CN102065854A

CN102065854A - 用于治疗沙-马-图病和相关病症的毛果芸香碱和甲巯咪唑的组合

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Publication number: CN102065854A
Application number: CN2009801232249A
Authority: CN
Inventors: 丹尼尔·科恩; 伊利亚·楚马科夫; 谢尔盖·纳比罗钦; 奥克萨纳·盖拉斯门科; 娜莎莉·肖莱
Original assignee: Pharnext SA
Current assignee: Pharnext SA
Priority date: 2008-06-18
Filing date: 2009-06-17
Publication date: 2011-05-18
Anticipated expiration: 2029-06-17
Also published as: US20140235599A1; CN102065854B; PT2307000E; CY1115360T1; EP2307000B1; DK2307000T3; ES2460617T3; EA023380B1; AU2009259336B2; EA201170043A1; US8716269B2; CA2727064C; US9597297B2; JP5677946B2; WO2009153291A1; HRP20140354T1; EP2135607A1; IL209816A0; US20120040940A1; EP2307000A1

Abstract

本发明涉及用于治疗沙-马-图病和相关周围神经病变的组合物和方法。更具体来说，本发明涉及通过同时影响对象中的毒蕈碱型受体信号传导和甲状腺激素途径来治疗所述疾病的组合疗法。

Description

用于治疗沙-马-图病和相关病症的毛果芸香碱和甲巯咪唑的组合

本发明涉及用于治疗沙-马-图病和相关病症的组合物和方法。

沙-马-图病(“CMT”)是一种孤儿遗传性周围多神经病。在2,500个体中约有1人患有此病，是最常见的外周神经系统遗传性病症。尽管在婴儿期也可能检测到该病，但它的发作典型地在生命的第一或第二个十年中发生。疾病过程是慢性的，伴有渐进性神经肌肉退化。对于伴有神经性疼痛和极端肌肉失能的病例来说，该疾病造成病废。在法国，CMT是被研究得最好的遗传病之一，约有30,000个病例。尽管大多数CMT患者带有含髓鞘基因PMP22的17号染色体片段的重复(CMT1A型)，但有20多种基因被暗示与不同形式的CMT相关。因此尽管在起源上是单基因的，但由于可能的调节基因，该病表现出临床非均质性。在CMT患者中突变的基因群集于影响施旺细胞或神经元分化或改变这些细胞在外周神经中的相互作用的紧密关联的分子途径周围。

PMP22是表达在外周神经系统中基本上所有有髓纤维的致密部分中的髓鞘的主要组分，并主要通过施旺细胞产生。此外，在患有神经纤维瘤、一种特征为皮肤的咖啡牛奶色斑和纤维瘤肿瘤的常染色体显性疾病的患者中，假定PMP22基因参与瘤形成的发生。在CMT患者中对于重复为杂合的施旺细胞中，也观察到正常PMP22蛋白的适度的、1.5倍的过表达(在某些罕见病例中，CMT1A样表型也可能与PMP22蛋白中的结构性突变相关)(Lupski等，1992；Suter等，1992；Roa等，1993；Thomas等，1997；Suter和Scherer，2003；Nave和Sereda，2007)。异常PMP22基因剂量引起CMT1A样表型的直接证据，由在过表达PMP22蛋白的啮齿动物模型中的转基因实验所提供(Niemann 等，1999；Perea等，2001；Robaglia-Schlupp等，2002；Meyer等，2006；Sereda和Nave，2006)。

此外，使用孕酮受体抑制剂和抗坏血酸的治疗性干预在转基因小鼠中降低了这种表达，改善或减缓了疾病表型的发展(Sereda等，2003；Passage等，2004；Meyer zu Horste等，2007)。

Bassi等，1978，涉及在伴有神经病变和脑脊髓炎的甲状腺毒症的治疗中使用甲巯咪唑。

Celtrix的WO 00/20024涉及使用甲巯咪唑缓解一种甲状腺病症——IGF-依赖性病症的症状。

WO2004/019938涉及在神经病性疼痛综合征的治疗中使用毛果芸香碱。

Keltner等，1975，建议单独使用毛果芸香碱治疗肌强直乳头状畸变。但是没有描述使用毛果芸香碱治疗CMT。此外，也没有建议使用毛果芸香碱与任何其他化合物的组合。

总而言之，对用于治疗CMT疾病的有效、批准的疗法，存在着需求。

发明简述

本发明的目的是为治疗CMT和相关病症提供新的治疗手段。更具体来说，本发明人鉴定到了新的组合疗法，其能够有效影响导致CMT和相关病症的途径，并代表了用于治疗这些病症的新手段。因此，本发明提供了新的组合产品和组合物，及其在治疗CMT疾病和相关病症中的应用。

更具体来说，本发明的目的涉及化合物的组合用于治疗CMT或相关病症的应用或在制备用于治疗CMT或相关病症的药物中的应用，其中所述化合物的组合选自毒蕈碱型受体激动剂或其前药，以及甲状腺激素合成抑制剂或其前药。

本发明的另一个目的在于包含毒蕈碱型受体激动剂和甲状腺激素合成抑制剂或其前药的组合产品，用于同时或相继地分组或独立给药于对象。

本发明还涉及药物组合物，其包含毒蕈碱型受体激动剂和甲状腺激素合成抑制剂或其前药，以及可药用的载体或赋形剂。

在最优选实施方案中，毒蕈碱型受体激动剂是(3S，4R)-3-乙基-4-[(3-甲基咪唑-4-基)甲基]氧杂环戊烷-2-酮(CAS 92-13-7，其是毛果芸香碱药物的活性剂)或其前药。

此外，在最优选实施方案中，甲状腺激素合成抑制剂还显示出前列腺素信号传导活性。这样的化合物的优选实例包括1-甲基-3H-咪唑-2-硫酮(CAS 60-56-0，其是甲巯咪唑药物的活性剂)或其前药，例如卡比马唑。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含毒蕈碱型受体激动剂和甲状腺激素合成抑制剂的组合物，用于在对象中治疗CMT，其中该治疗还包括确定患者是否患有CMT1A的步骤。

就此而言，本发明的具体目的涉及组合物，其包含毛果芸香碱或其前药和甲巯咪唑或其前药，以及任选的可药用的载体或赋形剂。正如实施例中所示，这样的组合能够在公认的动物模型中有效治疗CMT。

本发明的产品或组合物还可以包含至少一种附加活性化合物，其优选选自雷帕霉素、巴氯芬、山梨醇、米非司酮、纳曲酮、氟比洛芬和酮洛芬。

在优选实施方案中，本发明的组合物至少包含：

-毛果芸香碱、甲巯咪唑和米非司酮；

-毛果芸香碱、甲巯咪唑和巴氯芬；或

-毛果芸香碱、甲巯咪唑和山梨醇。

在另一个优选实施方案中，本发明的组合物至少包含：

-毛果芸香碱、甲巯咪唑、米非司酮、巴氯芬和山梨醇；或

-毛果芸香碱、甲巯咪唑、米非司酮、巴氯芬、山梨醇和纳曲酮。

在其他实施方案中，本发明涉及产品或组合物，其包含甲巯咪唑、毛果芸香碱以及两种附加的活性化合物，优选为米非司酮和山梨醇。

在其他实施方案中，本发明涉及产品或组合物，其包含甲巯咪唑、毛果芸香碱以及三种附加的活性化合物，优选为：

-米非司酮、巴氯芬和山梨醇；或

-米非司酮、山梨醇和雷帕霉素；或

-米非司酮、山梨醇和酮洛芬；或

-米非司酮、山梨醇和氟比洛芬。

在其他实施方案中，本发明涉及产品或组合物，其包含甲巯咪唑、毛果芸香碱以及四种附加的活性化合物，优选为：

-米非司酮、山梨醇、巴氯芬和纳曲酮；

-米非司酮、山梨醇、巴氯芬和雷帕霉素；

-米非司酮、山梨醇、纳曲酮和雷帕霉素。

在其他实施方案中，本发明涉及产品或组合物，其包含表1中所公开的任何药物组合。

在其他具体实施方案中，本发明涉及产品或组合物，其包含：

-甲巯咪唑和巴氯芬；或

-甲巯咪唑和西维美林。

在另一个实施方案中，本发明还涉及产品或组合物，其包含毛果芸香碱和丙硫氧嘧啶。

本发明的另一个目的涉及使用毛果芸香碱与甲巯咪唑的组合、或这两种化合物单独或与其他增强其效能的化合物组合用于治疗CMT或相关病症的应用或用于制备用于治疗CMT或相关病症的药物的应用。

本发明的另一个目的涉及使用毛果芸香碱与甲巯咪唑的组合、或这两种化合物单独或与其他增强其效能的化合物组合用于治疗中毒性神经病变的应用或用于制备用于治疗中毒性神经病变的药物的应用。

本发明的另一个目的涉及使用毛果芸香碱与甲巯咪唑的组合、或这两种化合物单独或与其他增强其效能的化合物组合用于治疗ALS(肌萎缩性侧索硬化症)的应用或用于制备用于治疗肌萎缩性侧索硬化症的药物的应用。

优选情况下，用于增强毛果芸香碱和甲巯咪唑组合的效能以治疗CMT的化合物，选自米非司酮、巴氯芬、山梨醇、纳曲酮、雷帕霉素、氟比洛芬和酮洛芬。

在其变体中，使用毛果芸香碱和甲巯咪唑的混合物与一种附加活性化合物(优选为米非司酮或巴氯芬)组合，用于治疗CMT或相关病症。

在另一种变体中，毛果芸香碱和甲巯咪唑的混合物与两种附加活性化合物(优选为米非司酮和山梨醇)组合使用。

在另一种变体中，毛果芸香碱和甲巯咪唑的混合物与三种附加活性化合物组合使用，所述附加活性化合物优选包含米非司酮和山梨醇与选自巴氯芬、雷帕霉素、酮洛芬或氟比洛芬的第三种化合物的组合。

在另一种变体中，毛果芸香碱和甲巯咪唑的混合物与四种附加的活性化合物组合使用，所述附加活性化合物优选为米非司酮、山梨醇、巴氯芬和纳曲酮或雷帕霉素；或为米非司酮、山梨醇、纳曲酮和雷帕霉素。

本发明还提供了用于治疗CMT或相关病症、特别是CMT的方法，所述方法包括向需要的对象给药有效量的毒蕈碱型受体激动剂或其前药与甲状腺激素合成抑制剂或其前药的组合。

本发明还涉及在对象中治疗CMT的方法，所述方法包括向对象给药有效量的毛果芸香碱或其前药与甲巯咪唑或其前药的组合。

本发明还涉及在对象中治疗CMT的方法，所述方法包括向对象给药有效量的毛果芸香碱和甲巯咪唑与至少一种附加活性化合物的组合，所述附加活性化合物优选选自雷帕霉素、巴氯芬、山梨醇、米非司酮、纳曲酮、氟比洛芬和酮洛芬。

在其变体中，本发明还涉及在对象中治疗CMT的方法，所述方法包括向对象给药有效量的下述组合：

-毛果芸香碱、甲巯咪唑和至少一种选自巴氯芬、米非司酮、山梨醇和纳曲酮的附加活性化合物；

-毛果芸香碱、甲巯咪唑和巴氯芬；

-毛果芸香碱、甲巯咪唑和米非司酮；

-毛果芸香碱、甲巯咪唑、米非司酮、山梨醇和巴氯芬；

-毛果芸香碱、甲巯咪唑、米非司酮、山梨醇和雷帕霉素；

-毛果芸香碱、甲巯咪唑、米非司酮、山梨醇和酮洛芬；

-毛果芸香碱、甲巯咪唑、米非司酮、山梨醇和氟比洛芬；

-毛果芸香碱、甲巯咪唑、米非司酮、山梨醇、巴氯芬和纳曲酮；

-毛果芸香碱、甲巯咪唑、米非司酮、山梨醇、巴氯芬和雷帕霉素；

-毛果芸香碱、甲巯咪唑、米非司酮、山梨醇、纳曲酮和雷帕霉素；

-甲巯咪唑和巴氯芬；

-甲巯咪唑和西维美林；或

-毛果芸香碱和丙硫氧嘧啶。

本发明可用于在任何哺乳动物对象、特别是人类对象中治疗CMT或相关病症。它特别适合用于治疗CMT1a。

就此而言，本发明的具体目的是在患者中治疗CMT1a的方法，所述方法包括向对象给药有效量的毛果芸香碱或其前药与甲巯咪唑或前药的组合。

本发明的另一个目的是治疗CMT1a的方法，所述方法包括(1)评估对象是否患有CMT1a，以及(2)使用有效量的毛果芸香碱或其前药与甲巯咪唑或其前药的组合，治疗患有CMT1a的对象。确定对象是否患有CMT1a，可以通过本身在本技术领域中已知的各种检测方法、例如DNA检测法来进行。

附图说明

图1：以％显示了在用化合物A和B处理24小时的大鼠原代施旺细胞中PMP22 mRNA表达的相对水平。左图显示了添加1mM或1μM化合物A(甲巯咪唑)后24小时时PMP22 mRNA水平的％。观察到在原代施旺细胞中PMP22 mRNA显著降低，并且较低剂量的化合物A诱导了最重要的PMP22下调。^*：p＜0.05；^***：p＜0.001；与对照显著差异(配对student t检验)。在右图，在暴露于化合物B(毛果芸香碱)24小时后，在原代施旺细胞中PMP22 mRNA的表达水平显著下调，即使在非常低剂量下(10nM和50nM)。同样地，我们观察到在温育24小时后，化合物B(1μM)使施旺细胞中PMP22蛋白的表达水平显著降低了38％。这种效应在温育48小时后仍然明显(-18％，p＜0.001)。

图2：所选药物对RT4-D6P2T神经鞘瘤细胞的通过RT-Q-PCR定量的PMP22 mRNA表达水平的影响。^***：p＜0.0001：与对照(＝无药物)显著差异。对ΔΔCt值的双侧Student’s t检验。

图3：以趋势线形式表示的在整个处理研究过程中雌性大鼠在条试验(Bar-test)中的运动评估结果。WT_安慰剂：用安慰剂处理的正常大鼠，TG_安慰剂：用安慰剂处理的对照转基因大鼠，TGptx25：用阴性对照物质处理的转基因大鼠，TGA：强迫进食每日剂量为0.2mg/kg甲巯咪唑的转基因大鼠；TGB：用每日剂量为0.35mg/kg毛果芸香碱处理的转基因大鼠。

图4：在20周内用药物处理的CMT大鼠中敏感性神经电位幅度的电生理评估。TG_安慰剂：用安慰剂处理的对照转基因大鼠，TGptx25：用阴性对照物质处理的转基因大鼠，TGA：用每日剂量为0.2mg/kg甲巯咪唑处理的转基因大鼠；TGB：用每日剂量为0.35mg/kg毛果芸香碱处理的转基因大鼠。

图5：从图3的图例中所述的用药物处理的动物获得的解剖样品的分析。将在20周期间用药物和安慰剂处理的大鼠深度麻醉，仔细取样并称重整个坐骨神经和比目鱼肌。图显示了30个这些测量数据的平均值。

图6：在步态评估测试(雌性大鼠)中混合物1的正效应；黑线表示用安慰剂处理的对照大鼠；黑粗线表示用安慰剂处理的转基因大鼠；虚线表示用混合物1处理的转基因大鼠。^*p＜0,05；黑色^*：wt_安慰 _剂对tg_安慰剂；灰色^*：tg_安慰剂对tg_混合物1。统计学使用Student双侧检验来实现；平均值表示成±s.e.m。

图7：混合物2对尾神经兴奋性阈值的正效应(白色条表示用安慰剂处理的雄性对照大鼠；黑色条表示用安慰剂处理的转基因雄性大鼠；灰色条表示用混合物2处理的转基因雄性大鼠)。统计学使用Student双侧检验来实现；平均值表示成±s.e.m。

图8：在条试验中混合物2处理4周后的正效应(白色条表示用安慰剂处理的雄性对照大鼠；黑色条表示用安慰剂处理的转基因雄性大鼠；灰色条表示用混合物2处理的转基因雄性大鼠)。统计学使用Student双侧检验来实现；平均值表示成±s.e.m。

图9：用混合物2处理3周后对步态的正效应(白色条表示每组中用流畅步态行走的雄性大鼠的百分率；灰色条表示不流畅的步态；黑色条表示不能行走)。统计学使用Student双侧检验来实现。

图10：慢性OXALPN模型中的抗异常疼痛效应。蓝色显示了对照动物在丙酮试验中的反应时间，红色为用奥沙利铂处理的动物，绿色为用奥沙利铂和混合物2处理的动物。

发明详述

本发明提供了用于治疗CMT或相关病症的新治疗手段。本发明公开了由已知药物的组合制成的新组合物及其在这种疾病的有效矫正中的新应用，并可以用于任何哺乳动物对象。

在本发明的文本中，术语“CMT相关病症”是指其他的遗传性和获得性的周围神经病变。

CMT的主要形式CMT1A由PMP22基因重复引起。PMP22是表达在外周神经系统的基本上所有有髓纤维的致密部分中的髓鞘的主要组分。PMP22蛋白与另一种结构性髓鞘蛋白P0相互作用，因此，改变PMP22/P0蛋白比例可能影响髓鞘的紧束(Vallat等，1996；D’Urso等，1999)。正如体外研究所证实的，PMP22蛋白也以ρ-依赖性方式参与细胞伸展的调控，因此能够影响轴突入鞘(Brancolini等，1999)。此外，PMP22与α6β4整合蛋白形成复合物，并能介导施旺细胞与细胞外基质的相互作用(Amici等，2006；Amici等，2007)。此外，PMP22蛋白水平的增加能够改变由Arf6调控的质膜内体再生途径，并导致PMP22在晚期内体中的积累(Chies等，2003)。还已证实，过表达PMP22蛋白在施旺细胞中扰乱了细胞内蛋白分拣并使蛋白降解机制过载(Notterpek等，1997；Tobler等，2002；Fortun等，2003；Fortun等，2006；Fortun等，2007；Khajavi等，2007)。最后，PMP22直接参与细胞增殖和程序化细胞死亡的控制(Sancho等，2001；Atanasoski等，2002)，并且已显示，突变的PMP22蛋白激起影响深远的轴突离子通道的重新组织和异常表达(Ulzheimer等，2004；Devaux & Scherer，2005)。

因此，术语“CMT相关病症”包含外周病症例如ALS、中毒性神经病变、特发性神经病、癌症和HIV诱导的神经病变、吉-巴综合征。

在优选实施方案中，CMT相关病症是指神经病变，例如脱髓鞘性神经病包括HNPP(具有压力麻痹倾向性的遗传性神经病)、CMT1B、CMT1C、CMT1D、CMT1X、CMT2A、CMT2B、CMT2D、CMT2E、CMT2-P0、严重脱髓鞘性神经病DSS(德-索综合征)、CHN(先天性髓鞘发育不良性神经病)、CMT4A、CMT4B1、CMT4B2、CMT4D、CMT4F、CMT4、AR-CMT2A、HSN1。

本发明特别适用于治疗CMT1A。

本文中使用的病症的“治疗”包括治疗、阻止、预防、迟滞或减轻由所述病症引起的疼痛。具体来说，术语治疗包括控制疾病的进展和相关症状。

此外，术语化合物是指在本申请中明确命名的化学化合物，及其任何可药用盐、水合物、酯、醚、异构体、外消旋物、缀合物、前药。

此外，术语“组合”是指将至少两种药物共同给药于对象以引起生物效应的治疗。在组合疗法中，至少两种药物可以一起或独立地、在同时或相继地给药。此外，至少两种药物可以通过不同途径和方案给药。

本发明显示，CMT或CMT相关病症可以通过药物的特定组合进行治疗。更具体来说，本发明显示甲巯咪唑和毛果芸香碱化合物的组合，可用于治疗CMT或相关病症。就此而言，实验结果显示，甲巯咪唑和毛果芸香碱的组合显著降低了大鼠施旺细胞中PMP22基因的RNA表达水平。此外，对模拟人类CMT疾病的PMP22转基因大鼠用包含甲巯咪唑和毛果芸香碱的组合进行每日治疗。观察到了行为终点的显著改善。

毛果芸香碱：(3S，4R)-3-乙基-4-[(3-甲基咪唑-4-基)甲基]氧杂环戊烷-2-酮

该药物，C₁₁H₁₆N₂O₂，已被批准用于治疗i)由头颈癌的放疗引起的唾液腺机能减退所产生的口干症状；和ii)在患有舍伦格综合征的患者中治疗口干症状。

作为毒蕈碱型受体激动剂，它引起平滑肌纤维收缩(消化道、眼、支气管)，刺激发汗、唾液、支气管和胃分泌。此外，它表现出复杂的心血管作用，刺激拟副交感神经(血管舒张)神经节兴奋途径。

本发明人已证实，毛果芸香碱、一种毒蕈碱型受体激动剂，在体外降低了施旺细胞中PMP22蛋白的表达。我们提出，通过毛果芸香碱刺激毒蕈碱型受体，可能通过一组复杂的分子机制，导致细胞内Erk/Akt活性平衡的移动，以相反的方式调控髓磷脂相关蛋白标志物的表达朝向更显著的Erk信号传导(Ogata等，2004)。

不受理论的束缚，据推断，刺激毒蕈碱型受体可能通过几种同时发生的机制改变Akt和Erk激酶的活性(Ma等，2004；Anger等，2007)。例如，毒蕈碱型受体通过促进IRS-1被PKC的抑制性酪氨酸去磷酸化或抑制性丝氨酸磷酸化，可以选择性阻断IGF-1而不是PDGF受体的信号传导。其次，毒蕈碱型受体能够通过Src样Fyn激酶介导ERK信号传导的细胞内反式激活；此外，通过降低腺甘酸环化酶活性，毒蕈碱型受体可能也通过PKA介导的机制参与Akt/Gsk-3β和Erk激酶的功能调控。最后，已经证明，刺激毒蕈碱型受体能够通过激活AMPK短暂地引起Akt的去磷酸化，从而降低β-连环蛋白的细胞内储量(Batty等，2004；King等，2006)。

因此，其他毒蕈碱型受体激动剂也可以使用，例如：西维美林(CAS编号107233-08-9)、卡巴胆碱(CAS编号51-83-2)、乙酰甲胆碱(CAS编号55-92-5)和氯贝胆碱(CAS编号674-38-4)。

甲巯咪唑：1-甲基-3H-咪唑-2-硫酮

甲巯咪唑通过阻断甲状腺过氧化物酶活性抑制新的甲状腺激素的产生，所述甲状腺过氧化物酶将碘化物转变成碘并催化得到的碘分子掺入到酪氨酸的苯酚环上。因此，甲巯咪唑能够有效降低甲状腺激素受体的转录活性。此外，已报道甲巯咪唑通过弱化前列腺素H合酶活性抑制前列腺素生产(Zelman等，1984)。前列腺素通过它们的同源GPCR受体，能够进一步增加Akt信号传导途径的活性，促进髓磷脂相关蛋白的表达(Ogata等，2004；Castellone等，2006)。因此，既抑制甲状腺激素合成又影响前列腺素生产或信号传导的化合物，对于在本发明中的使用来说是特别有利的。

其他作用方式与甲巯咪唑相关的化合物是卡比马唑(甲巯咪唑的前药-CAS编号22232-54-8)和丙硫氧嘧啶(CAS编号51-52-5)以及胺碘酮(CAS编号1951-25-3)。

正如在实施例中所公开的，化合物甲巯咪唑和毛果芸香碱执行组合作用，引起抗CMT的疗效增加，允许降低有效治疗剂量并减小继发效应。

本发明的具体组合是用于治疗CMT或相关病症、特别是CMT1A的组合疗法，其中所述组合疗法包含甲巯咪唑和毛果芸香碱化合物，以及至少第三种能够增加该组合的活性的化合物。

本发明的另一个具体实施方案是用于治疗ALS的组合疗法，其中所述组合疗法包含甲巯咪唑和毛果芸香碱化合物，以及至少第三种能够增加该组合的活性的化合物。

本发明的另一个具体实施方案是用于治疗中毒性神经病变的组合疗法，其中所述组合疗法包含甲巯咪唑和毛果芸香碱化合物，以及至少第三种能够增加该组合的活性的化合物。

本发明的具体实施方案是用于治疗CMT或相关病症的疗法，其中单独使用化合物甲巯咪唑和毛果芸香碱。

本发明的另一个具体实施方案是用于治疗CMT或相关病症的消费，其中将甲巯咪唑和/或毛果芸香碱与至少一种附加活性化合物组合使用。在优选实施方案中，所述至少一种附加化合物选自表1中列出的化合物。

本发明的另一个具体实施方案是包含表1中所公开的任何药物组合的产品或组合物。

本发明的另一个具体实施方案是用于治疗CMT或相关病症的组合疗法，其包含表1中所公开的任何药物组合。

本发明的另一个具体实施方案是用于治疗ALS的组合疗法，其包含表1中所公开的任何药物组合。

本发明的另一个具体实施方案是用于治疗中毒性神经病变的组合疗法，其包含表1中所公开的任何药物组合。

本发明的疗法作为药物组合执行，任选地与任何其他疗法结合。它可以在家、医生办公室、诊所、医院的门诊部或医院提供，以便医生能够密切观察该疗法的效果并做出任何需要的调整。

治疗的时间长度取决于疾病的阶段、患者的年龄和状况以及患者对治疗的反应如何。

此外，具有发生其他神经病病症的较高风险的人(例如遗传易感或患有例如糖尿病或正进行肿瘤病症等的治疗的人)可以接受预防性治疗，以减轻或延迟最终的神经病变反应。

所述组合的每种组分的给药剂量、频率和方式可以独立进行控制。例如，一种药物可以口服给药，而第二种药物可以肌肉内给药。组合疗法可以以包含休息期的断续周期的方式提供，以便患者的身体有机会从任何还未预见到的副作用中恢复。药物也可以配制在一起，以便一次给药投送两种药物。

药物组合物的配制

所述组合的每种药物的给药可以通过任何适合的方式进行，使得在到达外周神经后，与其他组分组合的药物的浓度能够校正PMP22表达升高所带来的效应。

尽管所述组合的活性成分可以作为纯的化学物质给药，但优选情况下将它们作为药物组合物的形式来提供，在本文中也称为药物制剂。可能的组合物包括适用于口服、直肠、局部(包括透皮、颊和舌下)或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内和真皮内)给药的组合物。

更通常情况下，这些药物制剂以“患者包”的形式开给患者，所述患者包在单一包装、通常为泡罩包装中含有定量投配单位或其他在不同治疗期间使用的用于给药计量单位剂量的手段。患者包与药剂师从散料供应中分出患者的药物供应的传统处方相比，前者的优势在于，患者总是能够得到患者包中包含的包装说明书，而这在传统处方中一般是缺失的。已经显示，包含包装说明书增加了患者对医生指导的顺从性。因此，本发明还包括本文前述的药物制剂，其与适合于所述制剂的包装材料组合。在这样的患者包中，用于组合治疗的制剂的预期使用方法，可以从说明书、器具、供应品、适应症和/或用于帮助制剂最适合地用于治疗的其他手段推断出来。这样的措施使患者包特别适合于和适用于使用本发明的组合进行治疗。

药物可以以任何适合的量被包含在任何适合的载体物质中，并且可以以组合物总重量的1-99重量％的量存在。组合物可以提供在适合于经口、肠胃外(例如静脉内、肌肉内)、直肠、皮肤、鼻、阴道、吸入、皮肤(贴片)或眼给药途径的剂型中。因此，组合物可以采用例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、包括水凝胶在内的凝胶剂、糊剂、膏剂、霜剂、膏药、灌药、渗透投送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入物、喷剂或气雾剂的形式。

药物组合物可以按照常规药物实践进行配制(参见例如《雷明顿药物科学与实践》(第20版)(Remington：The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.))，A.R.Gennaro主编，Lippincott Williams & Wilkins，2000和《制药技术百科全书》(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)，J.Swarbrick和J.C.Boylan主编，1988-1999，Marcel Dekker，New York)。

本发明的药物组合物可以配制成在给药后基本上立即地或在给药后任何预定的时间或时段内释放活性药物。

受控释放制剂包括(i)在较长时期内在体内产生基本上恒定的药物浓度的制剂；(ii)在预定延迟时间后在较长时期内在体内产生基本上恒定的药物浓度的制剂；(iii)通过在体内维持相对恒定、有效的药物水平同时使得与活性药物的血浆水平波动相关的不想要的副作用最小化，在预定时段内维持药物作用的制剂；(iv)通过例如将受控释放组合物在空间上放置在患病组织或器官附近或其中，使药物作用局部化的制剂；以及(v)通过使用将药物投送到特定靶细胞类型的载体或化学衍生物进行定向药物作用的制剂。

采用受控释放制剂形式的药物的给药，在药物单独或组合地具有下述特征的情况下是特别优选的：(i)狭窄的治疗指数(即产生有害副作用或毒性反应的血浆浓度与产生疗效的血浆浓度之间的差值小；一般来说，治疗指数TI被定义为中值致死剂量(LD50)与中值有效剂量(ED50)的比率)；(ii)在胃肠道中狭窄的吸收窗口；或(iii)非常短的半衰期，使得为了将血浆水平维持在治疗水平需要在一天中频繁用药。

可以采取许多策略中的任一种来获得受控释放，其中所研究的药物的释放速率超过其代谢速率。受控释放可以通过适当选择各种配制参数和成分、包括例如各种类型的受控释放组合物和涂层来获得。因此，使用适合的赋形剂将药物配制成药物组合物，其在给药后以受控的方式释放药物(单一或多个单位的片剂或胶囊组合物、油溶液、混悬剂、乳剂、微胶囊、微球、纳粒、贴片和脂质体)。

用于经口使用的固体剂型

用于经口使用的剂型在与无毒的可药用赋形剂的混合物中包含活性成分的片剂。这些赋形剂可以是例如惰性的稀释剂或填充剂(例如蔗糖、微晶纤维素、包括马铃薯淀粉在内的淀粉、碳酸钙、氯化钠、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；造粒剂和崩解剂(例如包括微晶纤维素在内的纤维素衍生物、包括马铃薯淀粉在内的淀粉、交联羧甲基纤维素钠、藻酸盐或藻酸)；粘合剂(例如阿拉伯树胶、藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；和润滑剂、助流剂和抗粘附剂(例如硬脂酸、二氧化硅或滑石粉)。其他可药用赋形剂可以是着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂等。

片剂可以是未包衣的，或它们可以通过已知技术被包衣，以任选地延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在较长时段内提供持续作用。包衣可以适合于以预定样式释放活性药物(例如以便获得受控释放制剂)，或者它可以适用于直到通过胃之后才释放活性药物(肠溶包衣)。包衣可以是糖包衣、薄膜包衣(例如基于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸类共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)、或肠溶包衣(例如基于甲基丙烯酸共聚物、乙酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、虫胶和/或乙基纤维素)。可以使用延时材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

固体片剂组合物可以包括包衣，其适用于保护组合物免于不想要的化学变化(例如在活性药物释放前的化学降解)。包衣可以以与《制药技术百科全书》(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)中描述的相似的方式被施加到固体剂型上。

在片剂中，两种药物可以混合在一起，也可以分区。例如，第一种药物包含在片剂内部，第二种药物在外部，使得大部分第二种药物在第一种药物释放之前释放。

用于经口使用的制剂也可以作为可咀嚼片剂的形式被提供，或作为其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如马铃薯淀粉、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合的硬质明胶胶囊的形式被提供，或作为其中活性成分与水介质或油介质例如液体石蜡或橄榄油混合的软质明胶胶囊的形式被提供。粉剂和颗粒剂可以使用在上面所述的片剂和胶囊一节中所提到的成分以常规方式制备。

用于经口使用的受控释放组合物可以被构建成例如通过控制活性药物的溶出和/或扩散来释放活性药物。

溶出或扩散受控释放可以通过药物的片剂、胶囊、丸粒或颗粒剂制剂的适合包衣，或通过将药物掺入到适合的基质中来实现。受控释放包衣可以包括一种或多种上面提到的包衣物质，和/或，例如虫胶、蜂蜡、glycowax、蓖麻油、巴西棕榈蜡、硬脂醇、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯、乙基纤维素、丙烯酸树脂、dl-聚乳酸、乙酸丁酸纤维素、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-羟基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝胶、1，3-丁二醇、甲基丙烯酸乙二醇酯和/或聚乙二醇。在受控释放基质制剂中，基质材料也可以包括例如水合甲基纤维素、巴西棕榈蜡和硬质醇、卡巴浦尔934(carbopol 934)、硅树脂、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯和/或卤代氟烃。

含有一种或多种请求保护的组合的受控释放组合物，也可以采用漂浮片剂或胶囊的形式(即在口服给药后，在胃内容物顶部漂浮一段时间的片剂或胶囊)。药物的漂浮片剂制剂可以通过将药物与赋形剂和20-75％w/w的水凝胶例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素的混合物造粒来制备。然后可以将获得的颗粒压制成片剂。在与胃液接触后，片剂在其表面周围形成基本上不透水的凝胶阻挡层。这种凝胶阻挡层参与维持密度小于1，从而允许片剂保持漂浮在胃液中。

用于经口给药的液体

适合于通过添加水制备水性混悬剂的粉剂、可分散粉剂或颗粒剂，是用于经口给药的方便剂型。作为混悬剂的制剂提供了活性成分与分散或润湿剂、助悬剂和一种或多种防腐剂的混合物。适合的助悬剂是例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、藻酸钠等。

肠胃外组合物

药物组合物也可以通过注射、输注或植入(静脉内、肌肉内、皮下等)，以剂型、制剂或通过适合的投送装置或含有常规的无毒的可药用载体和佐剂的植入物的形式进行肠胃外给药。这样的组合物的配制和制备对于药物制剂领域的专业人员来说是众所周知的。

用于肠胃外使用的组合物可以作为单位剂型(例如在单剂安瓿中)形式被提供，或作为含有几份剂量的小管并且其中可以添加适合的防腐剂(参见下文)的形式被提供。组合物可以采取溶液剂、混悬剂、乳剂、输注装置或用于植入的投送装置的形式，或者它可以作为干粉存在，在使用前用水或其他适合的介质进行重构。除了活性药物之外，组合物可以包含适合的肠胃外可接受的载体和/或赋形剂。活性药物可被掺入到微球、微胶囊、纳粒、脂质体等中，用于受控释放。组合物可以包含助悬剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂和/或分散剂。

本发明的药物组合物可以采取适合于无菌注射的形式。为了制备这样的组合物，将适合的活性药物溶解或悬浮在肠胃外可接受的液体介质中。在可以使用的可接受的介质和溶剂中包括水、通过加入适量的盐酸、氢氧化钠或适合的缓冲液调整到适合pH的水、1，3-丁二醇、林格溶液和等渗氯化钠溶液。水性制剂也可以包含一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸的甲酯、乙酯或正丙酯)。在其中药物之一仅仅少量或微溶于水的情况下，可以加入溶解增强剂或增溶剂，或者所述溶剂可以包含10-60％w/w的丙二醇等。

受控释放肠胃外组合物可以采取水性混悬剂、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液、油混悬剂或乳剂的形式。可替选地，活性药物可被掺入到生物相容性的载体、脂质体、纳粒、植入物或输注装置中。用于制备微球和/或微胶囊的原料是例如可生物降解/可生物腐蚀的聚合物，例如聚催乳素、聚(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟基乙基-L-谷氨酰胺)。在配制受控释放肠胃外制剂时可以使用的生物相容载体是糖类(例如葡聚糖)、蛋白(例如白蛋白)、脂蛋白或抗体。用于植入物的原料可以是不可生物降解的(例如聚二甲基硅氧烷)或可生物降解的(例如聚己内酯、聚乙醇酸或聚原酸酯)。

直肠组合物

对于直肠应用来说，适用于组合物的剂型包括栓剂(乳剂或混悬剂类型)和直肠明胶胶囊(溶液剂或混悬剂)。在典型的栓剂制剂中，活性药物与适合的可药用栓剂基质组合，例如可可脂、酯化的脂肪酸、甘油化的明胶以及各种水溶性或水可分散的基质例如聚乙二醇。可以掺入各种添加剂、增强剂或表面活性剂。

经皮和局部组合物

药物组合物也可以在含有常规的无毒性可药用载体和赋形剂、包括微球和脂质体的剂型或制剂中，局部给药于皮肤上，用于经皮吸收。制剂包括霜剂、膏剂、洗剂、搽剂、凝胶剂、水凝胶、溶液剂、混悬剂、棒剂、喷剂、糊剂、膏药和其他类型的经皮药物投送系统。可药用的载体或赋形剂可以包括乳化剂、抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、保湿剂、渗透增强剂、螯合剂、成胶剂、软膏基质、香料和皮肤保护剂。

乳化剂可以是天然存在的树胶(例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶)。

防腐剂、保湿剂、渗透增强剂可以是对羟苯甲酸酯类例如对羟基苯甲酸的甲酯或丙酯，以及苯扎氯铵、甘油、丙二醇、脲等。

上面描述的用于局部给药于皮肤上的药物组合物，也可以用于局部给药在身体待治疗部分上或其附近的情况中。组合物可以适用于直接施用或利用特制的药物投送装置施用，例如敷料或可替选的石膏、衬垫、海绵、条板或其他适合的柔性材料形式。

治疗的剂量和持续时间

应该理解，组合的药物可以在相同或不同的药物制剂中同时或顺序给药。在优选实施方案中，药物被一起配制在相同的赋形剂或载体中。如果进行顺序给药，在给药第二种(或附加)活性成分时的延迟不应该导致活性成分组合的有效效果的益处的丧失。本发明的组合的最低要求是，该组合应该计划用于组合使用活性成分的组合的有效效果的益处。该组合的所计划的使用，可以通过器具、供应物、适应症和/或用于帮助使用本发明的组合的其他手段推断出来。

作为本发明的主题的治疗有效量的两种或多种药物可以一起用于制备药物，所述药物可用于减轻PMP22基因表达增加引起的效应，防止或降低发生CMT1A疾病的风险，在CMT1A疾病变得临床明显后终止或减慢其进展，以及阻止或降低神经病变事件的首次或后继发作的风险。

尽管本发明的活性药物可以以分剂量给药，例如每日2到3次，但所述组合中的每种药物的单一单日剂量是优选的，在单一药物组合物中所有药物的单一单日剂量(单位剂型)是最优选的。

给药可以是每日一次到几次，持续几日到几年，甚至可以持续患者的一生。在大多数情况下指示长期或至少周期性重复的长期给药。

●术语“单位剂型”是指适合作为人类对象的单一剂量的物理离散的单位(例如胶囊、片剂或装药的注射器筒)，每个单位包含根据计算能够产生所需疗效的预定量的活性物质或多种活性物质以及所需的药物载体。

优选用于单位剂型的组合中每种药物的量取决于几种因素，包括给药方法、患者的体重和年龄、由CMT1A疾病引起的神经病变损伤的严重性、或考虑到待治疗对象的总体健康状态后可能的副作用的风险。

此外，关于特定患者的药物基因组学(基因型对药物动力学、药效学或治疗的效能情况的影响)信息可以影响使用的剂量。

除了当对应于特别受损的CMT疾病病例时可能需要较高剂量、或当治疗儿童时应该选择较低剂量之外，组合中每种药物的优选剂量通常将在不高于长期维持性治疗所通常开出的或在大型3期临床研究中被证明是安全的剂量范围内。

例如

●经口给药甲巯咪唑从每天约0.5到约15mg。如果局部给药，将选择特殊的剂量。

●经口给药毛果芸香碱从每天约0.1到约20mg。

最优选的剂量将对应于通常为长期维持性治疗所开出的量的1％到最高10％的量。

应该理解，实际给药的药物的量将由医生根据相关的情况确定，所述情况包括待治疗的病况或多种病况、所给药的具体组合物、个体患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重性以及所选的给药路线。因此，上述剂量范围只是打算为本文中的讲授提供一般性指导和支持，而不是打算限制本发明的范围。

治疗计划、给药剂量和途径

下面描述药物组合(其给药途径不同)在人类中的剂量。

甲巯咪唑和毛果芸香碱

1-作为单一药物组合物经口给药：每日经口给药约0.5到约15mg甲巯咪唑和约0.1到约20mg毛果芸香碱，给药历时数月，组合物中两种药物的最优选剂量在每单位(每天)0.6到35mg的范围内。

2-相伴经口给药历时数月：每日经口给药约0.1到约15mg甲巯咪唑和约0.02到约20mg毛果芸香碱，给药历时数月，组合物中两种药物的最优选剂量在每单位(每天)1.02到35mg的范围内。

3-相伴给药历时数月：每日经口给药约0.05到约15mg甲巯咪唑和约0.01到约20mg毛果芸香碱，给药历时数月，组合物中两种药物的最优选剂量在每单位(每天)0.06到35mg的范围内。

在本发明公开的组合中，任何组合中该药物的剂量，在提议用于男性或女性治疗的制剂中可以不同。

本发明的其他方面和优点将公开在下面的实验部分中，其应该仅仅被视为说明性的。

实施例

I.体外实验

商业化的大鼠原代施旺细胞

将大鼠施旺细胞(SC)初级培养物(Sciencell#R1700)玻璃小瓶解冻，并以10,000个细胞/平方厘米的密度接种在装有“Sciencell施旺细胞培养基”(来自Sciencell#R1701的基础培养基)并用聚L-赖氨酸预包被的75cm²培养瓶中。所述培养基包含基础培养基、5％胎牛血清(3H-Biomedical AB#1701-0025)、1％施旺细胞生长增补剂(3HBiomedical AB#1701-1752)、1％庆大霉素(Sigma#G1397)和10μM毛喉素(Sigma#F6886)，以促进它们的增殖。

在达到合生后(4到10天，取决于细胞批次)，通过轻柔搅拌或通过thy1.1免疫淘选以使SC与粘附性成纤维细胞分离来纯化施旺细胞，以产生至少95％纯的培养物。然后对SC进行计数(锥虫蓝方法)，并接种在装有相同SC培养基并用聚-L赖氨酸预包被的75cm²培养瓶中。在合生时，将细胞漂洗，用胰蛋白酶处理(从Invitrogen#1540054稀释的1x胰蛋白酶-EDTA，在不含钙和镁的PBS中稀释)，计数，并铺在12孔碟中(140 000个细胞/孔)，该碟中装有含有5％FBS、1％细胞生长增补剂(CGS)、40μg/ml庆大霉素和4μM毛喉素的Sciencell施旺细胞培养基。

定制的大鼠原代施旺细胞

原代施旺细胞培养物(SC)从Sprague-Dawley新生大鼠(P0到P2之间)坐骨神经建立。将所有新生大鼠处死并在皮氏培养血上分离。解剖在无菌条件下进行。

从后爪和躯干下部取下背部皮肤。分离出坐骨神经并转移到培养皿中，该培养皿含有用冰冷却的Leibovitz(L15，Invitogen#11415)，其中添加有1％青霉素/链霉素溶液(分别为50UI/ml和50μg/ml；Invitrogen#15070)和1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma A6003)。将每只大鼠的两根神经都转移到含有用冰冷却的L15的15ml试管中。然后除去L15培养基，并用2.4ml含有10mg/ml胶原酶(Sigma#A6003)的DMEM(Invitrogen#21969035)代替。将神经在该培养基中在37℃下温育30分钟。然后除去培养基，将两根神经用在不含钙和镁的PBS(Invitrogen#2007-03)中稀释的胰蛋白酶(10％胰蛋白酶EDTA 10x，Invitrogen#15400054)，在37℃下解离20分钟。通过添加含有II级DNase I(0.1mg/mlRoche diagnostic#104159)和胎牛血清(FCS 10％，Invitrogen#10270)的DMEM终止反应。使用10ml移液管将细胞悬液捣碎，并将其过滤到50ml管中(Swinnex 13mm过滤装置，Millipore，带有20μm尼龙筛网滤膜，Fisher)。将细胞悬液在室温(RT)下以350g离心10分钟，并将沉淀悬浮在含有10％FCS和1％青霉素/链霉素的DMEM中。对细胞计数(锥虫蓝方法)，并以5.10⁵到10⁶个细胞/板的密度接种在Falcon 100mmPrimaria组织培养板中。

在培养1天后，将培养基替换成含有10％FCS、1％青霉素/链霉素和10μM胞嘧啶β-D-呋喃阿拉伯糖苷(Sigma#C1768)的DMEM。48小时后，除去培养基，并将细胞用DMEM洗涤三次。然后加入SC生长培养基，其由DMEM、10％FCS、1％青霉素/链霉素、2μM毛喉素(Sigma#F6886)、10μg/ml牛垂体提取物(PEX，Invitrogen#13028)构成。每2-3天更换培养基。

在培养8天(4到10天，取决于细胞批次)后，施旺细胞达到合生，将含有大量污染性成纤维细胞的培养物通过thy1.1免疫淘洗方法进行纯化。在纯化后，将细胞悬浮以10,000个细胞/平方厘米的密度悬浮在用聚-L-赖氨酸预包被的75cm²培养瓶中的生长培养基中。在细胞达到合生后，将其漂洗，用胰蛋白酶(胰蛋白酶-EDTA)处理，计数并铺板于12孔板中(100,000个细胞/孔)。

药物温育：

在将细胞铺板于12孔板中后，将培养基更换为确定培养基，其包含DMEM-F12混合物(Invitrogen#21331020)，其中添加有1％的N2增补剂(Invitrogen#17502)、1％L-谷氨酰胺(Invitrogen#25030024)、2.5％FBS(Sciencell#0025)、0.02μg/ml肾上腺酮(Sigma#C2505)、4μM毛喉素和50μg/ml庆大霉素。没有向该培养基添加生长因子，以促进SC分化。

24小时后，将培养基更换成确定培养基(DMEM-F12)，其中补充有1％胰岛素-转铁蛋白-硒-X(ITS，Invitrogen#51300)、16μg/ml腐胺(Sigma#P5780)、0.02μg/ml肾上腺酮和50μg/ml庆大霉素。在该步骤中，在培养基中不存在孕酮或毛喉素。

一天后，将原代施旺细胞用药物刺激24小时(3个孔/条件)。每种化合物在添加到细胞培养基中之前是新制备的。

在原代施旺细胞中测试的毛果芸香碱(SIGMA)在10μM到10nM浓度范围内，而甲巯咪唑(SIGMA)的测试范围为10μM、1μM、100nM和10nM。

将药物添加到确定培养基中，其由DMEM-F12构成，并含有1％胰岛素-转铁蛋白-硒-X(ITS，Invitrogen#51300)、16μg/ml腐胺、0.02μg/ml肾上腺酮、10nM孕酮和50μg/ml庆大霉素。在药物刺激之前和期间不存在毛喉素，避免了腺苷酸环化酶饱和。

培养的神经鞘瘤细胞

将大鼠神经鞘瘤RT4-D6-P2T细胞系(ATCC#CRL-2468^TM)在DMEM(ATCC#30-2002)和10％FCS(invitrogen#10106)中解冻。将细胞维持在加湿培养箱中，在37℃和空气(95％)-CO₂(5％)气氛环境下。在第4次传代时，将细胞在37℃下用胰蛋白酶处理5到15分钟(+1ml的胰蛋白酶-EDTA，0.25％-0.53mM；Invitrogen)进行解离。通过添加含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM终止反应。将孔在Neubauer细胞仪中使用锥虫蓝排除试验(Sigma)进行计数。使用10ml移液管将悬液捣碎，然后将细胞在室温下以350xg离心10分钟。将解离细胞的沉淀重新悬浮，并以30,000个细胞/毫升的密度接种在12孔板中。48小时后，将培养基替换成不含血清的培养基(DMEM)。15小时后，通过向细胞培养基加入选定浓度的药物，对RT4-D6P2T孔进行刺激。每种单独药物或药物组合在添加到细胞培养基中之前新鲜制备。

定量反转录酶聚合酶链反应(Q-RT-PCR)

使用定量RT-PCR来比较药物刺激后PMP22mRNA相对于RT4-D6P2T细胞系中看家的RPS9 mRNA的水平。

在药物刺激8小时后，将细胞用冷的经灭菌的PBS漂洗，使用Qiagen RNeasy微量试剂盒(Qiagen#74004)从SC提取并纯化来自每个细胞样品的总RNA。使用1μl RNA样品通过Nanodrop分光光度计对核酸进行定量。RNA完整性通过BioAnalyzer(Agilent)装置确定。

按照标准流程将RNA反转录成cDNA。用于PCR扩增的cDNA模板从100ng总RNA合成，使用SuperScript II反转录酶(Invitrogen#18064-014)在存在oligo(dT)的情况下在42℃反应60分钟，终体积为20μl。

使用《LightCycler

480》系统(Roche Molecular Systems Inc.)对cDNA进行PCR扩增。在用于PCR扩增之前，将每种cDNA稀释5倍。将2μl该cDNA加入到含有5μl Master混合物试剂盒(Roche#04-887301001)的PCR反应溶液中，终体积为10μl。进行预备试验以确保在两种序列扩增过程的指数期中进行定量，并确保靶和看家基因之间的反应效率相似。

使用Taqman化学进行RT-Q-PCR分析。通过使用500nM每种引物(F和R)以及200nM来自Sigma-Aldrich的探针Taq1扩增大鼠PMP22(NM_017037)，来进行PCR反应。

使用下列PCR条件：在95℃下变性5分钟，然后在95℃下10秒、60℃下40秒和72℃下10秒以及40℃下1分钟(40个扩增循环)。按照Ct方法比较从靶基因PMP22产生的产物的量，来计算PMP22基因表达的相对水平，并通过流式细胞术(FACS)进行PMP22表达分析。在药物温育后8小时、24小时和48小时，回收初级大鼠施旺细胞的上清液，离心并冷冻。将SC用胰蛋白酶-EDTA解离。一旦大部分细胞进入悬液，使用含有10％FCS的DMEM将胰蛋白酶中和。

回收含有细胞的上清液并离心。将细胞沉淀转移到微量管中，在PBS中洗涤一次，并用特异性溶液(AbCys #Reagent A BUF09B)固定。10分钟后，将细胞用PBS漂洗一次并保持在4℃下。

在细胞固定5天后，使用下列方案对具有不同温育时间的所有细胞制备物进行标记。

将细胞以7000rpm离心5分钟，将沉淀悬浮在通透化溶液(AbCys#Reagent B BUF09B)中，并用第一PMP22抗体(Abeam#ab61220，1/50)在室温下标记1小时。然后将细胞以7000rpm离心5分钟，并将细胞沉淀在PBS中漂洗一次。加入与Alexa Fluor 488偶联的第二抗体(山羊抗兔IgG抗体，Molecular Probes #A11008，1/100)，在室温下一小时。然后将细胞以7000rpm离心5分钟，并将细胞沉淀在PBS中漂洗一次。加入与Alexa Fluor 488偶联的第三抗体(鸡抗山羊IgG抗体，Molecular Probes #A21467，1/100)，在室温下温育1小时以增加标记。然后将细胞在PBS中漂洗一次。进行了不含任何抗体的对照(未标记细胞)以确定自身荧光水平并调整光电倍增管的灵敏度。进行了使用第二和第三抗体两者但是没有使用第一抗体的对照，以评估抗体的非特异性结合。

数据获取和分析使用FACS阵列细胞仪和FACS阵列软件(Becton Dickinson)在5000个细胞上进行。分析了与细胞体积(尺寸)相关的前向散射(FSC)和取决于细胞内部复杂性(粒度)的侧向散射(SSC)。对于PMP22的表达来说，在全部细胞中进行分析，并计算阳性细胞的百分率。阳性细胞是荧光强度高于带有第二抗体的对照的细胞。

为了对SC数量进行定量，使用抗S100蛋白抗体分析了对照培养基中的细胞。

细胞按照下列流程制备：将施旺细胞用抗S100蛋白抗体(Dako#S0311，1/100)在室温下染色1小时。该抗体按照上述用于PMP22免疫染色的流程进行标记，但是不与第三抗体温育。

结果

我们观察到在原代施旺细胞中，PMP22 mRNA水平(图1)显著降低，并且1μM剂量的毛果芸香碱诱导了最重要的PMP22下调。^*：p＜0.05；^***：p＜0.001；与对照显著差异(配对student t检验)。在右图，在暴露于毛果芸香碱24小时后，在原代施旺细胞中PMP22 mRNA的表达水平显著下调，即使是在低剂量下(10nM和50nM)。同样地，我们观察到在温育24小时后，毛果芸香碱(1μM)使原代施旺细胞中PMP22蛋白的表达水平显著降低了38％。这种效应在温育48小时后仍然明显(-18％，p＜0.001)。

在另一个实验中，将药物(表1中所列的)与大鼠神经鞘瘤细胞系温育8小时，并通过RT-Q-PCR对PMP22 mRNA表达水平进行定量。

本发明人观察到(图2)，尽管作为单独药物使用的甲巯咪唑(0.1nm)和毛果芸香碱(0.001nm)对PMP22 mRNA表达水平没有发挥显著活性，但这种表达水平被它们的组合显著降低。这两种药物的协同活性显示在图2中。这些数据证明，在所选浓度下，毛果芸香碱和甲巯咪唑的组合能够在培养的神经鞘瘤细胞中显著下调PMP22基因的表达，而在较高浓度下在原代施旺细胞中有活性的毛果芸香碱和甲巯咪唑不能在本系统中降低该基因的表达水平。

II.在CMT动物模型中的体内试验

本发明人已测试了化合物和组合在CMT转基因大鼠模型中的治疗效果，该大鼠是带有三个附加的小鼠PMP22基因拷贝的半合的PMP22转基因大鼠，在外周和脑神经中显示出脱髓鞘征兆(Sereda等，1996；Grandis等，2004)。在mRNA水平上，在CMT大鼠中平均1.6倍的PMP22过表达与临床表型相关。使野生型基因转变成疾病基因的PMP22过表达水平的推测的阈值，代表了旨在降低PMP22基因表达的疗法所达到的明显的“靶”。

从临床观点来说，该CMT大鼠模型是人类CMT1A疾病的良好近似。成年CMT大鼠显示出与CMT1A患者相似的运动神经传导速度的减慢，即低于50％。在坐骨神经刺激后，复合肌肉动作电位显示出幅度降低和去同步。这种组织学和电生理变化出现在运动受损的明显临床征兆之前(Sereda等，1996，2003)。通过组织学显著的肌肉萎缩症所证实的轴突丧失，与人类CMT1A症状相符。

CMT大鼠已用做实验性CMT1A疗法的模型(Meyer zu

等，2007)。在该CMT1A疾病的模型中，病理的外显和隐藏征兆(运动缺损、特别是电生理和组织特征的改变以及最终PMP22的过表达水平)，似乎与在CMT1A患者中发现的最为接近。

本发明人在大鼠模型中测试了化合物和组合的治疗效果。实验组由两种性别的幼年大鼠分别构成。大鼠按照根据体重的随机化计划表被指派到不同组中。在某些实验中，随机化是基于大鼠在条试验中的表现。两种性别由数量与处理组相等或更大的单独的对照同窝大鼠组代表。

取决于每种药物的生物利用度，在3或6周内，使用药物强制喂食或通过用Alzet渗透皮下泵(DURECT Corporation Cupertino，CA)进行注射，对大鼠进行长期处理。

每周两次对动物称重，以便根据增加的体重来调整剂量。如果选择渗透泵用于治疗给药，药物剂量根据在泵送持续时间内(6周)根据年龄所预计的动物的估计平均体重进行计算。如果需要，使用适合的麻醉方案重新植入泵。

行为试验

每三或四周对动物进行行为测试。每次试验由同一个研究人员在同一个房间并在一天的同一时间进行；在整个实验期间维持这种均一性。所有处理和基因型确定对于研究人员来说是未知的。主要使用“条实验”和“抓握强度”来评估研究过程中的行为。随着动物的生长，条实验的程序可以改变(以避免由于例如学习产生的偏差)。

抓握强度的测定允许对似乎由肌肉力量、灵敏性状态(例如，疼痛触感可能改变测量到的力量值)、行为构成(“动因”)构成的抓握表现的微妙差别进行检测。前肢与后肢之间的值存在差异，并主要取决于动物的年龄。

抓握强度试验测量动物分别用其前爪或后爪保持在握杆上的强度。将测力计与握杆放置在一起以测量强度(测力计FG-5000A)。大鼠由实验者握住，使其用前爪或用后爪握住握杆，并将大鼠轻轻向后拉，直到它释放握杆。记录动物释放握杆时测量到的力。

对每只动物进行两次连续的测量前爪的试验和两次连续的测量后爪的实验，只标注最大值(一个前爪的和一个后爪的)(单位为N)。

条实验

条试验评估大鼠握住固定杆的能力。显示出肌肉虚弱的Pmp22大鼠在该试验中表现出表现缺陷(Sereda等，1996)。将大鼠的四爪放置在杆(直径：2.5cm，长度：50cm；在桌面上方30cm)的中间。试验连续进行；在我们的实验中，试验的数(5或10次)和持续时间(30或60秒)取决于动物的批次。在测试中引入这种变化性是为了确定适合于在实验过程中最好地检测CMT大鼠中运动缺陷的程序。

在每次实验时段后记录表现指标：

-为了在杆上保持60秒或30秒所需的试验次数。

-在每次试验中在条上花费的平均时间(即跌落等待时间)以及实验时段中的平均值。在实验过程中，在大鼠已经两次在条上保持截止时间、即30秒或60秒后，实验时段结束。没有完成试验时，将表现指派为截止时间(30秒或60秒)。

-跌落的次数。

总体健康评估

在实验过程中监测动物的体重、外显征兆(皮毛外观、身体姿势、震颤)。使用计分标度进行记录：0＝正常，1＝不正常。

步态

将每只大鼠在不含杂物的新的鼠笼(尺寸55×33×18cm)中观察5分钟。大鼠的步态使用4个参数进行评估：

-0分：正常步态(流畅)

-1分：异常步态(不流畅或大鼠轻微跛行)

-2分：中度失能(大鼠拖着一条腿，并能弥补它并行走)

-3分：严重失能(大鼠拖着其一只或两只后爪，但是不能弥补它/它们)。

斜面试验

滑动装置具有30×50cm有机玻璃平面，其可以以0°(水平)到60°的角度倾斜。将每只大鼠在开始时以头在上的位置(头朝上的方向)放置在25°角倾斜的平面上；进行两次试验，间隔1分钟。30分钟后，在30°角倾斜的平面上进行同样的实验，然后在35°角倾斜的平面上进行。在此期间将大鼠放回笼子。在每次试验后清理平面。

大鼠的表现通过4个不同分值进行评估：

-0分：不滑落

-1分：轻微滑落(一只或两只爪)

-2分：中度滑落(4只爪)，但是没有到达平面底端

-3分：大鼠滑落到平面最底端。

电生理学

在适合时，对大鼠进行电生理评估：测量了敏感性神经传导速度以及等待时间和电位幅度。

NCV测量和电位获取(皮下)在由放大器(AM系统1700和/或EMG-UTC)、刺激器(Havard装置223)和装备有获取卡和用于获取(SPATOL)和信号处理(CALVISE)的软件的计算机构成的测链的帮助下进行。

使用氯胺酮/赛拉嗪将动物麻醉，并在整个试验期间维持在37℃的恒温板上(在需要时补加麻醉剂)。将刺激银针电极插入尾的近端部分。将记录电极在尾的远端皮下插入，穿过约1mm皮肤(距离刺激电极4到6cm)。以每秒0.3的频率施加持续时间为0.2秒的恒流方波刺激。放大5.000-20.000倍的响应，在基于计算机的数据获取系统上观察和收集。在每个波开始时测量等待时间(被定义为第一个可以清楚辨别的与基线的偏离)。计算最大偏离的峰与峰之间的振幅，以确定最高振幅。对于每次记录来说，进行对至少十次相同刺激的平均响应的计算。

通过用刺激阴极之间的距离除以从两个刺激位点获得的响应等待时间之间的差，计算与感觉相关的传导速度(SNCV)。

组织学测量

在最后一次测试后(处理持续到最后一天)，对大鼠实施安乐死。切下野生型和转基因大鼠的后足，通过在4％甲醛溶液中浸泡48小时并转移到10％甲醛溶液中继续浸泡2天进行固定。在水中漂洗15分钟后，将它们进行脱钙处理26小时(Labonord Décalcifiant rapide n°3#DC3_09128300)。

然后将足横剖成两片，进行锇着色处理。

将组织在1％四氧化锇溶液(VWR，锇VIII氧化物，0.5g#20551.076)上方悬挂24小时，然后用去矿物质水漂洗4到6小时。然后将组织在包埋中自动脱水(VIP2000 Vertical，Bayer Diagnostics)，并在石蜡中常规包埋。

将4μm的组织切片相继在二甲苯和醇浴中脱水并固定(Pertex胶，#T/00811_MICROM)，用于进一步分析。

图像分析

仔细选择来自6只动物的切片以显示同样的解剖水平(趾连接处)，并在与Saisam microvision软件(Microvision Instruments公司的Archimed Pro

1997-2000)连接的Olympus显微镜下进行分析。外周神经如下进行定位和分析：对圆形有髓纤维进行计数(在神经束中至少150个纤维/动物)。测定对应于有髓纤维内周长的轴突直径和同样纤维的外周长。然后，我们比较了野生型和转基因大鼠中髓鞘厚度和轴突直径的分布。

此外，我们测量了相同神经切片的光密度，以确定在转基因动物中无髓纤维含量(不能在锇切片上看见，因此没有分析)是否更高(由神经切片的整体浅色外观所反映)。

最后，对用于神经分析的相同切片上存在的所有足部肌肉人工勾画轮廓，以确定整体肌肉表面。然后我们计算了“肌肉含量/切片面积”比率。

切下坐骨神经并用于称重以及用于分子生物学和/或生物化学测定。(RT-Q-PCR用于PMP22 mRNA以及Western印迹用于髓鞘蛋白定量；Cayman’s EIA试剂盒-用于生化标志物例如花生四烯酸代谢物，HPLC定量用于甾类和胺类，ELISA用于CNTF、IL-6等)按照通用方案进行，并用于分析步骤(药物浓度测量)。

对后肢肌肉(比目鱼肌)进行取样，称重，速冻并保存在-80℃下直到分析(与用于坐骨神经的相同)。

结果

通过强制喂食给药甲巯咪唑(每日剂量0.35mg/kg)和毛果芸香碱(每日剂量0.2mg/kg)，在整个处理过程中改进了条实验的表现(图3)而化合物PXT25(其出现在这里仅仅是出于比较的目的)几乎不显示任何改进。

在用安慰剂处理的不同CMT TG大鼠中，与野生型(WT)组相比，成功的运动表现平均低3倍。用甲巯咪唑和毛果芸香碱处理使TG动物在该实验中表现改善，效果早在强制喂食8周后即变得统计学显著。

数据显示，用这些相对高剂量的甲巯咪唑和毛果芸香碱处理的CMT大鼠与安慰剂组相比，变得明显表现更好。用化合物毛果芸香碱处理的组甚至恢复了与WT安慰剂组没有更明显差异的表现水平。

已发现，在TG安慰剂组中，在尾的远端部分测量到的SNAP明显降低，这可能反映了由脱髓鞘引起的重要的轴突丧失。在用化合物A处理后该电生理参数明显提高(图4)，而用化合物B处理的转基因大鼠的SNAP达到了公认的5％的显著性阈值。

该项观察允许我们推测，甲巯咪唑的作用可以阻止轴突丧失，即使外周神经的髓鞘状态没有可测量到的改进。毛果芸香碱的效果似乎基本上相同，即使由于组内可变性，与安慰剂组参数的差异不能达到统计学显著。在CMT1A中，感觉神经动作电位(SNAP)幅度比在CMT2中更低，SNAP持续时间更长。在CMT1A中复合肌肉动作电位(CMAP)和SNAP的降低可能是脱髓鞘和轴突机能病症的组合效应(Bienfait等，2006)。

在研究结束时进行了形态度量分析。后肢组织的测量显示，在用安慰剂处理的CMT雌性大鼠中，与对照WT大鼠相比，坐骨神经和比目鱼肌明显减小(图5)。

这些缺陷似乎被化合物A处理完全校正：肌肉和神经的绝对质量甚至比对照WT大鼠中更高，而与安慰剂组相比，在化合物A组中整个体重甚至减少(数据未显示)。毛果芸香碱处理对后肢肌肉和神经的影响似乎比甲巯咪唑小。

如图6中所示，含有低50倍剂量的甲巯咪唑(4mkg/kg)和毛果芸香碱(7mkg/kg)的混合物1(表1)，在10周的强制喂食处理后改进了雌性大鼠的步态分值。我们在处理6周后观察到阳性趋势。

下面的图显示了含有毛果芸香碱(7mkg/kg)、甲巯咪唑(4mkg/kg)、米非司酮(40mkg/kg)、纳曲酮(4mkg/kg)、巴氯芬(60mkg/kg)和山梨醇(2mg/kg)的混合物2(表1)，在3种不同行为和电生理试验中对雄性大鼠的影响。

图7显示了这些剂量下的混合物2降低了在CMT安慰剂大鼠中发现的在尾神经电刺激后兴奋性阈值的升高。

图8显示了混合物2对雄性大鼠在条实验中的表现的正效应；在处理4周后，跌落的次数减少，在杆上花费的时间增加。

图说明了下述事实，即混合物2在处理3周后也改进了雄性大鼠的步态表现；对于处理过的大鼠来说，与CMT安慰剂大鼠相比，以流畅步态行走的大鼠的百分率增加了35％。。

对于其他组合来说产生了类似结果，结果的概述显示在表1中。

表1

POS：体内疾病症状的复原

这些数据显示，在体内，本发明的组合和治疗体系允许有效治疗CMT。

III.在中毒性神经病变模型中的体内效应

药物治疗或治疗体系是从第一次腹膜内注射3mg/kg奥沙利铂前一天(D-1)到最后测试日的前一天(D16)进行经口给药。属于奥沙利铂处理组的动物每日给药蒸馏水(10ml/kg)。动物在早晨进行每日的测试处理和蒸馏水给药，而奥沙利铂的给药在下午。

在测试日(即D1、D4、D10)中，处理和蒸馏水在测试后被给药。对于包括化合物和介质给药以及奥沙利铂注射的测试日(D4)来说，在测试后注射奥沙利铂之前给药处理和蒸馏水。来自参比治疗组的动物只在测试日中(即D1、D4、D10和D17)给药。

通过在D1(第一次注射3mg/kg奥沙利铂后24小时左右(奥沙利铂的急性效应))、D4、D10(奥沙利铂的慢性效应)和D17(在处理完成后一周奥沙利铂的残留效应)测量对非痛苦性热刺激(丙酮测试)的反应，评估冷痛觉异常。

测试在参比物给药后2小时使用丙酮测试来进行。

参比物质是每次经口给药100mg/kg加巴喷丁(一天一×4个测试日)。

丙酮测试

使用丙酮测试评估冷痛觉异常。在该测试中，在向两只后爪的跖面施加一滴丙酮后，测量后爪缩回的等待时间(反应时间)，并对反应强度进行打分(冷分值)。

在病痛施加后20秒内(截止值)测量对丙酮冷却效应的反应时间。对丙酮的反应也按照下面的4点标度进行分级：0(无反应)；1(快速回缩，爪子轻拍)；2(长时间回缩或明显拍动爪子)；3(重复拍动爪子并舔或咬)。

使用大鼠进行了六次试验。对于每个实验组来说，结果表示成每只大鼠的6个分值合在一起的总和所确定的累计冷分值±SEM。最小分值是0(对于6次试验的任一次都没有反应)，最大的可能分值是18(在6次试验的每次中重复拍动爪子并舔或咬)。

加巴喷丁：来源：中国浙江手性药物化学品公司(Zhejiang Chiral Medicine Chemicals，China)

奥沙利铂：来源：Sigma，法国。

结果

在奥沙利铂中混合物2的测试结果显示在图10上。显然，混合物2保护动物免于毒性药物处理诱导的神经病变。

IV.在ALS模型中的体内效应

动物模型

我们选择SOD1^G93A大鼠模型(由Howland DS等，2002产生)模拟肌萎缩性侧索硬化症病理。该模型在脊髓、许多脑区域以及外周组织中过表达突变的SOD1基因(Howland DS等，2002)。该模型的运动神经元疾病约在115天时发作(Howland DS等，2002)；它表现为后肢步态异常。在几天内，出现后肢瘫痪。

实验步骤

我们通过将SOD1^G93A大鼠种畜与Sprague Dawley雌性大鼠杂交获得了群体。使用特异性针对hSOD1的引物，通过尾部DNA的聚合酶链反应(PCR)鉴定了杂合SOD1^G93A大鼠(Howland DS等，2002)。将动物维持在具有受控照明(在0500-1900h光照)和温度(23±1℃)的房间中，并提供自由接近食物和水。本研究中的所有动物操作按照动物护理指导标准进行。

每周进行体重测量，并在60日龄时开始行为测试。从5周龄其每日通过经口给药或皮下方式给药进行处理。

观察试验：总体情况定性

将每只大鼠在不含杂物的新的鼠笼(尺寸为55×33×18cm)中观察5分钟。并记录5种不同参数：

步态

-0分：正常步态(流畅)

-1分：异常步态(不流畅或大鼠轻微跛行)

-2分：中度失能(大鼠拖着一条腿，并能弥补它并行走)

皮毛情况

-0分：清洁和柔滑皮毛

-1分：竖毛或肮脏皮毛

震颤

-0分：没有震颤

-1分：震颤

身体姿势

-0分：正常

-1分：异常(伏倒或弓背)

后爪姿势

-0分：正常

-1分：伸展后爪

运动分值测试：运动缺损的定性

该测试评估大鼠在30秒内扶正自身被扭向任一侧的能力(正位反射)(Gale K.等，1985)。

按照下列标准使用非参数性计分系统(Matsumoto A.等，2006；Thonhoff JR等，2007)：

-0分：大鼠不能在30秒内从任一侧扶正自身；

-1分：大鼠仅仅不能在30秒内从一侧扶正自身；

-2分：大鼠能够在30秒内从两侧扶正自身，但是不能站立在笼子中；它总是拖着一部分身体；

-3分：大鼠能够在30秒内从两侧扶正自身，不能站立在笼子中，但是不拖着一部分身体；

-4分：大鼠能够在30秒内从两侧扶正自身，能够站立在笼子中，但是具有可见的功能性缺陷；

-5分：大鼠能够在30秒内从两侧扶正自身，能够站立在笼子中并且没有可见的功能性缺陷。

疾病的终点固定在0分处；然后将大鼠安乐死。

斜面测试：运动缺陷的定性

滑动装置具有30×50cm有机玻璃平面，其可以以0°(水平)到60°的角度倾斜。将每只大鼠在开始时以头在上的位置(头朝上的方向)放置在25°角倾斜的平面上；进行两次试验，间隔1分钟。30分钟后，在35°角倾斜的平面上进行同样的实验，然后在40°角倾斜的平面上进行。在此期间将大鼠放回笼子。在每次试验后清理平面。

大鼠的表现通过4个不同分值进行评估：

-0分：不滑落

-1分：轻微滑落(一只或两只爪)

-2分：中度滑落(4只爪)，但是没有到达平面底端

-3分：大鼠滑落到平面最底端。

丝网测试：在困难情形中运动能力的定性

将丝网置于顶部与盒子接触(角度为70°)并且底部与桌子边接触(Thonhoff JR等，2007)。将每只大鼠放置在丝网底部，并通过将其同窝仔畜放置在顶部的盒子中促使它们登高。每只大鼠每周训练一次(3次试验)。

记录的参数是到达丝网顶部的等待时间。

户外测试：运动活动定性

运动活动在有机玻璃盒子(45×45×30cm，Acti-Track，由BIOSEB，Lyon，法国制造)中测量，该盒子带有沿着地板上方1和5cm的两条轴的16个光电池束。

在3小时时间内评估每只大鼠的自发和探索性活动。

记录4个参数(总移动距离，用后肢站立次数，移动距离和在空地中央花费的时间的百分率)。

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