CN103804148B

CN103804148B - 水提印加果叶中羟基酪醇的方法

Info

Publication number: CN103804148B
Application number: CN201410034710.6A
Authority: CN
Inventors: 胡思宁; 王勇; 肖茜莹; 肖培富; 孙炎
Original assignee: SANYA QIXING BIOLOGICAL ENERGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: Shanghai Yuner Cosmetics Co., Ltd
Priority date: 2014-01-25
Filing date: 2014-01-25
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2034-01-25
Also published as: CN103804148A

Abstract

本发明涉及一种植物提取领域，即水提印加果叶中羟基酪醇的方法。其步骤如下：（1）原料：印加果叶。（2）水提取两次，合并提取液，离心去杂，所得清液经D—101树脂吸附，将洗脱液合并，在60℃下减压蒸馏，回收乙醇并继续蒸发浓缩至1.05g/mL时冷冻干燥。采用水作提取液，大大地降低了生产成本且极为安全，提取工艺合理，生产成本低、安全，操作简单，提取物杂质少。本方法提取物的产率为2.5%-3.1%，其中羟基酪醇的含量为25%-30%。提取率高，有效成分的提取率为82%-85%。<u/>

Description

水提印加果叶中羟基酪醇的方法

技术领域　

本发明涉及一种植物提取领域，即水提印加果叶中羟基酪醇的方法。

背景技术

在现有技术中，羟基酪醇（英文：hydroxytyrosol），化学名称为：3,4-二羟基苯乙醇，分子式：C₈H₁₀O₃，溶解性：既可溶于醇、水，又能溶于脂类溶剂。

羟基酪醇的药效：（1）抗肿瘤。（2）抗血栓、调血脂和抗动脉硬化。（3）抗病原微生物。（4）防治视网膜黄斑变性。（5）抑制DNA氧化损伤、保护皮肤光损伤。（6）抗炎、镇痛。（7）保护软骨和抗骨质疏松作用。（8）其他：可以有效降低和抑制吸烟对人体的危害；快速恢复体能，增强抵抗力和运动能力；减肥等。

羟基酪醇的应用范围：（1）在食品工业中，可作为天然的防腐剂，防止食品的氧化变质。（2）在营养保健领域，可作为营养补充剂、抗菌剂，添加到各种食品中。（3）在美容产品保健品方面，能有效增强皮肤弹性和润泽，减少紫外线对皮肤的损伤作用，延缓皮肤老化。（4）有助于人体对矿物质的吸收，无需补钙，自然吸收，保持骨密度，减少骨骼疏松，同时提高内分泌系统功能，促进新陈代谢，促进伤口愈合，消除体内自由基，恢复人体脏腑器官的健康状态，防止脑衰，延缓衰老，保持青春活力。（5）可以防治肺癌、乳腺癌、子宫癌、前列腺癌等，促进癌症后期恢复和提高化疗效果。（6）防治因吸烟导致的多种病变。（7）对动脉硬化、高血压、心脏病、脑溢血等的预防与治疗有奇效，优于同类药品。（8）作为天然的抗菌、抗病毒和杀真菌产品用于农业和虫害控制。

羟基酪醇在自然界中的分布：在自然界中，羟基酪醇主要存在于：（1）橄榄的果实和枝叶中。橄榄枝叶中羟基酪醇的含量为0.3%-0.8%。（2）制备橄榄油过程中产生的残渣和废水中。（3）印加果叶中。印加果叶中羟基酪醇的含量为0.7%-0.9%。羟基酪醇的制备：目前，羟基酪醇的制备主要是以化学合成法为主，以天然植物提取为辅。（1）山东省巨野晨农天然产物有限公司等单位以对羟基苯乙醇为原料制备了羟基酪醇。（2）天津市尖峰天然产物研究开发有限公司发明了从橄榄提取液中提取羟基酪醇的方法。（3）普罗贝尔特医药公司（发明人：西班牙J.A洛佩斯马斯等）发明了从橄榄或提取橄榄油后的橄榄固体残渣中提取羟基酪醇的方法。（4）中国林业科学院林产化学工业研究所叶建中等人发明了用90%的甲醇从油橄榄叶中采用超声波辅助提取提取羟基酪醇的方法。目前从天然植物中提取羟基酪醇一般采用高浓度的甲醇为提取液，生产中的防火级别极高。

印加果又名印奇果、印加花生、南美油藤，原产于南美洲。2006年，中国科学院在我国的云南、海南等地引种成功并推广，2011年中国科学院西双版纳热带植物园获得国家发明专利（一种南美油藤的育种方法）。印加果叶片中羟基酪醇的含量明显高于橄榄叶。

经海南省医学信息研究所查新，未见从印加果叶中提取羟基酪醇的文献报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足而提供一种以印加果叶为原料，工艺合理，生产成本低、安全，操作简单的水提印加果叶中羟基酪醇的方法。

本发明的技术解决方案是：一种水提印加果叶中羟基酪醇的方法，其步骤如下：

（1）原料：印加果叶。

（2）在50－70℃下，以水为溶剂循环提取2－3次，每次1.5－3h，第一次加水量为8倍，第二次加水量为6倍，合并提取液，离心去杂，所得清液经D—101树脂吸附，树脂用量与原料的质量相等，柱层析药液流速2BV/h，完毕后用4BV水快速洗脱去杂，再用30%乙醇解吸附2次，第一次用量为4BV，流速为1 BV/h，第二次用量为1 BV，快速解吸附；最后将洗脱液合并，在60℃下减压蒸馏，回收乙醇并继续蒸发浓缩至d≥1.05g/mL时冷冻干燥。

本发明的主要优点：

1、建立了一种制备羟基酪醇的新方法，用水作提取液，大大地降低了生产成本且极为安全。

2、所用原料（印加果叶）中羟基酪醇的含量较高，是一种提取羟基酪醇的新来源。

3、提取工艺合理，生产成本低、安全，操作简单，提取物杂质少。

4、本方法提取物的产率为2.5%-3.1%，其中羟基酪醇的含量为25%-30%。提取率高，有效成分的提取率为82%-85%。

下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。

附图说明

图1是羟基酪醇对照品色谱图。

图2是印加果提取物色谱图。

具体实施方式

实施例

水提印加果叶中羟基酪醇的方法，其步骤如下：印加果叶在60℃，以水为溶剂循环提取2次，每次2h，第一次加水量为8倍，第二次加水量为6倍，合并提取液，离心去杂，所得清液经D—101树脂吸附，树脂用量与原料的质量相等，柱层析药液流速2BV/h，完毕后用4BV水快速洗脱去杂，再用30%乙醇解吸附2次，第一次用量为4BV，流速为1 BV/h，第二次用量为1 BV，快速解吸附；最后将洗脱液合并，在60℃下减压蒸馏，回收乙醇并继续蒸发浓缩至1.05g/mL时冷冻干燥。

实验例1

提取工艺及纯化方法考察

基于羟基酪醇的水溶性较好的因素考虑，直接采用水溶方法提取，全面考察了浸泡时间、提取温度、加水倍量、提取时间、提取次数、纯化方法等因素，每个因素均考察了多个水平。结论如下：

（1）浸泡时间因素

分别取100 g烘干印加果叶（羟基酪醇的含量为0.8%）各加水2000 mL, 分别浸泡0.5，1，2，3，4 h，循环提取2h，提取液经离心分离（≥2500 rpm，10 min），弃去沉淀物，所得清液在60℃下减压浓缩至干，收集产品，称量、测定。结果见表1。

表1 浸泡时间因素的影响结果

浸泡时（h）	0	0.5	1	2	3	4
							产量	8.87g	8.7g	8. 7g	8.7g	8.7g	8.6g
纯度	5.0%	5.05%	5.0%	5.0%	5.0%	5.05%
							提取率	55.6%	55.2%	55.6%	55.6%	55.6%	54.3%

结果表明，浸泡时间对于产量和提取率并无显著影响，基于羟基酪醇的化学性质，生产周期越短越好。

结论1：提取时，原料不必浸泡。

（2）温度因素

分别取100 g烘干印加果叶（羟基酪醇的含量为0.8%）加水2000 mL, 不浸泡，提取1次，在不同温度下循环提取4 h。提取液经离心分离（≥2500 rpm，10 min），弃去沉淀物，所得清液置于旋转蒸发仪中在60℃下减压浓缩至干，收集产品，称量、测定。在上述条件下考察了温度因素的影响。结果见表2。

表2 温度因素的影响结果

温度	室温	40℃	50℃	60℃	70℃	80℃
							产量	4.7g	8.0g	8.6g	9.4g	10.5g	13.5g
纯度	5.13%	4.90%	5.11%	5.1%	3.89%	2.67%
							提取率	30%	49%	55%	60%	51%	45%

结果表明：提取温度对提取效果的影响很大。

温度过低时，产量和提取率偏低。

温度过高时，产量明显提高，但有效成分的含量及提取率严重偏低。

因素分析：

若温度过低，有效成分的浸出不完全，产量和提取率偏低是必然的结果。

若温度过高，浸出成分多且复杂，所以产量高，但有效成分的含量严重偏低。

当温度过高时，可能是由于羟基酪醇氧化变质，导致提取率明显偏低。

结论2：提取的最佳温度为60 ℃。

（3）料液比考察

在60℃的条件下不浸泡，循环提取4h，其他因素同（1）和（2），结果见表3。

表3 料液比的影响结果

加水倍量	20	15	10	8	6	5
							产量	9.4g	0.88g	0.87g	0.87g	0.80g	0.60g
纯度	5.10%	4.90%	5.11%	5.10%	5.20%	5.22%
							提取率	60%	53.7%	55.8%	55.6%	52.0%	39.2%

结果表明，当加水倍量超过8倍时，结果相差无几，但低于6倍时，有显著影响。

结论3:加水倍量为8倍时为最佳。

（4）提取时间因素

分别取100 g 原料，加水800 mL，在60℃恒温条件下提取，其他条同（1）、（2）、（3）的前提下，考察了提取时间因素的影响。

基于羟基酪醇的化学性质较为活泼，易被氧化，所以要尽可能地缩短生产周期。结果见表4。

表4 提取时间因素的影响结果

结果表明：提取时间低于2h时，产量和提取率有明显差异，当提取时间≥2h时，差异不大，以2h为最佳。

因素分析：

提取时间过短（＜2 h）有效成分不能完全浸出，产量和提取率严重偏低；但提取时间过长，效益并不明显，反而会增加生产成本。

结论4：每次提取时间为2 h最佳。

（5）提取次数因素

分别取印加果叶100g，加水800 mL，不浸泡，在60℃的条件下直接提取，每次提取时间为2h，其他因素同（1）、（2）、（3）、（4），考察了提取次数因素的影响。由于第一次提取完毕后，原料已经浸润，以后每次料液比均为1:6，合并提取液。结果见表5。

表5 提取次数因素的影响结果

提取次数	1次	2次	3次	4次	5次
						产量	8.7g	13.8g	13.5g	13.5g	13.2g
纯度	5.10%	5.05%	5.10%	5.08%	5.00%
						提取率	55.6%	86.8%	86.1%	85.9%	82.8%

结果表明，只提取1次，其产量和提取率严重偏低；提取2次，效果最好。提取3次以上，其产量和提取率反而下降。

因素分析：

只提取1次，有效成分没有完全浸出，其产量和提取率必然低。当提取次数3次或3次以上时，由于提取液量的增加，在纯化（吸附）过程中损失量增加，导致产量和提取率有所下降。

结论5：提取2次为最佳。

（6）纯化方法研究

众所周知，大孔树脂是中草药提取的通用树脂，本方案考察了D-101、AB-8、X-5、HP-20纯化效果。

分别将上述树脂各100 g湿法装柱。

各取100 g 原料，加水800mL（第2次600mL），升温至60 ℃后，恒温提取2次，每次2 h ,合并提取液，离心分离，清液分别进行柱层析，其他操作同(1)、（2）（3）、（4）、（5），结果见表6。

表6 不同树脂纯化效果比较

树脂	D-101	AB-8	X-5	HP-20
					产量	2.72g	2.70g	2.70g	2.70g
纯度	25.5%	25.25%	25.5%	25.4%
					提取率	86.22%	85.5%	86.1%	85.9%

结果表明：上述四种树脂的纯化效果无明显差别。基于D-101的价格、使用周期、供应来源、再生等因素考虑，选定D-101树脂。

结论6.纯化方法

D-101树脂:原料为1:1（质量比）；

吸附：柱层析药液流速2BV/h；

解吸附：先用4BV水快速洗脱去杂，再用30%乙醇（V/V）解吸附2次，第一次用量为4BV，流速为1 BV/h；第二次用量为1 BV，快速解吸附。

（7）干燥方法的筛选

基于羟基酪醇的化学性质并结合生产实际考虑，首选冷冻干燥方式。

将洗脱液在60℃下减压蒸馏回收乙醇并继续蒸发浓缩至d≥1.05g/mL时冷冻干燥。

结论7.干燥方法：冷冻干燥。

综述

本发明涉及制备羟基酪醇的一种新方法，它具有生产成本低、安全、操作简单、提取率高等优点。

由印加果叶片为原料，在60℃下以水为溶剂循环提取2次，每次2h，第一次加水量为8倍，第二次加水量为6倍，合并提取液离心去杂（≥2500 rpm，10 min），所得清液经D—101树脂吸附，树脂用量与原料的质相等量。柱层析药液流速2BV/h，完毕后用4BV水快速洗脱去杂，再用30%乙醇（V/V）解吸附2次，第一次用量为4BV，流速为1 BV/h；第二次用量为1 BV，快速解吸附。最后将洗脱液合并，在60℃下减压蒸馏回收乙醇并继续蒸发浓缩至d≥1.05g/mL时冷冻干燥。

本工艺提取物的产率为2.5%-3.1%，其中羟基酪醇的含量为25%-30%。有效成分的提取率为82%-85%。

羟基酪醇对照品和印加果叶提取物的HPLC图如图1、2所示。

实验例2

羟基酪醇的含量测定（HPLC法）

（1）色谱条件

LC-2010AHT高效液相色谱仪

色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)

流动相：甲醇-0.4%醋酸水溶液（10: 90）

流速：1.0 mL/min ，

检测波长：280 nm，

柱温：30 ℃

原料（印加果叶片）羟基酪醇含量测定结果

自然阴干的原料中羟基酪醇的含量为0.7%；烘焙箱中低温（50℃以下）烘干的原料中羟基酪醇的含量为0.9%。

结果表明：自然阴干的原料中羟基酪醇的含量略低于烘干的原料。所以，原料以烘干为好。

上面描述，只是本发明的具体实施方式，各种举例说明不对本发明的实质内容构成限制。

Claims

1. 一种水提印加果叶中羟基酪醇的方法，其特征在于步骤如下：

（1）原料：印加果叶；

2.按照权利要求1所述的水提印加果叶中羟基酪醇的方法，其特征在于步骤如下：印加果叶在60℃，以水为溶剂循环提取2次，每次2h，第一次加水量为8倍，第二次加水量为6倍，合并提取液，离心去杂，所得清液经D—101树脂吸附，树脂用量与原料的质量相等，柱层析药液流速2BV/h，完毕后用4BV水快速洗脱去杂，再用30%乙醇解吸附2次，第一次用量为4BV，流速为1 BV/h，第二次用量为1 BV，快速解吸附；最后将洗脱液合并，在60℃下减压蒸馏，回收乙醇并继续蒸发浓缩至d等于1.05g/mL时冷冻干燥。

3.按照权利要求1或2所述的水提印加果叶中羟基酪醇的方法，其特征在于印加果叶经烘干处理。