作。本发明的方法基于在自待测试的受试者获得的正常组织样品，诸如血、粘膜或成纤维细胞，优选成纤维细胞或成淋巴细胞中检测降低的MMR能力。
如本文所用，术语“正常”组织旨在包括任何健康的非恶性组织，优选组成性组织。
如本文所用，术语“组成性组织”指基本上呈现出生时所遗传的遗传组成且可源于可进行采样的人体任何部分（例如粘膜或成纤维细胞的）非恶性细胞的组织。
本发明的测试流程涉及定量方法。如本文所用，术语“定量方法”指称给出具有改变强度的MMR效率的结果的方法，即其不是开/关型测试。本MMR测定将MMR蛋白不足检测为修复效率的降低（见图4中针对MLH1和MSH2）。如本文所用，MMR基因或蛋白指参与MMR过程的任何基因或蛋白，例如选自：MLH1，MSH2，MSH6，MLH3，MSH3，PMS1，PMS2和EXO1。在一个特定实施方式中，由本发明的方法或手段检测MMR蛋白MLH1，MSH2和/或MSH6的不足。的确，如果例如仅一个正常MMR等位基因存在，如在LS家族中全部MMR基因突变携带者的正常细胞中一样，或如果MMR基因被部分灭活，那么仍有校正错配的某些能力。与此相比，用于癌细胞的现有技术测试揭示MMR是否发生（野生型等位基因均存在）或缺乏（野生型等位基因均不存在），其代表MMR的开/关测试。
DNA的MMR在细胞核内发生，且仅核的MMR蛋白参与修复过 程。借助本发明的方法，有可能测定已进入核内发挥体内修复活性的那些MMR蛋白的功能性，因为此方法的原材料是核提取物。相反，在传统流程中，MMR测定被用于研究体外构建的突变的MMR蛋白产物的MMR效率。在这些体外测试中，待测试的蛋白质被人工添加到核提取物中，根本不可能仅研究天然地存在于核中的这些蛋白质。由此，本发明的致病性测试不同于现有技术的功能测试在于可以揭示核的实际MMR能力。因此，由本发明的方法也有可能发现MMR蛋白的核定位方面的问题。
现有技术方法利用细胞提取物，即细胞质提取物（CE），而不是核提取物。用细胞质提取物的测试给出现实现中能用于修复过程的MMR蛋白的量和比例的错误信息。因此，用细胞质提取物的测试仅适合于开/关测试，而不适合于MMR的定量测试。
在本发明的方法中，无需使用现有技术的任何间接检测方法，诸如大肠埃希氏菌（E.coli）中的互补测定（其中检测通过lacZα的表达进行），而可以直接从琼脂糖凝胶检测MMR能力。
如果需要，本发明的一步测定可以任选地在其后进行鉴定潜在遗传性或后生性缺陷基因的步骤或包括这样的步骤，但此对于临床诊断不是必需的。不同于传统测试，本发明的方法可以识别由于缺陷MMR或甚至尚无家族成员发展癌的情况而具有增加的癌易感性的个体，其中突变测试无可检测的变化，和/或其中潜在变化不是遗传性的，而是表观性（调控性）的。
所建议的测定的基本原理以及不同实施方式以阵列形式显示于表1中，其中Y表示MMR缺陷的核蛋白提取物，X表示测试样品核蛋白提取物，Z表示MMR充足的阳性对照核蛋白提取物。
表1
Y
X
Z Z Z Z
在本发明的一个实施方式中，从自待测试的受试者获得的培养的正常细胞（诸如成纤维细胞）制备测试样品核蛋白提取物（X），并且本发明的MMR测定在分别包含Y（MMR缺陷的核提取物）、X和Z（MMR充足的阳性对照核提取物）的瓶中实施。修复反应将对被限制性内切酶切割不敏感的异源双链体转变为可被切割的同源双链体。如果样品X是MMR充足的，则底物异源双链体会由此被切割并且线性化为3个片段，而如果X是MMR缺陷的，则由线性化仅会产生一个片段。相应地，Y将产生仅一个片段，而Z将产生3个片段。本发明的此实施方式，即MMR+/-测定（+/-指示MMR基因的一个等位基因发挥功能，而另一个有缺陷），能够确定测试的人受试者是否具有损伤的/缺陷MMR功能或正常MMR功能。
在本发明的另一实施方式中，样品核提取物（X）被用于弥补MMR缺陷核提取物（Y）而形成X+Y。然后将弥补的测试样品（X+Y），以及阳性（Z）和阴性（Y）对照用于本发明的MMR测定以研究修复错配的能力。通过使用活性成纤维细胞核提取物（Z）的修复效率作为参照水平测量切割效率来定量修复效率，如在实施例8和图4中例示的。
所述测定中包括的MMR缺陷核提取物数（Yn）可依缺陷是否被认为鉴定出来很重要而改变。在本发明方法的一个优选实施方式中，Y1是MLH1缺陷，Y2是MSH2/MSH6缺陷。在本发明的进一步实施方式中，Y3可为PMS2缺陷。但是，所述MMR缺陷核提取物（Yn）中的任何一个均可省略或被添加使用，可以是任何组合。本领域技术人员能构建适合于目标临床情况的测试系列。
如下详述实施本发明的典型诊断测定。
A.组织样品
待测试的组织样品可为容易获得及处理的任何正常组织。在本发明的一个特定实施方式中，选择的组织样品是可能已由医疗从业者熟知的任何方法获得的人皮肤打孔组织或切除活组织。
可在本发明的方法中使用的其他组织样品包括血液样品，及粘膜 拭子。
B.样品细胞的扩展
为了检查细胞的错配修复（MMR）能力，需在用于提取核蛋白之前培养足够量的细胞。使细胞在适合于使用的细胞类型及本领域熟知的标准细胞培养条件下生长，然后通过对它们轻度离心来收集。
可在本发明的方法中使用源于取自人受试者的临床样品的任何细胞类型，包括源于肿瘤的恶性细胞。本发明的测试中使用的优选的细胞类型是人成纤维细胞。另一优选的细胞类型是源于血的人细胞，诸如淋巴样细胞。
用于本发明测试的细胞最优选是正常原代细胞或转化的正常细胞。
C.自人成纤维细胞提取核蛋白
从细胞的核提取MMR蛋白。将细胞离心沉降，计数及用盐水缓冲剂洗涤，以便去除任何残留的胰蛋白酶。将细胞再用等张缓冲剂洗涤，之后将它们离心沉降，并通过后续低渗剂洗涤的渗透效应进行膨胀。用窄针破坏细胞膜，直到大多数细胞在显微镜下被确认裂解。
在将细胞离心沉淀之后，去除含有细胞质级分的上清液。通过在冷提取缓冲剂中与盐温育而从剩余核级分提取核蛋白，之后将任何残留核碎片离心沉降及去除残留沉淀。然后将提取的核蛋白样品在蛋白酶抑制剂的存在下透析，通过离心进一步澄清，之后存储于-80℃。由荧光计定量样品的蛋白含量。
D.底物制备
通过将单链DNA（ssDNA）和具有一个非同源位点的变性的匹配质粒DNA再退火来制备本发明的MMR测定中使用的环状异源双链体质粒底物。
在重抗生素选择下，在细菌细胞和可商购的辅助噬菌体辅助下从质粒产生ssDNA。将细胞碎片离心沉降，并通过沉淀和再离心收集噬菌体颗粒。也通过离心去除细菌细胞，并用酶处理去除源自细菌的任何残留染色体DNA。样品澄清之后，在蛋白酶辅助下从噬菌体衣壳蛋 白释放ssDNA。
在细菌细胞中扩增含有错配误差的双链（ds）质粒模板，并自其中纯化。为了在误差位点上游具有5’切口，用特定限制性酶线性化构建体，之后将样品沉淀并溶解在适当体积的缓冲剂中。
为了制备用于本发明MMR测定的带有错配的异源双链体底物，将以上描述的ssDNA和匹配质粒DNA变性及再退火在一起。随后的洗涤步骤，包括去除盐及未杂交的线性dsDNA以及未杂交的ssDNA，以及之后的乙醇沉淀确保了最终产物的纯度。用分光光度计以及凝胶电泳来测量浓度，其中后者也用于确证样品纯度。
E.本发明的MMR测定
本发明的MMR测定可仅用于测定测试样品的MMR功能是否缺陷，但也可区分从具有缺陷MMR的细胞提取的核蛋白和自MMR充足的细胞提取的核蛋白的MMR能力，如上所述。为了鉴定MMR缺陷基因，将样品核提取物（X）用于分别地补充MLH1（Y1）和MSH2/MSH6（Y2）缺陷核提取物。
通过组合约50～500μg，优选约50～200μg，更优选约75～100μg的核蛋白提取物与过量的环状质粒底物（异源双链体）来实施本发明的MMR测定，然而在补充良好表征的MMR缺陷细胞系以测定导致该缺乏的MMR基因的情况下，测定中使用的2种提取物的总量应不超过200μg。在确保最佳盐浓度同时也提供ATP和脱氧核糖核苷酸的MMR缓冲剂的存在下诱导修复反应。酶促终止修复反应，并由苯酚/氯仿/异戊醇抽提从样品除去蛋白。
在沉淀之后，使样品经历双消化，如果修复过程成功的话，其将底物异源双链体DNA切割为2个更小片段。由琼脂糖凝胶电泳将这2个更小片段可视化。由于底物DNA被过量加入，线性化的全长产物也会总是可见的。当未发生修复时，仅全长的线性化质粒DNA是可见的。
本发明的另一目的是提供试剂盒，其包含对于实施本发明的方法必需的试剂。本发明的试剂盒包括标准试剂，诸如包含带有必需错配 的异源双链体DNA底物的底物；至少一种，但优选2种MMR缺陷核提取物；及作为阳性对照的MMR充足的核提取物。在本发明的一个特定实施方式中，所述MMR缺陷核提取物源于分别针对MLH1和MSH2/MSH6有缺陷的细胞系。更特别是，所述MMR缺陷核提取物源于HCT116和LoVo细胞。
本发明的试剂盒中包括的试剂应根据表1中公开的基本原理选择。在一实施方式中，第1核提取物（Y1）是MLH1缺陷，而第2核提取物（Y2）是MSH2/MSH6缺陷。如果测试的样品不弥补所述第1核提取物，但确实弥补所述第2核提取物，则所述测试样品揭示MLH1缺乏。但是，如果所述测试的样品确实弥补所述第1核提取物但不弥补所述第2核提取物，则所述测试样品揭示测试的受试者具有MSH2或MSH6缺乏。
任选地，本发明的试剂盒可包括进一步的MMR缺陷核提取物，其特别区别MSH2和MSH6基因的缺乏。该核提取物可源于一些细胞系，诸如MSH6缺陷的HCT-15/DLD-1（ATCCCCL-225/221）。
任选地，本发明的试剂盒也可包含对于实施MMR测定必需的另外的试剂，诸如必需缓冲剂和核苷酸。
在下述实施例中给出了本发明试剂盒的一个实例。
【实施例】
给出下列实施例以进一步举例说明本发明的各实施方式，但不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员明晰，随着技术发展，本发明的构思可以各种方式实施。因此本发明和其实施方式不限于本文所述的实施例，而是可在权利要求的范围之内改变。
【实施例1.培养取自待测试的受试者的成纤维细胞】
使成纤维细胞在37℃5%CO2培养箱中生长在Dulbecco氏改良的Eagle培养基（Invitrogen,CAT#31966-021）中。生长培养基中补充了10%胎牛血清（Invitrogen,CAT#10106-169），2×非必需氨基酸（Invitrogen,CAT#10370-070）和2%青霉素-链霉素（Invitrogen, CAT#15070-063）。当细胞大致80～90%汇合时在胰蛋白酶0.25%EDTA（Invitrogen,CAT#25200-072）辅助下以1:2～1:6传代培养。为了维持在MLH1-耗竭的衍生细胞系FB-M1或在MSH2-耗竭的衍生细胞系FB-SH13中的沉默，将150μg/μl潮霉素B（Invitrogen,CAT#10687-010）加入生长培养基。使细胞在经细胞培养物处理的有滤器封帽的175个瓶（NUNC,CAT#145-178883）中生长，直到收集到大致5×108～109细胞用于提取核蛋白。
【实施例2.细胞系和核提取物】
将贴壁人癌细胞系HeLa，LoVo和HCT116（美国典型培养物保藏中心,Manassas,VA,USA）根据生产商的使用说明培养。HeLa细胞（ATCC CCL-2）是源于一位妇女子宫颈的MMR充足的上皮细胞，而HCT116（ATCC CCL-247）和LoVo细胞（ATCC CCL-229）是源于一位男性结肠的MMR缺陷上皮细胞。HCT116细胞缺乏MLH1，而在LoVo细胞中，MSH2基因被灭活，导致MSH2、MSH3和MSH6蛋白缺乏。已将MSH2的缺乏与其对应物MSH3和MSH6的蛋白水解降解关联起来。
使HeLa细胞在补充了2%L-谷氨酰胺，10%FBS和5%PS的DMEM培养基中生长。使LoVo细胞在补充了2%L-谷氨酰胺、10～20%FBS和5%PS的F12（或F12:DMEM）培养基（Invitrogen,CAT#31765-027/31331-028）中生长，而使HCT116细胞在补充了2%L-谷氨酰胺、10%FBS和5%PS的McCoys5A培养基（Invitrogen,CAT#22330-021）中生长。
FB-M1细胞系如McDaid等人，BJC，101:441-451，2009所述产生。简言之，设计产生在AACTGTTCTACCAGATACTCA处靶向MLH1的siRNA的重叠寡核苷酸，并连接到可商购的shRNA载体pSilencerTM（Ambion CAT#AM7209）中。通过测序验证构建体，之后线性化，并用1μg DNA电穿孔1×107细胞。立即添加血清富集的培养基，将细胞以5×105铺板，之后添加潮霉素选择（150μg/μl）进行 10～14天。类似地，通过使用在TCTGCAGAGTGTTGTGCTT处靶向MSH2的siRNA的重叠寡核苷酸并连接到pSilencerTMshRNA载体内来产生FB-SH13细胞系。
相应地，可使用shRNA载体pSilencerTM4.1-CMV Hygro（Cat#AM5777）制备包含其他MMR基因突变（诸如沉默的MSH6）的成纤维细胞细胞系。成纤维细胞核提取物根据以下流程制备(Lahue et al,Science,245:160-164,1989)：
1.用胰蛋白酶收获5×108-109个对数期细胞。
2.计数细胞。
3.于4℃以500×g离心10min。
4.在20～30ml的冷1×等渗缓冲剂（20mM Hepes pH7.5,5mM KCl,1.5mM MgCl,250mM蔗糖,0.2mM PMSF,1×无EDTA的完全蛋白酶抑制物混合物（Roche DiagnosticsGmbH,Mannheim,德国），0.25μg ml-1抑肽酶,0.7μg ml-1胃酶抑素,0.5μg ml-1亮抑酶肽,1mMDTT）中重悬浮细胞沉淀，并如前所述离心。
5.估计沉淀块细胞体积并将其在20～30ml冷1×低渗缓冲剂（无蔗糖的等渗缓冲剂）中重悬浮，并立即如前所述离心。
6.移出上清液，并将细胞沉淀重悬浮于1×冷的低渗缓冲剂中以获得1～2×108个细胞/ml的细胞密度。自重悬浮体积减去沉淀块细胞体积。
7.用具有窄规格针的注射器通过将细胞缓慢吸入注射器然后用单次快推射出它们来破坏细胞。实施细胞破坏直到80～90%的细胞发生裂解，如在显微镜下确证（50μl于PBS中的0.4%台盼蓝及45μl PBS和5μl细胞）。
8.于4℃以3000×g离心破坏的细胞10min及移出上清液。
9.估计核酸沉淀体积并添加1/3～1/5的冷提取缓冲剂（25mM Hepes pH7.5,10%蔗糖,1mM PMSF,0.5mM DTT,1μg ml-1亮抑酶肽）至沉淀体积。通过移液吸吐充分重悬浮沉淀。
10.测量新体积并一边混合一边添加NaCl至0,155M的终浓度。
11.于4℃旋转混合物60min。
12.于2℃以14500×g离心20min。
13.在3.500MWCO盒中在1L的冷透析缓冲剂（25mM Hepes pH7.5,50mM KCl,0.1mMEDTA pH8,10%蔗糖,1mM PMSF,2mM DTT,1μg ml-1亮抑酶肽）中透析样品2×50min。在头50分钟之后更换缓冲剂。
14.通过于2℃以20000×g离心15min来澄清提取物。
15.在液氮中快速冷冻核蛋白，并存储于-80℃。
【实施例3.蛋白印迹分析】
由蛋白印迹分析，使用50mg的NE和0.1～5μl的野生型总蛋白提取物，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳研究核提取物（NE）中的蛋白表达水平。将蛋白印迹到硝酸纤维素膜（Amersham HypondTM,PVDF,Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden）上，将其随后与单克隆抗体抗-MSH2（Calbiochem,San Diego,CA,USA,MSH2-Ab1,NA-26,0.2mg/ml），抗-MSH3（BD Transduction Laboratories,Lexington,KY,USA,M94120,250mg/ml），抗-MSH6（BD Transduction Laboratories,clone44,0.02mg/ml），抗-PMS2（Calbio-chem/Oncogene Research,San Diego,CA,USA,Ab-1,0.2mg/ml）和抗-MLH1（BD Biosciences/Pharmingen,San Diego,CA,USA,clone168-15,0.5mg/ml）温育。将遍在表达的α-微管蛋白用作装载对照以估计提取物中的MMR蛋白水平（抗α-微管蛋白;Sigma,Louis,MO,USA,DM1A,0.2mg/ml）。
【实施例4.野生型异源二聚体蛋白复合物的产生】
将草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda，Sf9）（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）昆虫细胞用携带野生型（WT）MSH2，MSH3，MSH6，PMS2或MLH1cDNA片段的杆粒DNA转染，之后将细胞再感染以获得高产率的重组杆状病毒（等人,2002）。将这些 WT-重组杆状病毒用于共感染Sf9细胞进行蛋白质生产，用于形成待测定的异源二聚体复合物：MutLα（MLH1+PMS2），MutSα（MSH2+MSH6）和MutSβ（MSH2+MSH3）。在50h（MutLα）或72h（MutSα和MutSβ）通过裂解及离心细胞将异源二聚体复合物作为总蛋白提取物（TE）进行提取。
【实施例5.底物制备】
异源双链体分子的制备。异源双链体DNA分子是在错配位点上游445bp处具有单链切口的环状3192bp长分子。其含有完全BglII限制性位点。通过将自pGEM-IDL40质粒（图6）的单链DNA与基于相同构建体的误差导入质粒（对于5’GT底物是pGEM-IDL GT，或对于5’IDL1底物是pGEM-IDL-39）退火在一起来制备所述分子。
通过用M13K07噬菌体（Amersham Biosci-ences,Piscataway,NJ,USA）感染pGEMIDL40转化的XL1-blue细菌细胞来制备单链DNA（ssDNA），所述噬菌体复制反义链，然后可从细胞提取。由M13噬菌体扩增的下（-）链具有SEQ ID NO:1所示的序列，其中标注了BglII限制性位点。
制备2种不同异源双链体构建体；G-T错配（5’GT）和单核苷酸5’IDL1。根据生产商的使用说明对pGEM-IDL40实施定点诱变（定点诱变,Stratagene,LaJolla,CA,USA），以产生含有误差的pGEM IDLGT和pGEM IDL39质粒。
通过将ssDNA与含有错配的pGEM-IDLGT退火来制造5’GT底物。用于线性dsDNA的此3192bp长碱基质粒（pGEM-IDLGT）含有不完全的BglII限制性位点（GGATCT）。上（+）链互补于自IDL40产生的ssDNA，除了取代在BglII位点中本来互补的A的G之外。pGEM-IDLGT的序列示于SEQ ID NO:2，并标注了该不完全的BgIII限制性位点。
通过使ssDNA与含有误差的pGEM-IDL1退火来制造5’IDL1底物。用于线性dsDNA的此3191bp长基本质粒（pGEM-IDL39）含有 不完全的BglII限制性位点（-GATCT）。上（+）链互补于自IDL40产生的ssDNA，除了在BglII位点中的delA之外。为了创建5’切口，在再退火之前将此环状底物用BamII或DraIII线性化。pGEM-IDL39的序列示于SEQ ID NO:3，并标注了该不完全的BglII限制性位点。
实施例6.本发明的MMR测定
本发明是之前描述的体外MMR测定（等人,2002）的改进形式，可用于直接测定核提取物的MMR能力。此外，通过补充描述于表1的已表征的MMR缺陷提取物，可利用弥补法表征样品中的缺陷MMR基因。将修复反应标准化以包括总共75～100μg的NE。过量量的异源双链体DNA底物（5’GT或5’IDL1）设置为100ng。在具有以下试剂的20μl体积中实施修复反应：
●100ng异源双链体底物
●75～100μg核提取物
●2μl的10×MMR缓冲剂（200mM Tris-HCL pH7.6,400mM KCl,50mM MgCl2,10mM谷胱甘肽,BSA500μg/ml,1mM每种dNTP,15mM ATP）
●KCl以获得110mM终浓度
●添加H2O达20μl。
由于欲在20μl的总体积和110mM的最终KCl浓度下进行反应，需考虑核提取物的KCl含量（2μl的10×MMR缓冲剂会使反应混合物的KCl含量达到40mM）。核提取物的KCl含量推定为75mM/μl。
本发明MMR测定的典型流程是：
1.在冰上一并移取修复反应的组分，并于37℃温育30min。
2.通过添加30μl的新鲜停止溶液（42mM EDTA,1.2%SDS,50.4μg/ml蛋白酶K）停止反应。于37℃温育20min。
3.添加1体积（50μl）的TE缓冲剂pH8.0。
4.添加1体积的苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）并涡旋10s。于室温以最大速度离心10min。
5.转移上层相（大致90μl）到新管，并添加等体积的氯仿。涡旋10s，并于室温以最大速度离心10min。
6.转移85μl的上层相至新鲜管，用于乙醇沉淀。
7.添加NaCl至获得150mM的终浓度，之后加入2.5体积的冷无水乙醇。于-20℃温育30分钟。
8.通过于4℃将样品以全速离心30分钟来沉淀DNA。
9.用150μl的70%乙醇洗涤沉淀，以全速离心10分钟，干燥及在6μl的ddH2O中重悬浮沉淀。
10.添加4μl的新鲜制备的10×消化混合物（2.5μlBglII（Fermentas,CAT#FD0083），2.5μlEco31I（Fermentas,CAT#FD0293），10μl缓冲剂和25μlddH2O），并于37℃温育10分钟。
11.添加RNA酶A达40μg/ml，并于37℃温育10分钟。
12.将样品装载到用1xTAE制备的1.0%琼脂糖凝胶上以观察是否发生了修复。
通过使用4.0（Media Cybernetics,Silver Spring,MD,USA）分析修复百分率。
将MMR-活性HeLa NE用作阳性对照，而将未弥补的MMR缺陷NE用作阴性对照。将底物用Eco31I限制性酶线性化。由于修复反应将GT异源双链体转变为AT同源双链体，或填充1或2nt环结构而重建BglII限制性位点，因此可由双消化的效率测量修复效率。
【实施例7.本发明的MMR测定中使用的成纤维细胞】
实施此实施例以显示可对正常组织（诸如成纤维细胞）实施MMR测定。对如实施例2中所述制备的野生型成纤维细胞核提取物（FB-WT），来自MMR充足的HeLa细胞的核提取物和不含有蛋白的阴性对照（MOCK）进行如在实施例3中所述的本发明MMR测定。
在允许修复反应发生之后，当不发生修复时，底物DNA的双消化会产生大致3000bp的单个较大条带，而当发生修复时，会产生另2 个较小片段（大致1800和1300bp）。由于底物DNA总是过量添加，甚至MMR活性提取物也会除了双切割片段之外还具有该线性化的底物存在。
此测定的结果示于图2，其显示含有MOCK细胞的泳道1仅具有一个大条带（=无修复），然而，分别含有FB-WT和HeLa核提取物的泳道2和3显示2个另外的较小条带，指示有修复反应。
因此此实施例明确地显示，自正常成纤维细胞的核提取物具有可与MMR充足的对照细胞系（HeLa）相当的MMR能力，这可由本发明的测定确认。
实施例8.在本发明的MMR测定中，具有部分沉默的MMR基因的人成纤维细胞显示降低的MMR能力
此实施例显示人成纤维细胞细胞系FB-M1和FB-SH13（描述于实施例2，其中MLH1基因或MSH2基因分别由(sh)RNA技术部分沉默）显示MMR能力的明显降低。
首先，对等量的自野生型成纤维细胞（FB-WT）细胞和FB-M1细胞或FB-WT和FB-SH13细胞的核提取物实施蛋白印迹。结果（图3）可看到，相比FB-WT而言，FB-M1细胞中MLH1蛋白的量明显降低，如FB-SH13细胞中MSH2的水平降低一样。包括了α-微管蛋白作为装载对照。
其次，如在实施例6中描述，使用等量的相同核提取物实施MMR测定：
MOCK-无核提取物的阴性测定对照；
FB-WT-野生型人成纤维细胞核提取物（阳性对照）；以及
FB-M1-来自具有部分沉默的MLH1的人成纤维细胞的核提取物；或者
FB-SH13-来自具有部分沉默的MSH2的人成纤维细胞的核提取物。
此测定的结果显示，关键MMR蛋白之一的降低浓度与缺陷的 MMR机理有关联。结果显示于图4，其明显证明了，相比野生型人成纤维细胞核提取物，本发明的MMR测定检测MLH1和MSH2的缺乏为修复效率的降低。此外，当与野生型或部分MMR缺陷核提取物一起测定时，MMR缺陷核提取物的MMR能力可被有差异地恢复，如在图5显示（在此情况中，HCT116与FB-WT或FB-M1一起）及表1显示及第10～11页描述的测试所述。
本发明的MMR测定的修复效率被视为是反应中全部底物DNA的修复DNA的百分率。关键MMR蛋白的不足以改变的强度降低修复效率，而关键MMR蛋白的完全缺乏将修复效率降低至不可检测的水平。
实施例9.用于MMR中诊断缺陷的测定中使用的试剂盒
本发明的试剂盒优选作为预装载有用于实施MMR测定的全部试剂的瓶提供。仅添加测试样品核提取物。在本发明的一个实施方式中，提供分开的瓶用于待测试的不同MMR缺乏。
此实施例描述了用于测定受试者是否具有Lynch综合征的试剂盒，其通过测定所述受试者是否具有MLH1基因的缺陷或者MSH2或MSH6基因的缺陷来进行，其中在后者的情况下不进行区分。该试剂盒具有至少5个分开的瓶。
表2
瓶 试剂
1 HCT116 =MLH1缺陷对照NE
2 LoVo =MSH2/6缺陷对照NE
3 HCT116 =待由样品NE补充
4 LoVo =待由样品NE补充
5 FB-WT =MMR充足的NE，阳性对照
所述瓶中包括的试剂有：
●底物异源双链体
●核提取物（HCT116,LoVo或FB-WT）
●10×MMR缓冲剂（200mM Tris-HCL pH7.6,400mM KCl,50mM MgCl2,10mM谷胱甘肽,BSA500μg/ml,1mM每种dNTP,15mM ATP）。
除此之外，需要用于MMR测定的停止溶液（42mM EDTA,1.2%SDS,50.4μg/ml蛋白酶K），其可随试剂盒一起提供。
此外，所述试剂盒可任选地含有澄清样品（TE缓冲剂,苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿），沉淀样品（NaCl和乙醇）及检测修复（RNA酶A和限制性酶BglII和Eco31I及缓冲剂和装载染料）需要的试剂。
试剂盒的其他任选的组分是培养待从中提取样品核蛋白的细胞所需要的试剂，以及自其提取核蛋白需要的试剂（见实施例2）。
本发明的试剂盒不局限于任何特定形式或类型的瓶。如在实施例6中描述的适合于操作及温育的任何类型的瓶，诸如管是适合的。

Claims (18)

1.至少一种带有错配的异源双链体DNA底物在制备用于测定人受试者是否具有遗传的受损DNA错配修复功能MMR+/-的定量方法中的制剂中的用途，其中所述方法包括:
a)培养来自所述人受试者的正常组成性组织样品的原代成纤维细胞；
b)从所述人受试者的所述培养的原代成纤维细胞产生核蛋白提取物；
c)提供来自细胞系的MMR充足型MMR+/+和MMR缺陷型MMR-/-核蛋白提取物分别作为阳性和阴性对照；
d)在分开的瓶中将至少一种带有错配的异源双链体DNA底物分别与步骤b)的原代成纤维细胞核蛋白提取物、步骤c)的MMR充足型MMR+/+核蛋白提取物和MMR缺陷型MMR-/-核蛋白提取物中的一种组合；
e)用所述DNA底物对原代成纤维细胞的核蛋白提取物以及对照核蛋白提取物实施错配修复测定；和
f)定量测定所述原代成纤维细胞的核蛋白提取物修复所述底物DNA分子的能力，其中与MMR充足型MMR+/+核蛋白提取物对照相比其修复效率降低指示所述受试者中具有遗传的受损DNA错配修复功能MMR+/-。
2.权利要求1的用途，其中所述DNA底物源于具有SEQ ID NO:1的质粒。
3.权利要求2的用途，其中所述DNA底物还包含选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
4.权利要求1的用途，其中所述MMR缺陷型MMR-/-核蛋白提取物源于选自下列的细胞系：HCT116和LoVo细胞。
5.权利要求4的用途，其中每瓶的核蛋白提取物总量在50～500μg范围内。
6.非诊断性地体外鉴定具有缺陷型MMR+/-功能的错配修复基因的定量方法，其中所述方法包括：
a)培养获自人受试者的正常组成性组织样品的原代成纤维细胞；
b)从所述人受试者的所述培养的原代成纤维细胞产生核蛋白提取物；
c)提供来自细胞系的MMR充足型MMR+/+和MMR缺陷型MMR-/-核蛋白提取物分别作为阳性和阴性对照；
d)混合步骤c)的至少一种MMR缺陷型核蛋白提取物与步骤b)的所述核蛋白提取物；
e)在分开的瓶中将至少一种带有错配的异源双链体DNA底物与步骤c)的至少一种MMR缺陷型MMR-/-核蛋白提取物和步骤b)的所述核蛋白提取物的混合物组合，以及；
f)对步骤e)的所述核蛋白提取物及所述DNA底物实施错配修复测定；及
g)通过测定步骤b)的所述核蛋白提取物是否能修复所述DNA底物来鉴定所述缺陷基因。
7.权利要求6的方法，其中所述DNA底物源于具有SEQ ID NO:1的质粒。
8.权利要求7的方法，其中所述DNA底物还包含选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
9.权利要求6的方法，其中所述MMR缺陷型MMR-/-核蛋白提取物源于选自下列的细胞系：HCT116和LoVo细胞。
10.权利要求9的方法，其中每瓶中的核蛋白提取物总量在50～500μg范围内。
11.用于通过使用权利要求6～10之任一项的方法鉴定缺陷DNA错配修复基因的试剂在制备用于诊断人中的Lynch综合征的制剂中的用途，其中所述原代成纤维细胞来自由人受试者的组成性组织获得的临床样品。
12.至少一种带有错配的异源双链体DNA底物在制备用于鉴定具有缺陷MMR+/-功能的错配修复基因的定量方法的制剂中的用途，其中所述方法包括：
a)培养获自人受试者的正常组成性组织样品的原代成纤维细胞；
b)从所述人受试者的所述培养的原代成纤维细胞产生核蛋白提取物；
c)提供来自细胞系的MMR充足型MMR+/+和MMR缺陷型MMR-/-核蛋白提取物分别作为阳性和阴性对照；
d)混合步骤c)的至少一种MMR缺陷型核蛋白提取物与步骤b)的所述核蛋白提取物；
e)在分开的瓶中将至少一种带有错配的异源双链体DNA底物与步骤c)的至少一种MMR缺陷型MMR-/-核蛋白提取物和步骤b)的所述核蛋白提取物的混合物组合；
f)对步骤e)的所述核蛋白提取物及所述DNA底物实施错配修复测定；及
g)通过测定步骤b)的所述核蛋白提取物是否能修复所述DNA底物来鉴定所述缺陷基因。
13.权利要求12的用途，其中所述DNA底物源于具有SEQ ID NO:1的质粒。
14.权利要求13的用途，其中所述DNA底物还包含选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
15.权利要求12的用途，其中所述MMR缺陷型MMR-/-核蛋白提取物源于选自下列的细胞系：HCT116和LoVo细胞。
16.权利要求15的用途，其中每瓶中的核蛋白提取物总量在50～500μg范围内。
17.权利要求6的方法，其中所述错配修复基因选自下组中：MLH1、MSH2、MSH6、MLH3、MSH3、PMS1、PMS2和EXO1。
18.权利要求12的用途，其中所述错配修复基因选自下组中：MLH1、MSH2、MSH6、MLH3、MSH3、PMS1、PMS2和EXO1。
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