CN103820435A - 表达kcnq1/kcne1蛋白的宿主细胞及其制法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表达KCNQ1/KCNE1蛋白的宿主细胞及其制法，该宿主细胞是通过BacMam重组杆状病毒载体的构建、BacMam重组杆状病毒的制备，以及将BacMam重组杆状病毒转入CHO细胞后所形成的。通过该宿主细胞可获得KCNQ1/KCNE1通道蛋白，为高通量的药物筛选提供研究基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达通道蛋白的宿主细胞及其制法，特别是涉及一种利用BacMam病毒进行表达KCNQ1/KCNE1通道蛋白的宿主细胞及其制备方法。
背景技术
KCNQ钾通道是钾通道超家族的一个重要分支，KCNQ基因编码的钾离子通道，分布于神经节、脑皮质、海马神经细胞、心肌细胞、内耳毛细胞等，在调节神经兴奋性、心肌动作电位和听觉方面发挥作用。KCNQ分为5个亚型，即KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4、KCNQ5，其中，KCNQ1作为钾通道家族的一个成员，在心脏、内耳和小肠的生理调节和病理机制作用中均具有重要意义。
KCNQ1（即KvLQT1）最早发现于遗传性LQT综合征患者的一染色体位点，该基因位点编码钾离子通道，且与50%的遗传性LQT综合征相关。KCNQ1在两种组织中具有重要作用：在心肌细胞中，KCNQ1与KCNE1β-亚基结合形成通道复合物，参与形成的心肌I ks电流（缓慢整流），在动作电位复极化中具有重要作用，KCNQ1突变会引起心肌复极化延长而引起心律失常；在多种器官的上皮细胞中，如肺、胃、耳蜗、肠和肾，盐和水的运输对于功能的发挥起到至关重要的作用，研究发现KCNQ1通道表达的缺失对功能的发挥具有重要影响。人体内KCNQ1突变可能导致耳聋。此外，对KCNQ1基因敲除的小鼠的研究也显示，小鼠出现耳聋、平衡问题以及内耳和胃肠道形态异常的症状。KCNQ1与KCNQ家族其他几个亚型不同，KCNQ1一般不存在于神经组织中。
KCNQ亚家族成员的电流都已经于爪蟾卵等异源表达系统所表达。5种亚型均诱发电压依赖性外向整流钾电流。在哺乳动物细胞中，KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4的同源多聚体和KCNQ2/3的异源多聚体一样，都能在hek293和CHO细胞上产生M电流。KCNQ1同源多聚体通道可诱发外向整流，其半数激活电压（V1/2）为-10～20mV，斜率为12mV，其激活动力学曲线为S型，在100～200ms内可激发90%，当表达于爪蟾卵时，电流在2～3s内也不能达到最大，但是在哺乳动物细胞表达时，电流激活速度增加1s内可全部激活，且该电流的失活不明显。KCNQ1还可以与KCNE家族(钾通道超家族的另一成员)，特别是KCNE1相互作用，增强通道功能。当KCNE1存在时，KCNQ1的电流可大幅度增加，且激活减慢，失去失活特性。
杆状病毒是专一性感染昆虫细胞的病毒，具囊膜，其基因组为共价闭合环状双链DNA，分子量为130kb。自从Smith等用昆虫杆状病毒在昆虫细胞成功表达β-干扰素之后，昆虫杆状病毒受到广泛关注，至今，杆状病毒载体-昆虫表达系统已发展成一个较为成熟的高效表达系统，表达了众多不同的外源基因。
杆状病毒作为在哺乳动物细胞中表达重组蛋白的基因转移载体具有良好的应用前景。含有在哺乳动物细胞中具有活性的基因表达盒的重组杆状病毒，被称作BacMam病毒，它可有效转导多种哺乳动物细胞。BacMam病毒作为基因转移载体转导哺乳动物细胞首先在肝脏细胞中证实。Hofmann等和Boyce等分别用含有细胞巨化病毒（CMV）启动子-荧光酶基因或Rous肉瘤病毒（RSV）的LTR启动子-β-gal基因的重组病毒转导原代肝细胞和多种非肝细胞细胞系，结果表明，在肝细胞和肝瘤细胞中，可观察到有效转导和高水平的报告基因活性。随后大量实验证实，许多细胞系和原代培养细胞都能被BacMam病毒有效转导。BacMam病毒作为基因转移载体的一个优势就是在不同细胞系中直接添加病毒即可，然而有些细胞在良好的转导条件下转导效率并不高。有些研发现，丁酸盐（组蛋白脱乙酰化酶抑制剂）在许多细胞中都有助于提高BacMam病毒介导的基因表达。丁酸盐添加入中华仓鼠卵巢（CHO）细胞悬浮培养液中，低温(34℃相较于37℃更好)孵育可以提高蛋白的表达。
BacMam病毒作为基因转移载体，具有众多优势：
（1）许多细胞系和原代细胞都能被有效转导，但很少或没有观察到细胞毒性，甚至在高达10,000MOI的条件下也很少看到细胞毒性。用含有CMV启动子和绿色荧光蛋白报告基因（GFP）的杆状病毒进行转导试验表明，许多细胞系和原代培养细胞都能被有效转导，而在几个起源于血细胞器官的细胞系中，例THP-1、U937、K562、Raw2647和P388D细胞有非常低水平的转导。
（2）BacMam病毒不但能够转导体外培养的哺乳动物细胞并介导外源基因的表达，而且能在体内转导一些哺乳动物组织并介导目的基因的表达。
（3）AcMNPV巨大的基因组(约130kb)使得杆状病毒可以进行大容量基因克隆，可以同时插入多个片段或插入一个较大的外源DNA片段（可高达38kb）。
（4）从生物安全性观点出发，重组杆状病毒天生不能在哺乳类细胞中复制，出芽型病毒对自然宿主无感染性，这使得杆状病毒在基因传递方面具有迷人的吸引力。
（5）重组杆状病毒相对于其他的病毒载体来说，它更易于构建、改造和制备。杆状病毒是双链DNA，克隆治疗基因非常方便。
（6）杆状病毒也可用于基于细胞的药物筛选，评价启动子在不同组织、哺乳类细胞中的强度，毒性基因产物也可用重组杆状病毒在哺乳类细胞表达。
（7）在哺乳类细胞内，除启动瞬时表达外，重组杆状病毒也能产生稳定的转导细胞系。用含有猿猴病毒40（SV40）启动子——新霉素磷酸转移酶基因的杆状病毒转导CHO细胞，并用抗生素G418进行筛选，可获得稳定表达GFP的CHO细胞系分离株。
因此，利用BacMam病毒，可进行基因的转移，从而表达相应的蛋白，为药物的研发奠定基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种表达KCNQ1/KCNE1通道蛋白的宿主细胞及其制备方法。通过利用BacMam重组杆状病毒，能将KCNQ1与KCNE1基因转导进入CHO细胞株，发挥其离子通道功能，并能获得KCNQ1/KCNE1通道蛋白，可为高通量的药物筛选提供研究基础。
为解决上述技术问题，本发明的表达KCNQ1/KCNE1通道蛋白的宿主细胞，是通过BacMam重组杆状病毒载体的构建、BacMam重组杆状病毒的制备，以及将BacMam重组杆状病毒转入CHO细胞后，形成的宿主细胞。针对该宿主细胞的整个制作过程，现分述如下：
本发明的BacMam重组杆状病毒载体，包含有：KCNQ1或KCNE1基因片段；其中，该KCNQ1或KCNE1基因片段通过以下方式获得：
以如SEQ ID NO.3-4所示的KCNQ1引物或如SEQ ID NO.5-6所示的KCNE1引物，分别从质粒pCDNA3.3-KCNQ1和质粒pCDNA3.3-KCND1上经PCR扩增获得KCNQ1或KCNE1基因片段。
对于上述BacMam重组杆状病毒载体，其构建方法包括步骤：
（1）根据KCNQ1与KCNE1全基因序列设计特异性引物；
其中，KCNQ1的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示；
KCNQ1的下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；
KCNE1的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示；
KCNE1的下游引物如SEQ ID NO.6所示；
（2）用KCNQ1与KCNE1的引物分别从质粒pCDNA3.3-KCNQ1和pCDNA3.3-KCND1上PCR扩增获得KCNQ1和KCNE1基因片段，并将这2个基因片段分别克隆到pFastBac1-pCDNA3.1(-)载体上，形成pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNQ1和pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNE1载体；
（3）将pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNQ1和pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNE1载体分别转化到Top10感受态细胞中，筛选出含KCNQ1或KCNE1的阳性克隆载体；
（4）通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，将含KCNQ1或KCNE1的阳性克隆载体，分别转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，经筛选，获得KCNQ1-BacMid或KCNE1-BacMid重组杆状病毒载体。
所述步骤（3）的筛选中，是将转化后的Top10感受态细胞在含有氨苄青霉素（50～200μg/mL）的LB培养基平板上，36～38℃培养(100μg/mL)12～20小时后，挑单克隆，以通用引物CMV和BGH为引物，进行菌落PCR鉴定。
所述步骤（4）的筛选中，是将转化后的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞涂在含有卡那霉素(50μg/mL)、庆大霉素(10μg/mL)、四环素(100μg/mL)、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷）(100μg/mL)和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）(40μg/mL)的LB培养基平板上，37℃培养30～72小时后，挑单克隆，以通用引物M13F和M13R作为引物，进行菌落PCR鉴定。
本发明的BacMam重组杆状病毒，是将KCNQ1-BacMid和KCNE1-BacMid重组杆状病毒载体分别转染进入昆虫SF9细胞后，获得KCNQ1-BacMam重组杆状病毒或KCNE1-BacMam重组杆状病毒。
对于上述的BacMam重组杆状病毒，其构建方法包括步骤：
1）将KCNQ1-BacMid或KCNE1-BacMid重组杆状病毒载体分别转染进入昆虫SF9细胞，分别获得P1代KCNQ1-BacMam重组杆状病毒或KCNE1-BacMam重组杆状病毒；
2）用P1代KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒，继续感染昆虫SF9细胞，分别制备成病毒滴度在1～5×108范围内的高滴度KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒。
本发明的表达KCNQ1/KCNE1通道蛋白的宿主细胞，是将高滴度KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒，共同转导CHO-k1细胞后，获得表达KCNQ1和KCNE1通道蛋白的宿主细胞。
对于表达KCNQ1/KCNE1通道蛋白的宿主细胞，其制备方法包括步骤：
将上述高滴度KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒，共同转导CHO-k1细胞，在一定的感染复数（MOI）下，37℃孵育24小时，获得表达KCNQ1和KCNE1通道蛋白的宿主细胞。
所述转导中，KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒的比例为1：2～2：1，优选为1：1；该转导中，还可添加丁酸钠，添加浓度为5mM。
所述感染复数为150～250，优选为200。
本发明通过重组杆状病毒载体的构建、制备高病毒滴度的重组杆状病毒、选择合适的感染细胞的条件以高效转导目的基因KCNQ1与KCNE1进入CHO细胞株使其共表达，获得KCNQ1/KCNE1异源多聚体蛋白，并不断优化手动膜片钳检测的实验条件，以确认该离子通道是否具有功能。因此，本发明具有如下有益效果：
1）利用BacMam重组杆状病毒，可以使外源基因在许多细胞系和原代细胞中被有效转导，本发明利用BacMam重组杆状病毒成功地将KCNQ1与KCNE1基因转导进入CHO细胞株并获得功能蛋白。
2）本发明利用BacMam重组杆状病毒，成功地实现了KCNQ1与KCNE1两个基因在CHO细胞株中的共表达。
3）现有技术2个或2个以上的基因共表达会对细胞产生很大的毒性，而本发明在MOI为200的条件下感染细胞，几乎没有看到细胞毒性，且该重组病毒在MOI为200，感染24小时的条件下，其转导效率最高。
4）从生物安全性方面考虑，重组杆状病毒本身是不能在CHO细胞内复制的，用它作为基因传递载体，只有目的基因KCNQ1与KCNE1进入CHO细胞，并由哺乳动物启动子CMV启动目的基因表达，因此，该技术具有良好生物安全性。
5）本发明可以应用于高通量的药物筛选。重组病毒感染后的细胞可以冻存备用，使用时复苏即可用于检测，这一方法应用于药物的筛选，可以大大缩短检测时间，重组病毒制备简单，可以同时感染大量细胞，因此可以大大的提高药物筛选的量。目前，利用BacMam病毒技术表达的G蛋白受体应用于药物的筛选。
6）基因的表达量可以通过改变转导的量来控制。以往的技术是无法控制基因的表达量的，而本发明可以通过控制重组病毒的感染复数来控制目的基因的表达量。
7）除启动瞬时表达外，重组杆状病毒在哺乳类细胞内也能产生稳定的转导细胞系。
因此，本发明不仅制备方法简单，而且具有广泛的应用价值。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1是利用BacMam重组杆状病毒表达KCNQ1/KCNE1通道蛋白的CHO-K1细胞上记录到的原始电流图；
图2是所记录通道的KCNQ1/KCNE1通道的电流-电压关系曲线图；
图3是加入KCNQ1/KCNE1通道的选择性抑制剂Chromanol293B后的KCNQ1/KCNE1通道的电流图。
具体实施方式
实施例1
一、重组杆状病毒载体的构建
根据KCNQ1全基因序列【Homo sapiens potassium voltage-gated channel,KQT-likesubfamily,member 1(KCNQ1),NCBI Reference Sequence:NM_000218.2，全基因序列如SEQ ID NO.1所示）与KCNE1全基因序列【Homo sapiens potassium voltage-gated channel,Isk-related family,member 1(KCNE1),NCBI Reference Sequence:NM_000219.3，全基因序列如SEQ ID NO.2所示】，设计其特异性的引物，其中：
KCNQ 1的上游引物序列：5‘-ACTGAATTCGCCACCATGGCCGCGGCCTCCTC-3’，如SEQ ID NO.3所示，含有EcoRI酶切位点；
KCNQ 1的下游引物序列：5‘-CTGAAGCTTCAGGACCCCTCATCGGGG-3’，如SEQ ID NO.4所示，含有HindIII酶切位点；
KCNE 1的上游引物序列：5‘-ACTGAATTCGCCACCATGATCCTGTCTAACACCACAGCG G-3’，如SEQID NO.5所示，含有EcoRI酶切位点；
KCNE 1的下游引物：5‘-CTGAAGCTTCATGGGGAAGGCTTCGTCT CA-3’，如SEQ ID NO.6所示，含有HindIII酶切位点。
即在基因5’末端引入酶切位点EcoRI，3’末端引入酶切位点HindIII。
用以上的KCNQ1和KCNE1引物，以实验室原有质粒pCDNA3.3-KCNQ1和pCDNA3.3-KCND1为模板，用Takara公司的高保真聚合酶PrimeStar Taq进行PCR扩增，获得KCNQ1（2031bp）和KCNE1（390bp）基因。其中，质粒pCDNA3.3-KCNQ1是含有KCNQ1基因的pCDNA3.3质粒，质粒pCDNA3.3-KCND1是含有KCND1基因的pCDNA3.3质粒。质粒pCDNA3.3-KCNQ1和pCDNA3.3-KCND1，可通过常规生物学手段得到或采用商业化的产品。
然后，用NEB公司的限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切目的基因KCNQ1、KCNE1和载体pFastBac1-pCDNA3.1(-)（Invitrogen），胶回收后，用T4连接酶把KCNQ1和KCNE1基因片段分别连接到载体pFastBac1-pCDNA3.1(-)上，形成pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNQ1和pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNE1，再将连接产物分别转化到Top10感受态细菌（Invitrogen）中，均匀涂在含有200μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板上，37摄氏度培养14小时后，挑单克隆，以通用引物CMV和BGH为引物进行菌落PCR鉴定，pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNQ1的阳性克隆有大约2400bp的条带，pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNE1的阳性克隆有大约800bp的条带，测序阳性克隆。
把测序结果正确的阳性克隆接种在3ml含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB培养基中，37摄氏度摇菌16小时后，按常规方法进行质粒小提，将大约20ngDNA加入到100微升DH10Bac感受态细菌（Invitrogen）中，冰浴30分钟后热激45秒，再冰浴3分钟，加入900μl SOC培养基，在37摄氏度摇床中复苏4小时后，均匀涂在含有卡那霉素(50μg/mL)、庆大霉素(10μg/mL)、四环素(100μg/mL)、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷）(100μg/mL)和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）(40μg/mL)的的LB培养基平板上，37摄氏度培养48小时后，挑白色单克隆，以通用引物M13F和M13R作为引物进行菌落PCR鉴定，含KCNQ1的阳性克隆有4.3kb的条带，含KCNE1的阳性克隆有2.7kb的条带，将阳性克隆接种在3ml含有卡那霉素(50μg/mL)、庆大霉素(10μg/mL)、四环素(100μg/mL)的LB培养基中，37摄氏度摇菌16小时后，做质粒小提，获得KCNQ1-BacMid或KCNE1-BacMid重组杆状病毒载体。
二、重组杆状病毒的制备
将上述获得的KCNQ1-BacMid或KCNE1-BacMid重组杆状病毒载体（质粒）各约2μg，用Invitrogene的Cellfectin转染试剂分别转染到1×106个SF9昆虫细胞（Invitrogen）中，27摄氏度培养72小时后，收集上清，上清中含有滴度较低的P1代KCNQ1-BacMam重组杆状病毒或KCNE1-BacMam重组杆状病毒。
把P1代病毒以0.01～0.1的感染复数，再分别接种到密度为4×106/ml的SF9细胞中，培养96小时，收集上清，上清液中含有高滴度的P2代病毒，4摄氏度避光保存病毒液，将病毒梯度稀释105倍、106倍、107倍、108倍、109倍，加入到6孔板的SF9细胞中，避光反应1小时，吸走液体培养基，用40摄氏度左右的0.5%～1%的低熔点琼脂糖SF900II培养基覆盖细胞，27摄氏度培养96小时后，用中性红（3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐）染色细胞，计数没有被染色的斑点（即空斑实验），乘以稀释的倍数即为该病毒的滴度，滴度在1～5×108/ml为高滴度的病毒。
通过上述空斑实验，可确定病毒的滴度，因此，本实施例中，可获得高滴度的KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒。
三、重组杆状病毒转导CHO-k1细胞及功能验证
①重组杆状病毒转导CHO-k1细胞
为方便做电生理方法检测通道蛋白功能实验，选用3.5cm细胞培养皿。
将CHO-K1细胞（ATCC）用胰酶消化吹散后，每个3.5cm细胞培养皿种1×105个CHO-k1细胞，37摄氏度培养24h后，以感染复数（MOI）为200的实施例2制备的重组杆状病毒，按照以下条件，进行优化转导CHO-k1细胞，从而获得表达KCNQ1和KCNE1通道蛋白（KCNQ1/KCNE1通道蛋白）的宿主细胞，并能通过手动膜片钳检测是否具有钾离子通道进行验证：
1）高滴度的KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒，以1:0、0:1、1:1的不同比例，共同转导；
2）在转导的同时，添加或不加丁酸钠，其中，添加时，丁酸钠的添加浓度为5mM；
3）重组杆状病毒转导CHO-k1细胞后，37摄氏度孵育24h。
②以电生理方法检测宿主细胞的表达KCNQ1/KCNE1通道蛋白的功能验证
电生理检测采用手动全细胞膜片钳（电压钳）的方法，在室温下进行。
实验仪器采用Axon系统，包括Multiclamp 700B放大器，DigiData 1440A A/D转换板和pCLAMP10软件。细胞内液的成分为（mM）：KCl 120、KOH 31.25、CaCl25.374、MgCl21.75、EGTA 10、HEPES 10、Na2-ATP 4，用1N氢氧化钾调节pH至7.2；渗透压调至280-290mOsm。玻璃微电极由拉制仪拉制而成，入水电阻为2–4mΩ。细胞外液成分为(mM)：HEPES 10、NaCl145、KCl 4、CaCl22、MgCl21、葡萄糖10，用1N氢氧化钠调节pH至7.4；渗透压调至290-300mOsm。
实验中，选取一个稳定表达KCNQ1/KCNE1的CHO-K1细胞，手动操作形成全细胞膜片钳构架，细胞外由细胞外液持续灌流。KCNQ1/KCNE1电流由Axon系统产生的刺激波引出并被该系统显示和记录。当加入KCNQ1/KCNE1通道的选择性抑制剂药物Chromanol293B（ATCC）时，将药物加在灌流的细胞外液中直接作用于细胞。
其中，在利用BacMam重组杆状病毒表达KCNQ1/KCNE1通道蛋白的CHO-K1细胞上记录到的原始电流图如图1所示，所记录通道的KCNQ1/KCNE1通道的电流-电压关系曲线如图2所示，当加入Chromanol293B后，能抑制KCNQ1/KCNE1通道的电流（如图3所示）。
根据以上实验，结果证实，采用两种病毒以1：1的比例共同转导，感染复数MOI为200，感染24h，且添加5mM丁酸钠，能显著提高KCNQ1和KCNE1基因的表达，产生较好的通道信号。
本实施例中，在适当的条件下，合理的延长转导时间可以提到转导效率。丁酸钠在转导过程中，可以显著的提高外源基因的表达或转录，但是丁酸钠对细胞存在细胞毒性，因此，要选择合适的浓度。
Claims (12)
1.一种应用于BacMam重组杆状病毒载体构建中的引物，其特征在于：所述引物为如SEQID NO.3-4所示的KCNQ1引物或如SEQ ID NO.5-6所示的KCNE1引物。
2.一种BacMam重组杆状病毒载体，其特征在于，包含有：KCNQ1或KCNE1基因片段；其中，该KCNQ1或KCNE1基因片段通过以下方式获得：
以如SEQ ID NO.3-4所示的KCNQ1引物或如SEQ ID NO.5-6所示的KCNE1引物，分别从质粒pCDNA3.3-KCNQ1和质粒pCDNA3.3-KCND1上经PCR扩增获得KCNQ1或KCNE1基因片段。
3.如权利要求2所述的BacMam重组杆状病毒载体，其特征在于：所述质粒pCDNA3.3-KCNQ1是含有KCNQ1基因的pCDNA3.3质粒；
所述质粒pCDNA3.3-KCND1是含有KCND1基因的pCDNA3.3质粒。
4.一种如权利要求2所述的BacMam重组杆状病毒载体的构建方法，其特征在于，包括步骤：
（1）根据KCNQ1与KCNE1全基因序列设计特异性引物；
其中，KCNQ1的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示；
KCNQ1的下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；
KCNE1的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示；
KCNE1的下游引物如SEQ ID NO.6所示；
（2）用KCNQ1与KCNE1的引物分别从质粒pCDNA3.3-KCNQ1和pCDNA3.3-KCND1上PCR扩增获得KCNQ1和KCNE1基因片段，并将这2个基因片段分别克隆到pFastBac1-pCDNA3.1(-)载体上，形成pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNQ1和pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNE1载体；
（3）将pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNQ1和pFastBac1-pcDNA3.1(-)-KCNE1载体分别转化到Top10感受态细胞中，筛选出含KCNQ1或KCNE1的阳性克隆载体；
（4）将含KCNQ1或KCNE1的阳性克隆载体，分别转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，经筛选，获得KCNQ1-BacMid或KCNE1-BacMid重组杆状病毒载体。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）的筛选中，是将转化后的Top10感受态细胞在含有50～200μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板上，36～38℃培养12～20小时后，挑单克隆，以通用引物CMV和BGH为引物，进行菌落PCR鉴定。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）的筛选中，是将转化后的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞涂在含有50μg/mL卡那霉素、10μg/mL庆大霉素、100μg/mL四环素、100μg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷和40μg/mL异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的LB培养基平板上，37℃培养30～72小时后，挑单克隆，以通用引物M13F和M13R作为引物，进行菌落PCR鉴定。
7.一种BacMam重组杆状病毒，其特征在于：所述BacMam重组杆状病毒是将如权利要求4所述的KCNQ1-BacMid和KCNE1-BacMid重组杆状病毒载体，分别转染进入昆虫SF9细胞后，获得KCNQ1-BacMam重组杆状病毒或KCNE1-BacMam重组杆状病毒。
8.如权利要求7所述的BacMam重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括步骤：
1）将KCNQ1-BacMid或KCNE1-BacMid重组杆状病毒载体分别转染进入昆虫SF9细胞，分别获得P1代KCNQ1-BacMam重组杆状病毒或KCNE1-BacMam重组杆状病毒；
2）用P1代KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒，继续感染昆虫SF9细胞，分别制备成病毒滴度在1～5×108范围内的高滴度KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒。
9.一种表达KCNQ1/KCNE1通道蛋白的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞是将如权利要求8所述的高滴度KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒，共同转导CHO-k1细胞后，获得表达KCNQ1和KCNE1通道蛋白的宿主细胞。
10.如权利要求9所述的表达KCNQ1/KCNE1通道蛋白的宿主细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：
将如权利要求8所述的高滴度KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒，共同转导CHO-k1细胞，在一定的感染复数下，37℃孵育24小时，获得表达KCNQ1和KCNE1通道蛋白的宿主细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述转导中，KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒的比例为1：2～2：1；
该转导中，还能添加丁酸钠，添加浓度为5mM；
所述感染复数为150～250。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述KCNQ1-BacMam重组杆状病毒和KCNE1-BacMam重组杆状病毒的比例为1：1；
所述感染复数为200。
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-
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|---|
| DANIEL W. BEACHAM，等: "Cell-Based Potassium Ion Channel Screening Using the FluxORTM Assay", 《JOURNAL OF BIOMOLECULAR SCREENING》, vol. 15, no. 4, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 441 - 446 * |
| STEVEN A. TITUS，等: "A new homogeneous high-throughput screening assay for profiling compound activity on the human ether-α-go-go-related gene channel", 《ANAL BIOCHEM》, vol. 394, no. 1, 1 November 2009 (2009-11-01), pages 30 - 38, XP026524829, DOI: 10.1016/j.ab.2009.07.003 * |
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