BR112013033478B1

BR112013033478B1 - método in vitro para determinar a função de reparo de malparemento e método in vitro para diagnosticar a síndrome de lynch

Info

Publication number: BR112013033478B1
Application number: BR112013033478A
Authority: BR
Inventors: Nyström Minna; Kansikas Minttu; Peltomäki Päivi
Original assignee: Helsingin Yliopisto
Priority date: 2011-07-01
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2020-04-14
Also published as: US20140220559A1; AU2012280397B2; RU2014103137A; PL2726629T3; JP5897706B2; EP2726629A1; IL230002A; ES2646394T3; AU2012280397A1; PT2726629T; FI20115709A0; CA2840526A1; US9994899B2; EP2726629B1; CN103827316A; WO2013004618A1; CA2840526C; JP2014520515A; CN103827316B; DK2726629T3

Abstract

resumo patente de invenção: "método para determinar a função de reparo de malparemento". a presente invenção refere-se a um método quantitativo para determinar se um indivíduo humano tem uma função de reparo de malpareamento de dna enfraquecida; oferecer uma amostra para diagnóstico retirada do referido ser humano e produzir um extrato nuclear a partir da referida amostra; oferecer extratos nucleares proficientes em mmr e deficientes em mmr como controles positivo e negativo, respectivamente; combinar cada extrato nuclear com pelo menos uma molécula de dna de substrato carregando malpareamento; conduzir um ensaio de reparo de malpareamento; e determinar se a referida extrato nuclear de amostra é capaz de reparar a referida molécula de dna do substrato; onde a referida amostra compreende células constitutivas não malignas normais, tais como fibroblastos. a invenção refere-se ainda a um kit oferecendo os reagentes necessários para uso no referido método.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO IN VITRO PARA DETERMINAR A FUNÇÃO DE REPARO DE MALPAREMENTO E MÉTODO IN VITRO PARA DIAGNOSTICAR A SÍNDROME DE LYNCH.

CAMPO DA INVENÇÃO [0001] Esta invenção refere-se ao diagnóstico de câncer e oferece métodos baseados em um ensaio de reparo de malpareamento de DNA para determinar de um indivíduo humano tem uma função de reparo de malpareamento de DNA enfraquecida; e para identificar um gene de reparo de malpareamento tendo uma função defeituosa e por conseguinte um risco aumentado de desenvolver cânceres hereditários, especialmente câncer colorretal. O método também oferece um novo método de diagnóstico da síndrome de Lynch. O método é realizado em uma amostra derivado de tecido normal, tal como fibroblastos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] O câncer colorretal (CRC) é a segunda causa mais comum de morte associada ao câncer nos Estados Unidos e na Europa. Segundo um recente artigo de revisão de Pino, M.S. e Chung, D.D. em Expert Rev Mol Diagn, 10(5):651 -665,2010, o CRC é responsável por aproximadamente 52.000 mortes por ano nos Estados Unidos e 146.000 mortes por ano na União Europeia. Aproximadamente 2-5% dos casos de CRC diagnosticados recentemente podem ser atribuídos à síndrome de Lynch.

[0003] síndrome de Lynch (LS), frequentemente também chamada de síndrome de câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC), manifesta-se pelo câncer colorretal e endometrial de início prematuro, e um risco aumentado de certos cânceres extracolônicos, incluindo tumores em alguma outra parte do trato gastrointestinal (por exemplo, estômago, intestino delgado, trato biliar), do sistema coletor urinário

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 7/83

2/32 (pelve renal, ureter) e do sistema reprodutor feminino (ovários).

[0004] Estudos de famílias de LS selecionados estimaram um risco de 70-80% de câncer de cólon com uma idade média no momento do diagnóstico em torno de 45 anos. O segundo câncer mais comum em LS é o câncer endometrial, e mulheres com LS apresentam um risco cumulativo de desenvolver câncer endometrial e de ovário, com uma idade média no momento do diagnóstico 10 anos antes do que os casos esporádicos. O risco de câncer gástrico em pacientes com LS varia entre as populações, com uma incidência particularmente alta em áreas tais como a China e a Coreia, onde existe um risco endêmico alto de câncer gástrico, com um risco de aproximadamente 30%. Nessas áreas, o risco de câncer gástrico ultrapassa o risco de câncer endometrial.

[0005] A síndorme de Lynch é altamente associada à herança autossômica dominante de mutações em genes fundamentais para o mecanismo de reparo de malpareamento de DNA (MMR), e é causada por mutações na linhagem germinativa em um dos quatro genes de reparo de malpareamento de DNA (MMR), MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2. Além disso, 25% dos tumores de cólon esporádicos, assim comi inúmeros tumores de endométrio, ovário e alguns outros órgãos e tecidos, são deficientes em MMR. As proteínas de MMR normalmente reconhecem e reparam nucleotídeos malpareados e/ou alças de inserção/deleção causadas pelo escorregamento da DNA polimerase durante a replicação de sequências de repetição curtas conhecidas como microssatélites.

[0006] As cinco proteínas envolvidas no mecanismo de reparo de malpareamento (MMR) humano para manter a função de integridade genômica como heterodímeros são MutLa (MLH1 +PMS2), MutSa (MSH2+MSH6) and MutS (MSH2+MSH3). As proteínas MMR corrigem malpareamentos base/base e alças de inserção/deleção (IDLs) pe

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 8/83

3/32 quenas que surgem no cordão recém-sintetizado durante a replicação e recombinação do DNA.

[0007] Os genes afetados com mais frequência incluem MLH1,

MSH2, MSH6 e PMS2, cujas variações na linhagem germinativa estão apresentadas no banco de dados LOVD (http://www.insight-group.org/; http://www.lovd.nl/). Embora a maioria das mutações que afetam os genes de MMR sejam truncantes, uma proporção significativa de mutações resultam na substituição de um único aminoácido ou em uma deleção in-frame e são difíceis de serem distinguidas de polimorfismos inofensivos. Tais variações normalmente são chamadas de variantes de significância incerto (VUS) devido ao efeito não caracterizado da variações sobre a função do polipeptídio.

[0008] Os tumores deficientes em MMR são fortemente associados à instabilidade microssatélite (MSI). No entanto, o grau e o tipo de MSI diferem dependendo do gene de MMR afetado (Kantelinen et al., British J Cancer, 1 -6, 2010).

[0009] A idade média de aparecimento de câncer na LS é significativamente mais baixa que aquela de câncer colorretal esporádico com base no fato de que, na LS, um indivíduo já possui a susceptibilidade herdada através de um alelo mutado e precisa apenas de um segundo estímulo em uma célula somática para perder a atividade de MMR e dar início à tumorigênese. Consequentemente, os tumores associados à LS caracterizam-se pela falta ou pelo nível reduzido de uma proteína de MMR causativa assim como de reparo de DNA enfraquecimento causando MSI.

[00010] O pronto reconhecimento da LS é essencial para identificar pacientes de alto risco que vão requerer controle intensivo quanto ao aparecimento de câncer. Colonoscopia e remoção de lesões precursoras, adenomas, reduzem significativamente a morbidade e mortalidade associadas ao câncer em portadores da mutação do gene de MMR

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 9/83

4/32 (Jarvinen et al., Gastroenterology 118: 829-834, 2000). Análises de custo reduzido indicam que o controle do aparecimento de câncer colorretal em portadores da mutação do gene de MMR é eficaz e consideravelmente mais barato que as consequências do não controle. Os Centros para Controle e Prevenção de Doenças (CDC) nos Estados Unidos recomendam que todos os indivíduos com um novo diagnóstico de câncer colorretal, independente da idade ou histórico familiar, tenha acesso ao exame genético para a síndrome de Lynch. O relatório dos CDC afirma adicionalmente que ainda não há evidências suficientes para recomendar qualquer estratégia de exame específica vs. estratégias alternativas.

[00011] Entretanto, uma grande variedade de fenótipos clínicos complica o diagnóstico da LS e diversas normas clínicas foram estabelecidas para distinguir famílias de LS da carga de CRC geral. Atualmente, o diagnóstico clínica da LS depende bastante dos critérios de Amsterdam e das normas revisadas de Bethesda, que levam em consideração a idade do aparecimento do câncer, o número e a segregação de indivíduos afetados em uma família, e o nível de MSI (Pino & Chung, Supra). No entanto, muitas famílias putativas de LS não satisfazem esses critérios e poderiam ser reconhecidas como famílias de LS apenas pela caracterização de uma mutação no gene de MMR na linhagem germinativa patogênica nas mesmas.

[00012] O tradicional fluxo de trabalho de diagnóstico para identificar portadores de mutação no gene de MMR, isto é, indivíduos acometidos pela síndrome de Lynch, envolve diversas fases, tais como estudos do tumor, análises de DNA, testes in vitro para verificar a patogenicidade da mutação e vai desde detectar um defeito genético até avaliar se ele está associado à capacidade reduzida de MMR. A primeira etapa clínica no diagnóstico de tumores associados à LS inclui imunohistoquímica (IHC) e análise por MSI seguida pelo rastreamento de

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 10/83

5/32 mutações ditado pelos resultados da IHC e MSI. Uma estratégia para rastrear mutações é analisar todos os quatro genes de MMR (MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2). Quando uma mutação patogênica é encontrada, a LS pode ser confirmada ou na ausência de uma variação de um gene de MMR, considerada improvável mas não descartada (uma vez que nenhum método, seja usado isoladamente ou em combinação, é 100% sensível e específico).

[00013] Uma recente publicação dos presentes inventores (Kansikas et al., Hum Mutat 32:107-115, 2011 ) divulga que testar proteínas mutantes sintetizadas in vitro quanto à capacidade de MMR forma a cornerstona para testar a patogenicidade. O ensaio de MMR in vitro publicado estuda as consequências fenotípicas das mutações de LS em um sistema de MMR humano homólogo. A construção da proteína mutante de LS requer que o defeito genético em questão seja encontrado e totalmente caracterizado no nível de sequência do DNA. Uma árvore de decisão de três etapas foi então proposta (Couch et al., Hum Mutat 29:1314-1326, 2008):

HISTÓRICO FAMILIAR

Suspeta de Lynch (IHC.MSI)

ETAPA 1

TESTAGEM GENÉTICA, variances de signiícância incerta; (VSI)

ETAPA 2

ANÁLI SE WS1UCO &

ENSAIO DE MMR WWTRO

Atividade de MMR

ETAPA 3

LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR

INTERAÇÕES PROTEICAS ESTABILIDADE DAS PROTEÍNAS

OUTROS ENSAIOS W WTRO

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 11/83

6/32 [00014] Entretanto, existem diversas desvantagens associadas aos testes atuais usados para o estabelecimento de um diagnóstico clínico: [00015] A testagem de MSI é muito trabalhosa e requer serviços especializados de patologia molecular, e embora seja uma indicação para LS, não é específica para isso. Aproximadamente 10-25% de CRCs esporádicos e muitos cânceres extracolônicos também exibem MSI. Além disso, CRCs associados a LS e MSI-positivos esporádicos têm muitos aspectos histopatológicos em comum, mas diferem pelo fato de que CRCs MSI esporádicos não são associados a um histórico familiar positivo.

[00016] Uma potencial deficiência inerente do teste de IHC é que a técnica é um tanto subjetiva e depende da qualidade de preparação do tecido, coloração e interpretação dos resultados. Curiosamente, os padrões de coloração anormais podem ser devido à preservação do tecido e ao microambiente do tumor. Por exemplo, hipoxia ou estresse oxidativo do tecido podem diminuir a função das proteínas de MMR, mesmo em tecidos geneticamente proficientes em MMR, levando a uma perda focal ou coloração fraca. Anormalidades secundários em genes de MMR também podem levar a padrões de coloração raros.

[00017] Entretanto, a limitação mais óbvia em relação aos presentes métodos de diagnóstico da LS é que os testes baseiam-se na testagem genética e análise de mutações em indivíduos de uma família com um histórico conhecido, ou suspeito, de LS, ou em indivíduos que já foram afetados pelo câncer. Este fato faz com que os atuais métodos de diagnóstico não sejam adequados para triagem de rotina de indivíduos saudáveis com suspeita de serem portadores. Além disso, os atuais esquemas de testagem são muito trabalhosos exigindo laboratórios bem equipados assim como profissionais de laboratório altamente qualificados. Foi estimado que as etapas incluindo análise de IHC, MSI e mutações totalizam cerca de 3500€ por teste, o que é dis

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 12/83

7/32 pendioso para um exame de rotina.

[00018] Há, portanto, uma necessidade bem consolidada e reconhecida de exames precisos, mais simples, porém mais baratos e clinicamente adequados para identificar se uma pessoa é portadora de mutações no gene de MMR relacionado com a síndrome de Lynch e, portanto, sujeito a um alto risco de câncer colorretal, assim como a outros cânceres.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [00019] Constitui o objetivo da presente invenção oferecer novos métodos e meios para a realização de exames precisos, simples, baratos e clinicamente adequados para detectar uma redução na eficiência de MMR sem conhecimento preliminar de histórico de LS ou cânceres nos indivíduos, e assim resolver os problemas dos atuais métodos de diagnóstico. A presente invenção refere-se a um método quantitativo para determinar se um indivíduo humano tem uma função de reparo de malpareamento de DNA enfraquecida, onde o referido método compreende a) produzir um extrato nuclear a partir de uma amostra obtida do referido indivíduo humano, b) oferecer extratos de proteína nuclear proficientes em MMR e deficientes em MMR como controles positivo e negativo, respectivamente, c) combinar em frascos separados cada extrato nuclear com pelo menos um substrato de DNA heterodúplex carregando malpareamento, d) conduzir um ensaio de reparo de malpareamento nas referidas amostras de extrato de proteína nuclear de controle e no referido substrato, e e) determinar se a referida extrato nuclear de amostra é capaz de reparar a referida molécula de DNA do substrato. De preferência a referida amostra compreende células normais obtidas a partir de um tecido constitutivo, mais preferivelmente fibroblastos ou células derivadas do sangue.

[00020] Em uma modalidade da invenção, o referido substrato é derivado de um plasmídio tendo a SEQ ID N°: 1, e de preferência o

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 13/83

8/32 referido substrato compreende ainda uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N°:

3.

[00021] Em uma outra modalidade o extrato nuclear deficiente em MMR é derivado de uma linhagem celular selecionada do grupo que consiste em células HCT116 e células LoVo. Em uma modalidade específica a quantidade total de extrato nuclear por frasco varia na faixa de 50-500 pg, de preferência 50-200 pg, mais preferivelmente 75-100 Pg.

[00022] A presente invenção refere-se ainda a um método quantitativo para identificar um gene de reparo de malpareamento tendo uma função defeituosa, onde o referido método compreende a) produzir um extrato de proteína nuclear a partir de uma amostra obtida de um indivíduo humano, b) oferecer extratos de proteína nuclear proficientes em MMR e deficientes em MMR como controles positivo e negativo, respectivamente, c) misturar pelo menos um extrato de proteína nuclear deficiente em MMR com a referida amostra de extrato, d) combinar em frascos separados cada extrato nuclear oferecidos nas etapas a-c com pelo menos um substrato de DNA heterodúplex carregando malpareamento, e) conduzir um ensaio de reparo de malpareamento nos referidos extratos nucleares e no referido substrato, e f) identificar o referido gene defeituoso determinando se a referida extrato nuclear de amostra é capaz de reparar o referido substrato e complementar o referido extrato nuclear deficiente em MMR. De preferência a referida amostra compreende células normais obtidas a partir de um tecido constitutivo, mais preferivelmente fibroblastos ou células derivadas do sangue.

[00023] Em uma modalidade da invenção, o referido substrato é derivado de um plasmídio tendo a SEQ ID N°: 1, e de preferência o referido substrato compreende ainda uma sequência de ácidos nuclei

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 14/83

9/32 cos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N°:

3.

[00024] Em uma outra modalidade o extrato nuclear deficiente em MMR é derivado de uma linhagem celular selecionada do grupo que consiste em células HCT116 e células LoVo. Em uma modalidade específica a quantidade total de extrato nuclear por frasco varia na faixa de 50-200 pg, de preferência 75-100 pg.

[00025] Além disso, a presente invenção refere-se a um novo método para o diagnóstico da síndrome de Lynch em um ser humano, baseado na identificação de um gene de reparo de malpareamento de DNA defeituoso usando um ensaio de MMR de acordo com a presente invenção, a partir de uma amostra clínica obtida de um tecido constitutivo de um indivíduo humano.

[00026] A presente invenção também se refere a um kit para uso nos métodos de acordo com a presente invenção, compreendendo pelo menos um substrato de DNA heterodúplex carregando malpareamento, pelo menos um extrato nuclear deficiente em MMR, e um extrato nuclear proficiente em MMR como um controle positivo. De preferência os referidos extratos nucleares deficientes em MMR são derivados de uma linhagem celular tendo uma deficiência em MMR em relação a qualquer um dentre MLH1, MSH2 ou MSH6, de preferência de células HCT116 ou células LoVo.

[00027] Em uma modalidade específica da presente invenção, o kit compreende pelo menos dois extratos nucleares deficientes em MMR. [00028] Em uma outra modalidade o kit também pode incluir reagentes adicionais necessários para conduzir o ensaio de MMR, tais como 10X tampão MMR compreendendo 200 mM de Tris-HCL pH 7,6, 400 mM de KCI, 50 mM de MgCI2,10 mM de glutationa, BSA 500 pg/ml, 1 mM de cada dNTP e 15 mM de ATP; e uma solução STOP para o ensaio de MMR compreendendo 42 mM de EDTA, 1,2% de

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 15/83

10/32

SDS, 50,4 qg/ml de proteinase K. Opcionalmente, o kit pode compreender reagentes para clarificar a amostra, tais como tampão TE, fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e clorofórmio; para precipitar a referida amostra, tais como NaCl e etanol; e para detectar o reparo, tais como RNase A e as enzimas de restrição Bg/II and Eco31I com tampão e corante de carga.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [00029] A seguir a invenção será descrita em maiores detalhes por meio de modalidades preferidas com referência aos desenhos em anexo, nos quais

A Figura 1 é um panorama do método da presente invenção;

A Figura 2 é uma análise de MMR de um extrato nuclear de fibroblasto saudável (FB-WT, tipo selvagem) comparado com aquele obtido a partir de uma linhagem celular proficiente em MMR (HeLa) e um controle de ensaio deficiente em MMR (MOCK) sem proteínas nucleares;

A Figura 3 é uma análise da mancha ocidental mostrando

a) o teor de proteínas de MMR (MLH1 e sua contraparte PMS2) de um extrato nuclear de fibroblasto saudável (FB-WT) comparado com a linhagem celular derivada de fibroblasto FB-M1 onde o MLH1 fora parcialmente silenciado e b) o teor de proteínas de MMR (MSH2 e sua contraparte MSH6) de FB-WT comparado com a linhagem celular derivada de fibroblasto FB-SH13 onde MSH2 fora parcialmente silenciado.

A Figura 4 é uma análise quantitativa de MMR mostrando que a deficiência de MLH1 em FB-M1 e de MSH2 em FB-SH13 é detectada como uma redução na eficiência de reparo com intensidade variável. As percentagens relativas de reparo estão mostradas em relação à eficiência de reparo de FB-WT; e

A Figura 5 é uma análise quantitativa de MMR mostrando

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 16/83

11/32 que capacidades de MMR diferentes do FB-WT e do FB-M1 podem ser detectadas quando usados em combinação com um extrato nuclear deficiente em MLH1 HCT116); e

A Figura 6 é uma representação esquemática da preparação de substrato, incluindo as representações de plasmídio de pGEMIDL40, pGEM-IDLGT e pGEM-IDL39, e suas construções derivadas 5'IDLGT e 5'IDL1 .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [00030] Foi surpreendentemente descoberto que uma avaliação funcional da eficiência de reparo de malpareamento (MMR) de DNA pode ser usada para reconhecer indivíduos com uma deficiência de MMR herdada, tendo assim um risco considerável de desenvolver câncer. A presente invenção oferece um novo ensaio de MMR, que tem como objetivo identificar a capacidade deficiente para MMR (Figura 1 ). O ensaio de acordo com a presente invenção pode ser aplicado sem qualquer conhecimento prévio da sequência genética ou alteração reguladora de MMR subjacente, histórico familiar, histórico de câncer ou resultados de IHC e, por conseguinte, constitui uma nova abordagem para fins de diagnóstico. O ensaio é ideal para fins de rastreamento de portadores de mutação em MMR em populações grandes, e, por conseguinte, para encontrar pessoas com alto risco de desenvolver câncer.

[00031] A presente invenção refere-se a um protocolo de exame simples consistindo em um único ensaio, ao passo que o fluxo de trabalho tradicional para fins de diagnóstico para identificar portadores de mutação no gene de MMR (síndrome de Lynch) envolve diversos exames, e vai desde detectar um defeito genético até avaliar se ele está associado à capacidade reduzida de MMR. A presente invenção oferece um procedimento de uma etapa que avalia se um indivíduo é ou não portador de um defeito em MMR na linhagem germinativa, de

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 17/83

12/32 terminado por um ensaio quantitativo de MMR. O método de acordo com a presente invenção baseia-se na detecção de capacidade de MMR reduzida em uma amostra de tecido normal, tal como sangue, mucosa ou fibroblastos, de preferência fibroblastos ou linfoblastos obtidos do indivíduo a ser examinado.

[00032] Conforme usado neste relatório, o termo tecido normal inclui qualquer tecido não maligno saudável, de preferência um tecido constitutivo.

[00033] Conforme usado neste relatório, o termo tecido constitutivo refere-se aos tecidos de células não malignas que representam substancialmente a composição genética herdada ao nascer e que pode ser derivada de qualquer parte do corpo humano acessível para amostragem, por exemplo, mucosa ou fibroblastos.

[00034] O protocolo de exame da presente invenção refere-se a um método quantitativo. Conforme usado neste relatório, o termo método quantitativo refere-se a um método, que oferece resultados da eficiência de MMR com intensidade variável, isto é, não é um exame on/off (liga/desliga). O presente ensaio de MMR detecta deficiências de proteínas de MMR como uma redução na eficiência de reparo (vide Figura 4 para MLH1 e MSH2). Conforme usado neste relatório, genes ou proteínas de MMR referem-se a quaisquer genes ou proteínas que participam no processo de MMR, por exemplo, selecionados do grupo que consiste em MLH1, MSH2, MSH6, MLH3, MSH3, PMS1, PMS2 e EXO1. Em uma modalidade específica, deficiências nas proteínas de MMR MLH1, MSH2 e/ou MSH6 são detectadas pelo método ou pelos meios da presente invenção. Na verdade, há ainda uma certa possibilidade de corrigir malpareamentos, se por exemplo apenas um alelo normal de MMR estiver presente, como é o caso em células normais de todos os portadores de mutação no gene de MMR em famílias com LS, ou se um gene de MMR estiver parcialmente inativado. Em com

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 18/83

13/32 paração. Os exames da técnica anterior usados para encontrar células cancerosas revelam se o MMR ocorre (ambos os alelos do tipo selvagem presentes) ou está ausente (ambos os alelos do tipo selvagem ausentes) representando um exame on/off para MMR.

[00035] O MMR do DNA ocorre no núcleo da célula, e apenas as proteínas de MMR do núcleo participam do processo de reparo. Pelo método da presente invenção é possível avaliar a funcionalidade daquelas proteínas de MMR que foram dirigidas para o núcleo para atividade de reparo in vivo, porque um material inicial do método é um extrato nuclear. Ao contrário, no fluxo de trabalho tradicional, o ensaio de MMR é usado para estudar a eficiência de MMR dos produtos de proteínas de MMR mutadas construídos in vitro. Nesses testes in vitro, as proteínas a serem testadas são artificialmente adicionadas ao extrato nuclear sem a possibilidade de se estudar somente as proteínas naturalmente presentes nos núcleos. Por conseguinte, o exame de patogenicidade da presente invenção difere dos exames funcionais da técnica anterior revelando a efetiva capacidade de MMR do núcleo. E, por isso, pelo método da presente invenção, também é possível descobrir problemas de localização nuclear das proteínas de MMR.

[00036] Os métodos da técnica anterior utilizam extratos celulares, isto é, extratos citoplasmáticos (CE) no lugar de extratos nucleares. Os testes com extratos citoplasmáticos dão informações erradas sobre as quantidades e proporções de proteínas de MMR, que são na realidade capazes de efetuar processos de reparo. Portanto, testes com extratos citoplasmáticos são adequados apenas o teste on/off e não para testagem quantitativa de MMR.

[00037] Nos métodos da presente invenção, a capacidade de MMR é detectada diretamente ao gel de agarose sem o uso de qualquer método de detecção indireta da técnica anterior tal como ensaios de complementação em E.coli, onde a detecção é providenciada por ex

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 19/83

14/32 pressão de lacZa.

[00038] O ensaio de uma etapa de acordo com a presente invenção pode, opcionalmente, ser acompanhado por ou incluir etapas para identificar um gene geneticamente ou epigeneticamente defeituoso subjacente se assim desejado, mas esta não é necessária para um diagnóstico clínico. Ao contrário dos testes tradicionais, o método de acordo com a presente invenção permite o reconhecimento de indivíduos com susceptibilidade aumentada ao câncer devido ao MMR deficiente mesmo nos casos em que nenhum membro da família tenha, ainda, desenvolvido câncer, onde testes de mutação resultam em nenhuma alteração detectável, e/ou onde a alteração subjacente não é genética mas epigenética (reguladora).

[00039] O princípio básico, assim como diferentes modalidades do ensaio proposto, está mostrado em um formato de arranjo na Tabela 1, onde Y denota um extrato de proteína nuclear deficiente em MMR, X um extrato de proteína nuclear de amostra de teste e Z um extrato de proteína nuclear proficiente em MMR de controle positivo.

Tabela 1

MMR +/-	Gene de MMR 1 +/-	Gene de MMR 2 +/-	Gene de MMR 3+/-
Y	Yi	Y₂	Y₃
X	X +Y-i	X +Y₂	X +Y₃
z	z	Z	z

[00040] Em uma modalidade da presente invenção um extrato de proteína nuclear de amostra de teste (X) é preparado a partir de células normais cultivadas, tais como fibroblastos, obtidas do indivíduo a ser testado, e um ensaio de MMR de acordo com a presente invenção é realizado em frascos compreendendo Y (extrato nuclear deficiente em MMR), X e Z (extrato nuclear proficiente em MMR de controle positivo), respectivamente. A reação de reparo converte heterodúplex não susceptíveis à divagem pela endonuclease de restrição em homodúplex, que podem ser clivados. Se a amostra X for proficiente em MMR,

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 20/83

15/32 o heterodúplex substrato vai, portanto, ser clivado e linearizado em três fragmentos, enquanto que resulta apenas um fragmento por causa da linearização, se X for deficiente em MMR. Correspondentemente, Y vai produzir apenas um fragmento, ao passo que Z vai produzir três. Esta modalidade da presente invenção, o ensaio de MMR +/- (+/- indicando que somente um alelo do gene de MMR está funcionando e o outro é um alelo deficiente), vai possibilitar determinar se o indivíduo humano testado tem uma função de MMR enfraquecida/deficiente ou uma função de MMR normal.

[00041] Em uma outra modalidade da presente invenção, o extrato nuclear de amostra (X) é usado para complementar um extrato nuclear deficiente em MMR (Y) para formar X + Y. As amostras de teste complementadas (X + Y), assim como os controles positivo (Z) e negativo (Y), são então usados em um ensaio de MMR de acordo com a presente invenção para estudar a capacidade de reparar malpareamentos. A eficiência de reparo é quantificada medindo-se a eficiência de clivagem usando a eficiência de reparo do extrato nuclear de fibroblasto proficiente (Z) como um nível de referência, como exemplificado no exemplo 8 e na figura 4.

[00042] O número de extratos nucleares deficientes em MMR (Yn) incluídos no ensaio pode variar dependendo do fato de um defeito(s) ser considerado importante para ser identificado. Em uma modalidade preferida do método de acordo com a presente invenção Y1 é deficiente em MLH1 e Y2 é deficiente em MSH2/MSH6. Em uma outra modalidade da presente invenção Y3 pode ser deficiente em PMS2. Entretanto, qualquer um dos referidos extratos nucleares deficientes em MMR (Yn) pode ser omitido ou adicionado e usado, em qualquer combinação. O especialista na técnica é capaz de construir um painel de teste adequado para a situação clínica em questão.

[00043] Um ensaio de diagnóstico típico de acordo com a presente

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 21/83

16/32 invenção é realizado como descrito em maiores detalhes abaixo.

A. Amostras de tecido [00044] A amostra de tecido a ser testada pode ser qualquer de tecido normal, que seja facilmente obtido e processado. Em uma modalidade específica da presente invenção, a amostra de tecido escolhida é uma punção de pele humana ou biópsia de excisão, que pode ter sido obtida por qualquer método bastante conhecido por um profissional da área médica.

[00045] Outras amostras de tecido, que podem ser usadas em um método de acordo com a presente invenção, incluem amostras de sangue, e esfregaços mucosos.

B. Expansão das células de amostra [00046] Para examinar a capacidade de reparo de malpareamento (MMR) das células, é preciso cultivar uma quantidade suficiente de células antes de serem extraídas suas proteínas nucleares. As células são cultivadas em condições normais de cultura de células, adequadas para o tipo de células usadas e bastante conhecidas na literatura, e subsequentemente coletadas por delicada centrifugação das mesmas.

[00047] Qualquer tipo de célula derivada de uma amostra clínica retirada de um indivíduo humano, incluindo células malignas derivadas de um tumor, pode ser usado em um método de acordo com a presente invenção. Os tipos de células preferidos para uso em um teste de acordo com a presente invenção são fibroblastos humanos. Um outro tipo de células preferido são células humanas derivadas do sangue, tais como células linfoides.

[00048] Mais preferivelmente, as células para o teste da presente invenção são células primárias normais ou células normais transformadas.

C. Extração de proteínas nucleares de fibroblastos humanos

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 22/83

17/32 [00049] Proteínas de MMR são extraídas dos núcleos das células. As células são centrifugadas, contadas e lavadas com tampão salino para remover toda tripsina remanescente. As células são ainda lavadas com tampão isotônico antes de serem centrifugadas e intumescidas com o efeito osmótico de uma lavagem hipotônica subsequente. Uma agulha fina é usada para quebrar as membranas celulares até ser confirmado sob o microscópio que a maioria das células lisaram.

[00050] Depois da centrifugação das células, o sobrenadante contendo a fração citoplasmática é removido. As proteínas nucleares são extraídas da fração nuclear restante por incubação em tampão de extração frio com sal depois de todos os detritos nucleares remanescentes serem centrifugados e removidos como a pelota remanescente. A amostra de proteína nuclear extraída é então dialisada na presença de inibidores da proteinase, e adicionalmente clarificada por centrifugação antes de ser armazenado a -80°C. O teor de proteínas das amostras é quantificado por fluorômetro.

D. Preparação do substrato [00051] Um substrato de plasmídio heterodúplex circular para uso no ensaio de MMR de acordo com a presente invenção é feito por reanelamento de um DNA de cordão simples (ssDNA) e um DNA de plasmídio desnaturado correspondente com um sítio não-homólogo.

[00052] O ssDNA é produzido a partir de um plasmídio com o auxílio de células bacterianas e um fago auxiliar comercialmente disponível sob seleção de antibióticos pesados. Os detritos celulares são centrifugados e as partículas de fago são coletadas por precipitação e nova centrifugação. As células bacterianas também são removidas por centrifugação e todo DNA cromossômico remanescente originando das bactérias é removido com tratamentos enzimáticos. Com a clarificação da amostra, o ssDNA é desprendido das proteínas de capsídeo de fago com o auxílio de uma enzima proteinase.

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 23/83

18/32 [00053] Um gabarito de plasmídio de cordão duplo (ds) contendo o erro de malpareamento é amplificado em células bacterianas e purificado a partir das mesmas. Para ter uma extremidade 5' a montante do sítio do erro, uma enzima de restrição específica é usada para linearizar a construção depois do que a amostra é precipitada e dissolvida em um volume apropriado de tampão.

[00054] Para construir o substrato de heterodúplex carregando malpareamento para o ensaio de MMR de acordo com a presente invenção, o ssDNA e o DNA de plasmídio correspondente descrito acima são desnaturados e reanelados juntos. Etapas de lavagem subsequentes, incluindo a remoção de sais e de dsDNA linear não hibridizado assim como ssDNA não hibridizado seguida por precipitação em etanol garantem a pureza do produto final. A concentração é medida com um espectrofotômetro assim como por eletroforese em gel que também serve para verificar a pureza da amostra.

E. O ensaio de MMR de acordo com a presente invenção [00055] Um ensaio de MMR de acordo com a presente invenção pode ser usado apenas para determinar se a função de MMR da amostra de teste é deficiente ou não, mas também pode distinguir entre a capacidade de MMR de proteínas nucleares extraídas de células com MMR deficiente e daquelas extraídas de células proficientes em MMR, como descrito acima. Para identificar um gene deficiente em MMR, os extratos nucleares de amostra (X) são usados para complementar separadamente extratos nucleares deficientes em MLH1 (Yi) e em MSH2/MSH6 (Y2).

[00056] Um ensaio de MMR de acordo com a presente invenção é realizado combinando-se cerca de 50-500 qg, de preferência cerca de 50-200 qg, mais preferivelmente cerca de 75-100 qg de extrato de proteína nuclear com uma quantidade excessiva de substrato de plasmídio circular (heterodúplex), ao passo que no caso de complementar

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 24/83

19/32 uma linhagem celular deficiente em MMR bem caracterizada para determinar qual o gene de MMR causando a deficiência, a quantidade total dos dois extratos usados no ensaio não deve exceder 200 pg. A reação de reparo é induzida na presença de um tampão de MMR que assegura a concentração ideal de sal e também provê ATP e desoxirribonucleotídeos. A função de reparo é terminada enzimaticamente e as proteínas são removidas da amostra por uma extração em fenol/clorofórmio/álcool isoamílico.

[00057] Depois da precipitação, a amostra é submetida a uma digestão dupla, que cliva o DNA heterodúplex substrato em dois fragmentos menores se o processo de reparo for bem-sucedido. Estes dois fragmentos menores são visualizados por eletroforese em gel de agarose. Como o DNA substrato é acrescentado em excesso, um produto de comprimento integral linearizado também estará sempre visível. Onde o reparo não ocorre apenas o DNA de plasmídio linearizado de comprimento integral estará aparente.

[00058] Constitui um outro objetivo da presente invenção oferecer um kit compreendendo os reagentes necessários para a realização de um método de acordo com a presente invenção. Um kit de acordo com a presente invenção inclui reagentes tradicionais, tais como um substrato compreendendo substratos de DNA heterodúplex carregamento malpareamento necessários; pelo menos um, mas de preferência dois extratos nucleares deficientes em MMR); e um extrato nuclear proficiente em MMR como um controle positivo. Em uma modalidade específica da presente invenção, os referidos extratos nucleares deficientes em MMR são derivados de linhagens celulares deficientes em MLH1 e em MSH2/MSH6, respectivamente. Mais especificamente, os referidos extratos nucleares deficientes em MMR são derivados de células HCT116 e células LoVo.

[00059] Os reagentes incluídos em um kit de acordo com a presen

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 25/83

20/32 te invenção devem ser escolhidos segundo o princípio básico apresentado na Tabela 1. Em uma modalidade, um primeiro extrato nuclear (Y1 ) é deficiente em MLH1, ao passo que um segundo extrato nuclear (Y2) é deficiente em MSH2/MSH6. Se a amostra testada não complementar o referido primeiro extrato nuclear, mas complementar o referido segundo extrato nuclear, a referida amostra de teste revela uma deficiência em MLH1. No entanto, se a referida amostra de teste complementar o referido primeiro extrato nuclear, mas não o referido segundo extrato nuclear, a referida amostra de teste revela que o indivíduo testado tem uma deficiência em MSH2 ou em MSH6.

[00060] Opcionalmente, um kit de acordo com a presente invenção pode incluir outros extratos nucleares deficientes em MMR, que distinguem especificamente entre deficiências nos genes MSH2 e MSH6. Tais extratos nucleares podem ser derivados de linhagens celulares, tal como HCT-15/DLD-1 deficiente em MSH6 (ATCC CCL-225/221). [00061] Opcionalmente, um kit de acordo com a presente invenção também pode compreender reagentes adicionais necessários para a realização do ensaio de MMR, tais como tampões e nucleotídeos necessários.

[00062] Um exemplo de um kit de acordo com a presente invenção está dados nos exemplos abaixo.

EXEMPLOS [00063] Os exemplos a seguir são dados para ilustrar melhor as modalidades da presente invenção, não se destinam o limitar o escopo da invenção. Ficará óbvio para o especialista na técnica, como avanços tecnológicos, que o conceito inventivo pode implementado de várias maneiras. A invenção e suas modalidades não se limitam portanto aos exemplos descritos neste relatório, e podem variar dentro do escopo das reivindicações.

Exemplo 1. Cultura de fibroblastos retirados do indivíduo a

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 26/83

21/32 ser testado [00064] Fibroblastos são cultivados em meio de Eagle modificado da Dulbecco (Invitrogen, CAT# 31966-021 ) em uma incubadora a a 37°C e 5% de CO2. O meio de crescimento é suplementado com 10% soro bovino fetal (Invitrogen, CAT# 10106-169), 2 X aminoácidos nãoessenciais (Invitrogen, CAT# 10370-070) e 2% de penicilinaestreptomicina (Invitrogen, CAT# 15070-063). As células são subcultivadas 1:2-1:6 quando aproximadamente 80-90% confluem com o auxílio de tripsina 0,25% de EDTA (Invitrogen, CAT# 25200-072). Para manter o silenciamento da linhagem celular FB-M1 derivação por depleção de MLH1 ou da linhagem celular FB-SH13 derivação por depleção de MSH2, 150 pg/pl de higromicina B (Invitrogen, CAT# 10687010) são acrescentados ao meio de crescimento. As células são cultivadas em 175 frascos tampados com filtro e tratados com cultura de células (NUNC, CAT# 145-178883) até que aproximadamente 5 x 10⁸10⁹ células sejam reunidas para a extração de proteínas nucleares.

Exemplo 2. Linhagens celulares e extratos nucleares [00065] Linhagens de células cancerosas humanas HeLa, LoVo e HCT116 aderentes (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) são cultivadas de acordo com as instruções dos fabricantes. As células HeLa (ATCC CCL-2) são células epiteliais proficientes em MMR derivadas do cérvice de um indivíduo do sexo feminino, ao passo que as células HCT116 (ATCC CCL-247) e LoVo (ATCC CCL-229) são células epiteliais deficientes em MMR derivadas do cólon de um indivíduo do sexo feminino. As células HCT116 não possuem MLH1 ao passo que nas células LoVo, o gene MSH2 é inativado causando uma deficiências nas proteínas MSH2, MSH3 e MSH6. A falta de MSH2 fora associada à degradação proteolítica de suas contrapartes MSH3 e MSH6.

[00066] As células HeLa são cultivadas em meio DMEM comple

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 27/83

22/32 mentado com 2% de L-glutamina, 10% de FBS e 5% de PS. As células LoVo são cultivadas em meio F12 (ou F12:DMEM) (Invitrogen, CAT# 31765-027/31331 -028) complementado com 2% de L-glutamina, 1020% de FBS e 5% de PS ao passo que as células HCT116 são cultivadas em meio McCoys 5A (Invitrogen, CAT# 22330-021 ) complementado com 2% de L-glutamina, 10% de FBS e 5% de PS.

[00067] A linhagem celular FB-M1 foi produzida da maneira descrita por McDaid et al., BJC, 101 :441 -451, 2009. Em resumo, oligonucleotídeos sobrepostos produzindo siRNA visando MLH1 em AACTGTTCTACCAGATACTCA foram desenhados e ligados em um vetor de shRNA comercialmente disponível pSilencer™ (Ambion CAT# AM7209). A construção foi verificada por sequenciamento antes da linearização e eletroporação de 1 x 10⁷ células com 1 pg de DNA. Meio enriquecido com soro foi imediatamente acrescentado e as células foram plaqueadas a 5 x 10⁵antes da adição da seleção de higromicina (150 pg/pl) por 10-14 dias. Similarmente, a linhagem celular FB-SH13 foi produzida usando oligonucleotídeos sobrepostos produzindo siRNA visando MSH2 em TCTGCAGAGTGTTGTGCTT no vetor de shRNA pSilencer™.

[00068] Correspondentemente, linhagens de fibroblasto compreendendo outras mutações do gene de MMR, tais como MSH6 silenciado, podem ser preparadas usando o vetor de shRNA pSilencer™ 4.1 CMV Hygro (Cat# AM5777). Os extratos nucleares de fibroblastos foram preparados de acordo com o seguinte protocolo (Lahue et al., Science, 245:160-164,1989):

. Colher 5 x 108-10⁹ células de fase log com tripsina.

2. Contar as células.

3. Centrifugar a 500xg por 10 min +4°C.

4. Ressuspender a pelota de células em 20-30 ml de 1 x tampão isotônico frio (20 mM de Hepes pH 7,5, 5 mM de KCI, 1,5 mM de MgCI, 250 mM de sacarose, 0,2 mM de PMSF, 1 x mistura comple

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 28/83

23/32 ta de inibidores da protease sem EDTA (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), 0,25 g ml-1 de aprotinina, 0,7 g ml-1 de pepstatina, 0.5 g ml-1 de leupeptina, 1 mM de DTT) e centrifugar como acima.

5. Estimar o volume de células acondicionadas e ressuspender o mesmo em 20-30 ml de 1 x tampão hipotônico frio (tampão isotônico sem sacarose) e centrifugar imediatamente como acima.

6. Remover o sobrenadante e ressuspender a pelota de células em 1 x tampão hipotônico frio para obter uma densidade celular de 1-2 x 108 células/ml. O volume de células acondicionadas é subtraído do volume de ressuspensão.

7. Partir as células por meio de um seringa com uma agulha fina levando as células lentamente para dentro da seringa e então expulsando as mesmas com um único movimento rápido. A quebra das células deve ser efetuada até que 80-90% das células tenham lisado, segundo verificado sob o microscópio (50 pl de azul tripano a 0,4% em PBS com 45 pl de PBS e 5 pl de células).

8. Centrifugar as células partidas a 3000xg por 10 min +4°C e remover o sobrenadante.

9. Estimar o volume de pelotas nucleicas e acrescentar 1/3 a 1/5 de tampão de extração fio (25 mM de Hepes pH 7,5, 10% de sacarose, 1 mM de PMSF, 0,5 mM de DTT, 1 g ml-1 de leupeptina) ao volume da pelota. Ressuspender bem a pelota pipetando para cima e para baixo.

10. Medir o novo volume e acrescentar NaCl até uma concentração de 0,155 M durante a misturação.

. Girar a mistura por 60 minutos a 4°C.

12. Centrifugar a 14500xg por 20 minutos a 2°C.

13. Dialisar a amostra por 2 x 50 minutos em um cassete 3.500 MWCO em 1 L de tampão de diálise frio (25 mM de Hepes pH

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 29/83

24/32

7,5, 50 mM de KCI, 0,1 mM de EDTA pH 8, 10% de sacarose, 1 mM de PMSF, 2 mM de DTT, 1 g ml-1 de leupeptina). Trocar o tampão depois dos 50 primeiros minutos.

14. Clarificar o extrato por centrifugação a 20000xg por 15 minutos a 2°C.

15. Congelar sob pressão as proteínas nucleares em nitrogênio líquido e armazenar a -80°C.

Exemplo 3. Análise da mancha ocidental [00069] Os níveis de expressão de proteína nos extratos nucleares (NEs) foram estudados por análise da mancha ocidental usando 50 mg de NE e 0,1-5 pl de extrato de proteína total do tipo selvagem por meio de eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida. As proteínas foram colocadas para manchar em membranas de nitrocelulose (Amersham Hypond™, PVDF, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia), que foram subsequentemente incubadas com anticorpos monoclonais anti-MSH2 (Calbio-chem, San Diego, CA, EUA, MSH2-Ab1, NA-26, 0,2 mg/ml), anti-MSH3 (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, EUA, M94120, 250 mg/ml), anti-MSH6 (BD Transduction Laboratories, clone 44, 0,02 mg/ml), anti-PMS2 (Calbiochem/Oncogene Research, San Diego, CA, EUA, Ab-1, 0,2 mg/ml) e anti-MLH1 (BD Biosciences/Pharmingen, San Diego, CA, EUA, clone 168-15, 0,5 mg/ml). α-tubulina expressa ubiquamente foi usado como um controle de carga para estimar os níveis de proteína de MMR nos extratos (anti-a-tubulina; Sigma, Louis, MO, EUA, DM1A, 0,2 mg/ml).

Exemplo 4. Produção de complexos proteicos heterodiméricos do tipo selvagem [00070] Células do inseto Spodoptera frugiperda (Sf9) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foram transfectadas com fragmentos de cDNA de MSH2, MSH3, MSH6, PMS2 ou MLH1 do tipo selvagem (WT) carregando de DNA de bacmídeo e depois disso as células foram reinfecta

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 30/83

25/32 das para obter um maior rendimento de baculovírus recombinantes (Nystrom-Lahti et al., 2002). Esses baculovírus recombinantes WT foram usados para coinfectar células Sf9 para produção de proteínas formando os complexos heterodiméricos analisados: MutLa (MLH1 + PMS2), MutSa (MSH2 + MSH6) and MutS (MSH2 + MSH3). Os complexos heterodiméricos foram extraídos como extratos de proteínas totais (TE) em 50 h (MutLa) ou 72 h (MutSa e MutS ) por lise e centrifugação das células.

Exemplo 5. Preparação de substratos [00071] Preparação de moléculas heterodúplex. A molécula de DNA heterodúplex é uma molécula circular de 3192 bp de comprimento com uma extremidade (nick) de cordão simples de 445 bp a montante do sítio do malpareamento. Este contém um sítio de restrição Bg/II completo. A molécula é feita por anelamento de DNA de cordão simples a partir de plasmídio pGEM-IDL40 (Figura 6) junto com plasmídio introdutor de erro baseado na mesma construção (pGEM-IDL GT, para o substrato 5'GT ou pGEM-IDL-39 para o substrato 5'IDL1).

[00072] O DNA de cordão simples (ssDNA) foi preparado infectando-se células bacterianas XL1-Blue transformadas por pGEM IDL40 com o bacteriofago M13K07 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA), que replica o cordão antissense que pode ser subsequentemente extraído das células. O cordão inferior (-) amplificado pelo fago M13 tem a sequência representada em SEQ ID N°: 1, onde o sítio de restrição Bg/II é assinalado.

[00073] Duas construções heterodúplex diferentes foram preparadas; um malpareamento G-T (5'GT) e um 5'IDL1 de um único nucleotídeo. A mutagênese direcionada para o sítio foi realizada para um pGEM-IDL40 de acordo com as instruções do fabricante (QuikChange^® Site-directed mutagenesis, Stratagene, La Jolla, CA, EUA) para produzir os plasmídios pGEM IDLGT e pGEM IDL39 contendo

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 31/83

26/32 erro.

[00074] O substrato 5'GT foi feito por anelamento do ssDNA com o pGEM-IDLGT contendo malpareamento. Este plasmídio de 3192 bp de comprimento (pGEM-IDLGT) para dsDNA linear contém um sítio de restrição Bg/II incompleto (GGATCT). O cordão superior (+) é complementar ao ssDNA produzido a partir de IDL40, exceto pelo G que substitui o A que seria complementar no sítio BgIII. A sequência do pGEM-IDLGT está representada na SEQ ID N°: 2 e o sítio de restrição Bg/II incompleto, assinalado.

[00075] O substrato 5'IDL1 foi feito por anelamento do ssDNA com o pGEM-IDL1 contendo erro. Este plasmídio de 3191 bp de comprimento (pGEM-IDL39) para dsDNA linear contém um sítio de restrição Bg/II incompleto (-GATCT). O cordão superior (+) é complementar ao ssDNA produzido a partir de IDL40, exceto pelo delA no sítio Bg/II. Para criar a extremidade 5' o substrato circular foi linearizado com BamlI ou Dralll antes do reanelamento. A sequência de pGEM-IDL39 está representada na SEQ ID N°: 3 e o sítio de restrição Bg/II incompleto está assinalado.

Exemplo 6. Ensaio de MMR de acordo com a presente invenção [00076] A presente invenção é uma modificação do ensaio de MMR in vitro previamente descrito (Nystrom-Lahti et al., 2002), possibilitando analisar a capacidade de MMR diretamente de um extrato nuclear. Além disso, é possível usar complementação para caracterizar o gene de MMR defeituoso na amostra complementando um extrato deficiente em MMR caracterizado como descrito na Tabela 1. As reações de reparo são padronizadas para incluir um total de 75-100 pg de NE. A quantidade excessiva do subsrato de DNA heterodúplex (5'GT ou 5'IDL1 ) é fixada em 100 ng. A reação de reparo é realizado em um de volume 20 pl com os seguintes reagentes:

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 32/83

27/32

- 100 ng de substrato heterodúplex

- 75-100 pg de extrato nuclear

- 2 μΙ de 10X tampão de MMR (200 mM de Tris-HCl pH 7,6, 400 mM de KCI, 50 mM de MgCI2,10 mM de glutationa, BSA 500 de pg/ml, 1 mM de cada dNTP, 15 mM de ATP)

- KCI para atingir uma concentração final de 110 mM

- acrescentar H2O até completar 20 μΚ [00077] Como a reação deve ser efetuada no volume total de 20 μl e a uma concentração final de KCI de 110 mM, o teor de KCI do extrato nuclear precisa ser levado em consideração (2 μl de 10x tampão de MMR leva o teor de KCI da mistura reacional até 40 mM). Presume-se que o teor de KCl do extrato nuclear seja de 75 mM/μι [00078] O protocolo típico do ensaio de MMR de acordo com a presente invenção é:

. Pipetar os componentes da reação de reparo juntos em gelo e incubar por 30 minutos a 37°C.

2. Interromper a reação pela adição de 30 μl de solução de interrupção fresca (42 mM de EDTA, 1,2% de SDS, 50,4 μg/ml de proteinase K). Incubar a 37°C por 20 minutos.

3. Acrescentar 1 volume (50 μθ de tampão TE pH 8,0.

4. Acrescentar 1 volume de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1 ) e turbilhonar por 10 segundos. Centrifugar à velocidade máxima por 10 minutos à temperatura ambiente.

5. Transferir a fase superior (aproximadamente 90 pl) para um outro tubo e acrescentar um volume igual de clorofórmio. turbilhonar por 10 segundos e centrifugar à velocidade máxima por 10 minutos à temperatura ambiente.

6. Transferir 85 μl da fase superior para um outro tubo para precipitação em etanol.

7. Acrescentar NaCl para obter uma concentração final de

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 33/83

28/32

150 mM seguido por 2,5 volumes de etanol absoluto frio. Incubar a 20°C por 30 minutos.

8. Pelotizar o DNA por centrifugação da amostra à velocidade máxima por 30 minutos a +4°C.

9. Lavar a pelota com 150 pl de etanol a 70%, centrifugar à velocidade máxima por 10 minutos e secar e ressuspender a pelota em 6 pl de ddH2O.

10. Acrescentar 4 pl de 10 x de mistura de digestão recémpreparada (2,5 pl de Bg/II FastDigest® (Fermentas, CAT# FD0083),

2,5 pl de Eco31I FastDigest® (Fermentas, CAT#

FD0293), 10 pl de tampão FastDigest® e 25 pl de ddH2O) e incubar a 37°C por 10 minutos.

. Acrescentar RNAse A até atingir 40 pg/ml e incubar a 37°C por 10 minutos.

12. Carregar as amostras em gel de agarose a 1,0% feito com I xTAE para ver se o reparo ocorreu.

[00079] As percentagens de reparo são analisadas usando ImagePro® 4.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, EUA).

[00080] HeLa NE proficiente em MMR é usado como um controle positivo, ao passo que NEs deficientes em MMR não-complementados são usados como controles negativos. Os substratos são linearizados com a enzima de restrição Eco31I. Como a reação de reação converte um heterodúplex GT em um homodúplex AT ou preenche a 1 ou 2 estruturas de laço nt recriando o sítio de restrição Bg/II, a eficiência de reparo pode ser medida pela eficiência da digestão dupla.

Exemplo 7. Fibroblastos usados no ensaio de MMR de acordo com a presente invenção [00081] Este exemplo foi feito para mostrar que o ensaio de MMR pode ser realizado em tecido normal, tal como fibroblastos. Extrato nuclear de fibroblasto do tipo selvagem (FB-WT) preparado da maneira

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 34/83

29/32 descrita no exemplo 2, extrato nuclear de células HeLa proficientes em MMR e um controle negativo (MOCK) não contendo proteínas foram submetidos a um ensaio de MMR de acordo com a presente invenção da maneira descrita no exemplo 3.

[00082] Depois de deixar a reação de reparo ocorrer, uma digestão dupla do DNA substrato vai produzir uma única banda mais larga de aproximadamente 3000 bp onde nenhum reparo ocorreu, e outros dois fragmentos menores (de aproximadamente 1800 e 1300 bp) onde o reparo ocorreu. Como o DNA substrato é sempre acrescentado em excesso, mesmos os extratos proficientes em MMR terão o substrato linearizado presente além dos fragmentos da clivagem dupla.

[00083] O resultado deste ensaio está apresentado na Figura 2, que mostra a raia 1 contendo células MOCK tem apenas uma banda larga (= sem reparo), ao passo que as raias 2 e 3, contendo extratos nucleares de FB-WT e HeLa, respectivamente, mostram duas bandas adicionais menores, indicativas de uma reação de reparo.

[00084] Portanto, este exemplo mostra inequivocadamente que extratos nucleares de fibroblastos normais têm uma capacidade de MMR equiparável àquele de uma linhagem celular de controle proficiente em MMR (HeLa), o que pode ser confirmado por um ensaio de acordo com a presente invenção.

Exemplo 8. Fibroblastos humanos com um gene de MMR parcialmente silenciado mostram capacidade de MMR reduzida no ensaio de MMR de acordo com a presente invenção [00085] Este exemplo mostra que as linhagens de fibroblasto humano FB-M1 e FB-SH13 (descritas no exemplo 2), onde o gene MLH1 ou o gene MSH2, respectivamente, é parcialmente silenciado pela tecnologia de (sh)RNA, apresentam uma nítida redução na capacidade de MMR.

[00086] Em primeiro lugar, uma mancha ocidental foi feita em quan

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 35/83

30/32 tidades iguais de extratos nucleares de fibroblastos do tipo selvagem (FB-WT) e de células FB-M1 ou de células FB-WT e FB-SH13. Como resultado (Figura 3) pode-se ver que a quantidade da proteína MLH1 está nitidamente reduzida nas células FB-M1 em comparação com os FB-WT, assim como o nível de nas células FB-SH13, α-tubulina foi incluída como um controle de carga.

[00087] Em segundo lugar, o ensaio de MMR foi realizado da maneira descrita no exemplo 6, usando os mesmos extratos nucleares em quantidades iguais:

MOCK - Controle negativo do ensaio sem extrato nuclear;

FB-WT - Extrato nuclear de fibroblastos humanos do tipo selvagem (controle positivo); e

FB-M1 - Extrato nuclear de fibroblastos humanos com MLH1 parcialmente silenciado; ou

FB-SH13 - Extrato nuclear de fibroblastos humanos com MSH2 parcialmente silenciado.

[00088] O resultado deste ensaio mostra que uma concentração reduzida de uma das proteínas de MMR essenciais está associada um mecanismo de MMR defeituoso. O resultado está mostrado na Figura 4 e demonstra nitidamente que em comparação com o extrato nuclear de fibroblastos humanos do tipo selvagem, o ensaio de MMR de acordo com a presente invenção detecta a deficiência em MLH1 e MSH2 como uma diminuição na eficiência de reparo. Além disso, a capacidade de MMR de um extrato nuclear deficiente em MMR pode ser diferencialmente restaurada quando analisada junto com extrato nuclear do tipo selvagem ou parcialmente deficiente em MMR como apresentado na Figura 5 (HCT116 com FB-WT ou FB-M1 neste caso) e descrito pelo teste apresentado na Tabela 1 e descrito nas páginas 10-11.

[00089] A eficiência de reparo no ensaio de MMR de acordo com a presente invenção é considerada como a percentagem de DNA repa

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 36/83

31/32 rado de todo DNA substrato na reação. A escassez de uma proteína de MMR essencial reduz a eficiência de reparo com intensidade variável ao passo que a ausência completa de proteínas de MMR essenciais reduz a eficiência de reparo para um nível não detectável.

Exemplo 9. Um kit para uso em um ensaio para diagnosticar defeitos em MMR [00090] Um kit de acordo com a presente invenção é de preferência apresentado como frascos pré-carregados com todos os reagentes para a realização do ensaio de MMR. Apenas extrato nuclear de amostra de teste é acrescentado. Em uma modalidade da presente invenção frascos separados para as diferentes deficiências em MMR a serem testadas são apresentados.

[00091] Este exemplo descreve um kit para determinar se um indivíduo tem síndrome de Lynch ou não, determinando se o referido indivíduo tem um defeito no gene MLH1 ou algum dos genes MSH2 ou MSH6, sem distinguir entre estes últimos. Tal kit tem pelo menos cinco frascos separados.

Tabela 2

Frasco	Reagente
1	HCT116	= NE de controle deficiente em MLH1
2	LoVo	= NE de controle deficiente em MSH2/6
3	HCT116	= a ser complementado pelo NE de amostra
4	LoVo	- a ser complementado pelo NE de amostra
5	FB-WT	= NE proficiente em MMR, controle positivo

[00092] Os reagentes incluídos nos referidos fracos são:

- Substrato heterodúplex

- Extrato nuclear (HCT116, LoVo ou FB-WT)

- 10X de tampão de MMR (200 mM de Tris-HCI pH 7,6, 400 mM de KCI, 50 mM de MgCI2, 10 mM de glutationa, BSA de 500 pg/ml, 1 mM de cada dNTP, 15 mM de ATP).

[00093] Além disso, uma solução STOP para ensaio de MMR (42

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 37/83

32/32 mM de EDTA, 1,2% de SDS, 50,4 g/ml de proteinase K) é necessária, e pode ser portanto fornecida com o kit.

[00094] Ademais, o referido kit pode, opcionalmente, conter reagentes necessários para clarificar a amostra (tampão TE, fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e clorofórmio), para precipitar a mesma (NaCl e etanol) e para detectar o reparo (RNase A e as enzimas de restrição Bg/II e Eco311 com tampão e corante de carga).

[00095] Outros componentes opcionais do kit são reagentes necessários para o cultivo das células de onde as proteínas nucleares de amostra devem ser extraídas assim como os reagentes necessários para a extração das proteínas nucleares do mesmo (vide exemplo 2).

[00096] Um kit de acordo com a presente invenção não se restringe a qualquer forma ou tipo específico de frasco. Qualquer tipo de frasco adequado para a manipulação e incubações descritas no exemplo 6, tais como tubos eppendorf^®, são adequados.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método in vitro para determinar se um indivíduo humano tem uma função de reparo de malpareamento de DNA enfraquecida, caracterizado pelo fato de que compreende:

a) cultivo de fibroblastos primários derivados de uma amostra de tecido constitutivo não maligno do referido indivíduo humano;

b) produzir um extrato de proteína nuclear a partir das ditas células de fibroblastos primários cultivados do referido indivíduo humano,

c) oferecer extratos de proteína nuclear MMR proficientes em MMR+/+ e MMR deficientes em MMR-/- a partir de linhagens celulares como controles positivo e negativo, respectivamente,

d) combinar em frascos separados cada extrato nuclear com pelo menos um substrato de DNA heterodúplex carregando malpareamento,

e) conduzir um ensaio de reparo de malpareamento nos extratos de proteína nuclear, e

e) determinar quantitativamente a capacidade dos extratos de proteína nuclear das células de fibroblastos primários para reparar o dita molécula de substrato de DNA, em que a diminuição da eficiência do reparo comparada ao controle positivo é uma indicação da função de reparo de malpareamento de DNA enfraquecida em um indivíduo.
2. Método, de acordo a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido substrato é derivado de um plasmídio tendo a SEQ ID N°: 1.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido substrato compreende ainda uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N°: 3.

Petição 870190087234, de 05/09/2019, pág. 39/83

2/2
4. Método de acordo com quaisquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o extrato nuclear deficiente em MMR é derivado de uma linhagem celular selecionada do grupo que consiste em células HCT116 e células LoVo.
5. Método de acordo coma reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a quantidade total de extrato nuclear por frasco varia na faixa de 50-500 pg ou 50-200 pg.
6. Método in vitro para diagnosticar a síndrome de Lynch em um humano conforme o método descrito em quaisquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as células primárias de fibroblastos são de uma amostra clinica obtida de um tecido constitutivo de um indivíduo humano.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido gene de reparo de malpareamento de DNA enfraquecida é selecionado do grupo consistindo em MLH1, MSH2, MSH6, MLH3, PMS1, PMS2 e EXO1.