CN103796649A

CN103796649A - 神经变性疾病的治疗

Info

Publication number: CN103796649A
Application number: CN201280039226.1A
Authority: CN
Inventors: E·S·伯斯坦; R·奥尔森; K·麦克法兰
Original assignee: Acadia Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Acadia Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-08-11
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2014-05-14
Also published as: EP2556827A1; US20140329903A1; EP2741743A1; CA2842725A1; AU2012293702A1; WO2013020966A1

Abstract

本公开涉及以低剂量使用的治疗神经变性疾病或病症的化合物。它还涉及用于治疗神经变性疾病或病症的方法。

Description

神经变性疾病的治疗

技术领域

本文提供了影响Nurr1受体的化合物和使用这类化合物调节神经变性病状的方法。

背景技术

核受体相关1蛋白(NURR1)也称作NR4A2(核受体亚家族4，组A，成员2)，因此Nurr1是强烈地涉及多巴胺能神经元生长、维持和存活的核激素受体(NucHR)，其代表非常有前景的帕金森病(PD)治疗靶。在小鼠基因敲除实验中显著表明了Nurr1在多巴胺能细胞发育中的关键作用，在所述实验中缺少Nurr1的纯合小鼠未能产生中脑多巴胺能神经元(Zetterstrom等人,1997)。显示了Nurr1直接参与调节编码芳族氨基酸脱羧酶、酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运蛋白(DAT)的基因(Hermanson等人,2003)。此外，Nurr1限制中枢神经系统(CNS)中的炎症反应，并且特异性地保护多巴胺能神经元免于神经毒性(Saijo等人,2009)。这些观察结果表明Nurr1在范围从炎症反应至多巴胺能神经功能和存活的神经变性疾病方面发挥病理生理作用。

例如，Nurr1激动剂具有作为帕金森药物的巨大潜力，因为它们增强中脑原代培养物中TH和DAT表达并且在PD的动物模型中对多巴胺能神经元发挥有益作用(Ordentlich等人,2003;Jankovic等人,2005;Dubois等人,2006)。然而，未充分确定现有配体作用的分子基础。Nurr1可能单独或更可能与其他核激素受体配偶物协同介导其有益作用(Sacchetti等人,2006;Carpentier等人,2008)。迄今，存在一些可供实验测试的这类配体的例子(Shi,2007)。

Nurr1可以形成二聚体并且已知与包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、糖皮质激素受体(GR)、类法尼醇X受体(FXR)和类视黄醇X受体(RXR)的其他NucHR缔合(Sacchetti等人,2006;Carpentier等人，2008)。目前不目前不知道哪种Nurr1相互作用在PD治疗中是重要的。然而，一致认为Nurr1参与多巴胺能神经元的活化和细胞存活是重要的(Shi，2007)。几种最有力的结合Nurr1的化合物增强中脑原代培养物中TH和DAT表达并且在PD的动物模型中对多巴胺能神经元发挥有益作用(Jankovic等人,2005)。

因此，对如Nurr1激动剂的化合物或通过结合Nurr1的配偶体间接诱导Nurr1激活的化合物存在需求，所述配偶体通过在中枢神经系统中Nurr1受体处的活性具有神经保护性，所述化合物作为药理学工具和作为治疗剂。

WO2011/057022、WO2009/146218、WO2009/146216和WO2008/064133均提到化合物蓓萨罗丁。

发明内容

一些实施方案涉及一种用于治疗神经变性疾病或病症的式(I)的化合物

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物，其中，所述化合物以低剂量施用。

一些实施方案涉及式(I)的化合物

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物用于制造用于治疗神经变性疾病或病症的药物组合物的用途，其中，所述化合物以低剂量施用。

一些实施方案涉及一种用于治疗神经变性疾病或病症的方法，包括向患有神经变性疾病或病症的患者施用有效量的式(I)的化合物

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物，其中，将所述化合物以低剂量施用至所述患者。

一些实施方案涉及一种用于再生患有神经变性疾病或病症的患者中神经元功能的方法，包括向患有神经变性疾病或病症的所述患者施用有效量的式(I)的化合物

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物。

一些实施方案涉及一种用于保护患有神经变性疾病或病症的患者中神经元的方法，包括向患有神经变性疾病或病症的所述患者施用有效量的式(I)的化合物

一些实施方案提供了一种包含有效量的蓓萨罗丁(式(I)的化合物)或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物的药物组合物。实施方案详述

定义

除非另外定义，本文中所用的全部技术术语和科学术语具有与本领域技术人员通常所理解的相同含义。本文所引用的全部专利、申请、公开的申请和其他出版物通过引用的方式完整地并入。在本文中术语存在多种定义的情况下，除非另外说明，否则在这个部分中的那些定义居于优先。

本文所用的术语“神经变性疾病或病症”指选自由以下组成的组的疾病或病症：帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、与TDP-43蛋白相关的额颞叶变性(FTLD-TDP)、路易体痴呆(DLB)、血管性痴呆、肌萎缩侧索硬化(ALS)、和由衰老、疾病或创伤；或脊髓损伤导致的脑中变化引起的其他神经变性相关痴呆。这类神经变性疾病或病症可能与Nurr1受体相关。

本文所用的术语“神经保护”指防止由于暴露于神经毒素或由神经变性疾病或病症引起的神经元细胞的进一步丧失、或神经元功能的丧失。如本文所用，术语“神经保护”与“神经元的保护”同义。

如本文所用，认为促进神经元存活与神经保护等同。

本文所用的术语“再生”指使损伤或缺陷细胞，或相对于相应健康细胞的天然活性具有低于正常活性的细胞的活性增加。这种细胞可以是神经元。在本文中提供的一些实施方案中，“再生”指患有神经变性疾病或病症的患者中神经元的再生。

因此，在一些实施方案中，“神经元再生”指患有神经变性疾病或病症的患者中神经元的再生。在一些实施方案中，术语“神经再生”指逆转由于暴露于神经毒素出现的或由神经变性疾病引起的神经元细胞的丧失、或神经元功能的丧失的过程。

神经修复应当定义为与神经再生等同。

本文所用的术语“神经元功能”指神经元合成、贮存、释放、转运和响应神经递质的能力。因此，神经元某些组分的表达或完整性的变化可能影响神经元功能，所述组分包括但不限于受体转运蛋白、小泡、细胞体、轴突或树突。

神经递质应当定义为由神经元释放的刺激或抑制神经元活性的扩散性分子。

本文所用的表述“低剂量”指化合物或药物(例如蓓萨罗丁)的剂量对于人患者不大于每日75mg或每日1mg/kg体重。为了获得希望的化合物或药物的作用，至少在使用蓓萨罗丁时，对于人患者剂量应当是至少每日0.05mg或每日0.0006mg/kg体重。在一些实施方案中，所述“低剂量”因此可以是从每日大约0.05mg至每日大约75mg，或从每日大约0.0006mg/kg体重至每日大约1mg/kg体重的剂量。可以作为一次日剂量或作为一系列几个剂量或作为连续输注给予该低剂量，每日总剂量是从大约0.05mg至大约75mg或从每日大约0.0006mg/kg体重至每日大约1mg/kg体重。通过至少两种不同施用途径给予总的低日剂量也是可能的。不受任何具体理论限制，基于蓓萨罗丁在刺激Nurr-1-RXR异二聚体方面比RXR-RXR同型二聚体效力高10倍的令人惊讶的研究结果，使用本文提供的低剂量蓓萨罗丁是可能的。因此，对于依靠Nurr-1刺激的临床应用，蓓萨罗丁可以按照比抗癌治疗中使用的剂量低得多并且耐受剂量高得多的剂量使用。这由PD的动物模型中的研究支持，所述研究显示了非常低剂量的蓓萨罗丁的神经保护作用和神经再生作用，如下文进一步表明。蓓萨罗丁是通过同型二聚体RXR-RXR起作用以产生临床使用的抗癌作用的RXR激动剂。已经发现以低剂量给予的蓓萨罗丁是充分耐受然而有效的。进一步发现蓓萨罗丁可以用来减缓、停止或者甚至修复神经变性，这在下文进一步讨论并且说明。

如本文所用，“药学上可接受的盐”指本身不消除化合物的生物活性和特性的化合物的盐。药用盐可以通过将本文中公开的化合物与碱反应获得。碱形成的盐包括但不限于，铵盐(NH₄ ⁺)；碱金属盐，例如但不限于钠盐或钾盐；碱土金属盐，例如但不限于，钙盐或镁盐；有机碱(例如但不限于二环己胺、N-甲基-D-葡糖胺、三(羟甲基)甲胺)的盐；与氨基酸(例如但不限于，精氨酸和赖氨酸)的氨基形成的盐。

药学上可接受的溶剂化物和水合物是化合物与一个或多个溶剂分子或水分子，或1至大约100，或1至大约10，或1至大约2、3或4个溶剂分子或水分子的复合物。

如本文所用，“调节”受体的活性意指或者激活它，即，将它的细胞功能增加到在它存在的特定环境中所测量的基础水平以上，或者使它失活，即，将它的细胞功能降低到低于在它存在的环境中所测量的基础水平和/或使得它根本不能执行细胞功能，甚至在存在天然结合配偶体的情况下。天然结合配偶体是作为受体激动剂的内源性分子。

“激动剂”定义为增加受体的基础活性(即，由受体介导的信号转导)的化合物。

如本文所用，“部分激动剂”指这样的一种化合物，该化合物对受体具有亲和力，但是不像激动剂，当与受体结合时，仅激发部分程度的正常情况下与该受体相关的药理学反应，即使许多受体由该化合物占据。

“反向激动剂”定义为这样的一种化合物，该化合物减小或阻抑受体的基础活性，从而使得该化合物在技术上不是拮抗剂，而是具有负向内在活性(negative intrinsic activity)的激动剂。

如本文所用，“拮抗剂”指与受体结合以形成复合物的化合物，该复合物不产生任何反应，好像受体未被占据。拮抗剂减弱激动剂对受体的作用。拮抗剂可以可逆地或不可逆地结合，从而有效地永久消除受体的活性或至少消除受体的活性直至拮抗剂被代谢或解离或否则由物理或生物学过程移除。

如本文所用，“受试者”指是治疗、观察结果或实验的对象的动物。“动物”包括冷血和温血脊椎动物及无脊椎动物，如鱼类、甲壳类、爬行类和尤其哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于，小鼠；大鼠；兔；豚鼠；犬；猫；绵羊；山羊；母牛；马；灵长类，如猴，黑猩猩，和猿，以及尤其人。

如本文所用，“患者”指正在由医学专业人员如M.D.或D.V.M.治疗的主体以试图治愈，或至少减轻特定疾病或病症的影响或者从起初防止疾病或病症出现。

如本文所用，“载体”指有助于将化合物掺入到细胞或组织中的化合物。例如，但不限制地，二甲基亚砜(DMSO)是有助于将许多有机化合物至摄入试者的细胞或组织中的常用载体。

如本文所用，“稀释剂”指药物组合物中缺少药理学活性但是可能是药学上必须的或合乎需要的成分。例如，稀释剂可以用来增加对制造或施用质量太小的有效药物的体积。它也可以是用于溶解将通过注射、摄入或吸入施用的药物的液体。本领域常见形式的稀释剂是缓冲水溶液，例如但不限于，模拟人血液组成的磷酸盐缓冲盐水。

如本文所用，“赋形剂”指是添加至药物组合物以向该组合物提供，而并不限制地，体积、一致性、稳定性、结合能力、润滑、崩解能力等的惰性物质。“稀释剂”是一类赋形剂。

“受体”意在包括存在于细胞内部或其表面上的任何分子，所述分子被配体抑制或刺激时可以影响细胞生理。通常，受体包括具有配体-结合特性的胞外结构域、将受体锚定在细胞膜中的跨膜结构域，以及响应配体结合而产生细胞信号的胞质结构域(“信号转导”)。受体还包括具有受体的特征性结构但是不具有可识别配体的任何分子。此外，受体包括截短、修饰、突变的受体，或任何包括受体的部分或全部序列的分子。

“配体”意在包括与受体相互作用的任何物质。

“Nurr1受体”定义为具有与通过分子克隆和药理学表征的Nurr1受体亚型的活性相对应的活性的受体。

如本文所用，药理活性化合物的“共施用”指递送两种或更多种独立的化学实体，无论是体外或体内。共施用意指同时递送独立的药剂；同时递送药剂的混合物；以及递送一种药剂，随后递送第二药剂或额外的药剂。共施用的药剂通常意在彼此联合起作用。

本文所用的术语“有效量”意指活性化合物或药剂的量，所述量在研究者、兽医师、医生或其他临床医生正在探索的组织、系统、动物或人类中激发生物反应或医学反应，包括正在治疗的疾病的症状的减轻或缓和。

化合物

本文提供的化合物是蓓萨罗丁，根据式I的化合物(也以商品名称Targretin已知并称作LGD1069)，

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物。

在一些实施方案中，蓓萨罗丁或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物与至少一种其他药理活性化合物共施用。

如本文中所公开的，蓓萨罗丁或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物或包含这些中的任一种的药物组合物按照任何已知或/和常规的施用途径以低剂量施用。合适的施用途径的例子包括口服、直肠、透粘膜(包括舌下和颊部)、局部、经皮或肠道施用；肠胃外递送，包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射，以及鞘内、直接脑室内注射，直接注射至人脑，直接心室内、腹膜内、鼻内或眼球内注射。也可以以持续或受控释放剂型施用所述化合物，所述剂型包括纳米粒子、贮库注射剂、渗透泵、电子泵、丸剂、透皮(包含电转运)贴剂等，以便以预定速率实现延长的和/或定时的脉冲施用。持续或受控释放剂型可以用来增加CNS暴露和最小化全身暴露。将至少两种不同的施用途径联合也是可能的。

在一些实施方案中将化合物以至少0.05mg至多达并且包括每日75mg的剂量施用至患有神经变性疾病或病症的患者。

在一些实施方案中将化合物以多达并且包括每日70mg的剂量施用至患有神经变性疾病或病症的患者。这些实施方案的一些可以涉及口服施用。

在一些实施方案中将化合物以多达并且包括每日65mg的剂量施用至患有神经变性疾病或病症的患者。

在一些实施方案中将化合物以多达并且包括每日50mg的剂量施用至患有神经变性疾病或病症的患者。

在一些实施方案中将化合物以多达并且包括每日20mg的剂量施用至患有神经变性疾病或病症的患者。这些实施方案的一些可以涉及脑室内施用。

在一些实施方案中将化合物以多达并且包括每日15mg的剂量施用至患有神经变性疾病或病症的患者。这些实施方案的一些可以涉及脑室内施用。

剂量范围的下限可以是每日0.05mg，如上文进一步表明的。

在一些实施方案中，剂量范围的下限可以是每日0.08mg，上限按照上文给出的任何备选实施方案。这些实施方案的一些可以涉及脑室内施用。

在一些实施方案中，剂量范围的下限可以是每日0.1mg，上限按照上文给出的任何备选实施方案。

在一些实施方案中，剂量范围的下限可以是每日0.5mg，上限按照上文给出的任何备选实施方案。

在一些实施方案中，剂量范围的下限可以是每日1mg，上限按照上文给出的任何备选实施方案。

在一些实施方案中，剂量范围的下限可以是每日5mg，上限按照上文给出的任何备选实施方案。这些实施方案的一些可以涉及口服施用。

在一些实施方案中，剂量范围的下限可以是每日3mg，上限按照上文给出的任何备选实施方案。这些实施方案的一些可以涉及皮下施用。

在一些实施方案中，剂量范围的下限可以是每日12mg，上限按照上文给出的任何备选实施方案。这些实施方案的一些可以涉及口服施用。

在一些实施方案中，剂量范围可以选自由以下所组成的组：

从每日0.05mg至多达并包括75mg，

从每日0.05mg至多达并包括70mg，

从每日0.05mg至多达并包括65mg，

从每日0.05mg至多达并包括60mg，

从每日0.05mg至多达并包括59mg，

从每日0.05mg至多达并包括50mg，

从每日0.05mg至多达并包括20mg，

从每日0.05mg至多达并包括18mg，

从每日0.05mg至多达并包括15mg，

从每日0.05mg至多达并包括10mg，

从每日0.05mg至多达并包括5mg，

从每日0.05mg至多达并包括3mg，

从每日0.08mg至多达并包括75mg，

从每日0.08mg至多达并包括70mg，

从每日0.08mg至多达并包括65mg，

从每日0.08mg至多达并包括60mg，

从每日0.08mg至多达并包括59mg，

从每日0.08mg至多达并包括50mg，

从每日0.08mg至多达并包括20mg，

从每日0.08mg至多达并包括18mg，

从每日0.08mg至多达并包括15mg，

从每日0.08mg至多达并包括10mg，

从每日0.08mg至多达并包括5mg，

从每日0.08mg至多达并包括3mg，

从每日0.1mg至多达并包括75mg，

从每日0.1mg至多达并包括70mg，

从每日0.1mg至多达并包括65mg，

从每日0.1mg至多达并包括60mg，

从每日0.1mg至多达并包括59mg，

从每日0.1mg至多达并包括50mg，

从每日0.1mg至多达并包括20mg，

从每日0.1mg至多达并包括18mg，

从每日0.1mg至多达并包括15mg，

从每日0.1mg至多达并包括10mg，

从每日0.1mg至多达并包括5mg，

从每日0.1mg至多达并包括3mg，

从每日0.5mg至多达并包括75mg，

从每日0.5mg至多达并包括70mg，

从每日0.5mg至多达并包括65mg，

从每日0.5mg至多达并包括60mg，

从每日0.5mg至多达并包括59mg，

从每日0.5mg至多达并包括50mg，

从每日0.5mg至多达并包括20mg，

从每日0.5mg至多达并包括18mg，

从每日0.5mg至多达并包括15mg，

从每日0.5mg至多达并包括10mg，

从每日0.5mg至多达并包括5mg，

从每日0.5mg至多达并包括3mg，

从每日1mg至多达并包括75mg，

从每日1mg至多达并包括70mg，

从每日1mg至多达并包括65mg，

从每日1mg至多达并包括60mg，

从每日1mg至多达并包括59mg，

从每日1mg至多达并包括50mg，

从每日1mg至多达并包括20mg，

从每日1mg至多达并包括18mg，

从每日1mg至多达并包括15mg，

从每日1mg至多达并包括10mg，

从每日1mg至多达并包括5mg，

从每日1mg至多达并包括3mg，

从每日3mg至多达并包括75mg，

从每日3mg至多达并包括70mg，

从每日3mg至多达并包括65mg，

从每日3mg至多达并包括60mg，

从每日3mg至多达并包括59mg，

从每日3mg至多达并包括50mg，

从每日3mg至多达并包括20mg，

从每日3mg至多达并包括18mg，

从每日3mg至多达并包括15mg，

从每日3mg至多达并包括10mg，

从每日3mg至多达并包括5mg，

从每日5mg至多达并包括75mg，

从每日5mg至多达并包括70mg，

从每日5mg至多达并包括65mg，

从每日5mg至多达并包括60mg，

从每日5mg至多达并包括59mg，

从每日5mg至多达并包括50mg，

从每日5mg至多达并包括20mg，

从每日5mg至多达并包括18mg，

从每日5mg至多达并包括15mg，

从每日5mg至多达并包括10mg，

从每日10mg至多达并包括75mg，

从每日10mg至多达并包括70mg，

从每日10mg至多达并包括65mg，

从每日10mg至多达并包括60mg，

从每日10mg至多达并包括59mg，

从每日10mg至多达并包括50mg，

从每日10mg至多达并包括20mg，

从每日10mg至多达并包括18mg，

从每日10mg至多达并包括15mg，

从每日12mg至多达并包括75mg，

从每日12mg至多达并包括70mg，

从每日12mg至多达并包括65mg，

从每日12mg至多达并包括60mg，

从每日12mg至多达并包括59mg，

从每日12mg至多达并包括50mg，

从每日12mg至多达并包括20mg，和

从每日12mg至多达并包括18mg，

从每日12mg至多达并包括15mg。

上文给出的剂量是针对体重大约80kg且身高大约180cm的平均体格的成年人所估算的每日总剂量。剂量也可以作为mg/kg/日或mg/m²/日给出，其中kg是向其施用药物的受试者例如人的重量，m²是向其施用药物的患者的皮肤面积。通过将以mg/日表示的剂量除以80kg计算以mg/kg/日表示的剂量。通过将以mg/日表示的剂量乘以80kg、180cm个体的Km值计算以mg/m²/日表示的剂量。采用Km系数(体重(kg)除以身体表面积(以m²计的BSA))将用来将研究中所用的mg/kg剂量换算成mg/m²剂量。用于确定Km和BSA的公式来自Reagan-Shaw等人(Reagan-Shaw等人,2008)。可以在下文找到与上面给出的剂量相对应的上文以这些方式给出的剂量：

mg/日	mg/kg/日	mg/m²/日
			75	0.94	38
70	0.88	35
			65	0.81	33
60	0.75	30
			59	0.74	29.6
50	0.63	25
			20	0.25	10
18	0.23	9
			15	0.19	7.5
12	0.15	6
			10	0.13	5
7.5	0.09	3.8
			5	0.063	2.5
3	0.038	1.5
			1	0.013	0.5
0.5	0.0063	0.25
			0.1	0.0013	0.05
0.08	0.001	0.04
			0.05	0.0006	0.025

可选地，相对于上文给出的mg/日剂量，也可以按照mg/kg/日使用、施用或者开处药物。以mg/kg/日给出的剂量范围的上限可以是选自由1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.3、0.2、0.1、0.06和0.04所组成的组。以mg/kg/日给出的剂量范围的下限可以选自由0.0006、0.001、0.006、0.01、0.04、0.06、0.1和0.2所组成的组。由于取决于所用的施用途径有效剂量可以变动，构成一些施用途径的上限的一些剂量可能构成其他施用途径的下限。

可选地，可以按照mg/m²/日剂量使用、施用或者开处药物。如何将以mg/kg/日给出的剂量换算成mg/m²/日是本技术人员熟知的。使用如所描述的换算帮助也是可能的(Reagan-Shaw等人,2008)。

上文给出的剂量是日剂量或每日剂量(称作QD剂量)，即，每24小时给予的分别以mg、mg/kg或mg/m²表示的总量。然而，每个施用中给予的总量可以有所不同。例如，上文给出的每日总量可以每日给予一次，或分成每日一次、两次或三次施用。另外，在一些实施方案中，可以不需要每日施用药物。例如，可以将药物每隔一天、每隔两天或每隔三天施用一次，或每周施用一次。随后将每种情况下待施用的量计算为如上文提到的平均每日总量；例如，当将药物每隔一日施用时上文指定的量可以增加一倍。

在一些实施方案中，所述化合物可以非口服施用。非口服施用意指与口服施用相比，治疗可以更安全且更有效，可以更容易被受试者耐受，因为可以使用较低总剂量的蓓萨罗丁或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物，对肝功能的影响减低，原因在于肝脏暴露的最大药物浓度减小，并且蓓萨罗丁在体内的分布改变，从而使得与外周相比，更大比例所施用的剂量到达脑，因此更早地减少与蓓萨罗丁相关的许多副作用。

在一些实施方案中，该化合物可以脑室内(i.c.v.)施用。脑室内施用意指与口服施用相比，治疗可以更安全且更有效，因为可以使用低得多的总剂量的蓓萨罗丁或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物，并且蓓萨罗丁在体内的分布改变，从而使得绝大多数所施用的剂量是在脑中而很少进入外周，因此更早地避免与蓓萨罗丁相关的许多副作用。这也改善了蓓萨罗丁的功效，因为高浓度被递送至脑中，而极小浓度在外周中。

其中可以优选脑室内施用的一些实施方案可以涉及帕金森病的治疗。

其中可以优选脑室内施用的其他实施方案可以涉及阿尔茨海默病、亨廷顿病、与TDP-43蛋白相关的额颞叶变性(FTLD-TDP)、路易体痴呆(DLB)、血管性痴呆和/或肌萎缩侧索硬化(ALS)的治疗。

在一些实施方案中，皮下施用可以是优选的。这些实施方案的一些可以涉及帕金森病的治疗。

其中可以优选皮下施用的其他实施方案可以涉及阿尔茨海默病、亨廷顿病、与TDP-43蛋白相关的额颞叶变性(FTLD-TDP)、路易体痴呆(DLB)、血管性痴呆和/或肌萎缩侧索硬化(ALS)的治疗。

在一些实施方案中，局部或经皮施用可以是优选的。这些实施方案的一些可以涉及帕金森病的治疗。

其中可以优选局部或经皮施用的其他实施方案可以涉及阿尔茨海默病、亨廷顿病、与TDP-43蛋白相关的额颞叶变性(FTLD-TDP)、路易体痴呆(DLB)、血管性痴呆和/或肌萎缩侧索硬化(ALS)的治疗。

在本公开的背景中已经显示可以按照如上文所定义的低剂量施用蓓萨罗丁或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物或包含这些中的任一种的药物组合物，从而使有害副作用最小化但是仍获得所希望的治疗作用。

根据本公开可以被降低或最小化的这种有害副作用包括但不限于例如高脂血症、急性胰腺炎、肝功能检查(LFT)异常和尤其LFT升高、甲状腺功能检查改变和最经常地血清甘油三酯和血清胆固醇升高、甲状腺激素(总甲状腺素，T4)和甲状腺刺激激素(TSH)的降低、白细胞减少症、贫血、晶状体浑浊、糖尿病患者中的低血糖、出血(bleeding)、出血(hemorrhage)、和凝血病、呼吸困难、恶心、神经性疼痛、水肿、厌食、无力、乏力、白细胞减少症、胰腺炎和脱水和光敏性。

在一些实施方案中，待最小化的不利副作用是高脂血症。

在一些实施方案中，待最小化的不利副作用是高甘油三酯血症。

在一些实施方案中，待最小化的不利副作用是高胆固醇血症。

在一些实施方案中，待最小化的不利副作用是T₄水平降低。

在一些实施方案中，待最小化的不利副作用是TSH水平降低。

当施用至受试者或患者时，蓓萨罗丁或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物或包含这些中的任一种的药物组合物可以引起多巴胺能神经元功能的再生。

根据本公开，修复由于神经变性病症或神经变性病状丧失功能的多巴胺能神经元因此是可能的。测量罹患神经变性病症或神经变性病状的人中多巴胺能神经元功能修复的可能方式包括但不限于使用PET(正电子发射断层摄影术)测量多巴胺周转、或DAT(多巴胺转运蛋白)活性或神经炎症标记物。

在一些实施方案中，多巴胺能神经元部分地由于帕金森病丧失它们的功能。多巴胺能神经元功能可以再生的事实意指可以逆转疾病的进展。仅采用减缓疾病进展的化合物这是不可能的。测量对神经变性或神经再生的作用的可能方式包括但不限于使用PET(正电子发射断层摄影术)测量多巴胺周转、或DAT(多巴胺转运蛋白)活性或神经炎症标记物。测量对神经变性或神经再生的作用的其他方式可以是测量由神经变性引起的症状。例如，可以使用统一的帕金森病评定量表(UPDRS)。

蓓萨罗丁或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物或包含这些中的任一种的药物组合物因此可以用于治疗受益于多巴胺能神经元再生的疾病或病症。

受益于多巴胺能神经元再生的这类疾病或病症可以是与Nurr1受体相关的疾病或病症。

在一些实施方案中，在施用至受试者时，本文所提供的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物引起Nurr1受体的活性增加。

在一些实施方案中，Nurr1受体的活性是包括Nurr1受体的受体复合体的信号传导活性。

在一些实施方案中，Nurr1受体的活性与Nurr1受体激活相关。

在一些实施方案中，Nurr1受体位于受试者的中枢神经系统中。

该化合物可以构成药物组合物的部分。术语“药物组合物”指本文公开的化合物与其他化学组分如稀释剂或载体的混合物。将化合物引入至药物组合物中有助于将化合物施用至生物体。药物组合物也可以通过将化合物与无机酸或有机酸如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等反应获得。

术语“生理可接受的”限定不消除化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。

本文所述的药物组合物可以本身，或在它们与其他活性成分(如在联合疗法中)或合适载体或赋形剂混合的药物组合物中施用至人类患者。用于本申请的化合物的配制和施用的技术可以在''Remington'sPharmaceutical Sciences,''Mack Publishing Co.,Easton,PA,第18版,1990中找到。

本文公开的蓓萨罗丁的药物组合物可以按照本身已知的方式制造，例如，通过常规混合、分散、造粒、糖丸剂制造(dragee-making)、粉碎、乳化、封装或携裹(entrapping)或压片工艺制造。

如本文所述使用的蓓萨罗丁的药物组合物可以使用包括赋形剂和助剂的一种或多种有助于将所述活性化合物加工成制品的生理可接受载体以常规方式配制，其中所述制品可以按照药学方式使用。正确的制剂取决于所选的施用途径。可以使用本领域中(例如，在上述Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明登氏药学全书)中)适用和理解的任何熟知技术、载体和赋形剂。

注射剂可以按常规形式制备，或者作为液体溶液剂或混悬剂、适于在注射前形成溶液剂或混悬剂的固体形式，或者作为乳剂。合适的赋形剂是，例如水、盐水、右旋糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、盐酸半胱氨酸等。此外，如果需要的话，可注射药物组合物可以含有少量无毒的辅助物质，例如润湿剂、pH缓冲剂等。生理相容性缓冲液包括但不限于，汉克(Hanks's)溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。如果需要的话，可以使用增强吸收的制品(例如，脂质体)。

对于透黏膜施用，可以在制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。

对于经皮施用，可以将组合物配制成凝胶。

用于肠胃外施用(例如，通过快速浓注或连续输注)的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的混悬剂可以制备为适宜的油性注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油如芝麻油，或其他有机油如大豆油、葡萄柚油或杏仁油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射混悬剂可以含有增加混悬剂黏度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，混悬剂也可以含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液剂的物质。用于注射的制剂可以按单位剂量形式提供，例如，在安瓿或多剂量容器中，伴有添加的防腐剂。所述组合物可以采用多种形式，如在油性或水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂形式，并且可以含有配制剂，如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，活性成分在使用前可以呈用于与合适溶媒(例如，无菌无热原水)构成的粉末形式。

对于口服施用，可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体组合容易地配制蓓萨罗丁。这类载体能够使本文公开的化合物被配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等，用于由待治疗的患者口服摄入。可以通过如下方式获得用于口服用途的药物制品：将活性化合物与固体赋形剂组合，任选地碾磨所产生的混合物，并且如果需要的话，在添加合适的助剂后加工颗粒混合物，以获得片芯或锭芯。合适的赋形剂是，尤其填料如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制备物如，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐如海藻酸钠。锭剂芯提供有合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加至片剂或锭剂包衣以便鉴定或表征不同的活性化合物剂量组合。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加至片剂或锭剂包衣以便识别或表征不同的活性化合物剂量组合。

可以经口使用的药物制品包括由明胶制成的硬胶囊(push-fitcapsule)、以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的软密封胶囊。硬胶囊可以含有与填料如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和任选地与稳定剂混合的活性成分。在软胶囊剂中，活性化合物可以溶解于或悬浮于合适的液体，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可以添加稳定剂。用于口服施用的全部制剂应当处于适于这种施用的剂量。

颊含施用指将片剂放置在牙齿和颊粘膜之间，因此构思了适用于此的任何组合物。所述组合物可以例如采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于通过吸入的施用，如本文所述使用的蓓萨罗丁可以在使用合适推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体)的情况下，以从加压包装或雾化器提供的气雾喷雾剂形式方便地递送。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供递送计量量的阀确定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器中的由例如明胶组成的胶囊和匣，其含有所述化合物及合适粉末基底(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

本文进一步公开的是药学领域熟知的用于多种用途的各种药物组合物，所述用途包括眼球内、鼻内和耳内递送。用于这些用途的合适的渗透剂总体上是本领域已知的。用于眼球内递送的药物组合物包括水溶性形式如滴眼剂或处于吉兰糖胶(Shedden等人,Clin.Ther.,23(3):440-50(2001))或水凝胶(Mayer等人,Ophthalmologica,210(2):101-3(1996))中的活性化合物的水性眼用溶液剂；眼用油膏剂；眼用混悬剂，如微粒物，悬浮于液体载体介质中的含有药物的小聚合颗粒(Joshi,A.,J.Ocul.Pharmacol.,10(1):29-45(1994))，脂溶性制剂(Alm等人,Prog.Clin.Biol.Res.,312:447-58(1989))，和微球体(Mordenti,Toxicol.Sci.,52(1):101-6(1999))；和眼部插入物。上述文献均通过引用方式完整地并入本文。为了稳定和舒适，这类合适的药物制剂最经常且优选配制成无菌、等渗且缓冲性的。用于鼻内递送的药物组合物也可以包括经常制备成在许多方面模拟鼻分泌物以确保维持正常的纤毛作用的滴剂和喷雾剂。如Remington's PharmaceuticalSciences,第18版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990)中所公开的(通过引用的方式完整并入本文)，并且如本领域技术人员熟知的，合适的制剂最经常且优选是等渗的、略微缓冲性的以维持5.5至6.5的pH，并且最经常且优选包括抗微生物防腐剂和适宜的药物稳定剂。用于耳内递送的药物制剂包括用于在耳中局部施加的混悬剂和油膏剂。用于这类耳用制剂的常见溶剂包括丙三醇和水。

蓓萨罗丁也可以配制于直肠用组合物如栓剂或停留灌肠剂中，所述直肠用组合物例如含有常规栓剂基料如可可脂或其他甘油酯类。

除先前所述的制剂之外，也可以将所述化合物配制为贮库制品。这种长效制剂可以通过(例如皮下或肌内)植入或通过肌内注射施用。因此，例如，可以将所述化合物用合适的聚合材料和疏水材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制或配制为微溶性衍生物，例如微溶性盐。

对于疏水性化合物，合适的药用载体可以是包括苄醇、非极性表面活性剂、水溶性有机聚合物和水相的共溶剂体系。使用的常见共溶剂体系是VPD共溶剂体系，该体系是3%w/v苄醇溶液，8%w/v非极性表面活性剂聚山梨醇酯80^TM和65%w/v聚乙二醇300，在无水乙醇中补足至体积。自然地，共溶剂体系的比例可以相当大地变动而不破坏它的溶解度和毒性特性。另外，共溶剂组分的身份可以变动：例如，可以使用其他低毒性非极性表面活性剂代替聚山梨醇酯80^TM；聚乙二醇的份额大小可以变动；其他生物相容性聚合物可以替代聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；并且其他糖或多糖可以替代右旋糖。

可选地，可以使用用于疏水性药物化合物的其他递送体系。脂质体和乳液是熟知的用于疏水性药物的递送运载体或载体的例子。虽然通常以更大毒性为代价，但是某些有机溶剂如二甲基亚砜也可以使用。另外，可以使用持续释放体系，如含有所述治疗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，递送所述化合物。各种持续释放材料已经是确立的并且是本领域技术人员熟知的。取决于它们的化学本质，持续释放胶囊剂可以释放所述化合物持续几周直至超过100日。取决于治疗剂的化学本质和生物学稳定性，可以使用额外的用于蛋白质稳定化的策略。

可以使用本领域技术人员熟知的技术施用意在胞内施用的药剂。例如，可以将这类药物包封至脂质体中。在脂质体形成的时间，存在于水溶液中的全部分子结合至水性内部。脂质体内容物受到保护免遭外部微环境影响并且由于脂质体与细胞膜融合而被高效地递送至细胞胞质中。脂质体可以用组织特异性抗体包被。脂质体将被靶向并被希望的器官选择性地摄取。可选地，小的疏水性有机分子可以直接胞内施用。

可以将额外的治疗剂或诊断剂掺入药物组合物中。可选地或额外地，药物组合物可以与含有其他治疗性或诊断剂的其他组合物组合。

施用方法

可以通过任何合适的手段将蓓萨罗丁施用至患者。施用方法的非限制性例子包括，尤其(a)通过口服途径施用，该施用包括在胶囊剂、片剂、颗粒剂、喷雾剂、糖浆剂、或其他这类形式中的施用；(b)通过如直肠、阴道、尿道内、眼球内、鼻内、脑室内或耳内的非口服途径的施用，该施用包括作为水性混悬剂、油性制品等或作为滴剂、喷雾剂、栓剂、软膏剂、油膏剂等的施用；(c)通过皮下、腹腔内、静脉内、肌内、经皮、眶内、囊内、椎管内、胸骨内、颅内、脑室内等注射的施用，包括输注泵递送；(d)局部施用，如通过在肾内或心区内的直接注射，例如通过贮库式植入；(e)局部施用；本领域技术人员认为对用于使本文公开的化合物与活组织接触是适宜的，以及f)作为气雾剂经吸入施用。

适合施用的蓓萨罗丁的药物组合物包括其中含有有效实现其意图目的的量的活性成分的组合物。然而，如上文所表明的，所述化合物以低剂量施用。本文所公开的化合物的作为一个剂量所要求的治疗有效量将取决于施用途径、正在治疗的动物(包括人类)类型和所考虑的特定动物的身体特征。可以定制剂量以实现所希望的作用，但是将取决于这类因素如重量、膳食、共存药物和医学领域技术人员将认识到的其他因素。更具体地，在本公开的背景中，治疗有效量意指有效预防、减轻、改善或调节疾病或延长正在治疗的受试者存活的化合物的量。确定治疗有效量完全处于本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文所提供的详细公开内容。

对于本领域技术人员将显而易见的是，待施用的有用的体内剂量和具体施用模式将根据年龄、重量和所治疗的哺乳动物的种类、使用的具体化合物、和使用这些化合物所针对的具体用途而变动。有效的剂量水平(实现所希望的结果的剂量水平)的确定可以由本领域技术人员使用常规药理学方法完成。通常，产品的人类临床应用以较低的剂量水平开始，同时增加剂量水平直至达到所希望的作用。可选地，使用已建立的药理学方法，可以使用可接受的体外研究确定通过目前的方法确定的组合物的可用剂量和施用途径。

在非人类动物研究中，潜在产品的应用以较高的剂量水平开始，同时减少剂量直至不再达到所希望的作用或不良副作用消失。可选地，剂量可以基于患者的表面积并根据其计算，如本领域技术人员所理解的。

本文所公开的药物组合物的确切制剂、施用途径和剂量可以由各位医生根据患者的状况进行选择。(参见例如Fingl等人,引自1975,''The Pharmacological Basis of Therapeutics'',该文献在此通过引用的方式完整并入本文，特别引用了第1章第1页)。根据患者所要，该剂量可以是在一天或数天的过程中给予的单一剂量或一系列两个或数个剂量。

应当指出主治医生会知道由于毒性或器官功能障碍如何和何时终止、中断或调整施用。反过来，如果临床反应不充分(不包括毒性)，主治医生也会知道将治疗调整到更高的水平。在处理所关心的病状中施用剂量的大小将随待治疗的病状的严重性和施用途径而变动。病状的严重性可以例如部分地通过标准预后评价方法进行评价。进一步地，剂量和或许剂量频率也将根据各位患者的年龄、体重和反应而变动。与上文所讨论的相当的方案可以用于兽用药物中。

在一些实施方案中，将化合物施用一段连续的治疗期，例如一周或更多周，或数月或数年。

施用的组合物的量可能取决于正在治疗的受试者、该受试者的重量、疾患的严重性、施用方式和处方医生的判断。

如果需要的话，蓓萨罗丁的组合物可以呈现于含有一个或多个单位剂量形式的包装或分配器装置中，所述单位剂量形式包含活性成分。该包装可以例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。该包装或分配器装置可以伴有施用说明书。该包装或分配器装置也可以伴有管理药物的制造、使用或销售的政府机构所规定的形式的与容器相结合的注意事项，所述注意事项反映政府机构批准该形式的药物用于人类或兽用施用。这类注意事项，例如，可以是由美国食品药品管理局批准的用于处方药物或批准的产品插入物的标签。在相容性药用载体中配制的包含本文所公开的化合物的组合物也可以在适宜的容器中制备、放置，并用标签标明用于治疗所指明的病状。

进一步的细节在下面的实施例中提供，这些实施例不意在以任何方式限制本发明所要求的保护范围。

附图说明

在下面的实施例中参照说明以下内容的附图。

图1：公开了生物发光共振能量转移(BRET)构建体，其中，绘制了氨基端在左边的受体。竖线表示绿色荧光蛋白(GFP2)。网格表示海肾萤光素酶(Rluc)。

图2公开了BRET中的药理学曲线。将成对受体(一个用Luc加标签，一个用GFP加标签)共表达，除了与两种标签融合的DT标记的受体之外。使用所指示的配体浓度进行BRET测定。关于每种化合物的信息在表1中找到。

图3显示了蓓萨罗丁通过与Nurr1靶基因的启动子中特定共有序列相互作用的活性，称作神经生长因子诱导的克隆B应答元件(也称作NGFI-B应答元件或NBRE)增强子驱动萤光素酶报道分子测定法。

图4显示了在6-羟基多巴胺(6-OHDA)处理的大鼠中蓓萨罗丁的神经保护作用。

图5示出了在口服施用蓓萨罗丁的脑和血浆中的药物代谢动力学。雄性Sprague-Dawley大鼠每日一次接受1mg/kg/日或10mg/kg/日口服剂量的蓓萨罗丁。在第5个剂量之前，分析血浆样品和脑样品以获得T=0(时间)值。在第5个剂量之后，以指示的时间间隔获得血浆样品和脑样品并分析蓓萨罗丁浓度。对于1mg/kg剂量，在T=0和24小时(未显示)的脑浓度和血浆浓度低于检测限并且赋予0.5ng/mL(50%分析检测限)的值以允许估算AUC0-24。

图6示出了在6OHDA输注后72小时开始用溶媒(Veh)或蓓萨罗丁处理的假性动物(合并全部处理)和6-羟多巴胺动物(bex(72))的运动表现。小图A和B分别显示穿过难度梁所需要的开始潜伏期和时间。小图C和D分别显示在转棒上实现的试验时间和转/分钟。小图E显示在15分钟自发运动时间期间内行进的距离。对于这些运动能力量值的每一种，6OHDA处理统计上损害表现。在全部情况下，相对于假性对照，用脑室内施用0.006mg/kg/日的蓓萨罗丁处理(损害后72小时开始)的受损害动物未被损伤。使用单因素方差分析((one-wayANOVA)，随后使用Bonferroni多重比较事后分析法分析数据。*表示与假性处理的动物差异显著，p<0.05。+表示与溶媒/6OHDA处理的动物差异显著，p<0.05。N=每组7-9只动物。

图7示出了在假性处理或6OHDA处理后黑质致密部(SNc)中的酪氨酸羟化酶免疫荧光。6OHDA导致SNc中的细胞计数降低(小图A)、平均细胞尺寸降低(小图B)、免疫荧光像素的平均像素强度降低(小图C)、呈免疫阳性的图像的百分比降低(小图D)和TH阳性细胞与一般神经元标记Neutrotrace的共定位减少(小图E)。与溶媒处理的受试者相比，用6OHDA损害后72小时开始脑室内施用0.006mg/kg/日的蓓萨罗丁处理显著地改善细胞计数、细胞尺寸和平均像素强度。用单因素方差分析，随后用Bonferroni事后比较法分析数据。*表示与假性动物差异显著，p<0.05；+表示与溶媒/6OHDA动物差异显著，p<0.05。

图8示出了在假性处理或6OHDA处理后，纹状体中的多巴胺转运蛋白(DAT)、囊泡单胺转运蛋白2(VMAT2)免疫组织化学。6OHDA降低呈免疫阳性的图像的百分比(小图A、C)并降低免疫荧光像素的平均像素强度(小图B、D)。用6OHDA损害后72小时开始脑室内施用0.006mg/kg/日的蓓萨罗丁处理显著地增加全部量值。用单因素方差分析，随后用Bonferroni事后比较法分析数据。*表示与假性动物差异显著，p<0.05；+表示与溶媒/6OHDA动物差异显著，p<0.05。

图9示出了用6OHDA输注后72小时开始皮下施用的溶媒(Veh)或蓓萨罗丁(16(16Bex)、4(4Bex)、1(1Bex)和0.3(0.3Bex)mM提供1、0.25、0.0625和0.021mg/kg/日)处理的假性动物(合并全部处理)和6-羟多巴胺动物的运动表现。小图A和B分别显示穿过难度梁所需要的开始潜伏期和时间。小图C和D分别显示在转棒上实现的试验时间和转/分钟。小图E显示在15分钟自发运动时间期间内行进的距离。对于这些运动能力量值的每一种，6OHDA处理统计上损害表现。在全部情况下，相对于假性对照，用皮下(s.c.)施用的蓓萨罗丁处理(损害后72小时开始)的受损害动物未受损伤。使用单因素方差分析，随后使用Bonferroni多重比较事后分析法分析数据。*表示与假性处理的动物差异显著，p<0.05。+表示与溶媒/6OHDA处理的动物差异显著，p<0.05。N=每组9-12只动物。

图10示出了在假性处理或6OHDA处理后SNc中的酪氨酸羟化酶免疫荧光。6OHDA导致平均像素强度降低(小图A)、呈免疫阳性的图像的百分比降低(小图B)、SNc中的细胞计数降低(小图C)和TH阳性细胞与一般神经元标记Neutrotrace的共定位减少(小图D)。与溶媒处理的受试者相比，用6OHDA损害后72小时开始皮下施用的蓓萨罗丁(16、4、1和0.3mM提供1、0.25、0.0625和0.021mg/kg/日)处理显著地改善平均像素强度、呈免疫阳性的图像的百分比、细胞计数和与Neurotrace共定位的TH阳性细胞的百分比。用单因素方差分析，随后用Bonferroni事后比较法分析数据。*表示与假性动物差异显著，p<0.05；+表示与溶媒/6OHDA动物差异显著，p<0.05。

图11示出了在假性处理或6OHDA处理后SNc中的Ret-c(营养因子GDNF(神经胶质细胞系衍生神经营养因子)的辅助受体)。6OHDA导致了SNc中的细胞计数降低(小图A)、呈免疫阳性的图像的百分比降低(小图B)和免疫荧光像素的平均像素强度降低(小图C)。与溶媒处理的受试者相比，用6OHDA损害后72小时开始皮下施用的蓓萨罗丁(Bex)(16mM泵溶液提供1mg/kg/日)处理显著地改善细胞计数、免疫阳性图像百分比和平均像素强度。用单因素方差分析，随后用Bonferroni事后比较法分析数据。*表示与假性动物差异显著，p<0.05；+表示与溶媒/6OHDA动物差异显著，p<0.05。

图12示出了与假性对照相比，用6-羟多巴胺双侧损害黑质(损害/Veh)导致在难度梁(小图A和B)和转棒(小图C和D)表现中的运动损害。它还导致采用新物体识别所评估的记忆受损(小图E)和增加的自发甩头次数(小图F)。在全部情况下，蓓萨罗丁的口服施用使因损害破坏的行为正常化(损害/药物，损害后3日开始口服施用持续28日，1mg/kg/日或3mg/kg/日实现正常化，但是0.3mg/kg/日未实现正常化)。用单因素方差分析，随后用Bonferroni事后比较法分析数据。*表示与假性动物差异显著，p<0.05；+表示与溶媒/6OHDA动物差异显著，p<0.05。每组N=10-15只动物。

图13示出了用6-羟多巴胺双侧损害黑质导致SNc中的酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数目降低(小图A)、TH与神经元标记Neurotrace的共定位减少(小图B)、平均像素强度降低(小图C)和呈免疫阳性的图像的百分比降低(小图D)。与溶媒处理的受试者相比，蓓萨罗丁的口服施用显著地改善TH阳性细胞数目、平均像素强度、免疫阳性细胞%和TH与Neurotrace的共定位(6OHDA损害后3日开始口服施用持续28日，1mg/kg/日或3mg/kg/日改善，但是0.3mg/kg/日未改善)。用单因素方差分析，随后用Bonferroni事后比较法分析数据。*表示与假性动物差异显著，p<0.05。+表示与溶媒/6OHDA动物差异显著，p<0.05。

图14显示蓓萨罗丁使神经元再生。与假性对照相比，在分析前31日(损害/Veh)或3日(第3日)用6OHDA处理的动物显示了SNc中TH阳性细胞数目降低(小图A)、平均细胞尺寸降低(小图B)和TH与神经元标记Neurotrace的共定位减少。6OHDA损害后72小时开始用蓓萨罗丁处理(损害/Bex(72))28日显著地改善TH阳性细胞的数目、细胞尺寸和TH与Neurotrace的共定位。值得注意地，与损害后3日处死的动物相比时(即在蓓萨罗丁处理开始时)，蓓萨罗丁处理还显著地改善了这些量值。

图15示出了在24小时MPP+损伤(4μM)后施加时，蓓萨罗丁(图中所指的蓓萨罗丁)和BDNF(50ng/mL)对TH阳性神经元(a)、对总TH神经突长度(b)和显示神经突的TH阳性神经元(c)的量效曲线，以对照百分比表示(均数±标准差(s.e.m))。*：p<0.05组相对MPP+；#MPP+相对对照。

图16示出了图15中观察到的神经营养作用的代表性图片。

图17示出了蓓萨罗丁对血清甘油三酯水平和T4水平的影响。通过借助颅内泵连续输注所示浓度的蓓萨罗丁溶液(脑室内，0.1mM、0.3mM和1mM对应于0.000625、0.002和0.00625mg/kg/日)持续4日(D4)或8日(D8)，或者作为每日一次口服(P.O.)剂量以1、3、10、30或100mg/kg/日持续5日，向大鼠施用蓓萨罗丁。在所指示的给药期结束时，收获血液，并且由Idexx公司分析血清的甘油三酯水平(图17A)和T4水平(图17B)。

图18示出了AUC与蓓萨罗丁剂量的种间相关性。AUC值源自使用口服剂量蓓萨罗丁的PK实验。通过x=0和y=0，拟合线性回归。相关系数是优异的(r²>0.99)。因此可以推算种间的AUC。数据取自Targretin NDA#21055；targretin是蓓萨罗丁的商品名称。

图19显示了AUC与人类中的蓓萨罗丁剂量成正比。AUC值来自使用向人类受试者口服给药的蓓萨罗丁的PK实验。通过x=0和y=0，拟合线性回归。(A)和(B)的斜率(m1和m2)分别是1.735和2.030。数据取自Miller等人，J.Clin.Oncol.1997(A)和Rizvi等人，Clin.CancerRes.,1999(B)。

具体实施方式

实施例1：使用Nurr1受体在测定中筛选测试化合物

BRET测定

通过用绿色荧光蛋白(GFP2)或海肾萤光素酶(Rluc)或两者一起向每种受体加标签，我们建立了Nurr1受体和RXR受体(维甲酸受体如RXR-α、RXR-β和RXR-γ)的分子内和分子间BRET(生物发光共振能量转移)测定法（见图1）。BRET发生在仅当Rluc部分是在GFP部分的100埃以内时(Pfleger和Eidne,2003)，因此这些测定法使我们能够对每种受体测试其配体诱导的三级和四级结构重排，如图1中公开的。如下所述地进行BRET测定(Tan等人,2007)：在10cm²平板中培养的HEK293T细胞用表达生物发光供体的质粒DNA(1μg质粒DNA)和表达氨基端用GFP2加标签的受体的荧光接纳体(20μg质粒DNA)瞬时转染，所述生物发光供体表达羧基端用海肾萤光素酶加标签的受体。受体是Nurr1和RXR，各自用Rluc、GFP2或两者加标签，如图1中所示。转染后两天，将细胞收获并取决于转染效率重悬于BRET缓冲液(含有0.1%D-葡萄糖和1mM丙酮酸钠的PBS)中至2x10⁶-4x10⁶细胞/mL的浓度。将50μl3倍浓缩的配体稀释物分配至白色平底96孔板(Costar;Corning Life Sciences,Acton,MA)的孔中。将配体与50μl细胞悬液温育20至30分钟以刺激受体-Luc(生物发光供体)和受体-GFP2(荧光接纳体)的相互作用。在注射50μl/孔的15μM稀释于PBS中的腔肠素400A(DeepBlueC；PerkinElmer Life and Analytical Sciences)后，使用Mithras LB940平板读数仪(Berthold Technologies,Bad Wildbad,德国)直接检测BRET-2信号。在平板振摇1秒后，通过BRET优化的滤光片，记录海肾萤光素酶和GFP2的发光发射1至2秒(萤光素酶峰410nm；GFP2峰，515nm)。将BRET-2信号计算为由未转染细胞的背景发射校正的萤光素酶发射和GFP2发射之间的比率。

概括了具有多样性化学结构和在上述BRET测定法中所报道的多样性药理学曲线(见表1)的配体集合。

表1.化合物集合。示出了在这些研究中描述的一些化合物以及其提出

的药理学和主要参考文献。

图2和表2中提供了表明本文所述化合物的激动剂活性的结果。概括了在BRET中具有多样性化学曲线和药理学曲线的配体和观察到的下述配体的明确例子，所述配体具有形成或抵制Nurr1-RXR异二聚体形成的倾向，如在图2中所公开的。

表2：BRET测定法中的药理学特征。

AC-271251、AC-271252、6-MP、6-MP2-脱氧核糖和6-MP核糖在全部测定法中无活性。效力报道为EC50(pEC50)的负对数。

令人惊讶的是，强力RXR-选择性rexinoid蓓萨罗丁(Targretin)在促进Nurr1-RXR异二聚体形成方面显示出最大选择性和效力(图2)。结构上相关的RXR激动剂LG100268和SR11237在促进Nurr1-RXR异二聚体形成方面显示出与蓓萨罗丁相似的选择性(未显示)。XCT0135908，称作选择性Nurr1-RXR激动剂(Wallen-Mackenzie等人,2003)对Nurr1-RXR具有更大的最大作用，但是对RXR-RXR并不是更有力的。一种结构上不同的称作HX630的rexinoi(Umemiya等人，1997)对Nurr1-RXR和RXR-RXR是等效力的，而RARb2-选择性化合物AC-261066(Lund等人,2005)仅对RXR-RXR有活性。令人惊讶地，推定性Nurr1激动剂化合物11&12(Dubois等人,2006)和6-MP、6-MP-核糖和6-MP-2-脱氧核糖(Ordentlich等人,2003)对测试的全部受体组合均无活性(数据未显示)。

我们已经可以进行检测配体诱导的基因转录(报道基因测定法)的测定法以证实BRET2测定法中所获得的结果。通过萤光素酶表达定量基因转录，所述萤光素酶表达受应答于不同核受体的下述应答元件驱动：类视黄醇X受体(RXR)应答元件RXRE、维甲酸受体(RAR)应答元件RARE和NGFI-B应答元件(由Nurr1单体结合的NBRE)(Castro等人,1999)。我们在这些测定法中测试了蓓萨罗丁并且观察到当Nurr1共表达时，它对RXRE应答元件和NBRE应答元件相对于非选择性类视黄醇9-顺维甲酸大幅度增加，但是对RARE应答元件的活性不是这样(表3和图3)。对于PAO24、HX630和XTC0135908观察到相似的模式。

表3.哺乳动物报道基因转录测定法中的药理学特征。效力以纳摩尔为单位给出。最大反应作为功效%(Eff%)给出并且相对于9-顺式维甲酸的反应归一化。

实施例2：蓓萨罗丁保护神经元

基于蓓萨罗丁的选择性Nurr1-RXR特征，测试了蓓萨罗丁保护免遭啮齿类中6-OHDA(6-羟多巴胺)引起的神经元丢失的能力。结果在图4中显示。在雄性Sprague-Dawley大鼠的SNc上方2mm植入双侧导管。术后5-7日，受试者接受由3次每日微量注射(1μL10μM)蓓萨罗丁或溶媒组成的处理。第二次蓓萨罗丁处理后4小时，向受试者注射溶媒或6-OHDA(4μL，2mg/ml)以引起DA神经元丧失。在最终微量注射后48小时，处死受试者。将它们的脑固定，穿过切片SNc并且针对酪氨酸羟化酶进行标记。对双侧连续切片(3/侧面，距冠矢点-5.2mm)照相并分析TH+神经元的数目和呈免疫阳性的切片的百分比。相对于溶媒处理的对照(假性)，6-OHDA处理(损害)导致DA细胞数目和免疫阳性切片的百分比下降。如图4中所示，微量注射的蓓萨罗丁完全阻止由6-OHDA引起的多巴胺能细胞丧失。

可以得出结论，BRET中Nurr1-RXR异二聚体的形成和PD(帕金森病)模型中对DA(多巴胺能)神经元的神经保护之间存在强相关性，蓓萨罗丁在这两种情况下均非常有效。

实施例3：外周或中枢施用时血浆和脑中的蓓萨罗丁浓度

将蓓萨罗丁通过每日一次口服给药(P.O.，QD)以外周方式施用，通过使用植入泵连续皮下输注(s.c.)(C.I.s.c.)以外周方式施用，并且通过使用脑室内植入的导管连续脑室内(i.c.v.)输注以中枢方式施用，其中所述导管与皮下植入的泵连接。所述泵以恒定流速每日递送药物，然而动物在整个实验过程中体重增加。报道的剂量基于mg/kg/日并且基于大鼠初始重量和药物的浓度和泵的流速。相应的药物暴露量值在接近实验开始时取得并且因此最密切地对应于所指示的起始剂量。基于mg/kg/日的实际剂量因此在实验结束时低大约25至30%。脑对血浆比率在脑室内施用时高得多，在0.00625mg/kg/日时达到比率6，并且估计在0.002mg/kg/日时大于9。与血浆中的2ng/mL(等于2ng/g)相比，脑水平在0.00625mg/kg/日时是12ng/g。显著地，脑室内连续输注施用的0.00625mg/kg/日有效逆转6-羟多巴胺(6OHDA)损害黑质致密部(SNc)后的神经元缺陷和行为缺陷(见下文)。类似地，皮下连续输注施用的0.25mg/kg/日产生14ng/g的蓓萨罗丁脑水平，表明皮下连续输注施用的0.25mg/kg/日也将是逆转6-羟多巴胺(6OHDA)损害黑质致密部(SNc)后的神经元缺陷和行为缺陷的有效剂量。然而，在这种情况下，蓓萨罗丁的血浆水平是12ng/g；产生1.2的脑/血浆比。最后，范围从1至100mg/kg/日的一系列蓓萨罗丁剂量作为每日一次口服剂量(P.O.QD)施用。蓓萨罗丁的脑水平和血浆水平随1mg/kg/日至10mg/kg/日的剂量以与剂量成比例的方式增加，并且在30mg/kg/日和100mg/kg/日时以略次于与剂量成比例的方式增加。在全部测试的剂量，脑/血浆比一致地低于1，范围在0.4和0.8之间。

表4总结了与来自Targretin NDA#21055的数据相比，蓓萨罗丁在帕金森病和癌症的啮齿类模型中的剂量/暴露量/效应关系。此外，蓓萨罗丁的60mg/kg/日口服施用有效阻止用癌细胞系HN9N和HN21P(NDA#21055)注射的裸鼠中的肿瘤生长。这些数据表明了蓓萨罗丁通过各种施用途径被容易地吸收到脑中，并且它们了限定了在PD的大鼠模型中产生功效所需要的蓓萨罗丁的最小剂量、暴露量(AUC)和脑浓度。此外，它们显示了PD的啮齿类模型中产生功效所需要的剂量和暴露量大大地低于癌症。口服给药后血浆-脑浓度随时间的推移在图5中示出。在1mg/kg，蓓萨罗丁的脑浓度仍高于从脑室内和皮下输注实验所测定的逆转神经元缺陷和行为缺陷所需要的最小脑浓度(见下文)。还值得注意的是，暴露量在受损害的大鼠中比未受损害的大鼠中低(表4)。

表4

*数据来自蓓萨罗丁NDA#21055。使用梯形法计算的皮下给药的AUC。使用prizm软件计算的口服给药的AUC。[-]表示未测量。大鼠PD是黑质的6OHDA损害，癌症模型是NMU(N-亚硝基-N-甲基脲)引起的乳腺肿瘤癌模型(见NDA#21055)。来自脑室内给药和皮下给药的血浆浓度和脑浓度是4日至8日连续输注后的稳态水平。来自口服给药实验血浆浓度和脑浓度是给药5日后获得的峰值浓度，例外在于来自NDA#21055的数据是在给药15至50日后。是/否表示部分功效。脑/血浆比率=AUC脑/AUC血浆。^在6OHDA损害的大鼠中进行的PK。

实施例4：脑室内施用时的蓓萨罗丁功效

该实施例显示了6-OHDA损害后脑室内施用时蓓萨罗丁功效的评价以评估蓓萨罗丁的神经再生潜力。评估的终点是：

·由黑质致密部(SNc)中的酪氨酸羟化酶(TH)染色和纹状体(STR)中多巴胺转运蛋白(DAT)和囊泡单胺转运蛋白2(VMAT2)染色测量的神经保护。

·包括转棒、难度梁和自发运动的行为评估。

测试了蓓萨罗丁减缓、阻止或甚至逆转黑质致密部(SNc)的6-羟多巴胺(6OHDA)损害后的神经元缺陷和行为缺陷的能力。将6OHDA双侧地输注至雄性大鼠的SNc中以产生对多巴胺神经元的破坏。在6OHDA输注后72小时开始，使用渗透泵，将蓓萨罗丁或溶媒以恒定速率(0.25μL/小时或6μL/日的1mM蓓萨罗丁溶液提供0.000625mg/kg/日的剂量，见上表4)输注至脑室中持续28日。在处理28日后，以3种协调运动功能试验(自发运动、转棒和难度梁)对动物进行评估，随后采集组织以评估黑质(SNc)中的酪氨酸羟化酶免疫荧光以及纹状体(STR)中的DAT和VMAT2。用蓓萨罗丁处理逆转了由6OHDA施用引起的行为缺陷(见图6)，并且导致SNc中酪氨酸羟化酶表达的改善(见图7)、STR中多巴胺转运蛋白表达和VMAT2表达的改善(见图8)。

该实施例表明，在6-OHDA损害后施用时，蓓萨罗丁在神经变性和行为终点方面均显示出功效。

方法

受试者：这些实验的受试者是从Charles Rivers实验室购买的雄性Sprague-Dawley大鼠(Hollister,CA)，到达时重200-225g。将大鼠成对圈养于维持在12小时光照:暗周期(在上午7点光照)的控温动物饲养所内部的聚丙烯笼中。在该实验的持续期内，动物自由获取食物和水。全部程序根据《NIH实验动物护理和使用指南》进行并且由ACADIA制药公司的研究机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。动物在手术之前适应动物饲养所的条件和处置最少1周。

手术：为了保护去甲肾上腺素末梢，每只动物在使用异氟烷麻醉之前约15分钟接受地昔帕明注射(10mg/kg)。将动物置于立体定位装置中并对准SNc双侧输注6OHDA(8μg/4μl)或0.2%抗坏血酸溶媒(相对于冠矢点，A/P-5.2mm，M/L±1.6mm，D/V-8.0mm)。在6OHDA输注后，将与颅内导管连接的Alzet渗透泵(Durect Corporation，Cupertino，CA)皮下植入每只动物的肩胛骨之间。将导管以脑室内方式放置(脑室内，相对于冠矢点，A/P-0.8mm，M/L-1.4mm，D/V-4.5mm)并且用jeweler螺钉和牙科用丙烯酸树脂连接到颅，并且用U形钉闭合切口。在手术后，动物接受支持性护理，包括施用皮下(sc)流体(10ml/日)和软食物糊，直至它们超过其手术体重。在以下行为测试之前，受试者被允许至少28天：

泵：在手术前48小时，将渗透泵(Alzet,2004型)称重并且随后用蓓萨罗丁(1mM)或溶媒(盐水中的1%DMSO)填充。随后在37℃下将它们温育于0.9%生理盐水中直至手术植入。植入后泵以0.25μL/小时的速率输注28日。将输注泵用乙烯基管与脑室内导管连接，并且在蓓萨罗丁到达导管之前，通过用不同量的溶媒灌注该管实现不同的输注条件。因而，在植入导管后72小时开始蓓萨罗丁输注并且使用以下手术/处理条件(N=3-5/组)：假性/溶媒、假性/蓓萨罗丁(72)、6OHDA/溶媒、6OHDA/蓓萨罗丁(72)。在实验完成后，取出一小组渗透泵。将泵称重并抽空以验证化合物递送。对于全部测试的泵，该程序证实了这些泵成功地递送了化合物。

自发运动：在来自Accuscan Instruments公司(Columbus,OH)的沿每一水平轴(从前至后和从一侧至另一侧)配备16根红外光束的丙烯酸树脂室(42cm x42cm x30cm)中进行自主活动研究。将动物置于该室中15分钟并且记录它们行进的距离(cm)。

转棒：转棒测试在具有辅助抓握的滚花螺纹的转动圆柱体(70mm直径)上进行。将动物置于圆柱体上并且将圆柱体设置成以1转/分钟转动15秒。如果动物在30秒内从圆柱体跌落或跳下，则将它们替换并且重新开始适应期。一旦动物成功地留在圆柱体上持续该适应期，则将转动速度每15秒增加1转/分钟至最大值10转/分钟。记录适应期后动物留在圆柱体上以秒计的时间和实现的最大转/分钟。在2分钟试验间隔后，使用相同程序进行第二次试验，但是适应期缩减，使得仅要求动物在转动速度增加之前用全部四足行走。数据来自试验2。

难度梁试验：难度梁试验在一根102cm长的由ABS塑料制成的双水平梁上进行。顶部较窄梁从3.5cm至0.7cm逐渐收缩，而底部较宽梁沿梁的长度从5cm至1.8cm逐渐收缩。将梁升高至桌面上方23cm。将动物以一组4只置于容纳桶中并接受5次训练试验。在第一次训练时，将试验动物置于梁的末端并要求它们跳入容纳桶中。在后续试验时，将动物置于距梁末端25、50、75和100cm并要求它们穿过该梁并在末端处跳入容纳桶中。在训练后，进行单次试验，其中将每只动物置于梁的起点并且记录起始潜伏期(从起始位置移动全部4只足所需要的时间)和跑动时间(在开始后穿过梁所需要的时间)。允许动物最多300秒穿过该梁，在该点从梁上取下它们并且记录下300秒的跑动时间。

酪氨酸羟化酶荧光免疫组织化学：在行为测试后，将动物麻醉并用PBS经心脏灌注，随后是4%多聚甲醛灌注。将固定的脑组织穿过黑质切片(50μm)并且随后使用以下步骤针对酪氨酸羟化酶免疫标记：在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中淋洗3X5分钟；在封闭缓冲液(0.8PBS，3%正常驴血清，0.1%Triton)中45分钟封闭步骤；在室温与工作缓冲液(1x PBS，1%封闭缓冲液，0.1%Triton)中的兔抗-酪氨酸羟化酶多克隆抗体(AB152,Millipore公司,Billerica,MA)温育2小时；在工作缓冲液中淋洗3X5分钟；与工作缓冲液中的驴抗兔Alexa Fluor488荧光第二抗体(A21206,Invitrogen公司,Carlsbad,CA)温育1小时；在工作缓冲液中淋洗3X5分钟。

多巴胺转运蛋白免疫组织化学：类似地，将固定的脑穿过纹状体切片(50μm)并且对多巴胺转运蛋白标记。使用以下步骤用DAB免疫组织化学标记多巴胺转运蛋白：在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中淋洗3X5分钟；在80℃于柠檬酸钠缓冲液(1X PBS0.05%Tween20,pH=6.0中的10mM柠檬酸钠)中温育20分钟以促进抗原修复；在3%过氧化氢中温育10分钟以阻断过氧化物酶结合位点；在封闭缓冲液(1x PBS,8%正常山羊血清,3%牛血清白蛋白,0.1%Triton,来自Vector实验室,Burlingame,CA)中1小时蛋白质封闭步骤；在4℃与工作缓冲液(1xPBS,2%正常山羊血清,1%牛血清白蛋白,来自Vector实验室的生物素封闭液)中的大鼠抗-多巴胺转运蛋白单克隆抗体(MAB369,Millipore公司)温育过夜；在1X PBS中淋洗3X5分钟；与不含生物素的工作缓冲液中的山羊抗-兔生物素酰化第二抗体(BA-9400，Vector实验室)温育1小时；在1X PBS中淋洗3X5分钟；在ABC洗液(PK-6100，Vectastain Elite ABC试剂盒,Vector实验室)中温育30分钟；在1X PBS中淋洗3X5分钟；DAB(3,3'-二氨基联苯胺)温育(SK-4100,DAB底物试剂盒,Vector实验室)5分钟；在ddH₂O中淋洗1X5分钟；在1X PBS(磷酸盐缓冲盐水)中淋洗2X5分钟。随后将切片封装在载玻片上并允许其干燥，之后依次浸没于洗液中3分钟(70%EtOH、95%EtOH、100%EtOH、50/50Citrisolve/EtOH、100%Citrisolve)并且使用基于二甲苯的永久封片剂(H-5000,VectaMount,Vector实验室)加盖玻片。

囊泡单胺转运蛋白2免疫组织化学：使用以下步骤以DAB免疫组织化学标记VMAT2：在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中淋洗3X5分钟；在3%过氧化氢中温育10分钟以阻断过氧化物酶结合位点；在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中淋洗3X5分钟；在封闭缓冲液(1x PBS,8%正常山羊血清,3%牛血清白蛋白,0.25%Triton,来自Vector实验室,Burlingame,CA的抗生物素蛋白封闭液)中1小时蛋白质封闭步骤；在4℃与工作缓冲液(1x PBS,2%正常山羊血清,1%牛血清白蛋白,来自Vector实验室的生物素封闭液)中的兔抗-VMAT2多克隆抗体(NB100-68123,Novus Biologicals)温育过夜；在1X PBS中淋洗3X5分钟；与不含生物素的工作缓冲液中的山羊抗-兔生物素酰化第二抗体(BA-1000,Vector实验室)温育1小时；在1X PBS中淋洗3X5分钟；在ABC洗液(PK-6100，Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector实验室)中温育30分钟；在1X PBS中淋洗3X5分钟；DAB温育(SK-4100,DAB底物试剂盒,Vector实验室)5分钟；在ddH₂O中淋洗1X5分钟；在1X PBS中淋洗2X5分钟。

在免疫标记后，将切片封装并使用抗荧光淬灭封片剂(S3023,Dako USA,Carpinteria,CA)加盖玻片。使用配备数码照相机(Retina2000R,Qimaging,Surrey,BC)的Olympus BX51荧光显微镜(美国Olympus公司,Center Valley,PA)获得单光学平面图像。使用4X空气物镜(UPlanFL N,N.A.0.13)以2X数字放大率获得图像。对于每只动物，分析穿过每个SNc的3张连续切片(根据Paxinos和Watson图集,1997,相对于冠矢点-5.2mm)。将全部图像(N=6/动物)作为独立观察结果处理并且由不知道每个受试者处理情况的观察者使用ImageJ软件(在http://rsb.info.nih.gov/nih-imageJ可获得，由位于NIH,Bethesda,MD的Wayne Rasband开发)分析，以确定细胞计数(仅SNc组织)、细胞尺寸(像素/细胞，仅SNc组织)、像素强度和免疫阳性%。数据表示不同处理条件下这些量值的平均SNc切片。通过省略第一抗体，设置对照并且这些对照显示了没有非特异性染色(数据未显示)。

药物递送的证实。在第3周处死通过渗透泵脑室内接受蓓萨罗丁的动物，将脑收获并且使用LC-MS/MS根据供应商(Agilux实验室)的程序分析蓓萨罗丁。上表4中显示了这项研究的结果。

实施例5：通过皮下途径全身施用时的蓓萨罗丁功效

该实施例显示了6-OHDA损害后皮下施用时蓓萨罗丁功效的评价以评估蓓萨罗丁的神经再生潜力。评估的终点是：

·神经保护由黑质(SNc)中的酪氨酸羟化酶(TH)染色和

ret-c(营养因子GDNF的辅助受体)染色测量。

·包括转棒、难度梁和自发运动的行为评估。

测试蓓萨罗丁逆转6-羟多巴胺(6OHDA)损害黑质致密部(SNc)后的神经元缺陷和行为缺陷的能力。将6OHDA双侧地输注至雄性大鼠的SNc中以产生对多巴胺神经元的破坏。在6OHDA输注后72小时开始，使用在肩胛骨之间背侧上植入的渗透泵，将蓓萨罗丁或溶媒以恒定速率(2.5μL/小时或60μL/日的16、4、1或0.3mM蓓萨罗丁溶液提供1、0.25、0.0625或0.021mg/kg/日的剂量，见上表4)皮下输注持续28日。在处理后28日，以3种协调运动功能试验(自发运动、转棒和难度梁)评估动物，并且随后采集组织以评估黑质中的酪氨酸羟化酶和Ret-c免疫荧光。用蓓萨罗丁处理逆转了由6OHDA施用引起的行为缺陷(见图9)，并且导致SNc中酪氨酸羟化酶和Ret-c表达改善(见图10和11)。

该实施例表明，在6-OHDA损害后通过皮下连续输注全身施用时，蓓萨罗丁在神经变性终点和行为终点均显示出功效。

方法

受试者和产生损害的外科手术如上文对脑室内给药所描述的那样。

泵：在手术前48小时，将渗透泵(Alzet,2ML4型)称重并且随后用蓓萨罗丁(16、4、1或0.3mM)或溶媒(50%DMSO:50%PEG400)填充。随后在37℃下将它们温育于0.9%生理盐水中直至手术植入。植入后泵以2.5μL/小时的速率输注28日。16、4、1或0.3mM蓓萨罗丁溶液提供1、0.25、0.0625或0.021mg/kg/日的剂量。将输注泵用乙烯基管与皮下导管连接，并且在蓓萨罗丁到达导管之前，通过用不同量的溶媒灌注该管实现不同的输注条件。因而，在移植导管后72小时开始蓓萨罗丁输注并且使用以下手术/处理条件(N=10/组)：假性/溶媒、假性/蓓萨罗丁(16)、6OHDA/溶媒、6OHDA/蓓萨罗丁(16)、6OHDA/蓓萨罗丁(4)、6OHDA/蓓萨罗丁(1)和6OHDA/蓓萨罗丁(0.3)。在实验完成后，取出一小组渗透泵。将泵称重并抽空以验证化合物递送。对于全部测试的泵，该程序证实了这些泵成功地递送了化合物。

自发运动试验、转棒试验和难度梁试验如上文对脑室内给药所描述的那样进行。

酪氨酸羟化酶荧光免疫组织化学如上文对脑室内给药所描述的那样进行。

如上文所述，使用固定的脑和切片的SNc组织进行Ret-c免疫组织化学。使用以下步骤用DAB免疫组织化学标记Ret-c：在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中淋洗3X5分钟；在3%过氧化氢中温育10分钟以阻断过氧化物酶结合位点；在1X PBS中淋洗3X5分钟；在80℃于柠檬酸钠缓冲液(1X PBS0.05%Tween20,pH=6.0中的10mM柠檬酸钠)中温育20分钟以促进抗原修复；在1X PBS中淋洗3X5分钟；在封闭缓冲液(1x PBS，8%正常山羊血清,3%牛血清白蛋白,0.1%Triton，来自Vector实验室,Burlingame,CA的抗生物素蛋白封闭液)中2小时蛋白质封闭步骤；在4℃与工作缓冲液(1x PBS,2%正常山羊血清,1%牛血清白蛋白,来自Vector实验室的生物素封闭液)中的兔抗-ret多克隆抗体(Santa Cruz,sc-167)温育过夜；在1X PBS中淋洗3X5分钟；在室温与不含生物素的工作缓冲液中的山羊抗-兔生物素酰化的第二抗体(BA-1000,Vector实验室)温育1小时；在1X PBS中淋洗3X5分钟;在ABC洗液(PK-6100,Vectastain Elite ABC试剂盒,Vector实验室)中温育30分钟；在1X PBS中淋洗3X5分钟；DAB温育(SK-4100,DAB底物试剂盒,Vector实验室)5分钟；在ddH₂O中淋洗1X5分钟；在1X PBS中淋洗2X5分钟。随后如上文对TH进行的免疫组织化学所述那样，将Ret-c切片封装并成像。

实施例6：口服施用时的蓓萨罗丁功效

该实施例显示了6-OHDA损害后每日一次口服施用时蓓萨罗丁功效的评价以评估蓓萨罗丁的神经再生潜力。评估的终点是：

·神经保护由黑质(SNc)中的酪氨酸羟化酶(TH)染色计量。

·包括转棒、难度梁和自发运动的行为评估。

测试蓓萨罗丁逆转6-羟多巴胺(6OHDA)损害黑质致密部(SNc)后的神经元缺陷和行为缺陷的能力。将6OHDA双侧地输注至雄性大鼠的SNc中以产生对多巴胺神经元的破坏。在6OHDA输注后72小时开始，将蓓萨罗丁(1或3mg/kg/日)或溶媒每日一次口服施用(见上文表4和图5)持续28日。在处理28日后，以3种协调运动功能试验(自发运动、转棒和难度梁)评估动物，并且随后采集组织以评估黑质(SNc)中的酪氨酸羟化酶免疫荧光。用蓓萨罗丁处理逆转了由6OHDA施用引起的行为缺陷(见图12)，并且导致SNc中酪氨酸羟化酶表达改善(见图13)。

该实施例表明，在6-OHDA损害后口服施用时，蓓萨罗丁在神经变性终点和行为终点方面均显示出功效。

方法

在新环境中以两个阶段(熟悉(sample)和测试)进行新物体识别(NOR)。将受试者置于其中放置两个相同物体的NOR室。允许每只大鼠探索3分钟，并且记录在每个位置探索所花费的时间。3分钟后，将每只大鼠从场地取出并放回其笼中。在样品阶段后4小时，进行测试阶段。在测试期间，将一个熟悉物体(熟悉期间见过)和一个新物体置于该室中，并且允许每只大鼠探索3分钟。将测试阶段记录在视频上并由不知道每个受试者处理情况的观察者评定。对于试验数据，确定对新物体花费的探索%时间。甩头测定法。

自发甩头：将受试者按一组4只动物置于清洁的容纳桶中，在其中密切观察它们8分钟。动物每次显示与清洁行为或探索不相关的快速双方向头部运动或“湿狗样抖动”时，计数一次甩头。

实施例7：蓓萨罗丁使神经元再生

在该实施例中(见图14)，动物双侧接受进入SNc的溶媒(Sham-AllTx)或6OHDA处理(损害)。手术后3日，将动物处死(第3日)或动物开始脑室内接受蓓萨罗丁(1mM，0.25μL/小时)或溶媒(1%DMSO)持续28日。与假性对照相比，6OHDA处理的动物(损害/Veh)显示了SNc中TH阳性细胞数目减少(小图A)、平均细胞尺寸降低(小图B)和TH与神经元标记Neurotrace的共定位减少。6OHDA损害后72小时开始用蓓萨罗丁处理(损害/Bex(72))显著地改善TH阳性细胞的数目、细胞尺寸和TH与Neurotrace的共定位。值得注意地，与损害后3日处死的动物相比时(即在蓓萨罗丁处理开始时)，蓓萨罗丁处理还显著地改善全部这些量值。用单因素方差分析，随后用事后Tukey多重比较检验法分析数据。*表示与假性动物差异显著，p<0.05；+表示与溶媒/6OHDA动物差异显著，p<0.05；^表示与第3日显著差异，p<0.05。

结果在图14中显示。

实施例8：蓓萨罗丁在大鼠原代多巴胺能神经元中的MPP+损伤后的作用

神经毒1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)是特异性多巴胺能神经元毒素。MPTP由星形神经胶质转化成1-甲基-4-苯基吡啶鎓(MPP+)并随后在SNc中造成特异性多巴胺能神经元死亡，因此在人类、灵长类和小鼠中导致PD的临床症状(Uhl等人,1985)。由于这个原因，广泛使用小鼠中MPTP诱导的多巴胺能神经毒性作为PD研究的模型。已经大量报道了MPP+造成体外多巴胺能神经元的神经变性并且提供有用的帕金森病体外模型。

已经提出了神经营养因子即脑衍生神经营养因子(BDNF)和胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)在体外减少MPP+引起的神经变性(Hung和Lee,1996)；(Hou等人,1996)。

该实施例研究了以7种浓度测试的蓓萨罗丁对因24小时暴露于1-甲基-4-苯基吡啶鎓(MPP+)而事先受损的大鼠原代中脑培养物(帕金森病体外模型)的修复作用。在这项研究中BDNF用作阳性对照。

实验方案

多巴胺能神经元的原代培养物

大鼠多巴胺能神经元如Schinelli等人,1988所描述的那样培养。简而言之，采用颈椎脱臼法处死妊娠15天的怀孕雌性大鼠(Wistar大鼠;Janvier)并且从子宫取出胎儿。取出胚胎中脑，并置于冰冷的含有2%青霉素-链霉素(PS；Invitrogen)和1%牛血清白蛋白(BSA；PAN)的Leibovitz培养基(L15;PAN)。仅中脑曲的腹侧部分用于细胞制备，因为这是多巴胺能神经元富集的正在发育的脑区域。中脑由稀释于无钙和镁的PBS中在37℃通过胰蛋白酶化作用解离20分钟(胰蛋白酶EDTA1X;PAN)。通过添加含有II级DNA酶I(0.5mg/ml；PAN)和10%胎牛血清(FCS;Gibco)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM；PAN)终止反应。随后通过3次穿过10ml吸管机械地解离细胞。随后将细胞在+4℃以180x g在L15培养基中的一层BSA(3.5%)上离心10分钟。弃去上清液并将细胞沉淀物重悬于由补充有B27(2%;Gibco)、L-谷氨酰胺(0.2mM;Invitrogen)、2%PS溶液和10ng/mL BDNF(PAN)和1ng/mL GDNF的Neurobasal(Gibco)组成的限定成分培养基中。(PAN)使用台盼蓝拒染试验，在Neubauer细胞计数板(cytometer)中计数活细胞。将细胞以40000个细胞/孔的密度接种于96孔平板中(孔用聚-L-赖氨酸(greiner)预包被)并且在37℃在增湿空气(95%)/CO₂(5%)气氛下培养。每两日将一半培养基更换为新鲜培养基。

MPP+暴露和药物处理：修复方案

简而言之，在培养第6日，移去培养基并添加不含或含有4μMMPP+的新鲜培养基。在第7日，将培养物用不含蓓萨罗丁(含有溶媒)或含有蓓萨罗丁(0.3、1、3、10、30、100和300nM)或BDNF(50ng/mL)的新鲜培养基洗涤48小时。在48小时后，在含有或不含蓓萨罗丁(0.3、1、3、10、30、100和300nM)或BDNF(50ng/mL)的情况下，将细胞用多聚甲醛4%溶液固定(全部情况下)。在全部孔中，终浓度是0.1%DMSO。用0.1%皂素(Sigma)透化后，将细胞与针对酪氨酸羟化酶的小鼠第一单克隆抗体(TH，Sigma)温育以特异性着染多巴胺能神经元。这种抗体用Alexa Fluor488山羊抗小鼠IgG(Molecular probe)显现。测量在每个孔中TH神经元和TH神经元的总神经突的数目。

分析与定量方法

对于每种条件，使用InCell AnalyzerTM1000(GE Healthcare)以10倍放大率在相同条件下拍摄2x10幅/孔图片。使用显影软件(GEHealthcare)自动地进行分析以测量TH阳性神经元的总数。按孔自动地进行10幅图片的两次平均。将数据以对照条件的百分比表示。使用ANOVA检验，随后使用Dunnett检验(当允许时)，对不同条件进行统计分析(使用Graph Pad Prism软件包)，显著性设定在p≤0.05。图16中示出了代表性图片。

此外，针对显示神经突的神经元的数目，分析对照/溶媒、MPP+/溶媒、MPP+/蓓萨罗丁(300nM)和MPP+/BNDF(50ng/mL)条件。对于每种条件，使用InCell AnalyzerTM1000(GE Healthcare)以10倍放大率在相同条件下拍摄10幅/孔图片。手工地进行分析以测量显示神经突的TH阳性神经元的数目。每种条件下分析了6个孔。将数据以对照条件的百分比表示。使用单因素ANOVA检验，随后使用Dunnett检验(当允许时：p<0.01)，对不同条件进行统计分析(使用Graph PadPrism软件包)，显著性设定在p≤0.05。

结果

4μM的MPP+(24小时中毒)显示出了巨大和明显的TH阳性神经元和TH阳性神经突减少。24小时中毒后施加的蓓萨罗丁在测试的全部浓度均显示了TH神经元总数的增加。这种修复作用从10nM直到300nM是明显的。类似地，BDNF(50ng/mL)能够逆转MPP+损伤。可以提到的是，对于3个最高测试浓度(30、100和300nM)，蓓萨罗丁显示的作用与其中使用BDNF作为参考测试化合物时观察到的一种作用相似(在存活方面)。类似地，在蓓萨罗丁的2个最高浓度(100nM和300nM)，观察到对TH神经突长度的明显影响。在300nM剂量时观察到的神经营养作用与BDNF的神经营养作用一样高(内部参考测试化合物)。结果在图15A、图15B和15C中显示。在图16中示出了显示蓓萨罗丁对神经元的再生作用的代表性图像。

实施例9：造成副作用的蓓萨罗丁剂量

血清甘油三酯的升高和甲状腺功能减退症是已知由蓓萨罗丁引起的两种突出副作用。采用经脑室内途径(0.006mg/kg/日)、皮下途径(0.25mg/kg/日)连续输注或口服(1mg/kg/日和100mg/kg/日)，以先前显示在大鼠PD模型或癌症模型中有效的剂量(见表4)，在至多8日(脑室内或皮下)或5日(口服)的时间段内向大鼠施用蓓萨罗丁。如图17A中所示，脑室内或皮下给予蓓萨罗丁的大鼠中甘油三酯水平相对于溶媒处理的动物没有显著差异。与溶媒相比，口服给予1mg/kg/日的大鼠中的甘油三酯水平显著地增加。全部处理(脑室内、皮下和1mg/kg/日口服)中的甘油三酯水平均显著地低于口服接受100mg/kg/日的大鼠中的甘油三酯水平。类似地，与100mg/kg/日口服剂量组相比，T4水平在脑室内、皮下和1mg/kg/日口服组中显著较高(图17B)。最后，在较高的蓓萨罗丁剂量时，体重增加的下降是明显的(见表5)。

表5.在所指示的剂量(mg/kg/日)，每天口服施用蓓萨罗丁一次。在给药期的开始和结束测量体重并表示为体重增加百分比。

口服剂量	体重增加百分比(%)
		Bex(1)	20.8+/-2.8
Bex(3)	19.8+/-3.4
		Bex(10)	20.4+/-1.6
Bex(30)	11.2+/-0.8
		Bex(100)	7.0+/-3.6
Veh	20.9+/-2.6

这些数据表明了与目前临床上如何使用蓓萨罗丁相比，确定对逆转神经变性有效且具有极大降低的副作用的蓓萨罗丁剂量是可能的。

实施例10：在人类中的蓓萨罗丁剂量

推算物种之间的AUC和剂量。在Targretin NDA#21055中提供的关于蓓萨罗丁的药物代谢动力学信息表明，推算物种之间的药物暴露量(定量为‘曲线下面积’或AUC)(图18)是可能的。另外，公开的临床数据表明，在给予人的蓓萨罗丁剂量和AUC之间存在强相关性(图19)。

有效治疗人类或大鼠中癌症的蓓萨罗丁剂量。推荐的用于治疗人类中癌症的初始临床蓓萨罗丁剂量是300mg/m²/日(对于80kg的人，等同于8.1mg/kg/日或约650mg/日)，并且如果存在不充分反应，则可以增加这个剂量(Targretin NDA#21055;Duvic等人,J.Clin.Oncol.,2001)。在大鼠中充分有效的抗癌剂量是100mg/kg/日(Targretin NDA#21055)。

在帕金森病的大鼠模型中蓓萨罗丁的有效剂量低得多。我们已经表明了，经脑室内途径连续输注(C.I.i.c.v.)施用的蓓萨罗丁使事先给予神经毒素6OHDA的大鼠中的神经元再生(见图6-8)。在该剂量下的蓓萨罗丁的脑浓度是12ng/g(见上表4)。使用经皮下途径连续输注(C.I.s.c.)全身性递送0.25mg/kg/日的蓓萨罗丁提供了非常相似的14ng/g的蓓萨罗丁脑浓度(表4)并且还有效地逆转行为缺陷并且使因6OHDA损害受损的神经元再生(图9、图10和图11)。最后，每日一次口服施用1mg/kg/日的蓓萨罗丁也有效地逆转行为缺陷并且使因6OHDA损害受损的神经元再生(图12和图13)。口服施用1mg/kg/日的蓓萨罗丁提供了大于脑室内实验和皮下实验中测定的有效性所需的蓓萨罗丁阈值脑浓度的脑浓度(图5)。因此，可以使用以0.25mg/kg/日皮下连续输注递送的蓓萨罗丁的血浆水平(其为12ng/mL)来计算大鼠中的AUC，以求得全身性递送的有效PD剂量。类似地，可以计算以1mg/kg/日口服施用的蓓萨罗丁的AUC，以确定大鼠中的AUC，以求得每日口服递送的有效PD剂量。

因此利用大鼠中有效抗癌症剂量的AUC对有效PD剂量的比率，可以将人类中在有效抗癌症剂量时观察到的AUC推算至PD中产生功效所需的AUC。随后利用下文的人AUC/剂量相关性，可以估计在人体重有效对抗PD所需的蓓萨罗丁剂量。

人类数据：

·推荐的抗癌剂量： 300mg/m²=8.1mg/kg或648mg/日¹

·²推荐的抗癌剂量的AUC： 11.6 μM*小时

大鼠数据：

¹基于80kg的人；²AUC来自Miller等人,1997；Targretin NDA #21055和Duvic等人,2001，在300mg/m²推荐的抗癌剂量；³来自Targretin NDA #21055。⁴对于皮下给药，使用梯形法计算AUC，并且对于口服给药，使用prizm软件计算AUC。⁴口服的AUC代表对6OHDA损害大鼠和完好大鼠所测定的AUC的平均值(见表4)。

可以如下估算在人类中治疗帕金森病的蓓萨罗丁的有效剂量：

(大鼠AUC_帕金森病÷大鼠AUC_癌症)×人类AUC_癌症=人类AUC_帕金森病利用图19A或图19B中人类AUC与人类剂量的相关性：

人类AUC_帕金森病÷斜率=人类剂量_帕金森病

下表6中提供这些计算的概括。

表6

A：100mg/kg的大鼠有效剂量(癌症)=大鼠中的有效抗癌剂量(来自Targretin NDA#21055)。

B：口服30mg/kg和100mg/kg的大鼠AUC(癌症)，来自Targretin NDA#21055并经实验证实。从30mg/kg和100mg/kg的AUC推算的60mg/kg的大鼠AUC(癌症)。

C：0.25mg/kg皮下连续输注或1mg/kg/日每日一次口服施用的大鼠有效剂量(PD)。

D：使用梯形法(皮下)或prizm软件(口服)计算的大鼠血浆AUC(PD)。口服的AUC代表对6OHDA损害大鼠和完好大鼠所测定的AUC的平均值(见表4)。

E：来自先前报道值的300mg/m²口服(等同于8.1mg/kg)的人类AUC(癌症)(Miller等人,1997;Targretin NDA#21055,和Duvic等人,2001)。

F：基于300mg/m²剂量的人起始剂量(癌症)(8.1mg/kg/日x80kg的人=648mg/日)。

G：计算为(人类AUC_癌症x大鼠AUC_PD÷大鼠AUC_癌症)的人类AUC(PD)

H：使用人类AUC(PD)除以m₁(图19A的斜率)x80kg估算的人类剂量(PD)

I：使用人类AUC(PD)除以m₂(图19B的斜率)x80kg估算的人类剂量(PD)

估算治疗PD的人类剂量的第二种方式是将从表6推算的AUC值与接受低剂量蓓萨罗丁的人中测量的实际AUC值比较(表7)。

表7.暴露于低剂量Targretin(蓓萨罗丁)的人。

*基于80kg的人。^a来自Miller等人,1997。^b来自Rizvi等人,1999。^c来自Targretin核准基准摘要(summary basis of approval)–见EMEA核准。推算的AUC来自表6。s.c.是皮下，p.o.是口服。

表7的检验表明，推算的AUC值相当于或低于在接受39mg至75mg或基于80kg、180cm个体0.5mg/kg至0.9mg/kg的蓓萨罗丁剂量的人类中测量的AUC值。

估算在人类中治疗PD的剂量的第三种方式是使用FDA推荐的在人类和动物给药数据之间推算的方法。该方法也已经在科学文献(Reagan-Shaw等人,2008)中描述。在这份出版物中，提出了计算身体表面积(BSA)的方法。计算大鼠和人类的Km系数(体重(kg)除以BSA(m²))。随后将以mg/kg计的人类等同剂量计算为大鼠剂量x Km_大鼠÷Km_人。表8中提供了这些计算的总结。

表8.利用FDA放大指南的人类等同剂量

*如所描述(Reagan-Shaw等人,2008)的那样计算的Km_大鼠和Km_人值分别为6和40。人Km和人总剂量基于80kg、180cm的个体。

FDA公告中概述的上文参考的方法将口服施用在大鼠中治疗癌症的有效剂量60mg/kg/日(见Targretin NDA#21055)推算成人类中的720mg/日(见表8)，这良好吻合于实际建议的起始剂量648mg/日(Targretin NDA#21055)。相同的方法将大鼠6OHDA损害模型中的有效剂量(脑室内、皮下和口服施用时分别是0.00625、0.25和1mg/kg/日)推算至0.08、3和12mg/日以治疗人类中的PD。

脑室内(i.c.v.)施用蓓萨罗丁提供额外的优点

可以用脑室内施用蓓萨罗丁实现至少两种额外益处：

·十分低的剂量将有效

·药物的脑:血浆比率将增加，从而进一步降低全身性药物暴露量并因此减少全身性副作用。

表4(上文显示)揭示了，脑/血浆比率在脑室内施用时较高，达到有效脑浓度，同时保持低外周水平。

用0.25mg/kg/日皮下施用(12ng/g)所实现的脑浓度也用脑室内施用0.00625mg/kg/日(低40倍的剂量)实现。明显地，该水平的脑暴露量在大鼠PD模型中具有神经再生作用(见图6-8、14)。利用2ng/mL的血浆水平(表4)，脑室内施用的AUC比皮下施用低至少6倍，同时提供相等脑暴露量。使用表6中为皮下施用所提供的范围，与Targretin在人类中治疗癌症的推荐剂量(300mg/m²，对于80kg的人，等同于约650mg/日)相比，脑室内施用至人类的蓓萨罗丁的有效剂量估算为：

·基础AUC(6x)：蓓萨罗丁的有效脑室内剂量是1.5至3.0mg/日

·基础剂量(40x)：蓓萨罗丁的有效脑室内剂量是0.25至0.5mg/日

以上提出几种方法以将PD的大鼠模型中蓓萨罗丁的有效剂量外推成在人类中治疗PD的剂量。基于这些方法，预测的剂量范围是：

口服施用 12-59mg/日

皮下输注 3-18mg/日

脑室内输注 0.08-3mg/日

基于80kg个体，预测的剂量范围是:

口服施用 0.15-0.74mg/kg/日

皮下输注 0.04-0.23mg/kg/日

脑室内输注 0.001–0.04mg/kg/日

上述剂量范围因此跨度从大约0.08mg/日至大约59mg/日。由于预测了这些剂量，本领域技术人员会认识到稍微较低的剂量和稍微较高的剂量也将具有所希望的作用。采用一些小的概括，基于上述预测的估算如下：

口服施用 10-70mg/日或10-60mg/日；或0.13–0.88mg/kg/日或0.13-0.75mg/kg/日

皮下输注 1-20mg/日或0.01-0.25mg/kg/日

脑室内输注 0.05-5mg/日或0.0006-0.06mg/kg/日

因此，上述预测的剂量显然支持从大约0.05mg/日至大约75mg/日的剂量范围。也显然，剂量将取决于施用途径使用而变化。

本发明不应当解释为限于实施例中给出的剂量范围。例如，由于体重上的个体差异，基于mg/日的剂量范围可以增加或降低，这对本领域技术人员是熟知的并且是医生的例行工作；然而剂量应当总是低的以使不希望的副作用最小化。剂量范围也可能受其他因素如患者依从性和个体患者反应影响。因此，本申请通篇所使用的剂量范围也同样地认为。

虽然已经参照实施方案和实施例对本发明进行了描述，应当理解的是，在不脱离本发明的精神的情况下可以做出许多和各种修改。因此，本发明仅由以下权利要求限定。

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Claims

1.一种用于治疗神经变性疾病或病症的式(I)的化合物

2.根据权利要求1来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日0.05-75mg的剂量施用。

3.根据权利要求1来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日0.0006-1mg/kg的剂量施用。

4.根据权利要求1或权利要求2来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日0.05-65mg的剂量施用。

5.根据权利要求1或权利要求3来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日0.0006-0.8mg/kg的剂量施用。

6.根据权利要求1、2或4中任一项来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日0.05-50mg的剂量施用。

7.根据权利要求1、3或5中任一项来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日0.0006-0.6mg/kg的剂量施用。

8.根据权利要求1-3中任一项来使用的化合物，其特征在于，所述化合物口服施用。

9.根据权利要求8来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日10-70mg的剂量施用，例如每日10-60mg，或者例如每日12-59mg。

10.根据权利要求8来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日0.13-0.88mg/kg的剂量施用，例如每日0.13-0.75mg/kg，或者例如每日0.15-0.74mg/kg。

11.根据权利要求1-7中任一项来使用的化合物，其特征在于，所述化合物通过非口服施用途径施用。

12.根据权利要求11来使用的化合物，其特征在于，所述化合物皮下施用。

13.根据权利要求12来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日1-20mg的剂量施用，例如每日至少3-18mg。

14.根据权利要求12来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日0.01-0.25mg/kg的剂量施用，例如每日0.04-0.23mg/kg。

15.根据权利要求11来使用的化合物，其特征在于，所述化合物经皮施用。

16.根据权利要求11来使用的化合物，其特征在于，所述化合物脑室内施用。

17.根据权利要求16来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日0.05-20mg的剂量施用。

18.根据权利要求16来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日0.0006-0.3mg/kg的剂量施用。

19.根据权利要求16或权利要求17来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日0.05-15mg的剂量施用。

20.根据权利要求16或权利要求18来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以每日0.0006-0.2mg/kg的剂量施用。

21.根据权利要求16、17或19中任一项来使用的化合物，其特征在于，将所述化合物以每日0.05-5mg的剂量施用至患者，例如每日0.08-3mg。

22.根据权利要求16、18或20中任一项来使用的化合物，将所述化合物以每日0.0006-0.06mg/kg的剂量施用至患者，例如每日0.001-0.04mg/kg。

23.根据权利要求11-22中任一项来使用的化合物，其特征在于，所述化合物以连续输注方式施用。

24.根据权利要求1-23中任一项来使用的化合物，其特征在于，所述神经变性疾病或病症是一种从多巴胺能神经元功能再生受益的疾病或病症。

25.根据权利要求1-24中任一项来使用的化合物，其特征在于，所述神经变性病与Nurr1受体相关。

26.根据权利要求1-25中任一项来使用的化合物，其特征在于，所述神经变性疾病是帕金森病。

27.根据权利要求1-26中任一项来使用的化合物，其特征在于，将所述化合物施用至患者将引起多巴胺能神经元功能再生。

28.根据权利要求27来使用的化合物，其特征在于，所述多巴胺能神经元功能已经由于帕金森病受损。

29.一种式(I)的化合物

30.根据权利要求29的用途，其特征在于，所述化合物以每日0.05-75mg的剂量施用。

31.根据权利要求29的用途，其特征在于，所述化合物以每日0.0006-1mg/kg的剂量施用。

32.根据权利要求29或权利要求30的用途，其特征在于，所述化合物以每日0.05-65mg的剂量施用。

33.根据权利要求29或权利要求31的用途，其特征在于，所述化合物以每日0.0006-0.8mg/kg的剂量施用。

34.根据权利要求29、30或32中任一项的用途，其特征在于，所述化合物以每日0.05-50mg的剂量施用。

35.根据权利要求29、31或33中任一项的用途，其特征在于，所述化合物以每日0.0006-0.6mg/kg的剂量施用。

36.根据权利要求29-31中任一项的用途，其特征在于，所述化合物口服施用。

37.根据权利要求36的用途，其特征在于，所述化合物以每日10-70mg的剂量施用，例如每日10-60mg，或者例如每日12-59mg。

38.根据权利要求36的用途，其特征在于，所述化合物以每日0.13-0.88mg/kg的剂量施用，例如每日0.13-0.75mg/kg，或者例如每日0.15-0.74mg/kg。

39.根据权利要求29-35中任一项的用途，其特征在于，所述化合物通过非口服施用途径施用。

40.根据权利要求39的用途，其特征在于，所述化合物皮下施用。

41.根据权利要求40的用途，其特征在于，所述化合物以每日1-20mg的剂量施用，例如每日3-18mg。

43.根据权利要求40的用途，其特征在于，所述化合物以每日0.01-0.25mg/kg的剂量施用，例如每日0.04-0.23mg/kg。

44.根据权利要求39的用途，其特征在于，所述化合物经皮施用。

45.根据权利要求39的用途，其特征在于，所述化合物脑室内施用。

46.根据权利要求45的用途，其特征在于，所述化合物以每日0.05-20mg的剂量施用。

47.根据权利要求45的用途，其特征在于，所述化合物以每日0.0006-0.3mg/kg的剂量施用。

48.根据权利要求45或权利要求46的用途，其特征在于，所述化合物以每日0.05-15mg的剂量施用。

49.根据权利要求45或权利要求47的用途，其特征在于，所述化合物以每日0.0006-0.2mg/kg的剂量施用。

50.根据权利要求45、46或48中任一项的用途，其特征在于，将所述化合物以每日0.05-5mg的剂量施用至患者，例如每日0.08-3mg。

51.根据权利要求45、47或49中任一项的用途，将所述化合物以每日0.0006-0.06mg/kg的剂量施用至患者，例如每日0.001-0.04mg/kg。

52.根据权利要求39-51中任一项的用途，其特征在于，所述化合物以连续输注方式施用。

53.根据权利要求29-52中任一项的用途，其特征在于，所述神经变性疾病或病症是一种从多巴胺能神经元功能再生受益的疾病或病症。

54.根据权利要求29-53中任一项的用途，其特征在于，所述神经变性疾病与Nurr1受体相关。

55.根据权利要求29-54中任一项的用途，其特征在于，所述神经变性疾病是帕金森病。

56.根据权利要求27-55中任一项的用途，其特征在于，将所述化合物施用至患者将引起多巴胺能神经元功能再生。

57.根据权利要求56的用途，其特征在于，所述多巴胺能神经元功能已经由于帕金森病受损。

58.一种用于治疗神经变性疾病或病症的方法，包括向患有神经变性疾病或病症的患者施用有效量的式(I)的化合物

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物，其中，将所述化合物以低剂量施用至患者。

59.根据权利要求58所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.05mg至大约75mg的剂量施用至患者。

60.根据权利要求58所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.0006mg/kg至大约1mg/kg的剂量施用至患者。

61.根据权利要求58所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.05mg至大约65mg的剂量施用至患者。

62.根据权利要求58所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.0006mg/kg至大约0.8mg/kg的剂量施用至患者。

63.根据权利要求58所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.05mg至大约50mg的剂量施用至患者。

64.根据权利要求58所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.0006mg/kg至大约0.6mg/kg的剂量施用至患者。

65.根据权利要求58-60中任一项所述的方法，其特征在于，所述化合物口服施用。

66.根据权利要求65所述的方法，其特征在于，所述化合物以每日从大约10至大约70mg的剂量施用，例如每日从大约10至大约60mg，或者例如每日从大约12至大约59mg。

67.根据权利要求65所述的方法，其特征在于，所述化合物以每日从大约0.13至大约0.88mg/kg的剂量施用，例如每日从大约0.13至大约0.75mg/kg，或者例如每日从大约0.15至大约0.74mg/kg。

68.根据权利要求58-64中任一项所述的方法，其特征在于，所述化合物通过非口服施用途径施用。

69.根据权利要求68所述的方法，其特征在于，所述化合物皮下施用。

70.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，所述化合物以每日从大约1至大约20mg的剂量施用，例如每日从大约3至大约18mg。

71.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，所述化合物以每日从大约0.01至大约0.25mg/kg的剂量施用，例如每日从大约0.04至大约0.23mg/kg。

72.根据权利要求68所述的方法，其特征在于，所述化合物经皮施用。

73.根据权利要求68所述的方法，其特征在于，所述化合物脑室内施用。

74.根据权利要求73所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.05mg至大约20mg的剂量施用至患者。

75.根据权利要求73所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日从大约0.0006mg/kg至大约0.3mg/kg的剂量施用至患者。

76.根据权利要求73所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.05mg至大约15mg的剂量施用至患者。

77.根据权利要求73所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日从大约0.0006mg/kg至大约0.2mg/kg的剂量施用至患者。

78.根据权利要求73所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日从大约0.05mg/kg至大约5mg/kg的剂量施用至患者，例如每日从大约0.08mg/kg至大约3mg/kg。

79.根据权利要求73所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日从大约0.0006至大约0.06mg/kg的剂量施用至患者，例如每日从大约0.001至大约0.04mg/kg。

80.根据权利要求68-79中任一项所述的方法，其特征在于，所述化合物以连续输注方式施用。

81.根据权利要求58-80中任一项所述的方法，其特征在于，所述神经变性疾病与Nurr1受体相关。

82.根据权利要求58-81中任一项所述的方法，其特征在于，所述神经变性疾病是帕金森病。

83.一种用于再生患有神经变性病或病症的患者中神经元功能的方法，包括向患有神经变性病或病症的所述患者施用有效量的式(I)的化合物

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物。

84.根据权利要求83所述的方法，其特征在于，所述神经元是多巴胺能神经元。

85.根据权利要求83或84所述的方法，其特征在于，所述神经变性疾病或病症与Nurr1受体相关。

86.根据权利要求83-85中任一项所述的方法，其特征在于，所述神经变性疾病或病症是帕金森病。

87.根据权利要求83-86中任一项所述的方法，其特征在于，所述多巴胺能神经元功能已经由于帕金森病受损。

88.根据权利要求83-87中任一项所述的方法，其特征在于，将所述化合物以低剂量施用至患者。

89.根据权利要求83-88中任一项所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.05至大约75mg的剂量施用至患者。

90.根据权利要求83-88中任一项所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.0006至大约1mg/kg的剂量施用至患者。

91.根据权利要求89所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.05mg至大约65mg的剂量施用至患者。

92.根据权利要求89所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日从大约0.0006mg/kg至大约0.8mg/kg的剂量施用至患者。

93.根据权利要求91所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.05mg至大约50mg的剂量施用至患者。

94.根据权利要求91所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日从大约0.0006mg/kg至大约0.6mg/kg的剂量施用至患者。

95.根据权利要求89-90中任一项所述的方法，其特征在于，所述化合物口服施用。

96.根据权利要求95所述的方法，其特征在于，所述化合物以每日从大约10至大约70mg的剂量施用，例如每日从大约10至大约60mg，或者例如每日从大约12至大约59mg。

97.根据权利要求95所述的方法，其特征在于，所述化合物以每日从大约0.13至大约0.88mg/kg的剂量施用，例如每日从大约0.13至大约0.75mg/kg，或者例如每日从大约0.15至大约0.74mg/kg。

99.根据权利要求89-84中任一项所述的方法，其特征在于，所述化合物通过非口服施用途径施用。

100.根据权利要求99所述的方法，其特征在于，所述化合物皮下施用。

101.根据权利要求100所述的方法，其特征在于，所述化合物以每日从大约1至大约20mg的剂量施用，例如每日从大约3至大约18mg。

102.根据权利要求100所述的方法，其特征在于，所述化合物以每日从大约0.01至大约0.25mg/kg的剂量施用，例如每日从大约0.04至大约0.23mg/kg。

103.根据权利要求100所述的方法，其特征在于，所述化合物经皮施用。

104.根据权利要求100所述的方法，其特征在于，所述化合物脑室内施用。

105.根据权利要求104所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.05mg至大约20mg的剂量施用至患者。

106.根据权利要求104所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日从大约0.0006mg/kg至大约0.3mg/kg的剂量施用至患者。

107.根据权利要求104所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日大约0.05mg至大约15mg的剂量施用至患者。

108.根据权利要求104所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日从大约0.0006mg/kg至大约0.2mg/kg的剂量施用至患者。

109.根据权利要求104所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日从大约0.05至大约5mg/kg的剂量施用至患者，例如每日从大约0.08至大约3mg/kg。

110.根据权利要求104所述的方法，其特征在于，将所述化合物以每日从大约0.0006至大约0.06mg/kg的剂量施用至患者，例如每日从大约0.001至大约0.04mg/kg。

111.根据权利要求104-110中任一项所述的方法，其特征在于，所述化合物以连续输注方式施用。

112.一种治疗神经变性疾病的方法，其中，将式(I)的化合物

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或水合物施用至受试者，其中，由于施用低剂量式(I)的化合物，与连续治疗相关的副作用是低的。

113.根据权利要求112所述的方法，其特征在于，所述化合物以从每日大约12mg至每日大约59mg的剂量口服施用。

114.根据权利要求112所述的方法，其特征在于，所述化合物以每日从大约0.15mg/kg至大约0.74mg/kg/日的剂量施用。

115.根据权利要求112所述的方法，其特征在于，所述化合物以从每日大约3mg至每日大约18mg的剂量皮下施用。

116.根据权利要求112所述的方法，其特征在于，所述化合物以每日从大约0.04mg/kg/日至大约0.23mg/kg/日的剂量皮下施用。

117.根据权利要求112所述的方法，其特征在于，所述化合物以每日大约0.08mg至大约3mg的剂量脑室内施用。

118.根据权利要求112所述的方法，其特征在于，所述化合物以每日大约0.001mg/kg至大约0.04mg/kg的剂量脑室内施用。

119.根据权利要求112-118中任一项所述的方法，其特征在于，所述神经变性疾病或病症是帕金森病。

120.根据权利要求112-118中任一项所述的方法，其特征在于，将所述化合物施用至患者将引起多巴胺能神经元功能再生。

121.根据权利要求120所述的方法，其特征在于，所述多巴胺能神经元功能已经由于帕金森病受损。