CN107405503A - 鞣花酸二水合物在药物制剂中调节血糖水平的用途 - Google Patents

Abstract

本发明一般涉及包含有助于增加葡萄糖摄取的鞣花酸二水合物化合物的药物组合物和使用方法。

Description

鞣花酸二水合物在药物制剂中调节血糖水平的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年12月19日提交的、发明人为Michael Reyes、标题为“鞣花酸二水合物在药物制剂中调节血糖水平的用途”的美国临时专利申请第62/094746号的权益。所参考申请的全部内容通过引用并入本文。

发明背景

A.技术领域

本发明涉及含有鞣花酸二水合物和相关化合物的制剂及其用途。更具体地，本发明涉及能够治疗或预防高血糖症、肥胖症、代谢病况和病症以及相关病理、病况、病因和这些病症和病况的症状的方法和制剂。

B.相关技术说明

葡萄糖摄取和葡萄糖代谢的紊乱是全球日益增长的健康问题。体内血浆中的高葡萄糖水平(高血糖症)与过重、肥胖症、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病、前驱糖尿病和代谢综合征以及许多其他疾病或继发性疾病有关。肥胖症、糖尿病、前驱糖尿病和代谢综合征不是与体重增加、葡萄糖代谢紊乱或高于正常葡萄糖水平相关的仅有的疾病。这些病况与其他疾病和病理如神经病理学、阿尔茨海默病、心血管疾病和癌症有关。

肥胖症是涉及过量体脂的复杂病症。一般来说，超过30的体重指数(BMI)被认为是肥胖的。已经确定肥胖症与慢性疾病如糖尿病、心血管疾病、脑血管疾病和许多癌症之间的强烈联系。此外，肥胖症给政府、医疗体系和个人带来经济损失，并降低个人的生活质量。糖尿病是现代社会中与肥胖症有关的严重健康问题；然而，糖尿病并不一定是肥胖症。糖尿病呈现持续的高血糖症(高葡萄糖水平)。正在研究通过降低胰岛素抗性、增加葡萄糖摄取或刺激胰岛素分泌来降低葡萄糖水平的试剂。糖尿病可能是心脏病、中风、神经病变、四肢溃疡、血液循环不良和周围神经功能障碍的主要原因并导致肾衰竭和/或失明。

患有I型糖尿病的对象几乎不产生胰岛素，因此I型糖尿病的主要治疗是胰岛素疗法。被诊断患有II型糖尿病的对象产生胰岛素，但其身体不能有效地使用胰岛素(例如，身体中的细胞变得对胰岛素不敏感或对胰岛素没有反应)。该病况被称为胰岛素抗性。患有妊娠糖尿病的对象在怀孕期间变成胰岛素抵抗的，而这种胰岛素抗性增加了母亲和孩子的健康风险，并增加出生缺陷的风险。由于非胰岛素治疗的限制或治疗方案的不依从性，患有II型糖尿病的许多对象最终会出现慢性高血糖症。这种慢性高血糖症可以使胰岛素分泌型胰腺β细胞对葡萄糖不敏感，造成响应葡萄糖的胰岛素分泌减少。因此，患有II型糖尿病的许多对象最终需要胰岛素治疗，并且由于胰岛素抗性，治疗可能是无效的。典型的胰岛素方案包括每天进行几次胰岛素注射：每天一次或两次长效基础胰岛素和在进餐时的速效胰岛素。尽管这种治疗方案被认为是有效的，但是由于自我注射的不便和疼痛而受到限制。因此，患者往往不能充分依从规定的治疗方案。在许多情况下，II型糖尿病和妊娠糖尿病可以用口服药物疗法治疗，但这些疗法是有限的。许多目前的制剂设计为用于刺激胰腺β细胞释放更多的胰岛素，以减少肝脏产生的葡萄糖的量，抑制体内的DPP-4产生，抑制肾脏中的钠-葡萄糖转运蛋白2的功能，或抑制α-糖苷酶的产生。许多这些药物被组合使用以管理对象的血糖水平。然而，这些口服疗法不用于治疗I型糖尿病。因此，目前还没有可用于I型和II型糖尿病两者的单一治疗。

前驱糖尿病是人具有高于正常水平的血糖水平，但不足以被诊断患有糖尿病的病况。患有前驱糖尿病的对象具有发展成II型糖尿病、心脏病、中风和其他严重健康问题的较高风险。目前对前驱糖尿病的治疗是通过饮食进行重量管理和增加身体活动。

代谢综合征是糖尿病发展的主要原因，并与心血管疾病的增加的风险有关。代谢综合征的诊断需要向心性肥胖加上以下四个因素中的任意两个：甘油三酯升高；HDL-胆固醇降低；高血压；或空腹血糖异常。目前，代谢综合征通过控制或治疗潜在因素如腹部肥胖、致动脉粥样化的血脂异常、血压升高、具有或不具有葡萄糖不耐受的胰岛素抗性、促炎状态和/或血栓前状态来治疗。

治疗许多类型的癌症和疾病如糖尿病的替代方法包括使用植物和果实提取物(例如石榴汁、草莓、蓝莓)。这些提取物包括许多抗氧化剂化合物，例如多酚鞣花单宁。Rinsch等人的国际申请公开第WO 2012/088519号描述了来自石榴汁的鞣花单宁、游离的鞣花酸和尿石素(urolithins)的组合降低小鼠的空腹血糖水平。

发明概述

本发明提供了血糖水平调节和重量管理所面临的当前问题的解决方案。出人意料地发现，在相同的体外条件下，与游离的鞣花酸相比，鞣花酸二水合物提供每单位剂量的葡萄糖摄取的增加。值得注意的是，鞣花酸每单位剂量显示出很少甚至没有葡萄糖摄取。还出人意料地发现，鞣花酸二水合物引起的葡萄糖摄取可以与相同条件下的胰岛素的葡萄糖摄取曲线相似或比相同条件下的胰岛素的葡萄糖摄取曲线更好，而游离的鞣花酸具有不同的葡萄糖摄取曲线。不希望受理论约束，认为鞣花酸抑制酪蛋白激酶2(CK2)的活性，从而使脂肪细胞燃烧能量(例如使白色脂肪变成棕色脂肪)。根据该数据和用游离的鞣花酸处理的正常小鼠和糖尿病小鼠经历体重减轻的数据，认为用鞣花酸二水合物处理会提供甚至更大的体重减轻效果。本说明书中通篇描述的组合物可以配制为用于控制、治疗或可能地预防高血糖症和/或过重，或用于预防、控制或治疗I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病、胰岛素抵抗疾病、前驱糖尿病、临床肥胖症、代谢综合征、肝脏疾病、肾脏疾病、冠心病、认知疾病或与晚期糖基化终产物相关的疾病、或其任意组合。晚期糖基化终产物疾病可以包括动脉粥样硬化、慢性肾衰竭、痴呆或阿尔茨海默病。在一些情况下，使用鞣花酸二水合物可以改善肝功能、改善肾功能、减少动脉斑块、增加活动水平和/或细胞能量水平(例如通过增加ATP水平、磷酸肌酸的水平等)，以及与这些功能相关的疾病和病况，因为这些功能、疾病和病况可以与身体血浆中高于正常的葡萄糖浓度相关联。

在一个方面，公开了被配制为施用于对象的组合物，该组合物可以包含鞣花酸二水合物化合物，其中与相同条件下的游离鞣花酸相比，鞣花酸二水合物化合物在体外条件下提供了葡萄糖摄取的增加。鞣花酸二水合物可以包括一种或更多种多酚，优选包含至少两个羧基或两个内酯的二酚化合物。在一些实施方案中，鞣花酸二水合物化合物可以包含最少量的单宁(例如鞣花酸单宁)、游离的鞣花酸或其任意组合。鞣花酸二水合物可以由以下化学结构表示：

其中R₁、R₂、R₃和R₄各自独立地选自氢(H)、C₁-C₂₀烷基或醚基、酰基、芳基、芳烷基、酰胺、氨基酸和杂环基，X是杂原子。

C₁-C₂₀烷基或醚基可以包括任何带支链和/或直链的基团。烷基的非限制性实例包括甲基、乙基或丙基。醚基可以包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或其混合物。芳基可以包括苯基部分及其衍生物。苯基衍生物的非限制性实例可以包括邻位、间位或对位的甲苯基(C₇H₇)、二甲基苄基(C₉H₉)等。芳烷基可以包括苄基(例如CH₂C₆H₅)及其衍生物。酰胺可以包括C₁至C₅酰胺。氨基酸可以包括β-氨基酸(β3和β2)、高氨基酸、脯氨酸和丙酮酸衍生物、3-经取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环经取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、直链核氨基酸、二氨基酸、d-氨基酸、n-甲基氨基酸。氨基酸是可商购获得的。氨基酸供应商的非限制性实例是杂原子可以包括氧、氮或磷，优选氧。在本发明的优选方面，鞣花酸二水合物由以下化学结构表示：

如使用高压液相色谱(HPLC)确定的，鞣花酸二水合物可以具有95重量％或更大，或优选98重量％或更大的纯度。鞣花酸二水合物可以具有10重量％或更少、5重量％或更少、3重量％或更少、2重量％或更少的水，5重量％或更少的单宁，5重量％或更少的其它多酚。在具体的方面，鞣花酸二水合物化合物晶体结构不包括包含药学上可接受的碳水化合物、胺、酰胺、磺酰胺、羧酸、磺酸、酚、多酚、芳香族杂环、黄嘌呤和醇的共晶形成剂，如蔗糖、果糖和乳糖。组合物可以包含0.001重量％或更多、0.1重量％或更多、10重量％或更多或99.0重量％的鞣花酸二水合物化合物。

还公开了治疗或预防对象中糖尿病的方法，所述方法包括向对象施用本发明的任意一种药物组合物。此外，公开了向对象施用本发明的任意一种药物组合物的方法，该方法包括向对象施用本发明的任意一种药物组合物。在具体的情况下，对象已被诊断患有I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病、胰岛素抵抗疾病、前驱糖尿病、临床肥胖症、代谢综合征、肝脏疾病、肾脏疾病、冠心病、认知疾病或与晚期糖基化终产物相关的疾病。在另一个具体的情况下，对象可以患有前驱糖尿病。在又一个具体的情况下，对象已经被诊断患有代谢综合征。在另一个具体的情况下，经治疗的对象经历细胞能量水平增加。晚期糖基化终产物疾病可包括晚期动脉粥样硬化、慢性肾衰竭、痴呆和阿尔茨海默病。还公开了治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的鞣花酸二水合物化合物，其中鞣花酸二水合物化合物提供了细胞中AKT与磷酸化AKT比例的增加。此外，公开了治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的鞣花酸二水合物化合物，其中鞣花酸二水合物化合物提供了细胞中p44/42 MAPK与磷酸化p44/42 MAPK比例的增加。公开了治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的鞣花酸二水合物化合物，其中鞣花酸二水合物化合物提供了细胞表面的丝状伪足波动的增加。还公开了治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的鞣花酸二水合物化合物，其中鞣花酸二水合物化合物提供了细胞膜处的GLUT4浓度增加。在一些实施方案中，将组合物作为方案的一部分施用以预防孕妇或育龄妇女中的出生缺陷。对象可以是哺乳动物。哺乳动物可以是小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、猴或猿。在本发明的优选方面，哺乳动物可以是人。任何合适剂量的鞣花酸二水合物化合物可以配制在本发明的制剂中。在本发明的一些方面，0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg或0.5至5mg/kg剂量的组合物可以降低对象血浆中的最大平均葡萄糖浓度。在一种情况下，血浆中的最大平均葡萄糖浓度可以从200mg/dL或更大降低至约160mg/dL或更小、或90mg/dL至160mg/dL，85mg/dL至150mg/dL、或80mg/dL至100mg/dL。

在本发明的上下文中还公开了以下本发明的实施方案1至56。实施方案1是配制为向对象施用的组合物，所述组合物包含鞣花酸二水合物化合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物在体外条件下与游离的鞣花酸相比提供每单位剂量葡萄糖摄取增加。实施方案2是实施方案1的组合物，其中鞣花酸二水合物化合物包含一种或更多种多酚，优选地包含至少两个羧基的二酚化合物或具有至少两个内酯的二酚化合物。实施方案3是实施方案1至2中任一项的组合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物来源于选自红树莓、石榴、草莓和蓝莓及其任意组合的来源。实施方案4是实施方案1至2中任一项的组合物，其中鞣花酸二水合物来源于石榴(Punica granatum)，鞣花酸纯度为98％或更大。实施方案5是实施方案1至2中任一项的组合物，其中鞣花酸二水合物化合物来源于树皮提取物。实施方案6是实施方案1至5中任一项的组合物，其中鞣花酸二水合物化合物由下式表示：

其中R₁、R₂、R₃和R₄各自独立地选自氢(H)、C₁-C₂₀烷基或醚基、酰基、芳基、芳烷基、酰胺、氨基酸和杂环基，X是杂原子。实施方案7是实施方案6的组合物，其中C₁-C₂₀烷基是甲基、乙基或丙基。实施方案8是实施方案6至7中任一项的组合物，其中芳基是苯酚部分或其衍生物。实施方案9是实施方案6至7中任一项的组合物，其中芳烷基是苄基或其衍生物。实施方案10是实施方案6至7中任一项的组合物，其中杂原子是氧、氮或磷。实施方案11是实施方案10的组合物，其中杂原子是氧。实施方案12是实施方案1至5中任一项的组合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物基本由以下组成：

实施方案13是实施方案1至12中任一项的组合物，其中鞣花酸二水合物具有95％或更大、98％或更大、或99％或更大的纯度。实施方案14是实施方案1至13中任一项的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。实施方案15是实施方案14的组合物，其中药学上可接受的载体和/或稀释剂包含至少一种亲水性聚合物，其选自树胶、纤维素醚、丙烯酸树脂、碳水化合物载体、滑石、乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、水、胶制剂、蛋白质衍生的化合物、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁及其任意组合。实施方案16是实施方案14至15中任一项的组合物，其中组合物在约0.5mg/kg至5mg/kg的剂量下在对象的血浆中提供更低的浓度。实施方案17是实施方案1至16中任一项的组合物，其中所述组合物能够在施用0.5mg/kg至5mg/kg的剂量后将所述对象的血浆中最大平均葡萄糖浓度从200mg/dL或更大降低至约160mg/dL或更小。实施方案18是实施方案17的组合物，其中所述对象血浆中的葡萄糖浓度为90mg/dL至160mg/dl、85mg/dL至150mg/dL、或80mg/dL至100mg/dL。实施方案19是实施方案1至18中任一项的组合物，其中所述组合物在室温下储存1个月、6个月、12个月、18个月或24个月后保持稳定。实施方案20是实施方案1至19中任一项的组合物，其中所述组合物包含0.001重量％或更多、0.1重量％或更多、10重量％或更多、或99重量％或更多的鞣花酸二水合物化合物。实施方案21是实施方案1至20中任一项的组合物，其中组合物配制为用于口服施用。实施方案22是实施方案21的组合物，其中所述组合物以散剂、片剂、胶丸、珠、食用片剂、胶制剂、洗剂、透皮贴剂或液体溶液。实施方案23是实施方案21至22中任一项的组合物，其中组合物包含在固体纳米颗粒、含脂质的纳米颗粒、基于脂质的载体、密封导管、吸管、密封袋或其任意组合中。实施方案24是实施方案1至23中任一项的组合物，其中组合物配制为用于注射施用。实施方案25是治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的根据实施方案1所述的组合物，其中与游离的鞣花酸相比，所述鞣花酸二水合物化合物在体外条件下提供具有剂量效应的葡萄糖摄取增加。实施方案26是实施方案25至27中任一项的方法，其中所述对象已经被诊断为I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病、胰岛素抵抗疾病、前驱糖尿病、临床肥胖症、代谢综合征、肝脏疾病、肾脏疾病、冠心病、认知疾病或与晚期糖基化终产物相关的疾病。实施方案27是实施方案26的方法，其中晚期糖基化终产物疾病包括动脉粥样硬化、慢性肾衰竭、痴呆或阿尔茨海默病。实施方案28是实施方案25至27中任一项的方法，其中施用所述组合物是预防孕妇或育龄妇女中出生缺陷的方案的一部分。实施方案29是实施方案25至28中任一项的方法，其中将化合物口服施用。实施方案30是实施方案25至29中任一项的方法，其中所述组合物在施用约0.5mg/kg至5mg/kg的剂量后提供120mg/dl至160mg/dl、80mg/dL至200mg/dL、或80mg/dL至150mg/dL、或90mg/dL至100mg/dL的所述对象血浆中最大平均葡萄糖浓度。实施方案31是实施方案25至31中任一项的方法，其中所述对象是哺乳动物。实施方案32是实施方案31的方法，其中哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、猴或猿。实施方案33是实施方案32的方法，其中所述对象是人。实施方案34是实施方案25至33中任一项的方法，其中所述对象在施用组合物7天、14天、30天、1年或更久后经历体重减轻。实施方案35是治疗肥胖症或控制对象体重的方法，其包括向所述对象施用有效量的如实施方案1所述的组合物，其中所述对象在7天或更久后经历体重减轻。实施方案36是实施方案35的方法，其中所述对象每天施用0.005至100mg、0.05至75mg、0.1至50mg、或1至90mg的鞣花酸二水合物/磅对象。实施方案37是实施方案35至36中任一项的方法，其中所述体重减轻在14天或更久、30天或更久、或者1年或更久后持续体重减轻。实施方案38是实施方案35至37中任一项的方法，其中在30天的治疗后，所述组合物提供对象体重至少5％、至少8％、或至少10％或更多的减轻。实施方案39是实施方案35至38中任一项的方法，其中所述对象经历细胞能量水平的增加。实施方案40是配制用于向人对象施用用于治疗高血糖症的药物组合物，所述组合物包含鞣花酸二水合物化合物，其中所述组合物在一段时间内提供血浆中最大平均葡萄糖浓度的降低。实施方案41是用于治疗高血糖症的方法，其包括向对象施用包含实施方案1至24中任一项所述的包含鞣花酸二水合物化合物的组合物，其中所述组合物在一段时间内提供血浆中最大平均葡萄糖浓度的降低。实施方案42是配制用于向人对象施用用于治疗高血糖症的药物组合物，所述组合物包含鞣花酸二水合物化合物，其中所述组合物在一段时间内提供血浆中最大平均葡萄糖浓度的降低。实施方案43是用于治疗葡萄糖代谢病症的方法，所述方法包括施用如实施方案1至24中任一项所述的组合物，其中所述组合物在一段时间内提供血浆中最大平均葡萄糖浓度的降低。实施方案44是配制用于向对象施用用于治疗肥胖症或控制体重的药物组合物，所述组合物包含鞣花酸二水合物化合物。实施方案45是实施方案44的药物组合物，其中所述组合物被配制为在30天治疗后，提供对象至少5％，至少8％、至少10％或更多、或者至少20％体重的体重减轻。实施方案46是实施方案44至45中任一项的药物组合物，其中向所述对象每天施用0.001至100mg鞣花酸二水合物/kg对象。实施方案47是配制用于向人对象施用用于治疗葡萄糖代谢病症的药物组合物，所述组合物包含来源于具有95％或更大纯度的石榴(Punica granatum，石榴)提取物的鞣花酸二水合物化合物。实施方案48是配制为用于向哺乳动物对象皮下施用的稳定药物组合物，所述组合物包含鞣花酸二水合物化合物。实施方案49是实施方案48的稳定药物组合物，其中所述哺乳动物对象是人对象。实施方案50是实施方案48的稳定药物组合物，其中所述哺乳动物对象是兽医学对象。实施方案51是实施方案48的稳定的药物组合物，其中所述哺乳动物对象是犬科对象或猫科对象。实施方案52是配制为用于向人对象口服施用的用于治疗高血糖症或控制体重的药物组合物，所述组合物包含鞣花酸二水合物化合物。实施方案53是治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的鞣花酸二水合物化合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物提供细胞中AKT与磷酸化AKT比例的增加。实施方案54是治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的鞣花酸二水合物化合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物提供细胞中p44/42 MAPK与磷酸化p44/42 MAPK比例的增加。实施方案55是治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的鞣花酸二水合物化合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物提供细胞表面的丝状伪足波动增加。实施方案56是治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的鞣花酸二水合物化合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物提供细胞膜处的GLUT4浓度增加。

在本发明的一些方面，组合物还可以包含一种或更多种药学上可接受的载体或稀释剂。这些载体/稀释剂可以是佐剂、赋形剂或载剂，如防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂、调味剂、香料、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、维生素、聚合物、含硅氧烷的化合物、精油、结构剂和分散剂。每种载体在与制剂的其他成分相容并且不损害对象的意义上是可接受的。在本发明的一些方面，药学上可接受的载体可以包括至少一种亲水性聚合物，其选自树胶、纤维素醚、丙烯酸树脂、碳水化合物载体、滑石、乳糖、甘露醇、葡萄糖、水、胶制剂、蛋白质衍生化合物、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁及其任意组合。在本说明书全文中确定稀释剂/载体的非限制性实例，并通过引用并入本部分。这些成分的量可以为以组合物重量或体积计的0.0001％至99.9％，或本说明书其它部分所公开的任何整数或范围内，其通过引用并入本段。

稳定化合物可以在室温下储存1个月、6个月、12个月、18个月或24个月。在本发明的一些方面，组合物被配制成散剂、片剂、胶丸、珠、可食用片剂、胶制剂、洗剂、透皮贴剂或用于口服施用的液体溶液。在本发明的一些方面，所配制的组合物可以包含在固体纳米颗粒、含脂质的纳米颗粒、基于脂质的载体、密封导管、吸管、密封袋或其任意组合中。在本发明的其它方面，组合物可以配制为用于注射施用。

还预期的是包括本发明组合物的试剂盒。在某些实施方案中，组合物包含在容器中。容器可以是瓶、分配器、包装或吸管。容器可以分配预定量的组合物。在一些方面，组合物被分配为丸剂、片剂、胶囊、透皮贴剂、可食用咀嚼剂、霜剂、洗剂、凝胶、喷雾剂、雾剂、块、散剂或液体。容器可以包括在其表面上的标识。标识可以是单词、缩写、图片或符号。

预期本说明书中讨论的任何实施方案可以针对本发明的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。

还预期的是包含本发明的组合物的产品。在非限制性方面，产品可以是药品。药品可以是在本说明书其他章节中描述的或是本领域技术人员已知的那些药品。产品的非限制性实例包括丸剂、片剂、可食用咀嚼剂、胶囊、霜剂、洗剂、凝胶剂、喷雾剂、雾剂、溶解膜、透皮贴剂、或液体等。

“治疗剂”包括鞣花酸二水合化合物。其还包括这些化合物及其药学上可接受的盐。有用的盐是本领域技术人员已知的，包括与无机酸、有机酸、无机碱或有机碱的盐。本发明中有用的治疗剂是不论是单独施用还是与其它药物赋形剂或惰性成分组合施用，在施用于人或动物时影响所期望的、有益的、通常为药理作用的那些化合物。

术语“鞣花酸二水合化合物”指鞣花酸二水合物、其类似物、其衍生物、或其任何类似物或其衍生物的盐形式。

术语“基本上”及其变体定义为在很大程度上但不必完全是指定为本领域普通技术人员所理解的，在一个非限制性实施方案中，基本上指在10％以内、5％以内、1％以内或0.5％以内。

“患者”、“对象”或“个体”指哺乳动物(例如人、灵长类动物、狗、猫、牛、羊、猪、马、小鼠、大鼠、仓鼠、兔或豚鼠)。在具体的方面，患者、对象或个体是人。

“抑制”或“减少”或这些术语的任何变体包括任何可测量的降低或完全抑制以达到期望的结果。

“有效的”或“治疗”或“预防”或这些术语的任何变体指足以实现期望的、预期的或想要的结果。

当指化合物时，“类似物”指其中一个或更多个原子被其它原子取代、或其中一个或更多个原子从化合物中删除、或其中一个或更多个原子添加到化合物中、或这些修饰的任意组合的修饰的化合物。原子的这种添加、删除或取代可以在沿着化合物包含的一级结构的任何点或多个点发生。

关于母体化合物的“衍生物”指化学修饰的母体化合物或其类似物，其中至少一个取代基在母体化合物或其类似物中不存在。一个这种非限制性实例是被共价修饰的母体化合物。典型的修饰是酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯、聚乙二醇化等。

“治疗上等同的”药物是与一种或更多种其它药物治疗疾病或病况上具有基本上相同效果的药物。治疗上等同的药物可以是或可以不是化学上等同的、生物等同的或一般等同的。

“肠胃外注射”指在动物例如人的一层或更多层皮肤或粘膜下或者穿过动物例如人的一层或更多层皮肤或粘膜经注射施用小分子药物。

“生物利用度”指治疗剂例如鞣花酸二水化合物从制剂中被吸收的程度。

“全身的”关于向对象递送或施用治疗剂例如鞣花酸二水化合物，该治疗剂在对象血浆中以生物学显著的水平可检测。

“控释”指在治疗剂在约1小时或更长、优选12小时或更长的时间内以血液(例如血浆)浓度维持在治疗范围内、但低于毒性浓度的速度释放。

“药学上可接受的载体”指用于递送本发明的药物化合物到哺乳动物例如动物或人的药学上可接受的溶剂、助悬剂或载剂。

“药学上可接受的”成分、赋形剂或组分是适合用于人和/或动物、但没有不良副作用(如毒性、刺激和过敏反应)具有合理的益处/风险比的物质。

术语“哺乳动物”包括鼠科(例如大鼠、小鼠)哺乳动物、兔、猫、狗、猪和灵长类动物(例如猴、猿、人)。在本发明上下文中的具体方面，哺乳动物可以是鼠科哺乳动物或人。

术语“约”或“大约”或“基本上未改变的”定义为如本领域普通技术人员所理解的接近于，在一个非限制性实施方案中，该术语定义为10％以内、优选5％以内、更优选1以内、最优选0.5％以内。此外，“基本上无水的”指以重量或体积计小于5％、4％、3％、2％、1％或更少的水。

在权利要求和/或说明书中，当与术语“包含”一起使用时，指示物前不使用数量词可以指“一个”，但其也与“一个或更多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意思一致。

如本说明书和权利要求书中使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”、“含有”是包含性的或开放的，不排除附加的、未记载的要素或方法步骤。

组合物和使用其的方法可以“包括”本说明书全文公开的任意成分或步骤、“基本上由其组成”或“由其组成”。在一个非限制性方面，关于过渡性短语“基本上由...组成”，本说明书中公开的组合物和方法的基本的和新的特征包括组合物减少或预防肥胖症、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、隐匿性自身免疫性糖尿病、前驱糖尿病、代谢综合征等的能力。

由以下的详细描述，本发明的其它目的、特征和优点会变得明显。然而，应当理解的是，详细描述和实施例在表示本发明的具体实施方案的同时，仅以举例说明的方式给出。此外，预期的是在本发明精神和范围内的改变和修改通过该详细描述会对本领域技术人员变得明显。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，且被包括以进一步说明本发明的一些方面。通过参考一个或更多个这些附图并结合本文呈现的具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。

图1A描绘游离的鞣花酸的晶体结构模型。

图1B描绘鞣花酸二水合物的晶体结构模型。

图2描绘暴露于鞣花酸二水合物、载剂或无处理48小时后的MEF的细胞增殖。

图3是暴露于鞣花酸二水合物、载剂或无处理48小时后使用碘化丙啶(PI)标记的MEF的细胞膜完整性的柱状图。

图4A是暴露于鞣花酸二水合物、胰岛素、或载剂(阴性)后使用2-NBDG标记的MEF中化合物浓度(纳摩尔每升)相对2-NBDG信号的图。

图4B是相对于载剂对照处理，暴露于鞣花酸二水合物或胰岛素后，使用2-NBDG标记的MEF中化合物浓度(纳摩尔每升)相对葡萄糖摄取增加的百分比的图。

图5A是暴露于鞣花酸二水合物、胰岛素、或载剂(阴性)后使用2-NBDG标记的C2C12中化合物浓度(纳摩尔每升)相对2-NBDG信号的图。

图5B是相对于载剂对照处理，在暴露于鞣花酸二水合物或胰岛素后，使用2-NBDG标记的C2C12中化合物浓度(纳摩尔每升)相对葡萄糖摄取增加的百分比的图。

图5C是暴露于二甲双胍、胰岛素和第二批鞣花酸二水合物(鞣花酸二水合物2)后C2C12中化合物浓度(纳摩尔每升)相对葡萄糖摄取增加的百分比的图。

图6是暴露于鞣花酸二水合物、胰岛素或载剂(阴性)后使用2-NBDG标记，使用流式细胞术在MEF中化合物浓度(纳摩尔每升)相对2-NBDG信号的图。

图7是暴露于鞣花酸二水合物、鞣花酸、胰岛素或载剂(阴性)后使用2-NBDG标记，使用Operetta(20x)成像的MEF中化合物浓度(纳摩尔每升)相对2-NBDG信号的图。

图8是在高效成像系统上使用免疫细胞化学标记(抗AKT、抗磷酸化AKT)，相对于经载剂处理的细胞，暴露于二甲双胍、胰岛素和鞣花酸二水合物后C2C12中AKT与磷酸化AKT(Phos AKT)的比在log2标尺的柱状图。

图9是在高效成像系统(Operetta，Perkin Elmer)上使用免疫细胞化学标记(抗p44/42 MAPK，抗-Phos p44/42 MAPK)，相对于经载体处理的细胞，暴露于二甲双胍、胰岛素和鞣花酸二水合物后C2C12中p44/42 MAPK与磷酸化p44/42 MAPK(Phos p44/42MAPK)的比在log2标尺的柱状图。

详细说明

不希望受理论约束，认为鞣花酸二水合物化合物能够刺激葡萄糖摄取。此外，认为鞣花酸二水合物化合物在体外条件下能够刺激葡萄糖摄取。随着鞣花酸二水合物的单位剂量增加时，可以增加摄取。相比使用游离的鞣花酸，鞣花酸二水合物化合物可以更大程度地刺激葡萄糖摄取。通过增加的葡萄糖摄取，可以实现许多健康益处。在一些方面，葡萄糖的摄取可以导致体重减轻、脑功能增加、稳定血糖水平、增加细胞能量水平和/或经历代谢紊乱的对象的整体健康益处。疾病例如肝脏疾病、肾脏疾病和动脉疾病可以受到血浆中高葡萄糖水平的影响，因此葡萄糖摄取的增加可以导致改善的肝功能、肾功能和血流量。因此，可以制备鞣花酸二水合物化合物的组合物，其在施用于对象时，对象可以经历葡萄糖摄取增加和/或细胞能量水平增加，这导致对象的整体健康状况改善。此外，可以制备本文公开的可以用于治疗或预防高血糖症、肥胖症、代谢病况和病症以及以及这些病症和病况的相关病理、病况、原因和症状的组合物。这些病症、病况、病理和症状的非限制性实例包括肥胖症、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、隐匿性自身免疫性糖尿病、前驱糖尿病和代谢综合征。

A.鞣花酸二水合物化合物

本发明的组合物可以包括具有化学结构(I)和/或(II)的鞣花酸二水合物化合物。在优选的实施方案中，鞣花酸二水合物化合物具有大于98.0重量％的纯度，为结晶粉末。不希望受理论约束，认为鞣花酸二水合物包括通过氢键与水分子相连接的平面鞣花酸化合物，从而在整个晶体中产生分子层，而游离的鞣花酸氢键自身形成紧密堆积的晶体结构。剑桥结构数据库中报道的游离的鞣花酸和鞣花酸二水合物结构的晶体结构分别如图1A和1B所描绘的。不希望受理论约束，认为这些不同的晶体结构可以有助于细胞和/或对象对鞣花酸二水合物化合物的生物利用度。

鞣花酸二水合物衍生物和类似物可以通过已知的合成方法通过甲基化和酰化反应制备，如在Caufield的美国专利第5066571号中所描述的，其通过引用并入本文。例如，鞣花酸二水合物可以通过没食子酸(A)的氧化偶联形成鞣花酸(B)的二羧酸形式，然后通过内酯化形成期望的化合物(C)，如方案(I)所示，然后在水的存在下结晶来制备。鞣花酸衍生物可以使用已知的酰胺化、酯化反应等来制备。

在本发明的一些方面，鞣花酸二水合物可以从果实和植物的提取物中分离。果实的非限制性实例包括红树莓、石榴、草莓和蓝莓。植物的非限制性实例包括树皮提取物。树皮来源的非限制性实例包括异叶木属(Anisophyllea dichostyla)；Elaeocarpusparvifolius；蓝桉(Eucalyptus globulus)；化香树(Platycarya strobilacea)；石榴(Punica granatum)；栗属(Castanea)的物种；诃子属(Terminalia)的物种；栎属(Quercus)的物种。在本发明的一些方面，造纸工业的副产品可以用作鞣花酸和/或鞣花单宁的来源。植物和果实含有天然产物鞣花单宁。可以使用已知的提取方法从植物和果实中提取鞣花单宁，例如在环境温度下搅拌使树锯屑与醇接触，然后过滤以获得提取物。提取物可以包含鞣花单宁、鞣花酸和其他产物。提取物可以经受酸水解条件以将鞣花单宁(D)水解为开放酸形式的鞣花酸(B)，然后在酸或碱性条件下通过随后的内酯化制备鞣花酸二水合物(C)，如方案II所示。鞣花酸二水合物是可以从许多化学品供应商购得的。供应商的非限制性实例是Sigma-Aldrich(美国)和TCI Fine Chemicals(中国/日本)。

B.成分的量

预期的是本发明的组合物可以包括本说明书中讨论的任何量的成分。组合物还可以包括在整个说明书中描述的附加成分(例如稳定剂、填充剂、药学上可接受的盐和/或其他药物成分)的任意数量的组合。组合物中任何组分的浓度可以变化。在非限制性的实施方案中，例如该组合物在其最终形式中可以包含例如至少约0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0200％、0.0250％、0.0275％、0.0300％、0.0325％、0.0350％、0.0375％、0.0400％、0.0425％、0.0450％、0.0475％、0.0500％、0.0525％、0.0550％、0.0575％、0.0600％、0.0625％、0.0650％、0.0675％、0.0700％、0.0725％、0.0750％、0.0775％、0.0800％、0.0825％、0.0850％、0.0875％、0.0900％、0.0925％、0.0950％、0.0975％、0.1000％、0.1250％、0.1500％、0.1750％、0.2000％、0.2250％、0.2500％、0.2750％、0.3000％、0.3250％、0.3500％、0.3750％、0.4000％、0.4250％、0.4500％、0.4750％、0.5000％0.5250％、0.0550％、0.5750％、0.6000％、0.6250％、0.6500％、0.6750％、0.7000％、0.7250％、0.7500％、0.7750％、0.8000％、0.8250％、0.8500％、0.8750％、0.9000％、0.9250％、0.9500％、0.9750％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6.0％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7.0％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8.0％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9.0％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或其中导出的任意范围的本说明书和权利要求全文中提及的成分的至少一种，基本上由其组成，或由其组成。在非限制性的方面，百分比可以按照总组合物的重量或体积计算。本领域普通技术人员会理解，浓度可以根据添加、取代和/或减去给定组合物中的成分而变化。

C.附加组分

本发明的鞣花酸二水合物化合物可以配制成施用于人或非人动物患者的任何合适的组合物形式。

组合物可以单独由鞣花酸二水合物组成，或者可以包括鞣花酸二水合物和任何合适的附加成分，例如一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂，例如防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂，这取决于施用方式和剂型的性质。在与制剂的其他成分相容且不对患者造成伤害的意义上来说，每种载体必须是可接受的。

1.赋形剂

在本发明组合物中使用的赋形剂可以是固体、半固体、液体或其组合。优选地，赋形剂是固体。包含赋形剂的本发明的组合物可以通过任何已知技术制备，所述技术包括例如将赋形剂与鞣花酸二水合物混合。本发明的药物组合物每剂量单位含有期望量的鞣花酸二水合物，如果旨在用于口服施用，可以是例如片剂、囊片剂、丸剂、硬胶囊或软胶囊剂、锭剂、扁囊剂、可分配的散剂、颗粒剂、混悬剂、酏剂、分散体形式或合理地适合于这种施用的任何其它形式。如果旨在用于肠胃外施用，其可以是例如混悬剂或透皮贴剂的形式。如果旨在用于直肠施用，其可以是例如栓剂的形式。目前优选的是口服剂型形式，其为各自含有预定量的鞣花酸二水合物的分离的剂量单位，如片剂或胶囊。

2.载体/稀释剂

合适的载体或稀释剂示例性地包括但不限于单独或组合的乳糖，包括无水乳糖和一水合乳糖；淀粉、包括直接可压缩淀粉和水解淀粉(例如Celutab^TM和Emdex^TM)、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、葡萄糖(例如Cerelose^TM 2000)和葡萄糖一水合物、磷酸氢钙二水合物、蔗糖基稀释剂、糖果店的糖、硫酸氢钙一水合物、硫酸钙二水合物、粒状乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂、肌醇、水解谷物固形物、直链淀粉，纤维素包括微晶纤维素、食品级来源的α-纤维素和无定形纤维素(例如RexcelJ)、粉末状纤维素、羟丙基纤维素(HPC)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)、碳酸钙、甘氨酸、粘土、膨润土、嵌段共聚物、聚乙烯吡咯烷酮等。这些载体或稀释剂如果存在，则总计构成组合物总重量的约5％至约99.999％、约10％至约85％和20％至约80％。所选择的载体或稀释剂优选表现出合适的流动性质，并且在期望是片剂的情况下，表现出可压缩性。

3.崩解剂

本发明的组合物任选地可以包括一种或更多种药学上可接受的崩解剂作为赋形剂，特别是用于片剂制剂。合适的崩解剂包括但不限于，单独地或组合地，淀粉、包括羧甲基淀粉钠和预胶化玉米淀粉，粘土，纤维素如纯化纤维素、微晶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素和羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠，藻酸盐，交联聚维酮和树胶例如琼脂、瓜尔胶、刺槐角豆胶、刺梧桐树胶、果胶和黄蓍胶。可以在制备组合物期间在任何合适的步骤加入崩解剂，特别是在造粒之前或在压缩之前的润滑步骤期间。这种崩解剂如果存在，总计构成组合物总重量的约0.2％至约30％，优选约0.2％至约10％，更优选约0.2％至约5％。

4.黏结剂

本发明的组合物可以包括黏结剂或黏合剂，特别是用于片剂制剂。这样的黏结剂和黏合剂优选地赋予待压片的粉末足够的内聚力，以允许正常的加工操作，例如定型、润滑、压缩和包装，但仍允许片剂分解，并且使组合物在摄入时被吸收。当盐溶解在溶液中，这种黏结剂也可以防止或抑制本发明的共晶体的结晶或重结晶。合适的黏结剂和黏合剂包括但不限于，单独地或组合地，阿拉伯树胶；黄蓍胶、蔗糖、胶制剂、葡萄糖、淀粉例如但不限于预胶化淀粉、纤维素例如但不限于甲基纤维素和羧甲纤维素钠、海藻酸和海藻酸的盐；硅酸镁铝、PEG、瓜尔胶、多糖酸、膨润土、聚维酮、聚甲基丙烯酸酯、HPMC、羟丙基纤维素和乙基纤维素。这种黏结剂和/或黏合剂如果存在，总计构成药物组合物总重量的约0.5％至约25％，优选约0.75％至约15％，更优选约1％至约10％。许多黏结剂是包含酰胺、酯基、醚基、醇基或酮基的聚合物，这样可以包含在本发明的药物组合物中。聚乙烯吡咯烷酮是用于缓释片剂的黏结剂的非限制性实例。聚合物黏结剂可以具有不同的分子量、交联度和聚合物等级。聚合物黏结剂也可以是共聚物，例如含有亚乙基氧单元和亚丙基氧单元的混合物的嵌段共聚物。给定聚合物中这些单元比例的变化影响性质和性能。

5.润湿剂

润湿剂可以用于本发明的组合物中。可以选择润湿剂以保持晶体与水紧密相结合，这是被认为改善组合物的生物利用度的条件。这种润湿剂也可以用于增溶或增加晶体的溶解度。表面活性剂可以用作润湿剂。可以在本发明组合物中用作润湿剂的表面活性剂的非限制性实例包括季铵化合物，例如苯扎氯铵，苄索氯铵和西吡氯铵，琥珀辛酯磺酸钠，聚氧乙烯烷基苯基醚，泊洛沙姆(聚氧乙烯和聚氧丙烯嵌段共聚物)，聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和油、例如聚氧乙烯(8)辛酸/癸酸甘油单酯和聚氧乙烯(8)辛酸/癸酸甘油二酯、聚氧乙烯(35)蓖麻油和聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油，聚氧乙烯烷基醚、例如聚氧乙烯(20)鲸蜡硬脂基醚，聚氧乙烯脂肪酸酯、例如聚氧乙烯(40)硬脂酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯、例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80，丙二醇脂肪酸酯、例如丙二醇月桂酸酯，十二烷基硫酸钠，脂肪酸及其盐、例如油酸、油酸钠和油酸三乙醇胺，甘油脂肪酸酯、例如甘油单硬脂酸酯，脱水山梨糖醇酯、例如脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯和脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，泰洛沙泊及其混合物。这种润湿剂如果存在，总计构成药物组合物总重量的约0.25％至约15％，优选约0.4％至约10％，更优选约0.5％至约5％。

6.润滑剂

润滑剂可以包含在本发明的组合物中。合适的润滑剂包括但不限于，单独地或组合地，甘油山嵛酸酯，硬脂酸及其盐、包括硬脂酸镁、硬脂酸钙和硬脂酸钠；氢化植物油、硅胶、滑石、蜡、硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、富马酸钠、氯化钠、DL-亮氨酸、PEG(例如陶氏化学公司的Carbowax^TM 4000和Carbowax^TM 6000)、油酸钠、月桂基硫酸钠和月桂基硫酸镁。这种润滑剂如果存在，总计构成药物组合物总重量的约0.1％至约10％，优选约0.2％至约8％，更优选约0.25％至约5％。

7.其他试剂

表面活性剂、乳化剂或泡腾剂可以用于组合物中。乳化剂可以用于帮助成分溶解在软明胶胶囊内。表面活性剂、乳化剂或泡腾剂的非限制性实例包括D-山梨糖醇、乙醇、角叉菜胶、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、瓜尔胶、甘油、甘油脂肪酸酯、胆固醇、白蜂蜡、琥珀辛酯磺酸钠、蔗糖脂肪酸酯、硬脂醇、硬脂酸、聚乙二醇40硬脂酸酯、脱水山梨糖醇倍半油酸酯、鲸蜡醇、胶制剂、脱水山梨醇脂肪酸酯、滑石、脱水山梨糖醇三油酸酯、石蜡、马铃薯淀粉、羟丙基纤维素、丙二醇、丙二醇脂肪酸酯、果胶、聚氧乙烯(105)聚氧丙烯(5)二醇、聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油40、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯35蓖麻油、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、聚乙二醇400、辛基十二烷基肉豆蔻酸酯、甲基纤维素、脱水山梨糖醇单油酸酯、甘油单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单月桂酸酯、十二烷基二甲基氧化胺溶液、月桂基硫酸钠、聚桂醇、干燥碳酸钠、酒石酸、氢氧化钠、纯化大豆卵磷脂、大豆卵磷脂、碳酸钾、碳酸氢钠、中链甘油三酯、柠檬酸酐、棉籽油-大豆油混合物和液体石蜡。

D.载剂

各种递送系统是本领域已知的，并且可以用于施用本发明的治疗剂或组合物，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊、受体介导的内吞作用等中。施用方法包括但不限于经肠胃外、动脉内、肌肉内，静脉内、鼻内和口服途径。药物组合物可以以片剂、锭剂、颗粒剂、胶囊、丸剂、安瓿、栓剂或气溶胶形式提供。药物组合物还可以以水性或非水性稀释剂、糖浆、颗粒或粉末中活性成分的悬浮液、溶液和乳剂的形式提供。

E.制剂和施用

组合物可以是例如药物组合物(药剂)。根据本发明的药物组合物包含适于口服或肠胃外途径的制剂。具体途径的非限制性实例包括皮内、皮下、肌肉内、静脉内、局部注射、经直肠、鼻内吸入、吹入、局部(包括透皮、口腔和舌下)、经阴道、经肠胃外和肺部施用。制剂可以方便地以单位剂量的形式存在，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。这些方法包括使活性成分(例如鞣花酸二水合物)与构成一种或更多种辅助成分的载体相结合的步骤。通常，制剂通过将活性成分与合适的载体如液体载体或细分散的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后如果需要，使产品成型。适用于口服施用的本发明的制剂可以作为分离的单元呈现，例如胶囊、扁囊剂或片剂，每个含有预定量的活性成分，或作为水包油液体乳剂、油包水液体乳剂或作为水溶液例如茶中的补充剂。活性成分也可以作为大丸剂、药糖剂或贴剂呈现。有用的可注射制剂包括水性或油性载剂中鞣花酸二水合物化合物组合物的无菌悬浮液、溶液或乳剂。组合物还可以含有配制剂，如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。用于注射的制剂可以单位剂量形式存在，例如以安瓿或多剂量容器，并且可以含有添加的防腐剂。任选地，可注射制剂可以以粉末形式提供，用于在使用前用合适的载剂包括但不限于无菌无热原水、缓冲液、葡萄糖溶液等。为此，可以通过任何已知的技术干燥鞣花酸二水合物化合物组合物，例如冻干，并在使用前重建。

适于在口中局部施用的制剂包括包含在调味基质中的活性成分的锭剂，调味基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶，包含在惰性基质中的活性成分的锭剂，惰性基质例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶，包含在合适液体载体中的活性成分的漱口水，和包含活性成分的巧克力。

根据本主题发明的适于局部施用的制剂可以配制成软膏、霜剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液、贴剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油。任选地，制剂可以包含贴片或敷料，例如浸渍有活性成分的绷带或胶布，以及任选的一种或更多种赋形剂或稀释剂。局部制剂优选地包含促进活性成分通过皮肤吸收并进入血流的化合物。

适于鼻内施用的制剂，其中载体是固体，包括具有粒度为例如约20至约500微米的粗粉末，其以吸入鼻烟的方式施用，即从靠近鼻子的粉末容器通过鼻腔通道快速吸入。其中载体是用于通过喷雾器施用的液体的合适制剂包括试剂的水溶液或油溶液。制剂优选地可以包括促进活性成分通过皮肤吸收并进入血流的化合物。

适用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以含有使制剂与预期接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质；以及可以包括助悬剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液，以及设计成使化合物靶向血液成分或一种或更多种器官的脂质体或其它微粒体系。在使用之前，制剂可以以单位剂量或多剂量或多剂量密封容器，例如安瓿和小瓶存在，并且可以在仅需添加无菌液体的载体、例如用于注射的水的冷冻干燥(冻干)条件下储存。临时注射溶液和悬浮液可以由上述类型的无菌粉末、颗粒和片剂来制备。

用于口服施用的液体制剂可以采用例如酏剂、溶液、糖浆或混悬剂的形式，或者其可以作为干产品存在，以在使用之前用水或其它合适的载剂构建。这种液体制剂可以通过常规方法用药学上可接受的添加剂制备，添加剂如助悬剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水介质(例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)；防腐剂(例如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯或山梨酸)。制剂还可以根据情况包含缓冲盐、防腐剂、调味剂、着色剂和甜味剂。

对于经口腔施用，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于经直肠和经阴道途径施用，可以将鞣花酸二水合物化合物组合物配制为含有常规栓剂基质如可可油或其它甘油酯的溶液(用于灌肠治疗)、栓剂或软膏。

对于经鼻施用或通过吸入或吹入施用，鞣花酸二水合物组合物可以使用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、碳氟化合物、二氧化碳或其他合适的气体从加压包或喷雾器以气溶胶喷雾的形式方便地递送。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送计量的量来确定。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如由明胶组成的胶囊和药筒)可以配制成含有化合物和适当粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

为了延长递送，可以将鞣花酸二水合物化合物组合物配制成通过植入或肌肉内注射施用的长效制剂。鞣花酸二水合物化合物组合物可以用合适的聚合物材料或疏水材料(例如在可接受的油中作为乳剂)或离子交换树脂，或作为微溶衍生物例如作为微溶盐来配制。或者，可以使用制造为贴盘或贴剂的透皮递送体系，其缓慢释放用于经皮吸收的鞣花酸二水合物化合物组合物。为此，可以使用渗透促进剂以促进鞣花酸二水合物化合物组合物的经皮渗透。合适的透皮贴剂在例如美国专利第5407713号；美国专利第5352456号；美国专利第5332213号；美国专利第5336168号；美国专利第5290561号；美国专利第5254346号；美国专利第5164189号；美国专利第5163899号；美国专利第5088977号；美国专利第5087240号；美国专利第5008110号和美国专利第4921475号中描述。

任选地，可以采用其它的递送系统。脂质体和乳剂是可以用于递送鞣花酸二水合物化合物组合物的递送载剂的众所周知的实例。也可以使用一些有机溶剂如二甲基亚砜(DMSO)，尽管通常以更大的毒性为代价。

应当理解，除了上述具体提及的成分之外，可用于本发明的制剂可以包括现有技术关于所讨论制剂类型的其他常规试剂。例如，适于口服施用的制剂可以包括其它试剂例如甜味剂、增稠剂和调味剂。还旨在将本发明的试剂、组合物和方法与其它合适的组合物和疗法组合。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以局部施用于需要治疗的区域；这种局部施用可以通过例如局部灌输、注射或借助导管来实现。在另一个实施方案中，本发明的化合物或组合物以使得在疾病部位达到活性化合物峰值浓度的方式施用。疾病部位的峰值浓度可以例如通过静脉内注射任选地在盐水中的试剂来实现，或口服施用例如包含活性成分的片剂、胶囊或糖浆来实现。

F.其他药物试剂

本发明的药物制剂可以与其它药物或生物活性剂同时施用或连续施用。实例包括但不限于抗氧化剂、自由基清除剂、止痛剂、麻醉剂、肛门直肠剂、抗炎剂包括非甾体类的抗炎药物、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、抗微生物剂、抗癌活性物、抗肿瘤药、生物活性蛋白质和肽、酶、止血剂、类固醇包括激素和皮质类固醇等。

G.治疗方法和剂量

优选的单位剂量制剂是含有试剂的日剂量或单位剂量、每日次剂量或其适当部分的那些。治疗量可以根据经验确定，并且会随被治疗的病理学、被治疗的对象以及试剂的功效和毒性而变化。类似地，本领域普通技术人员可以容易地确定合适的剂型和试剂的施用方法。

在一些实施方案中，本发明的治疗方法可以包括通过以有效治疗疾病、病况或病症的量向具有这样疾病或病况的对象施用本文描述的稳定制剂来治疗疾病、病况或病症。在一些实施方案中，向对象施用包含鞣花酸二水合物化合物的稳定制剂。疾病、病况或病症可以由高血糖症和肥胖引起。此外，疾病、病况或病症可以是I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、隐匿性自身免疫性糖尿病、前驱糖尿病或代谢综合征及相关疾病、病况和病症。为了预防性施用，可以向处于发展上述病况之一的风险的患者施用组合物。

施用的组合物的量将取决于多种因素，包括例如所治疗的具体症状、施用方式、期望的益处是预防性还是治疗性的、所治疗的症状的严重性以及患者的年龄和体重等。有效剂量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。在本发明的一些方面，鞣花酸二水合物化合物组合物的总剂量通常为约0.0001mg/kg/天或0.001mg/kg/天或0.01mg/kg/天至约100mg/kg/天，但可以更高或更低，除其他因素以外，其取决于组分的活性、其生物利用度、施用方式以及上述讨论的各种因素等。可以单独地调整剂量和时间间隔以提供足以维持治疗效果或预防效果的化合物的血浆水平。例如，化合物可以每周施用一次、每周几次(例如，每隔一天)、每天一次或每天多次，除其他方面外，其取决于施用方式、所治疗的具体症状和处方医师的判断。本领域技术人员能够优化有效的局部剂量而无需过多的实验。在一些实施方案中，组合物可以与已知影响重量减轻的其它化合物联合施用。例如，化合物可以与已知燃烧脂肪的化合物一起提供。

H.试剂盒

在本发明的另一个方面，本文描述了用于治疗本文所述的疾病、病况或病症的试剂盒。例如，本发明的组合物可以包含在试剂盒中。试剂盒可以包括容器。容器可以包括瓶、金属管、层压管、塑料管、分配器、吸管、加压容器、隔离容器、包装、隔室或其它类型的容器，例如注射或吹塑塑料容器，其中保存了分散体或组合物或所期望的瓶、分配器或包装。试剂盒和/或容器可以在其表面上包括标识。例如，标识可以是词语、短语、缩写、图片或符号。

容器可以分配预定量的组合物。在其它实施方案中，可以将容器挤压(例如金属管、层压管或塑料管)以分配所期望量的组合物。组合物可以作为喷雾剂、气溶胶、液体、流体、半固体或固体分配。在优选的实施方案中，组合物作为自由流动的粉末或颗粒分配。容器可以具有喷雾、泵或挤压装置。试剂盒还可以包括用于使用该试剂盒组分以及使用包含在容器中的任何其他组合物的说明书。说明书可以包括如何应用、使用和维护该组合物的说明。如果需要，组合物可以存在于可以含有包含鞣花酸二水合物化合物组合物的一个或更多个单位剂型的包装或分配装置中。包装可以例如包括金属箔或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配装置可以伴有施用说明书。

实施例

将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员会容易地识别可以改变或修改以产生基本相同结果的各种非关键参数。

实施例1

(用于实施例2至实施例7的制剂)

通用过程。对于实施例2至实施例7，将所有感兴趣的测试化合物最初溶解于100％DMSO中。鞣花酸二水合物的估计饱和在约4mM时发生。将饱和溶液在1×PBS中按1:10稀释；生成400μM鞣花酸二水合物的100×储备溶液。通过1:10稀释至0.1％DMSO中，产生工作浓度(1×)4μM和更稀释浓度的鞣花酸二水合物。得到的6种稀释液为4μM至0.04nM。使用Operetta(Perkin Elmer)或Excel(Microsoft)上的Harmony软件分析剂量曲线用于流式细胞术，其在BD Accuri(BD Biosciences)上进行。

实施例2

(鞣花酸二水合物与葡萄糖相互作用)

分析鞣花酸二水合物与葡萄糖的直接相互作用。使用基于葡萄糖氧化酶的血糖仪测量血清葡萄糖。将鞣花酸二水合物与血清在室温下孵育5分钟或在37℃过夜。在测试混合物时，没有观察到葡萄糖氧化酶反应的抑制。认为鞣花酸二水合物不与葡萄糖直接相互作用。

实施例3

(细胞毒性)

评价了体外细胞培养物中鞣花酸二水合物的细胞毒性。使用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行细胞试验。细胞未暴露于(未处理)或暴露于不同浓度的鞣花酸二水合物(4μM至0.04nM)或载体(0.1％DMSO)48小时。所有试验重复三次。

在完全培养基(DMEM w/10％FBS)中暴露于鞣花酸二水合物48小时后，使用细胞自动细胞计数确定细胞增殖率。然后将细胞用1×PBS洗涤三次，用细胞消化液(Invitrogen)在37℃下孵育10分钟，用1×PBS中的10％FBS中和，并通过流式细胞仪分析。通过在流式细胞仪(Accuri C6，BD Biosciences)上细胞计数(500至1000个)确定细胞浓度。细胞浓度反映鞣花酸二水合物对细胞群体数量的影响(细胞死亡和细胞增殖)。

细胞膜完整性的丧失表明细胞死亡。在流式细胞仪之前，通过向悬浮细胞加入碘化丙啶(PI)确定细胞膜完整性/细胞毒性。PI是红色荧光DNA染料，其被活体健康细胞排斥，但会进入群体中的死细胞。通过流式细胞仪(Accuri C6，BD Biosciences)确定每个处理组的500至1000个细胞中PI的存在。与细胞死亡相关的具有膜破裂的细胞预期被PI阳性标记。

结果：暴露于鞣花酸二水合物48小时后，MEF的细胞增殖显示剂量相关的细胞增殖增加的趋势。参见图2。然而，所产生的细胞增殖变化不是统计学上显著的(P>.05)。因此，随着鞣花酸二水合物的浓度增加，观察到细胞浓度的总体但非显著的增加。这些数据表明暴露于鞣花酸二水合物后对细胞群体数量没有负面影响。

对于400nM至0.4nM的处理，暴露于鞣花酸二水合物48小时后，MEF的细胞膜完整性(PI阴性细胞百分比)相对于载剂或未处理细胞增加。图3。在4000nM，观察到相对于载剂的完整性降低(分别为95.48％、95.40％)。细胞死亡/膜完整性变化不是统计学上显著的(P>.05)。图3。这些数据表明暴露于鞣花酸二水合物后对细胞膜完整性没有负面影响。

实施例4

(鞣花酸二水合物、胰岛素和二甲双胍处理中的葡萄糖摄取)

测量鞣花酸二水合物处理的细胞培养物中的葡萄糖摄取，并与胰岛素或二甲双胍处理下的葡萄糖摄取比较。使用小鼠成肌细胞C2C12细胞和MEF细胞进行细胞试验。细胞未暴露于(未处理)或暴露于不同浓度的鞣花酸二水合物(4μM至0.04nM)或载剂(0.1％DMSO)或类似浓度的胰岛素或二甲双胍。

使用荧光标记的葡萄糖、2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)并在高效成像系统(Operetta，Perkin Elmer)或流式细胞仪(500至1000个细胞)(Accuri C6，BD Biosciences)上在MEF中确定葡萄糖摄取。葡萄糖摄取增加表示为细胞中2-NBDG(488nM)的信号增加。葡萄糖摄取试验在由1×磷酸缓冲盐水w/Ca+、Mg+(PBS++)中的2-NBDG构成的50μl最终孵育体积(100μM)的进行。使用相同的缓冲液洗涤细胞。胰岛素用作阳性对照。所有测试化合物在10％DMSO中制备，并按1:100稀释，终浓度为0.1％DMSO(载剂)。将细胞培养至70至90％融合，然后用PBS++洗涤两次。将细胞在37℃下、在PBS++中孵育30分钟。加入核染料、HCS CellMask染料(蓝色，Invitrogen)和/或测试化合物(鞣花酸二水合物、胰岛素或载剂)。将细胞在37℃孵育30分钟。将细胞用PBS++洗涤两次，并与2-NBDG孵育10分钟。细胞用PBS++洗涤三次，然后在PBS++中成像。任选地，去除最终的PBS洗涤液，将细胞与细胞消化液(Invitrogen)在37℃下孵育10分钟，用1×PBS中的10％FBS中和，并通过流式细胞仪分析。进行附加实验以测量暴露于二甲双胍、胰岛素和鞣花酸二水合物2(批次2)的C2C12细胞中的葡萄糖摄取。图5C。

结果：使用流式细胞术，胰岛素和鞣花酸二水合物显示出增加两个细胞系中葡萄糖摄取的剂量效应。图4和图5(图4A、图4B和图5A、图5B)显示测试化合物的2-NBDG摄取曲线。图4A和5A表示细胞吸收的葡萄糖荧光信号(2-NBDG)。图4B和图5B表示相对于载剂处理(0.1％DMSO)的细胞，相对葡萄糖摄取的百分比变化。在两个细胞系中，胰岛素相对于载剂产生葡萄糖摄取的显著增加。图4A和图5A。在两个细胞系中，鞣花酸二水合物对葡萄糖摄取的影响(2-NBDG信号)显著地大于经载剂处理的(阴性，0.1％DMSO)。图4A和5A。在测试的大多数浓度下，鞣花酸二水合物在成纤维细胞和成肌细胞中相对于胰岛素诱导显著更多的葡萄糖摄取。图4B和图5B。例如，在成纤维细胞中暴露于400nM时，鞣花酸二水合物和胰岛素分别将葡萄糖摄取增加了47％和32％。图4B。成肌细胞中鞣花酸二水合物和胰岛素产生的葡萄糖摄取相对于成纤维细胞(参见图4A和图4B)增加约4倍(参见图5A和图5B)。相比二甲双胍，鞣花酸二水合物在4000nm也显示葡萄糖摄取的更多增加。图5C。

此外，在高效成像系统(Operetta，Perkin Elmer)上使用细胞的2-NBDG标记确定MEF中葡萄糖摄取。胰岛素和鞣花酸二水合物显示如细胞中的2-NBDG信号增加(488nM，绿色)所示的葡萄糖摄取增加。胰岛素和鞣花酸二水合物显示在MEF中葡萄糖摄取增加的剂量效应。鞣花酸二水合物对葡萄糖摄取的影响(2-NBDG信号)显著地大于经载剂处理(阴性，0.1％DMSO)或经胰岛素处理的细胞(数据未显示)。数据平行于通过流式细胞术显示的结果。

通过鞣花酸二水合物在多种细胞类型中增加的葡萄糖摄取证实，该化合物能够刺激所培养的成肌细胞和成纤维细胞中的葡萄糖摄取。在相同的浓度下，鞣花酸二水合物诱导的摄取超过了在所测试的两个细胞系中的经胰岛素诱导的摄取。该效应在4nM至4μM是统计学上显著的。

实施例5

(比较胰岛素和鞣花酸的葡萄糖摄取)

测量经鞣花酸二水合物处理的细胞培养物中的葡萄糖摄取，并与经胰岛素或鞣花酸处理的葡萄糖摄取比较。使用如实施例4所述的MEF细胞进行细胞试验，除了细胞未暴露于(未处理)或暴露于不同浓度的鞣花酸二水合物(4μM至0.04nM)、载剂(0.1％DMSO)或类似浓度的胰岛素或鞣花酸。流式细胞术结果用每批1000个细胞重复三次。

结果：使用在流式细胞术中使用细胞的2-NBDG标记确定MEF中葡萄糖摄取，如通过相比于载剂(阴性)所有处理的细胞中2-NBDG信号(488nM，绿色)增加所示，显示增加葡萄糖摄取的剂量效应。图6。鞣花酸二水合物(EADH)处理显示比在鞣花酸(EA)或胰岛素处理中看到的葡萄糖摄取有显著更大的增加。图6。因此，出人意料的是，鞣花酸二水合物显示出比鞣花酸或胰岛素处理显著增加的葡萄糖摄取。这表明，相比胰岛素或鞣花酸，鞣花酸二水合物可能是对与更高葡萄糖水平或葡萄糖摄取或代谢降低有关的疾病和病症的更有效的治疗。

在高效成像系统(Operetta，Perkin Elmer)上使用细胞的2-NBDG标记确定的MEF中葡萄糖摄取，相对于载剂(阴性)，显示如所有处理的细胞中2-NBDG(488nM，绿色)的信号增加所示的葡萄糖摄取增加的。图7。鞣花酸二水合物(EADH)和胰岛素显示了在MEF中增加葡萄糖摄取的剂量效应，但在用鞣花酸(EA)处理的细胞中没有观察到这种剂量效应。图7。这再次表明相比鞣花酸，鞣花酸二水合物可能是对于与较高葡萄糖水平或降低的葡萄糖摄取或代谢有关的疾病和病症的更有效的治疗。

实施例6

(葡萄糖转运蛋白GLUT4的定位)

研究了葡萄糖转运蛋白GLUT-4在经鞣花酸二水合物处理的细胞培养物中的诱导。使用小鼠成肌细胞C2C12细胞进行细胞试验。用融合葡萄糖转运蛋白4绿色荧光蛋白(GLUT4-GFP)感染细胞。该蛋白质通过在荧光延时显微镜下对GFP成像使得GLUT4可视化。编辑框以产生未经胰岛素处理或胰岛素处理的细胞变化的延时图像。

葡萄糖转运蛋白(GLUT4-GFP)的定位在由500μl的Hank’s Buffer(Invitrogen)和5μl的测试化合物组成的505μL的最终孵育体积中进行。将胰岛素用作阳性对照，将载剂(0.1％DMSO)用作阴性对照。所有测试化合物在10％DMSO中制备，并按1:100稀释，终浓度为0.1％DMSO(载剂)。将细胞用Hank’s缓冲液洗涤三次，然后在Hank’s缓冲液中在37℃下孵育1小时。加入测试化合物(鞣花酸二水合物、胰岛素或载剂)，使用激光共聚焦显微镜(LeicaTCS SP5 X)与FITC荧光过滤器使细胞成像，以确定GLUT4-GFP定位的变化。收集延时图像(TIF)，并使用Image-J(NIH)对视频构建进行后处理。

结果：观察到由于胰岛素或鞣花酸二水合物暴露引起的细胞变化。在胰岛素暴露之前，荧光信号(GLUT4-GFP)主要位于细胞核周围。暴露于胰岛素(4000nM)导致细胞核周围的GLUT4-GFP降低，在膜处的运动平行增加。此外，胰岛素处理导致在细胞表面的许多突起(丝状伪足波动)的快速产生。膜和GLUT4-GFP活性的增加与胰岛素导致的葡萄糖摄取增加直接相关。暴露于鞣花酸二水合物(4000nM)也导致核GLUT4-GFP的减少和细胞表面丝状伪足的快速波动。膜和GLUT4-GFP活性的这些增加与鞣花酸二水合物导致的葡萄糖摄取增加直接相关。这些观察结果与胰岛素类似；然而，这种过程在经鞣花酸二水合物处理的细胞中似乎稍微延迟。在未经处理或经载剂处理的细胞的任何延时成像中，没有GLUT4-GFP的核定位变化或丝状伪足波动变化的迹象(数据未显示)。

实施例7

(比较用鞣花酸二水合物、胰岛素和二甲双胍活化AKT和MAPK途径)

在经鞣花酸二水合物处理的细胞培养物、经二甲双胍处理的细胞培养和经胰岛素处理的细胞培养中进行AKT通路和MAPK通路的刺激。胰岛素通过增加GLUT4活化来刺激葡萄糖摄取到细胞中，AKT、特别是磷酸化AKT信号转导改变GLUT4易位。MAPK也被认为参与GLUT4活化通路。使用小鼠成肌细胞C2C12细胞进行细胞试验。确定AKT:磷酸化AKT和p44/42MAPK:磷酸化p44/42 MAPK的相对蛋白水平。

将血清饥饿细胞(1小时)用每种测试化合物处理30分钟。在高效成像系统(Operetta，Perkin Elmer)上使用免疫细胞化学标记(抗AKT、抗磷酸化AKT或抗p44/42MAPK、抗磷酸化p44/42MAPK)、使用抗兔Alexa 647的荧光信号确定磷酸化与非磷酸化蛋白质的比。磷酸化增加表示为相对于经载剂处理的细胞，AKT:磷酸化AKT比例(log2标尺)和p44/42 MAPK:磷酸化p44/42MAPK比例(log2标尺)的信号降低。

结果：用胰岛素处理的细胞处理显示磷酸化AKT(-0.5比例)的增加(4nM至4μM)。图8。因此，胰岛素增加AKT的磷酸化。鞣花酸二水合物显示AKT相对于Phos-AKT信号的增加(4nM至4μM)。图8。因此，鞣花酸二水合物相对于AKT磷酸化增加了AKT。二甲双胍显示AKT相对于AKT磷酸化的增加。图8。

胰岛素和鞣花酸二水合物处理显示p44/42 MAPK的增加(400nM，0.04nM)。图9。二甲双胍在0.04nM处理时增加了p44/42 MAPK的比例。图9。观察到未处理组增加磷酸化p44/42MAPK相对于p44/42 MAPK信号的比。图9。

实施例8

(用于确定鞣花酸处理小鼠的体重减轻和改良的葡萄糖调节的试验和数据)

确定经鞣花酸处理的小鼠的体重减轻和血糖，并通过以下步骤确定经鞣花酸二水合物处理的小鼠的体重减轻和血糖。

每天用鞣花酸处理小鼠30天，或以补充丸剂的形式进行对照，将该补充丸剂均质化并悬浮于Cremophor EL的25％水溶液中。使用122.4mg丸剂/kg对象(40.6mg鞣花酸/kg对象)的人等效剂量(LD)、1224mg丸剂/kg对象的10×更高剂量(HD)(406mg鞣花酸/kg对象)或对照载剂(Cremophor EL的25％水溶液)采用填喂法处理小鼠。LD和HD剂量是基于下列假设计算的：人剂量为口服603mg(200mg鞣花酸)丸剂/天；一个人的平均体重是60kg，因此，人的平均剂量等于每天约9.95mg丸剂(3.3mg鞣花酸)/kg；小鼠等效剂量需要每kg人剂量的12.3倍。在总共一个月内，每天对小鼠进行称重和处理，每两天测量血糖水平。

结果：在雌性SWV小鼠中进行鞣花酸处理研究，该小鼠每天用人等效剂量(LD)和10倍较高剂量(HD)以补充丸剂形式的鞣花酸进行处理30天。经LD处理的小鼠平均损失8.9％的体重，经HD处理的小鼠平均损失10.4％的体重。同时，对照组增加了初始体重的3.2％。与对照组相比，在所有处理中均观察到正常的血糖水平。然而，基于实施例5中报告的鞣花酸二水合物与鞣花酸相比较的体外数据，预测与经鞣花酸处理的小鼠相比，经鞣花酸二水合物处理的小鼠将有体重减轻的较大降低并且可能具有血糖水平的一定降低。

实施例9

(用于确定患有STZ诱导型糖尿病的小鼠体重损失和改良的葡萄糖调节的试验和鞣花酸处理的数据)

确定经鞣花酸处理的糖尿病诱导小鼠体重减轻和血糖，并且可以通过以下步骤确定经鞣花酸二水合物处理的小鼠的体重减轻和血糖。

糖尿病诱导：通过5天每天腹腔注射链脲霉素(STZ 40mg/kg)诱导糖尿病。当每个组的葡萄糖水平高于200mg/dL时，认为小鼠是高血糖的。在STZ注射和葡萄糖测量之前，将小鼠禁食4小时。

处理：每天用鞣花酸处理小鼠30天，或以补充丸剂的形式进行对照，将该补充丸剂均质化并悬浮于Cremophor EL的25％水溶液中。使用122.4mg丸剂/kg对象(40.6mg鞣花酸/kg对象)的人等效剂量、使用98％纯的鞣花酸的40.6mg鞣花酸/kg对象的人等效剂量，或对照载剂(Cremophor EL的25％水溶液)用填喂法处理小鼠。如实施例8所述计算人等效剂量。处理在最后一次STZ注射后两周开始，其中在糖尿病小鼠中证实了高血糖症。每天称量小鼠，每5天在禁食动物中测量葡萄糖水平。

结果：在患有STZ诱导型糖尿病的雌性SWV小鼠中进行鞣花酸处理研究。每天用补充丸剂的形式或98％纯物质(人等效剂量)的鞣花酸处理小鼠30天。用补充丸剂处理的小鼠平均损失18.9％体重，用98％纯物质(人等效剂量)处理的小鼠平均损失11.7％体重。同时，对照组失去初始体重的2.2％。经处理的小鼠在整个处理期间是高血糖的(葡萄糖水平高于200mg/dL)，在处理小鼠和对照小鼠之间没有观察到平均葡萄糖水平值之间的显著差异。然而，基于实施例5中报告的鞣花酸二水合物与鞣花酸相比较的体外数据，预测与经鞣花酸处理的小鼠相比，经鞣花酸二水合物处理的小鼠将有体重减轻的较大降低并且将具有较低的平均血糖水平值。

实施例10

(用于确定活性水平的试验和鞣花酸处理的观察)

申请人注意到用鞣花酸处理的小鼠似乎具有增加的活性水平。基于实施例5中报告的鞣花酸二水合物与鞣花酸相比较的体外数据，预测与用鞣花酸处理的小鼠相比，用鞣花酸二水合物处理的小鼠将显示出显著更大的活性水平。小鼠中增加的活性可能表明增加的细胞能量水平，例如增加的ATP浓度、磷酸肌酸水平等。用鞣花酸二水合物处理的小鼠的活性水平可以通过若干过程来定量，例如Turri，M等人；QTL Analysis IdentifiesMultiple Behavioral Dimensions in Ethological Tests of Anxiety in LaboratoryMice；Current Biology；2001；11(10):725-734中概述的。其中教导的过程的两个实例如下。

居住笼中的总自发活动：在居住笼活动监测和随后测试前，将小鼠单独笼养几天。居住笼中的活动在连续两天的黑暗周期的最初2小时内进行测量。将两个红外光发射器检测器对用于随着动物中断光束来记录居住笼地面的总自发活动，该红外光发射器检测器对位于透明塑料居住笼外并将笼分成三个相等区域。光束中断活动得分由在两个测试天相加的每个检测器的光束中断数的平方根组成。

居住笼中的活动量级：在居住笼活动监测和随后测试前，将小鼠单独笼养几天。居住笼中的活动在连续两天的黑暗周期的最初2小时内进行测量。基于检测到的活动量级，使用位于居住笼顶部的红外运动检测器将居住笼内感应到的所有运动转换为任意单位。显示高水平活动并限制在居住笼的一个区域内的小鼠可以通过运动检测监测获得相对较高的活动分数，而不是上述的总自发活动测试。

鉴于本公开，可以制备和执行本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法而无需过多实验。虽然根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员明显的是，可以将变化应用于组合物和/或方法以及步骤或步骤顺序而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，明显的是，本文所述的试剂可以被化学和生理相关的一些试剂代替，同时获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这种类似替代和修改被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims (56)

1.一种配制为用于向对象施用的组合物，所述组合物包含鞣花酸二水合物化合物，其中与游离鞣花酸相比，所述鞣花酸二水合物化合物在体外条件下提供每单位剂量的葡萄糖摄取增加。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物包含一种或更多种多酚，优选包含至少两个羧基的二酚化合物或具有至少两个内酯的二酚化合物。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物来源于选自红树莓、石榴、草莓和蓝莓及其任意组合的来源。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物来源于石榴，且具有98％或更大的鞣花酸纯度。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物来源于树皮提取物。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物由下式表示：

其中R₁、R₂、R₃和R₄各自独立地选自氢(H)、C₁-C₂₀烷基或醚基、酰基、芳基、芳烷基、酰胺、氨基酸和杂环基，X是杂原子。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述C₁-C₂₀烷基是甲基、乙基或丙基。

8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述芳基是苯酚部分或其衍生物。

9.根据权利要求6所述的组合物，其中所述芳烷基是苄基或其衍生物。

10.根据权利要求6所述的组合物，其中所述杂原子是氧、氮或磷。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述杂原子是氧。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物主要由以下组成：

13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物具有95％或更大、98％或更大、或者99％或更大的纯度。

14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中药学上可接受的载体和/或稀释剂包含至少一种亲水性聚合物，所述至少一种亲水性聚合物选自树胶、纤维素醚、丙烯酸树脂、碳水化合物载体、滑石、乳糖、甘露醇、葡萄糖、水、明胶、蛋白质衍生的化合物、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁及其任意组合。

16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物在约0.5mg/kg至5mg/kg的剂量下在对象的血浆中提供更低的浓度。

17.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物能够在施用0.5mg/kg至5mg/kg的剂量后将所述对象血浆中的最大平均葡萄糖浓度从200mg/dL或更大降低至约160mg/dL或更小。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述对象血浆中的葡萄糖浓度为90mg/dL至160mg/dl、85mg/dL至150mg/dL、或80mg/dL至100mg/dL。

19.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在室温下储存1个月、6个月、12个月、18个月或24个月后保持稳定。

20.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含0.001重量％或更多、0.1重量％或更多、10重量％或更多、或99重量％或更多的鞣花酸二水合物化合物。

21.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物配制为用于口服施用。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物作为散剂、片剂、胶丸、珠、可食用片剂、胶制剂、洗剂、透皮贴剂或液体溶液提供。

23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物被包含在固体纳米颗粒、含脂质的纳米颗粒、基于脂质的载体、密封导管、吸管、密封袋或其任意组合中。

24.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物配制为用于通过注射施用。

25.一种治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物，其中与游离鞣花酸相比，所述鞣花酸二水合物化合物在体外条件下提供具有剂量效应的葡萄糖摄取增加。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述对象已经被诊断为患有I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病、胰岛素抵抗疾病、前驱糖尿病、临床肥胖症、代谢综合征、肝脏疾病、肾脏疾病、冠心病、认知疾病或与晚期糖基化终产物相关的疾病。

27.根据权利要求26所述的方法，其中晚期糖基化终产物疾病包括动脉粥样硬化、慢性肾衰竭、痴呆或阿尔茨海默病。

28.根据权利要求25所述的方法，其中施用所述组合物是用来预防孕妇或育龄妇女中出生缺陷的方案的一部分。

29.根据权利要求25所述的方法，其中所述化合物是口服施用的。

30.根据权利要求25所述的方法，其中所述组合物在施用0.5mg/kg至5mg/kg的剂量后提供120mg/dl至160mg/dl、80mg/dL至200mg/dL、或80mg/dL至150mg/dL、或90mg/dL至100mg/dL的所述对象血浆中的最大平均葡萄糖浓度。

31.根据权利要求25所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、猴或猿。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述对象是人。

34.根据权利要求25所述的方法，其中所述对象在施用所述组合物7天、14天、30天、1年或更久后经历体重减轻。

35.一种治疗肥胖症或控制对象体重的方法，其包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物，其中所述对象在7天或更久后经历体重减轻。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述对象每天被施用每磅对象0.005mg至100mg、0.05mg至75mg、0.1mg至50mg、或1mg至90mg的鞣花酸二水合物化合物。

37.根据权利要求35所述的方法，其中所述体重减轻在14天或更久、30天或更久、或者1年或更久后持续。

38.根据权利要求35所述的方法，其中在30天的治疗后，所述组合物提供对象体重至少5％、至少8％、或者至少10％或更多的减轻。

39.根据权利要求35所述的方法，其中所述对象经历细胞能量水平的增加。

40.一种配制为用于向人对象施用的治疗高血糖症的药物组合物，所述组合物包含鞣花酸二水合物化合物，其中所述组合物在一段时间内提供血浆中最大平均葡萄糖浓度的降低。

41.一种用于治疗高血糖症的方法，其包括向对象施用根据权利要求1所述的包含鞣花酸二水合物化合物的组合物，其中所述组合物在一段时间内提供血浆中最大平均葡萄糖浓度的降低。

42.一种配制为用于向人对象施用的治疗葡萄糖代谢紊乱的药物组合物，所述组合物包含鞣花酸二水合物化合物，其中所述组合物在一段时间内提供血浆中最大平均葡萄糖浓度的降低。

43.一种用于治疗葡萄糖代谢紊乱的方法，所述方法包括施用根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在一段时间内提供血浆中最大平均葡萄糖浓度的降低。

44.一种配制为用于向对象施用的治疗肥胖症或控制体重的药物组合物，所述组合物包含鞣花酸二水合物化合物。

45.根据权利要求44所述的药物组合物，其中所述组合物配制为在30天的治疗后，提供对象体重至少5％、至少8％、至少10％或更多、或者至少20％的体重减轻。

46.根据权利要求44所述的药物组合物，其中所述对象每天被施用每kg对象0.001mg至100mg鞣花酸二水合物。

47.一种配制为用于向人对象施用的治疗葡萄糖代谢紊乱的药物组合物，所述组合物包含具有95％或更大纯度的来源于石榴提取物的鞣花酸二水合物化合物。

48.一种配制为用于向哺乳动物对象皮下施用的稳定药物组合物，所述组合物包含鞣花酸二水合物化合物。

49.根据权利要求48所述的稳定药物组合物，其中所述哺乳动物对象是人对象。

50.根据权利要求48所述的稳定药物组合物，其中所述哺乳动物对象是兽医学对象。

51.根据权利要求48所述的稳定药物组合物，其中所述哺乳动物对象是犬科对象或猫科对象。

52.一种配制为用于向人对象口服施用的治疗高血糖症或控制体重的药物组合物，所述组合物包含鞣花酸二水合物化合物。

53.一种治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的鞣花酸二水合物化合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物提供细胞中AKT与磷酸化AKT比例的增加。

54.一种治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的鞣花酸二水合物化合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物提供细胞中p44/42MAPK与磷酸化p44/42MAPK比例的增加。

55.一种治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的鞣花酸二水合物化合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物提供细胞表面处丝状伪足波动的增加。

56.一种治疗对象的方法，其包括向对象施用有效量的鞣花酸二水合物化合物，其中所述鞣花酸二水合物化合物提供细胞膜处GLUT4浓度的增加。