MX2010013984A - Combinacion de pilocarpina y metimazol para tratar la enfermedad de charcot-marie-tooth y trastornos relacionados. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para el tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth y neuropatías periféricas relacionadas. Más en particular, la invención se refiere a terapias combinadas para tratar dicha enfermedad por afectación simultánea de las rutas de señalización del receptor muscarínico y de la hormona tiroidea en un sujeto.

Description

COMBINACIÓN DE PILOCARPINA Y METIMAZOL PARA TRATAR LA ENFERMEDAD DE CHARCOT-MARIE-TOOTH Y TRASTORNOS RELACIONADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para el tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth y trastornos relacionados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth ("CMT") es una polineuropatía periférica genética rara. Con afectación aproximada de 1 de cada 2.500 personas, esta enfermedad es el trastorno heredado más frecuente del sistema nervioso periférico. Su inicio típicamente se produce en la primera o segunda década de vida, aunque puede detectarse en la infancia. La evolución de la enfermedad es crónica, con degeneración neuromuscular gradual. La enfermedad es invalidante con casos de dolor neuropático concomitante e incapacidad muscular extrema. La CMT es una de las patologías mejor estudiadas, con aproximadamente 30.000 casos en Francia. Aunque la mayoría de los pacientes de CMT presentan una duplicación de un fragmento del cromosoma 17 que contiene un gen de la mielina: PMP22 (de CMT1A), dos docenas de genes se han relacionado con formas distintas de la CMT. Según esto, aunque de origen monogénico, esta patología manifiesta heterogeneidad clínica debida a posibles genes moduladores. Los genes mutados en los pacientes de CMT están situados en rutas moleculares estrechamente conectadas que afectan a la diferenciación de las células de Schwann o las neuronas o cambiando la interrelación de estas células en los nervios periféricos.

PMP22 es un componente principal de la mielina expresada en la porción compacta de casi todas las fibras mielinizadas del sistema nervioso periférico y se produce predominantemente por células de Schwann. Además, se supone que el gen de PMP22 está implicado en el desarrollo de neoplasia en pacientes con neurofibromatosis, un trastorno autosómico dominante caracterizado por manchas de color café con leche y tumores fibromatosos de la piel. También se observa una pequeña expresión en exceso de 1 ,5 veces de una proteína PMP22 normal en células de Schwann heterocigóticas para la duplicación en pacientes de CMT (en algunos casos raros, un fenotipo similar a CMT1A también se puede relacionar con mutaciones estructurales de la proteína PMP22) (Lupski y col., 1992; Suter y col., 1992; Roa y col., 1993; Thomas y col., 1997; Suter y Scherer, 2003; Nave y Sereda, 2007). La evidencia directa de que una dosificación anormal del gen PMP22 produce un fenotipo similar a CMT1A se proporcionó en experimentos transgénicos en modelos de roedor con expresión en exceso de la proteína PMP22 (Niemann y col., 1999; Perea y col., 2001 ; Robaglia-Schlupp y col., 2002; Meyer y col., 2006; Sereda y Nave, 2006).

Además, las intervenciones terapéuticas con un inhibidor del receptor de la progesterona y ácido ascórbico disminuyeron la expresión en los animales transgénicos, mejorando o ralentizando la progresión del fenotipo de la dolencia (Sereda y col., 2003; Passage y col., 2004; Meyer zu Horste y col., 2007).

Bassi y col., 1978, refieren el uso dé metimazol en la terapia de la tirotoxicosis asociada a neuropatía y encefalitis.

El documento WO 00/20024 de Celtrix se refiere al uso de metimazol para aliviar los síntomas de una dolencia dependiente de IGF que es una dolencia tiroidea.

El documento W02004/019938 se refiere al uso de pilocarpina en el tratamiento de los síntomas del dolor neuropático.

El uso de pilocarpina sola, para el tratamiento de anormalidades papilares miotónicas fue sugerido por Keltner y col., 1975. Sin embargo, el uso de pilocarpina para el tratamiento de la CMT no se ha descrito. Más aún, el uso de pilocarpina en combinación con cualquier otro compuesto ni siquiera se ha sugerido.

En resumen, existe necesidad de una terapia eficiente y aprobada para el tratamiento de la enfermedad de CMT BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El objeto de la presente invención es proporcionar enfoques terapéuticos novedosos para el tratamiento de la CMT y dolencias relacionadas. Más específicamente, los inventores han definido terapias de combinación novedosas que afectan eficazmente las rutas que conducen a la CMT y dolencias relacionadas, y que representan enfoques novedosos para el tratamiento de dichas dolencias. La invención por tanto proporciona productos y composiciones de combinación novedosos, así como el uso de los mismos para el tratamiento de la enfermedad de CMT y dolencias relacionadas.

Un objeto de esta invención se refiere más específicamente al uso de una combinación de compuestos para (la fabricación de un medicamento para) tratar CMT o una dolencia relacionada, donde dicha combinación de compuestos se selecciona entre un agonista del receptor muscarínico o un profármaco del mismo y un inhibidor de la síntesis de la hormona tiroidea o un profármaco del mismo.

Otro objeto de esta invención reside en un producto de combinación que comprende un agonista del receptor muscarínico y un inhibidor de la síntesis de la hormona tiroidea, o un profármaco del mismo, para una administración conjunta o independiente a un sujeto, simultánea o secuencialmente.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agonista del receptor muscarínico y un inhibidor de la síntesis de la hormona tiroidea, o un profármaco del mismo, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En una realización más preferida, el agonista del receptor muscarínico es (3S,4R)-3-etil-4-[(3-metilimidazol-4-il)metil]oxolan-2-ona (CAS 92-13-7, que es un agente activo del compuesto farmacéutico pilocarpina), o un profármaco del mismo.

Adicionalmente en una realización más preferida, el inhibidor de la hormona tiroidea muestra adicionalmente actividad en la señalización de la prostaglandina. Los ejemplos preferidos de dichos compuestos incluyen 1-metil-3H-imidazol-2-t¡ona (CAS 60-56-0, que es un agente activo del compuesto farmacéutico metimazol), o un profármaco del mismo, como carbimazol.

En otra realización, la invención se refiere a una composición que comprende un agonista del receptor muscarínico y un inhibidor de la síntesis de la hormona tiroidea para el tratamiento de la CMT en un sujeto, donde el tratamiento comprende además la etapa de determinar si el paciente padece CMT1A.

A este respecto, un objeto particular de esta invención se refiere a una composición que comprende pilocarpina, o un profármaco del mismo, y metimazol, o un profármaco del mismo y, opcionalmente, un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Como se muestra en los ejemplos, dicha combinación permite tratar eficazmente la CMT en modelos animales contrastados.

Los productos o composiciones de esta invención pueden comprender además al menos un principio activo adicional, seleccionado preferentemente del grupo constituido por rapamicina, baclofeno, sorbitol, mifepristona, naltrexona, flurbiprofeno y ketoprofeno.

En una realización preferida, la composición según la invención comprende al menos: - pilocarpina, metimazol y mifepristona; - pilocarpina, metimazol y baclofeno; o - pilocarpina, metimazol y sorbitol.

En otra realización preferida, la composición según la invención comprende al menos: - pilocarpina, metimazol, mifepristona, baclofeno y sorbitol; o - pilocarpina, metimazol, mifepristona, baclofeno, sorbitol y naltrexona.

En otras realizaciones, la presente invención se refiere a un producto o composición que comprende metimazol, pilocarpina y dos principios activos adicionales, preferiblemente mifepristona y sorbitol. En otras realizaciones, la presente invención se refiere a un producto o composición que comprende metimazol, pilocarpina y tres principios activos adicionales, preferiblemente: - mifepristona, baclofeno y sorbitol; o - mifepristona, sorbitol y rapamicina; o - mifepristona, sorbitol y ketoprofeno; o - mifepristona, sorbitol y flurbiprofeno.

En otras realizaciones, la presente invención se refiere a un producto o composición que comprende metimazol, pilocarpina y cuatro principios activos adicionales, preferiblemente: - mifepristona, sorbitol, baclofeno y naltrexona; - mifepristona, sorbitol, baclofeno y rapamicina; - mifepristona, sorbitol, naltrexona y rapamicina.

En otras realizaciones, la invención se refiere a un producto o composición, que comprende cualquier combinación de fármacos según se revela en la Tabla 1.

En otras realizaciones específicas, la presente invención se refiere a un producto o composición que comprende: - metimazol y baclofeno; o - metimazol y cevimelina.

En otra realización, la invención también se refiere a un producto o composición que comprende pilocarpina y propiltiouracilo.

Otro objeto de la invención se refiere al uso de una combinación de pilocarpina con metimazol o estos dos compuestos por separado, o en combinación(es) con otros compuestos que potencien su efecto para el (la fabricación de un medicamento para el) tratamiento de la CMT o una dolencia relacionada.

Otro objeto de la invención se refiere al uso de una combinación de pilocarpina con metimazol o estos dos compuestos por separado, o en combinación(es) con otros compuestos que potencien su efecto para el (la fabricación de un medicamento para el) tratamiento de una neuropatía tóxica.

Otro objeto de la invención se refiere al uso de una combinación de pilocarpina con metimazol o estos dos compuestos por separado, o en combinación(es) con otros compuestos que potencien su efecto para el (la fabricación de un medicamento para el) tratamiento de ELA (esclerosis lateral amiotrófica).

Preferiblemente, los compuestos que potencian el efecto de la combinación de pilocarpina y metimazol, para el tratamiento de la CMT, se seleccionan del grupo constituido por mifepristona, baclofeno, sorbitol, naltrexona, rapamicina, flurbiprofeno y ketoprofeno.

En una variante, se usa una mezcla de pilocarpina y metimazol para el tratamiento de la CMT o una dolencia relacionada, en combinación con un principio activo adicional, preferiblemente mifepristona o baclofeno.

En otra variante se usa una mezcla de pilocarpina y metimazol en combinación con dos principios activos adicionales, preferiblemente mifepristona y sorbitol.

En otra variante se usa una mezcla de pilocarpina y metimazol en combinación con tres principios activos adicionales, preferiblemente consistentes en mifepristona y sorbitol en combinación con un tercer compuesto seleccionado entre baciofeno, rapamicina, ketoprofeno o flurbiprofeno.

En otra variante se usa una mezcla de pilocarpina y metimazol en combinación con cuatro principios activos adicionales, preferiblemente mifepristona, sorbitol, baciofeno y naltrexona o rapamicina; o mifepristona, sorbitol, naltrexona y rapamicina.

La invención proporciona adicionalmente un procedimiento para tratar CMT o una dolencia relacionada, particularmente CMT, que comprende administrar a un sujeto necesitado de ello una cantidad eficaz de la combinación de un agonista del receptor muscarínico, o un profármaco del mismo, y un inhibidor de la síntesis de la hormona tiroidea, o un profármaco del mismo.

La invención además se refiere a un procedimiento para tratar la CMT en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la combinación de pilocarpina, o un profármaco del mismo, y metimazol, o un profármaco del mismo.

La invención también se refiere a un procedimiento para tratar la CMT en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una combinación de pilocarpina y metimazol con al menos un principio activo adicional, preferentemente seleccionado entre el grupo de rapamicina, baciofeno, sorbitol, mifepristona, naltrexona, flurbiprofeno y ketoprofeno.

En variantes, la presente invención también se refiere a un procedimiento para tratar la CMT en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una combinación de: - pilocarpina, metimazol y al menos un principio activo adicional que se selecciona entre baclofeno, mifepristona, sorbitol y naltrexona; - pilocarpina, metimazol y baclofeno; - pilocarpina, metimazol y mifepristona; - pilocarpina, metimazol, mifepristona, sorbitol y baclofeno; - pilocarpina, metimazol, mifepristona, sorbitol y rapamicina; - pilocarpina, metimazol, mifepristona, sorbitol y ketoprofeno; - pilocarpina, metimazol, mifepristona, sorbitol y flurbiprofeno; - pilocarpina, metimazol, mifepristona, sorbitol, baclofeno, y naltrexona; - pilocarpina, metimazol, mifepristona, sorbitol, baclofeno y rapamicina; - pilocarpina, metimazol, mifepristona, sorbitol, naltrexona y rapamicina; - metimazol y baclofeno; - metimazol y cevimelina; o - pilocarpina y propiltiouracilo.

La invención se puede usar para tratar CMT o una dolencia relacionada en cualquier sujeto mamífero, particularmente sujetos humanos. Resulta particularmente adecuada para el tratamiento de CMT1a.

A este respecto, un objeto específico de esta invención es un procedimiento para tratar CMT1A en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una combinación de pilocarpina, o un profármaco del mismo, y metimazol, o un profármaco.

Un objeto adicional de esta invención es un procedimiento para tratar CMT1a, comprendiendo el procedimiento (1) evaluar si un sujeto padece CMT1a y (2) tratar el sujeto que padece CMT1a con una cantidad eficaz de una combinación de pilocarpina, o un profármaco del mismo, y metimazol, o un profármaco del mismo. Determinar si un sujeto padece CMT1a puede realizarse mediante varias pruebas conocidas por sí mismas en la técnica, como ensayos de ADN.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : los niveles relativos se muestran como % de la expresión del ARNm de PMP22 en células de Schwann primarias de rata tratadas durante 24 h con los compuestos A y B. A la izquierda se representa el % del nivel de ARNm de PMP22, 24 h tras adición de compuesto A (metimazol) 1 mM o 1 µ?. Se observa que el ARNm de PMP22 está significativamente disminuido en las células de Schwann primarias, y que la dosis inferior de compuesto A induce la regulación por disminución de PMP22 más importante. *: p<0,05; ***: p<0,001 ; significativamente diferente del control (prueba de la t de Student de pares agrupados). A la derecha, exposición de 24 h al compuesto B (pilocarpina), nivel de expresión del ARNm de PMP22 significativamente regulado por disminución en células de Schwann primarias incluso a dosis muy bajas (10 nM y 50 nM). Similarmente, se observa que el compuesto B (1 µ?) disminuye significativamente el nivel de expresión de la proteína PMP22 tras 24 h de incubación en un 38 % en células de Schwann primarias. Este efecto sigue siendo significativo tras 48 h de incubación (-18 %, p<0,001).

Figura 2: Efecto de los fármacos seleccionados sobre el nivel de expresión del ARNm de PMP22 cuantificado mediante RT-Q-PCR en schwannoma RT4-D6P2T. ***: p<0,0001 : significativamente diferente del control (= sin fármaco). Prueba de la t de Student bilateral sobre los valores de AACt.

Figura 3: Resultados de la evaluación motora en ratas hembra en la prueba de la barra en todo el estudio de tratamiento presentados en forma de tendencias. Grupo WT tratado con placebo: ratas normales tratadas con placebo; Grupo TG tratado con placebo: ratas transgénicas control tratadas con placebo, TGptx25: ratas transgénicas tratadas con una sustancia de control negativo, TGA: ratas transgénicas alimentadas a la fuerza con una dosis diaria de 0,2mg/kg de metimazol; TGB: ratas transgénicas tratadas con una dosis diaria de 0,35 mg/kg de pilocarpina.

Figura 4: Evaluación electrofisiológica de la amplitud del potencial en nervios sensores en ratas con CMT tratadas con fármacos durante 20 semanas. Grupo TG tratado con placebo: ratas transgénicas control tratadas con placebo, TGptx25: ratas transgénicas tratadas con una sustancia de control negativo, TGA: ratas transgénicas tratadas con una dosis diaria de 0,2mg/kg de metimazol; TGB: ratas transgénicas tratadas con una dosis diaria de 0,35 mg/kg de pilocarpina.

Figura 5: Análisis de las muestras de necropsia obtenidas de los animales tratados con fármacos según se ha descrito en la leyenda de la Fig. 3. Las ratas tratadas con fármacos y placebo durante 20 semanas, se anestesiaron profundamente, y se muestrearon y pesaron cuidadosamente todos los nervios ciáticos y los músculos soleos. Los gráficos presentan 30 valores promedio de estas medidas.

Figura 6: Efecto positivo de la Mezcla 1 en la prueba de evaluación de la locomoción (ratas hembra); la línea negra representa ratas control tratadas con placebo; la línea negra gruesa representa ratas transgénicas tratadas con placebo; la línea punteada representa ratas transgénicas tratadas con Mezcla 1. * p<0,05; negro * : wt placebo vs tg placebo; gris * : tg placebo vs tg mezcla 1. Se realizó estadística con la prueba bilateral de Student; el promedio se representa como ± s.e.m.

Figura 7: Efecto positivo de la Mezcla 2 sobre el umbral de excitabilidad del nervio caudal (las barras blancas representan ratas macho de control tratadas con placebo; las barras negras representan ratas macho transgénicas tratadas con placebo; las barras grises representan ratas macho transgénicas tratadas con Mezcla 2. Se realizó estadística con la prueba bilateral de Student; el promedio se representa como ± s.e.m.

Figura 8: Efecto positivo de Mezcla 2 tras 4 semanas de tratamiento en la prueba de la barra (las barras blancas representan ratas macho de control tratadas con placebo; las barras negras representan ratas macho transgénicas tratadas con placebo; las barras grises representan ratas macho transgénicas tratadas con Mezcla 2). Se realizó estadística con la prueba bilateral de Student; el promedio se representa como ± s.e.m.

Figura 9: Efecto positivo sobre la locomoción de Mezcla 2 tras 3 de tratamiento (las barras blancas representan el porcentaje de ratas macho en cada grupo que caminan con una locomoción fluida, las barras grises representan la locomoción no fluida; las barras negras representan la incapacidad). Se realizó estadística con la prueba bilateral de Student.

Figura 10: Efecto antialodínico en el modelo crónico OXALPN. En azul se muestran los tiempos de reacción en pruebas de acetona para los animales de control, en rojo los animales tratados con oxaliplatino, en color verde los animales tratados con oxaliplatino y mezcla 2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona nuevos enfoques terapéuticos para tratar la CMT o dolencias relacionadas. La invención da a conocer composiciones novedosas fabricadas a partir de combinaciones de fármacos conocidos y su uso nuevo para una corrección eficaz de dichas dolencias y se pueden usar en cualquier sujeto mamífero.

En el contexto de la presente invención, el término "dolencia relacionada con CMT" designa otras neuropatías periféricas tanto hereditarias como adquiridas.

La forma principal de CMT, CMT1A, está causada por la duplicación de del gen PMP22. El gen PMP22 es un componente principal de la mielina expresado en la porción compacta de prácticamente todas las fibras mielinadas del sistema nervioso periférico. La proteína PMP22 interactúa con otras proteínas estructurales de la mielina PO, y de este modo, la relación alterada PMP22/proteína PO puede afectar la compactación de las vainas de mielina (Vallat y col., 1996; D'Urso y col., 1999). Como se ha demostrado en estudios in vitro, la proteína PMP22 también está implicada en la regulación de la diseminación celular de forma Rho dependiente y así puede afectar la formación de las vainas axonales (Brancolini y col., 1999). Más aún, PMP22 forma complejos con integrinas a6~4 y pueden mediar la interacción de las células de Schwann con la matriz extracelular (Amici y col., 2006; Amici y col., 2007). Adicionalmente, un aumento en el nivel de la proteína PMP22 puede alterar la ruta de reciclado de la membrana endosómica regulada por Arf6 y conducir a la acumulación de PMP22 en los endosomas tardíos Chies y col., 2003). También se ha demostrado que la expresión en exceso de la proteína PMP22 perturba la clasificación de proteínas intracelulares y sobrecarga la maquinaria de degradación de proteínas en las células de Schwann (Notterpek y col., 1997; Tobler y col., 2002; Fortun y col., 2003; Fortun y col., 2006; Fortun y col., 2007; Khajavi y col., 2007). Finalmente, PMP22 está directamente implicada en el control de la proliferación celular y la muerte celular programada (Sancho y col., 2001 ; Atanasoski y col., 2002) y se ha demostrado que la proteína PMP22 mutante provoca una reorganización profunda y la expresión aberrante de los canales iónicos axonales (Ulzheimer y col., 2004; Devaux y Scherer, 2005).

En consecuencia, el término "dolencias relacionadas con CMT" comprende dolencias periféricas tales como ALS, neuropatías tóxicas, neuropatías idiopáticas, neuropatía diabética, cáncer y neuropatías inducidas por VIH, síndrome de Guillain-Barre.

En una realización preferida, una dolencia relacionada con CMT designa una neuropatía, tal como neuropatías desmielinizantes, incluyendo HNPP (neuropatía hereditaria sensible a la presión), CMTIB, CMTIC, CMTID, CMTIX, CMT2A, CMT2B, CMT2D, CMT2E, CMT2-PO, neuropatías desmielinantes graves DSS (síndrome de Dejerine-Sottas), CHN (neuropatía hipomielinizante congénita), CMT4A, CMT4BI, CMT4B2, CMT4D, CMT4F, CMT4, AR-CMT2A, HSNI.

La invención es particularmente adecuada para tratar CMT1A.

Según se usa en el presente documento, "tratamiento" de una dolencia incluye la terapia, la prevención, la profilaxis, el retraso o la reducción del dolor provocado por la dolencia. El término tratamiento incluye en particular el control de la evolución de la enfermedad y los síntomas asociados.

También, el término compuesto designa los compuestos químicos que se nombran específicamente en la solicitud, así como cualquier sal, hidrato, éster, éter, isómeros, racematos, conjugados, profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos.

También, el término "combinación" designa un tratamiento en el que al menos dos fármacos se administran simultáneamente a un sujeto para producir un efecto biológico. En una terapia de combinación, los al menos dos fármacos se pueden administrar a la vez o por separado, al mismo tiempo o secuencialmente. También, los al menos dos fármacos se pueden administrar por diferentes vías y protocolos.

La invención demuestra que la CMT o una dolencia relacionada con CMT se pueden tratar con una combinación particular de fármacos. Más específicamente, la invención demuestra que los compuestos metimazol y pilocarpina en combinación(es) se pueden usar para tratar la CMT o dolencias relacionadas. A este respecto, los resultados experimentales muestran que una combinación de metimazol y pilocarpina disminuye significativamente el nivel de expresión del ARN del gen de PMP22 en células de Schwann de rata. Adicionalmente, ratas transgénicas para PMP22 que modelan la enfermedad CMT humana se han tratado diariamente con combinaciones que contienen metimazol y pilocarpina. Se ha observado una mejora significativa en los criterios de valoración conductuales.

Pilocarpina: (3S,4R)-3-etil-4-r(3-metilimidazol-4-il)metilloxolan-2-ona Este fármaco, C Hi6N202, ha sido aprobado para el tratamiento de i) síntomas de boca seca por hipofunción de las glándulas salivares causada por radioterapia en cáncer de la cabeza y el cuello; y ii) el tratamiento de los síntomas de boca seca en pacientes con el síndrome de Sjogren.

Los agonistas de los receptores muscarínicos producen la contracción de las fibras de la musculatura lisa (tracto digestivo, ojo, bronquio), estimula las secreciones sudorales, salivares, bronquiales y gástricas. Adicionalmente, muestra una acción cardiovascular compleja, estimulando ambas rutas parasimpaticomiméticas (vasodilatación) excitoganglionares.

Los inventores han demostrado que la pilocarpina, un agonista de los receptores muscarínicos, disminuye la expresión de la proteína PMP22 en células de Schwann in vitro. Proponen que la estimulación de los receptores muscarínicos debido a la pilocarpina conduce -posiblemente, mediante un conjunto complejo de mecanismos celulares- a un cambio en el equilibrio intracelular de las actividades Erk/Akt, que regulan la expresión de los marcadores en proteínas asociadas a la mielina de forma contraria, a la más marcada señalización Erk (Ogata y col., 2004).

Sin entrar en consideraciones teóricas, se postula que la estimulación de los receptores muscarínicos puede modificar la actividad de las cinasas Akt y Erk por varios mecanismos concomitantes (Ma y col., 2004; Anger y col., 2007). Por ejemplo, los receptores muscarínicos pueden bloquear selectivamente la señalización mediante IGF-I, pero no de los receptores PDGF, estimulando la desfoforilación inhibitoria de la tirosina, o la desfoforilación inhibitoria de la serina de IRS-I mediante PKC. A continuación, los receptores muscarínicos pueden mediar en la transactivación intracelular de la señalización de ERK mediante la cinasa Fyn tipo Src; igualmente, al disminuir la actividad de la adenilato ciclasa, los receptores muscarínicos pueden estar implicados en la regulación funcional de las cinasas Akt/Gsk-3 y Erk también mediante un mecanismo mediado por PKA. Finalmente, se ha demostrado que la estimulación de los receptores muscarínicos puede -mediante la activación de A PK- producir transitoriamente la desfoforilación de Akt, y de esta forma, disminuir la combinación intracelular de la ß-catenina (Batty y col., 2004; King y col., 2006).

Como resultado, se pueden usar igualmente otros agonistas del receptor muscarínico, tales como: Cevimelina (Número CAS 107233-08-9), Carbacol (Número CAS 51-83-2), Metacolina (Números CAS 55-92-5) y Betanecol (Número CAS 674-38-4).

Metimazol: 1-metil-3H-imidazol-2-tiona Metimazol inhibe la producción de nuevas hormonas tiroideas al bloquear la actividad de la peroxidasa tiroidea, convirtiendo el yoduro en yodo y catalizando la incorporación de la molécula de yoduro resultante en los anillos de fenol de las tirosinas. Así, el metimazol puede disminuir eficazmente la actividad transcripcional de los receptores de la hormona tiroidea. Adicionalmente, se ha informado de que el metimazol suprime la producción de prostaglandina al atenuar la actividad de la prostaglandina H sintasa (Zelman y col., 1984). Las prostaglandinas -mediante sus receptores análogos GPCR- podrían además aumentar la ruta de señalización de Akt que promueve la expresión de las proteínas relacionadas con la mielina (Ogata y col., 2004; Castellone y col., 2006). Según esto, los compuestos que a la vez inhiben la síntesis de hormonas tiroideas y la producción o la señalización de prostaglandina son particularmente ventajosos para uso en la presente invención.

Otros compuestos relacionados con el modo de acción del metimazol son carbimazol (profármaco de metimazol - Número CAS 22232-54-8) y propiltiouracilo (Número CAS 51-52-5), y amiodarona (Número CAS 1951-25-3).

Según se da a conocer en los ejemplos, los compuestos metimazol y pilocarpina ejercen una acción combinada que conduce a un efecto terapéutico mejorado para CMT, permitiendo disminuir las dosis terapéuticas eficaces con la disminución de efectos secundarios.

Una realización particular de la invención reside en una terapia de combinación para tratar CMT o una dolencia relacionada, particularmente CMT1A, en la que dicha terapia de combinación comprende los compuestos metimazol y pilocarpina y al menos un tercer compuesto capaz de potenciar la actividad de esta combinación.

Otra realización particular de la invención reside en una terapia de combinación para tratar ELA, en la que dicha terapia de combinación comprende los compuestos metimazol y pilocarpina y al menos un tercer compuesto capaz de potenciar la actividad de esta combinación.

Otra realización particular de la invención reside en una terapia de combinación para tratar la neuropatía tóxica, en la que dicha terapia de combinación comprende los compuestos metimazol y pilocarpina y al menos un tercer compuesto capaz de potenciar la actividad de esta combinación.

Una realización particular de la invención reside en una terapia para tratar CMT o una dolencia relacionada, en la que los compuestos metimazol y pilocarpina se usan en solitario.

Otra realización particular de la invención reside en una terapia para tratar CMT o una dolencia relacionada, en la que metimazol y/o pilocarpina se usan en combinación con al menos un principio activo adicional. En una realización preferida, el al menos un principio activo adicional se selecciona entre el grupo de compuestos relacionados en la Tabla 1.

Otra realización particular de la invención reside en un producto o composición, que comprende cualquier combinación de fármaco según la Tabla 1. Otra realización particular de la invención reside en una terapia de combinación para tratar CMT o una dolencia relacionada, que comprende cualquier combinación de de fármaco según la Tabla 1.

Otra realización particular de la invención reside en una terapia de combinación para tratar ELA, que comprende cualquier combinación de fármaco según la Tabla 1 .

Otra realización particular de la invención reside en una terapia de combinación para tratar neuropatía tóxica, que comprende cualquier combinación de fármaco según la Tabla 1.

Una terapia según la invención se realiza como combinación de fármacos, opcionalmente junto con cualquier otra terapia. Se puede proporcionar a domicilio, en una consulta médica, en una clínica, en un departamento de medicina extrahospitalaria, o en un hospital, de forma que un médico pueda observar los efectos de la terapia de cerca y realizar cualquier ajuste necesario.

La duración de la terapia depende del estadio de la enfermedad, la edad y estado del paciente, y la forma en que el paciente responde al tratamiento.

Adicionalmente, una persona en grave riesgo de desarrollar un trastorno neuropático adicional (por ejemplo, una persona genéticamente predispuesta o que tiene, por ejemplo, diabetes, o que está en tratamiento de una dolencia oncológica, etc.) puede recibir tratamiento profiláctico para aliviar o retrasar la eventual respuesta neuropática.

La dosificación, frecuencia y modo de administración de cada componente de la combinación se puede controlar independientemente. Por ejemplo, un fármaco se puede administrar oralmente mientras que el segundo fármaco se puede administrar intramuscularmente. La terapia de combinación puede administrarse en ciclos con y sin medicamento, incluir periodos de descanso de forma que el cuerpo del paciente tenga la posibilidad de recuperarse de cualquier efecto imprevisto, en caso de existir alguno. Los fármacos también se pueden formular conjuntamente de forma que en una sola administración se suministren ambos fármacos.

Formulación de composiciones farmacéuticas La administración de cada fármaco de la combinación puede ser por cualquier medio adecuado que dé por resultado una concentración del fármaco que, combinada con el otro componente, sea capaz de corregir el efecto de una expresión elevada de PMP22 tras alcanzar los nervios periféricos.

Aunque es posible que los principios activos de la combinación se administren como compuesto químico puro, es preferible presentarlos en forma de una composición farmacéutica, también denominada en este contexto como formulación farmacéutica. Las posibles combinaciones incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, tópica (incluyendo transdérmica, bucal y sublingual), o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica).

Más habitualmente, estas formulaciones farmacéuticas se prescriben en "envases para pacientes" que contienen un número de dosis unitarias u otros medios de administrar dosis unitarias medidas para uso durante un periodo de tratamiento distintivo en un envase único, normalmente un envase blíster. Los envases para pacientes tienen la ventaja sobre las prescripciones tradicionales, de que un farmacéutico divide el suministro para el paciente de un compuesto farmacéutico desde un envase voluminoso, en que el paciente siempre tiene acceso al prospecto incluido en el envase para el paciente, que falta normalmente en las prescripciones tradicionales. La inclusión del prospecto se ha demostrado que mejora la adhesión del paciente a las instrucciones del médico. De este modo, la invención además incluye una formulación farmacéutica, como se ha descrito anteriormente en el presente documento, en combinación con un material de envase adecuado a dichas formulaciones, En dicho envase para pacientes, el uso previsto de una formulación para el tratamiento combinado se puede inferir de las instrucciones, instalaciones, provisiones, adaptaciones y/u otros medios para ayudar a usar la formulación de manera más adecuada para el tratamiento. Dichas medidas convierten el envase para pacientes en específicamente adecuado y adaptado para uso en el tratamiento con la combinación de la presente invención.

El fármaco puede estar contenido en cualquier cantidad adecuada en cualquier sustancia vehículo, y puede estar presente en una cantidad del 1-99 % en peso del peso total de la composición. La composición puede proveerse en una forma de dosificación que sea adecuada para la ruta de administración oral, parenteral (por ejemplo, intravenosamente, intramuscularmente), rectal, cutánea, nasal, vaginal, inhalatoria, piel (parche), u ocular. De esta forma, la composición puede estar en la forma de, por ejemplo, comprimidos, cápsulas, pildoras, polvos, granulados, suspensiones, emulsiones, soluciones, geles incluyendo hidrogeles, pastas, pomadas, cremas, emplastos, pociones, dispositivos de administración osmótica, supositorios, enemas, inyectables, implantes, pulverizadores, o aerosoles.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse según la practica farmacéutica convencional (consultar, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of pharmacy (20a ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams y Wilkins, 2000 y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York).

Las composiciones farmacéuticas según la invención se pueden formular para liberar el fármaco activo de manera sustancial inmediatamente tras la administración o en cualquier tiempo o periodo de tiempo predeterminado tras la administración.

Las formulaciones de liberación controlada incluyen (i) formulaciones que crean una concentración sustancialmente constante del fármaco en el interior del cuerpo durante un periodo de tiempo prolongado; (ii) formulaciones que tras un periodo de espera predeterminado crean una concentración sustancialmente constante del fármaco en el interior del cuerpo durante un periodo de tiempo prolongado; (iii) formulaciones que mantienen la acción del fármaco durante un periodo de tiempo determinado manteniendo un nivel eficaz de fármaco relativamente constante en el cuerpo con minimización paralela de efectos secundarios indeseables asociados con fluctuaciones en el nivel de plasma de la sustancia fármaco activo; (iv) formulaciones que localizan la acción del fármaco mediante, por ejemplo, ubicación espacial de una composición de liberación controlada adyacente o en el tejido y órgano enfermo; y (v) formulaciones que dirigen la acción del fármaco usando vehículos o derivados químicos para administrar el fármaco a un tipo celular diana concreto.

La administración de fármacos en forma de una formulación de liberación controlada se prefiere especialmente en casos en los que el fármaco, tanto solo como en combinación, tiene (i) un bajo índice terapéutico (es decir, la diferencia entre la concentración en plasma que produce efectos secundarios dañinos o reacciones tóxicas y la concentración en plasma que produce un efecto terapéutico es pequeña; en general, el índice terapéutico, IT, se define como la relación entre la dosis letal media (DL50) y la dosis eficaz media (DE50)); (ii) una ventana de absorción estrecha en el tracto gastrointestinal; o (iii) una semivida biológica muy corta de forma que son necesarias dosificaciones frecuentes durante el día para mantener el nivel plasmático en el nivel terapéutico.

Se puede seguir cualquiera de las numerosas estrategias para obtener la liberación controlada en la que la velocidad de liberación exceda la tasa metabólica del fármaco en cuestión. La liberación controlada se puede obtener por selección adecuada de varios parámetros e ingredientes de la formulación, incluyendo, por ejemplo, varios tipos de composiciones y revestimientos para liberación controlada. De este modo, el fármaco se formula con excipientes adecuados en una composición farmacéutica que, tras administración. Libere el fármaco de forma controlada (composiciones en forma de comprimido o cápsula simples o múltiples, disoluciones oleosas, suspensiones, emulsiones, microcápsulas, microesferas, nanopartículas, parches y liposomas).

Formas de dosificación sólida para uso oral Las formulaciones para uso oral incluyen comprimidos que contienen el principio o principios activos en una mezcla con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes o cargas inertes (por ejemplo, sacarosa, celulosa microcristalina, almidones incluyendo almidón de patata, carbonato de calcio, cloruro de sodio, fosfato de calcio, sulfato de calcio, o fosfato de sodio); agentes granulantes y disgregantes (por ejemplo, derivados de celulosa incluyendo celulosa microcristalina, almidones incluyendo almidón de patata, croscarmelosa sódica, alginatos o ácido algínico); agentes aglutinantes (por ejemplo, acacia, ácido algínico, alginato sódico, gelatina, almidón, almidón pregelatinizado, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, etilcelulosa, polivinilpirrolidona, o polietilenglicol); y agentes lubricantes, fluidificantes y antiadhesivos (por ejemplo, ácido esteárico, sílices o talco. Otros excipientes farmacéuticamente aceptables pueden ser colorantes, agentes aromatizantes, plastificantes, humectantes, agentes tamponantes y similares.

Los comprimidos pueden estar sin revestir o revestidos mediante técnicas conocidas, opcionalmente para retrasar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal y proporcionando de esta forma una acción sostenida durante más tiempo. El revestimiento puede adaptarse para liberar el fármaco activo en un modelo predeterminado (por ejemplo, para conseguir una formulación de liberación controlada) o puede estar adaptado para no liberar el principio activo hasta que haya pasado por el estómago (revestimiento entérico). El revestimiento puede ser un revestimiento de azúcar, un revestimiento de película (por ejemplo, basado en hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa, metil hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, copolímeros de acrilato, polietilenglicoles y/o polivinilpirrolidona), o un revestimiento entérico (por ejemplo, basado en copolímero de ácido metacrílico, ftalato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato de hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de acetato de polivinilo, shellac, y/o etilcelulosa). Se puede emplear un material para retrasar el tiempo tal como, por ejemplo, monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las composiciones de comprimidos sólidos pueden incluir un revestimiento adaptado para proteger la composición de cambios químicos no deseados, (por ejemplo, degradación química previa a la liberación del fármaco activo). El revestimiento se puede aplicar a la forma de dosificación sólida de forma similar a la descrita en la Encyclopedia of Pharmaceutical Technology.

Los dos fármacos se pueden mezclar juntos en el comprimido, o se pueden repartir. Por ejemplo, el primer fármaco contenido en la parte interna del comprimido, y el segundo fármaco en la externa, de forma que una parte sustancial del segundo fármaco se libere antes de la liberación del primer fármaco.

Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como comprimidos masticables o cápsulas de gelatina dura en los que el principio activo está mezclado con un diluyente sólido inerte (por ejemplo, almidón de patata, celulosa microcristalina, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín), o cápsulas de gelatina blanda en las que el principio activo está mezclado con agua o un medio oleoso, por ejemplo, parafina líquida o aceite de oliva. Los polvos y granulados se pueden preparar de forma convencional usando los ingredientes anteriormente mencionados para comprimidos y cápsulas.

Las composiciones de liberación controlada para uso oral pueden, por ejemplo, construirse para liberar el fármaco activo controlando la disolución y/o la difusión del fármaco activo.

La liberación controlada por disolución o difusión se puede conseguir con un revestimiento adecuado de la formulación del fármaco en comprimido, cápsula, aglomerado o granulado, o incorporando el fármaco a una matriz adecuada. Un revestimiento de liberación controlada puede incluir una o más de las sustancias de revestimiento anteriormente mencionadas y/o, por ejemplo, shellac, cera de abeja, glycowax, cera de ricino, cera de carnauba, alcohol estearílico, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, palmitoestearato de glicerol, etilcelulosa, resinas acrílicas, ácido dipoliláctico, acetato butirato de celulosa, cloruro de polivinilo, acetato de polivinilo, vinilpirrolídona, polietileno, polimetacrilato, metacrilato de metilo, 2-hidroximethacrilato, hidrogeles de metacrilato, 1 ,3 butilenglicol, metacrilato de etilenglicol, y/o polietilenglicol. En una formulación de matriz para liberación controlada, el material de la matriz puede incluir también, por ejemplo, metilcelulosa hidratada, cera de carnauba y alcohol estearílico, carbopol 934, silicona, triestearato de glicerilo, acrilato de metilo-metacrilato de metilo, cloruro de polivinilo, polietileno, y/o fluorocarbono halogenado.

Una composición de liberación controlada que contiene uno o más de los fármacos de las combinaciones reivindicadas puede estar también en forma de un comprimido o cápsula flotante (es decir, un comprimido o cápsula que, tras la administración oral, flota sobre el contenido gástrico durante un determinado periodo de tiempo). Una formulación de comprimido flotante de los fármaco(s) se puede preparar granulando una mezcla de los fármaco(s) con excipientes y el 20-75 % p/p de hidrocoloides, tales como hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, o hidroxipropilmetilcelulosa. Los granulos obtenidos se pueden comprimir en comprimidos. Tras el contacto con el jugo gástrico, el comprimido forma una barrera de gel sustancialmente impermeable alrededor de su superficie. Esta barrera de gel forma parte del mantenimiento de una densidad inferior a uno, permitiendo de esta manera que el comprimido siga flotando en el jugo gástrico.

Líquidos para administración oral.

Los polvos, polvos dispersables o granulos adecuados para preparar una suspensión acuosa por adición de agua son formas de dosificación convenientes para administración oral. La formulación como suspensión proporciona el principio activo en una mezcla con agentes dispersantes o mojantes, agentes de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes de suspensión adecuados son, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, alginato de sodio y similares.

Composiciones parenterales La composición farmacéutica también se puede administrar parentalmente mediante inyección, infusión o implante (intravenoso, intramuscular, subcutáneo, o similar) en formas de dosificación, formulaciones o mediantes dispositivos o implantes adecuados para administración que contienen vehículos y adyuvantes convencionales no tóxicos. La formulación y preparación de dichas composiciones son bien conocidas de los expertos en la técnica de la formulación farmacéutica.

Las composiciones para uso parenteral pueden proporcionarse en formas de dosificación unitaria (por ejemplo, en ampollas de un solo uso), o en viales que contengan varias dosis y a los que se puede agregar un conservante adecuado (ver más adelante) La composición puede estar en forma de disolución, suspensión, emulsión, dispositivo de infusión, o un dispositivo de administración para implante o se puede presentar como polvo seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Además de los fármaco(s) activo(s), la composición puede incluir vehículos y/o excipientes adecuados parentalmente aceptables. El (los) fármaco(s) activo(s) puede(n) estar incorporado(s) a microesferas, microcápsulas, nanopartículas, liposomas o similares para liberación controlada. La composición puede incluir agentes suspensores, solubilizantes, estabilizantes, de ajuste del pH, y/o dispersantes.

Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden estar en la forma adecuada para inyección estéril. Para preparar dicha composición, el (los) fármaco(s) activo(s) adecuado(s) está(n) disuelto(s) o suspendido(s) en un vehículo líquido parentalmente aceptable. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están agua, agua ajustada a un pH adecuado por adición de una cantidad adecuada de ácido clorhídrico, hidróxido sódico o de un tampón adecuado, 1 ,3-butanodiol, disolución de Ringer, y disolución isotónica de cloruro de sodio. La formulación acuosa también puede contener uno o más conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoato de metilo, etilo o n-propilo). En los casos en los que uno de los fármacos sea ¡nsoluble o poco soluble en agua, se puede agregar una solución de potenciación o un agente de solubilización, o el disolvente puede incluir un 10-60 % p/p de propilenglicol o similar.

Las composiciones parenterales de liberación controlada pueden estar en forma de suspensiones acuosas, microesferas, microcápsulas, microesferas magnéticas, disoluciones oleosas, suspensiones oleosas, o emulsiones. Alternativamente, los fármaco(s) activo(s) pueden incorporarse a vehículos biocompatibles, liposomas, nanopartículas, implantes, o dispositivos de infusión. Los materiales para uso en la preparación de microesferas y/o microcápsulas son, por ejemplo, polímeros biodegradables/bioerosionables tales como poligalactina, policianoacrilato de isobutilo), poli(2-hidroxietil-L-glutamina). Los vehículos biocompatibles que se pueden usar al formular una formulación parenteral de liberación controlada son hidratos de carbono (por ejemplo, dextranos), proteínas (por ejemplo, albúmina), lipoproteínas, o anticuerpos. Los materiales para uso en implantes pueden ser no biodegradables (por ejemplo, polidimetil siloxano) o biodegradables (por ejemplo, poli(caprolactona), poli(ácido glicólico) o poli(ortoésteres)).

Composiciones rectales Para aplicaciones rectales, las formas de dosificación adecuadas para composición incluyen supositorios (tipo emulsión o suspensión) y cápsulas rectales de gelatina (disoluciones o suspensiones). En una formulación de supositorio típica, el (los) fármaco(s) activo(s) está(n) combinado(s) con. una base de supositorio farmacéuticamente aceptable tal como manteca de cacao, ácidos grados esterificados, gelatina glicerinada, y diferentes bases solubles o dispersables en agua tipo polietilenglicoles. Se pueden incorporar varios aditivos, potenciadores o tensioactivo.

Composiciones percutáneas y tópicas Las composiciones farmacéuticas pueden también administrarse tópicamente sobre la piel para absorción percutánea en formas de dosificación o formulaciones que contienen vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables convencionalmente no tóxicos entre los que se incluyen microesferas y liposomas. Las formulaciones incluyen cremas, pomadas, lociones, linimentos, geles, hidrogeles, disoluciones, suspensiones, adhesivos, pulverizadores, pastas, emplastos y otros tipos de sistemas de administración transdérmicos para fármacos. Los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables pueden incluir agentes emulsionantes, antioxidantes, agentes tamponantes, conservantes, humectantes, potenciadores de la penetración, agentes quelantes, agentes formadores de gel, bases para pomadas, perfumes, y agentes protectores de la piel.

Los agentes emulsionantes pueden ser gomas naturales (por ejemplo, goma de acacia o goma de tragacanto.

Los conservantes, humectantes, potenciadores de la penetración, pueden ser parabenos, tales como p-hidroxibenzoato de metilo o propilo, y cloruro de benzalconio, glicerina, propilenglicol, urea, etc.

Las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente para administración tópica sobre la piel también se pueden usar junto a la administración tópica en o cerca de la parte del cuerpo que se va a tratar. Las composiciones se pueden adaptar para aplicación directa o para aplicación mediante dispositivos especiales para administración de fármaco tal como apositos, o alternativamente emplastos, parches, esponjas, tiras o formas de material flexible adecuado.

Dosificaciones y duración del tratamiento Se tendrá en cuenta que los fármacos de la combinación se pueden administrar de forma concomitante en la misma o en distinta formulación farmacéutica o bien secuencialmente. En una realización preferida, los fármacos se formulan juntos, en el mismo excipiente o vehículo. Si la administración es secuencial, el retraso al administrar el segundo principio activo (o adicional) no debe ser tal que se pierda la ventaja del efecto eficaz de la combinación de los principios activos. Un requisito mínimo de una combinación según esta memoria descriptiva es que la combinación debe estar prevista para uso combinado con la ventaja del efecto eficaz de la combinación de los principios activos. El uso previsto de una combinación puede inferirse de las instalaciones, provisiones, adaptaciones y/o otros medios de ayuda usando la combinación según la invención.

Las cantidades terapéuticamente eficaces de dos o más fármacos que son sujeto de esta invención se pueden usar conjuntamente para la preparación de un medicamento útil para reducir el efecto del aumento en la expresión del gen PMP22, evitando o reduciendo el riesgo de desarrollar la enfermedad CMT1A, deteniendo o ralentizando la progresión de la enfermedad CMT1A una vez se ha manifestado clínicamente, y evitando o reduciendo el riesgo de una aparición primera o posterior de un episodio neuropático.

Aunque los fármacos activos de la presente invención se pueden administrar en dosis divididas, por ejemplo dos o tres veces al día, se prefiere una única dosis diaria de cada fármaco en la combinación, siendo lo más preferido una única dosis diaria de todos los fármacos en una única composición farmacéutica (forma de dosificación unitaria).

La administración puede realizarse de una a varias veces al día durante varios días o varios años, e incluso puede ser durante toda la vida del paciente. La administración crónica, o al menos periódicamente repetida durante una administración a largo plazo será lo indicado en la mayor parte de los casos.

• El término "forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas (tales como cápsulas, comprimidos o cilindros rellenos para jeringuillas) adecuado como dosificaciones unitarias para sujetos humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material o materiales activos calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.

La cantidad de cada fármaco en la combinación preferida para una dosificación unitaria dependerá de varios factores entre los que se incluyen el procedimiento de administración, el peso corporal y la edad del paciente, la gravedad del daño neuropático ocasionado por la enfermedad CMT1A o el riesgo de los potenciales efectos secundarios teniendo en cuenta el estado de salud general de la persona que se va a tratar.

Adicionalmente, la información farmacogenómica (el efecto del genotipo sobre la farmacocinética, farmacodinámica o perfil de eficacia de un compuesto terapéutico) de un paciente concreto puede afectar la dosificación usada.

Excepto cuando se responde a casos de la enfermedad CMT especialmente desequilibrantes que los que se requieren dosis más altas, o cuando se tratan niños para los que se escogen dosis más bajas, la dosis preferida de cada fármaco en la combinación estará usualmente comprendida en el intervalo de dosis que no superen la normalmente prescrita para el tratamiento de mantenimiento a largo plazo o que se haya demostrado como segura en grandes estudios clínicos de fase 3. Por ejemplo, · para metimazol de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15 mg por día si se toma oralmente. Deben elegirse dosis especiales si se administra tópicamente. • para pilocarpina de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg por día si al día se toma oralmente.

La dosificación más preferida se corresponderá con cantidades del 1 % hasta el 10 % de la habitualmente prescrita para el tratamiento de mantenimiento a largo plazo.

Se entenderá que la cantidad de fármaco realmente administrado será determinada por un médico, a la luz de las circunstancias relevantes entre las que se incluyen la dolencia o dolencias a tratar, la composición exacta que se va a administrar, la edad, peso y respuesta del paciente individual, la gravedad de los síntomas del paciente, y la ruta de administración elegida. Por tanto, los intervalos de dosificación anteriores están previstos para proporcionar guía y apoyo general de las enseñanzas del presente documento, pero no se pretende que limiten el alcance de la invención.

Esquema terapéutico, dosificaciones y rutas de administración A continuación se describen las dosificaciones para las combinaciones de fármacos (que difieren según las rutas de administración) en seres humanos.

Metimazol y pilocarpina 1. Administrado oralmente como una única composición farmacéutica: metimazol de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15 mg y pilocarpina de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg cada día oralmente durante varios meses, las dosificaciones más preferidas para ambos fármacos en la composición están en un intervalo de 0,6 a 35 mg por unidad (por día). 2. Administrado de forma concomitante oralmente durante varios meses: metimazol de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 15 mg y pilocarpina de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 20 mg cada día oralmente durante varios meses, las dosificaciones más preferidas para ambos fármacos en la composición están en un intervalo de 1 ,02 a 35 mg por unidad (por día). 3. Administrado de forma concomitante durante varios meses: metimazol de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 15 mg y pilocarpina de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg cada día oralmente durante varios meses, las dosificaciones más preferidas para ambos fármacos en la composición están en un intervalo de 0,06 a 35 mg por unidad (por día).

Las dosificaciones de este fármaco en cualquier combinación entre las dadas a conocer en la presente invención pueden diferir en las formulaciones propuestas para el tratamiento de hombres y mujeres.

Aspectos adicionales y ventajas de la presente invención se darán a conocer en la siguiente sección experimental, que debe considerarse como meramente ilustrativa.

EJEMPLOS 1. Experimentos in vitro Células de Schwann primarias comercializadas de ratas Viales con cultivo primario de células de Schwann (SC) de rata (Sciencell n° R1700) se descongelaron y sembraron a una densidad de 10.000 células/cm2 en "medio celular Schwann de Sciencell" (medio basal de Sciencell n° R1701) en frascos de 75 cm2 revestidos con poli-L-lisina. El medio de cultivo está compuesto por medio basal, suero fetal bovino al 5 % (3H-Biomedical AB n°1701 -0025), suplemento de crecimiento para células de Schwann al 1 % (3H Biomedical AB n°1701-1752), gentamicina al 1 % (Sigma n° G 1397) y 10 µ? de Forskolina (Sigma n° F6886) para estimular su proliferación.

Tras alcanzar la confluencia (4 a 10 días dependiendo del lote de células), las células de Schwann se purificaron por agitación suave o mediante immunopanning thyl.1 que permite el aislamiento de SC de los fibroblastos adherentes, para producir cultivos que sean puros en al menos un 95 %. A continuación, las SC se contaron (procedimiento del azul tripán) y se sembraron en frascos de 75 cm2 revestidos con poli-L-lisina con el mismo medio SC. A la confluencia, las células se lavaron, se tripsinizaron (tripsina-EDTA 1x diluido de Invitrogen n°1540054), se diluyeron en PBS sin calcio ni magnesio), se contaron y plaquearon en placas de 12 pocilios (140000 células/pocilio) en medio para Schwann de Sciencell con FBS al 5 %, 1 % de suplemento de crecimiento celular (CGS), 40 µ9/? de gentamicina y 4 µ? de Forskolina.

Células de Schwann primarias de rata personalizadas Se establecieron cultivos primarios de células de Schwann (SC) a partir de nervios ciáticos de ratas Sprague-Dawley recién nacidas (entre PO y P2). Todas las ratas recién nacidas se sacrificaron y aislaron en una placa Petri. La disección se realizó en condiciones estériles.

Se retiró la piel dorsal de la pata trasera y del torso inferior. Se aisló el nervio ciático y se transfirió a una placa de cultivo que contenia Leibovitz (LI5, Invitrogen n°11415) enfriado en hielo suplementado con disolución al 1 % de penicilina/estreptomicina (50 Ul/ml y 50 µg/ml1 respectivamente; Invitrogen n°15070) y albúmina de suero bovino al 1 % (BSA, Sigma A6003). Ambos nervios por rata se transfirieron a un tubo de 15 mi que contenía L15 enfriado en hielo. El medio L15 se retira a continuación y se sustituye por 2,4 mi de DMEM (Invitrogen n°21969035) con 10 mg/ml de colagenasa (Sigma n°A6003). Los nervios se incubaron en este medio durante 30 minutos a 37 °C. A continuación se retiró el medio y ambos nervios se disociaron mediante tripsina (10 % de tripsina en EDTA 10x, Invitrogen n°15400054) se diluyeron en PBS sin calcio ni magnesio (Invitrogen n° 2007-03) durante 20 min a 37 °C. La reacción se detuvo por adición de DMEM que contenía DNasa I calidad II (0,1 mg/ml Roche diagnostic n°104159) y suero de ternera fetal (FCS 10 %, Invitrogen n°10270). La suspensión celular se trituró con una pipeta de 10 mi y se hizo pasar por un filtro a un tubo de 50 mi (unidades de filtración Swinnex de 13mm, Millipore, con filtros de malla de nylon de 20) µ?, Fisher). La suspensión celular centrifugó a 350 g durante 10 min a temperatura ambiente (RT) y los residuos se suspendieron en DMEM con FCS al 10 % y 1 % de penicilina/estreptomicina. Las células se contaron (método de azul tripán) y se sembraron en placas de cultivo tisular Falcon 100mm Primaria a la densidad de 5 x105 a 106 células/disco.

Tras un día de cultivo, el medio se cambio a DMEM, FCS al 10 %, 1 % de penicilina/estreptomicina y 10 µ? de citosina b-D-arabinofuranósido (Sigma n°CI768). 48 h después, se eliminó el medio y las células se lavaron tres veces con DMEM. El medio de crecimiento de SC se agregó a continuación, compuesto de DMEM, FCS al 10 %, 1 % de penicilina/estreptomicina, 2 µ? de Forskolina (Sigma n°F6886), 10 µg/ml de extracto de pituitaria bovina (PEX, Invitrogen n°13028). El medio se sustituyo cada 2-3 días.

Tras 8 días de cultivo (4 a 10 días dependiendo de los lotes celulares), las células de Schwann alcanzaron confluencia y el cultivo, que contenía una gran cantidad de fibroblastos contaminantes, se purificó mediante el procedimiento de immunopanning thy 1.1. Tras su purificación, las células se suspendieron en medio de crecimiento a 10000 células/cm2 en frascos de 75 cm2 revestidos de poli-L-lisina. Una vez alcanzaron confluencia, las células se lavaron, se tripsinizaron (tripsina-EDTA), se contaron y plaquearon en placas de 12 pocilios (100 000 células/pocilio). Incubación del fármaco: Una vez se plaquearon las células en placas de 12 pocilios, el medio se sustituyó por un medio definido constituido por una mezcla de DMEM-F12 (Invitrogen n° 21331020) complementado por suplemento N2 al 1 % (Invitrogen n° 17502), L-Glutamina al 1 % (Invitrogen n°25030024) FBS al 2,5 % (Sciencell n°0025), 0,02 µg/ml de corticoesterona (Sigma n° C2505), 4µ? de Forskolina y 50 µg/ml de gentamicina. No se agregaron a este medio los factores de crecimiento, para promover la diferenciación de las SC. 24 horas después, el medio se sustituyó por un medio definido (DMEM-F12) complementado por Insulina-Transferrina-Selenio-X al 1 % (ITS, Invitrogen n° 51300), 16 µg ml de Putrescina (Sigma n° P5780), 0,02 µg/ml de corticoesterona y 50 µg/ml de gentamicina. En este punto, en el medio no había ni progesterona ni forskolina.

Un día después, las células de Schwann primarias se estimularon con fármacos durante 24 h (3 pocilios/condición). La preparación de cada compuesto se realizó justo antes de su adición al medio de cultivo celular.

Se ensayó pilocarpina (SIGMA) en las células de Schwann primarias con un intervalo de concentraciones de 10 µ? a 10 nM, mientras que el metimazol (SIGMA) se ensayó a 10 µ?, 1 µ?, 100 nM y 10 nM.

Los fármacos se agregaron a un medio definido compuesto por DMEM-F12, con Insulina-Transferrina-Selenio-X al 1 % (ITS, Invitrogen n° 51300), 16 µg/ml de Putrescina (Sigma n° P5780), 0,02 µg/ml de corticoesterona, 10 nM de progesterona y 50 µg/ml de gentamicina. La ausencia de Forskolina antes y después de la estimulación con el fármaco evita la saturación de la adenilato ciclasa.

Células de schwannoma cultivadas La línea celular de schwannoma de rata RT4-D6-P2T (ATCC n°CRL-2468™) se descongeló en DMEM (ATCC n°30-2002) y FCS al 10 % (invitrogen n°10106). Las células se mantuvieron a 37 °C en un incubador humidificado, en una atmósfera de aire (95 %)-C02 (5 %). En el paso n° 4, las células se disociaron mediante tripsinización (+ 1 mi de Tripsina-EDTA, 0,25 %-0,53 mM; Invitrogen) durante de 5 a 15 min a 37 °C. La reacción se detuvo por adición de DMEM que contenía suero fetal bovino al 10 % (FBS). Los pocilios se contaron en un citómetro Neubauer usando el ensayo de exclusión del azul tripán (Sigma). La suspensión se trituró con una pipeta de 10 mi y a continuación las células se centrifugaron a 350xg durante 10 min a temperatura ambiente. El residuo de las células disociadas se resuspendió y se sembró sobre la base de 30.000 células/ml en placas de 12 pocilios. 48 h después, el medio se sustituyó por un medio sin suero (DMEM). Tras 15 h, los pocilios RT4-D6P2T se estimularon mediante fármacos agregados al medio de cultivo celular a la concentración elegida. La preparación de cada combinación de fármaco o fármacos individual se realizó justo antes de su adición al medio de cultivo celular.

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) cuantitativa.

Se usó la RT-PCR cuantitativa para comparar los niveles de ARNm de PMP22 tras la estimulación con fármaco, en relación al ARNm de RPS9 alojado en la línea celular RT4-D6P2T. 8 h tras la incubación con el fármaco, las células se lavaron con PBS esterilizado frío, se extrajeron los ARN totales de cada muestra celular y se purificaron de las SC usando el microkit Qiagen RNeasy (Qiagen n°74004). Los ácidos nucleicos se cuantíficaron en un espectrofotómetro Nanodrop usando 1 µ? de muestra de ARN. La integridad del ARN se determinó en un equipo BioAnalyzer (Agilent).

Los ARN se transcribieron inversamente a ADNc según un protocolo normalizado. Las plantillas de ARN para amplificación por la PCR se sintetizaron a partir de 100 ng de ARN total usando transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen n° 18064-014) durante 60 min a 42 °C en presencia de oligo(dT), en un volumen final de 20 µ?.

Los ADNc se sometieron a amplificación por la PCR usando el sistema «LightCycler® 480» (Roche Molecular Systems Inc.) Cada ADNc se diluyó cinco veces antes de usarse para amplificación por la PCR. 2 µ? de estos ADNc se introdujeron en la disolución de reacción PCR con 5 µ? del kit de mezcla Master (Roche n°04-887301001) en un volumen final de 10 µ?. Experimentos preliminares aseguraron que la cuantificación se realizaba en la fase exponencial del proceso de amplificación para ambas secuencias, y que la eficacia de la reacción es similar entre los genes diana y domésticos.

Se usó la química de Taqman para realizar el análisis RT-Q-PCR. La reacción PCR se realizó por amplificación de PMP22 (NM_017037) de rata usando 500 nM de cada uno de los cebadores (F y ) y 200 nM de la sonda Taq1 de Sigma-Aldrich.

Se usaron las siguientes condiciones para la PCR: desnaturalización 5 min a 95 °C seguido por 10 s a 95 °C, 40 s a 60 °C y 10 s a 72 °C y 1 min a 40 °C (cuarenta ciclos de amplificación). Los niveles relativos de la expresión del gen de PMP22 gene se midieron siguiendo el procedimiento Ct que compara la cantidad de productos generados a partir del gen diana PMP22 y el análisis de la expresión de PMP22 mediante citometría de flujo (FACS) 8 h, 24 h y 48 h tras la incubación con el fármaco, se recuperaron los sobrenadantes de las células de Schwann primarias de rata, se centrifugaron y congelaron. Las SC se desprendieron con tripsina-EDTA. Tan pronto como la mayoría de las células estuvo en suspensión, la tripsina se neutralizó mediante DMEM con FCS al 10 %.

Los sobrenadantes con células se recuperaron y se centrifugaron. Los residuos de las células se transfirieron a microtubos, se lavaron una vez con PBS y se fijaron con una disolución específica (AbCys n° reactivo A BUF09B). 10 minutos después, las células se lavaron una vez con PBS y se mantuvieron a 4 °C.

, Cinco días tras la fijación celular, todas las preparaciones celulares con diferentes tiempos de centrifugación se marcaron usando el siguiente protocolo.

Se centrifugaron las células a 7000 rpm durante 5 minutos y se suspendieron los aglomerados en una disolución de permeabilización (AbCys n° de Reactivo B BUF09B) y se marcaron con anticuerpo primario dirigido contra PMP22 (Abcam n° ab61220, 1/50) durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, se centrifugaron las células a 7000 rpm durante 5 minutos y se lavaron los aglomerados celulares una vez en PBS. Se añadió un anticuerpo secundario, acoplado a Alexa Fluor 488 (anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de conejo, Molecular Probes n° A11008, 1/100), durante una hora a temperatura ambiente. A continuación se centrifugaron las células a 7000 rpm durante 5 minutos y se lavaron los aglomerados celulares una vez en PBS. Se aumentó el marcado añadiendo un anticuerpo terciario acoplado a Alexa Fluor 488 (anticuerpo de pollo dirigido contra IgG de cabra, Molecular Probes n° A21467, 1/100) durante una hora de incubación, a temperatura ambiente. A continuación se lavaron las células una vez en PBS. Se llevó a cabo un control sin ningún anticuerpo (células sin marcar) para determinar el nivel de autoflorescencia y se adaptó la sensibilidad de los fotomultiplicadores. Se llevó a cabo un control con anticuerpos secundario y terciario pero sin anticuerpo primario, para evaluar la unión no específica de los anticuerpos.

Se llevaron a cabo la adquisición y el análisis de los datos con un citómetro FACS Array y software FACS Array (Becton Dickinson) sobre 5000 células. Se analizaron la dispersión central (FSC) correlacionada con el volumen celular (tamaño) y la dispersión lateral (SSC) dependiente de la complejidad interna de las células (granularidad). Para la expresión de PMP22, se llevó a cabo el análisis con las células totales y se calculó el porcentaje de células positivas. Las células positivas son células que tienen una intensidad de la fluorescencia mayor que el control con el anticuerpo secundario.

Con el fin de cuantificar el número de SC, se analizaron las células en el medio control usando anticuerpos dirigidos contra la proteína S100.

Se prepararon las células según el siguiente protocolo: se tiñeron células de Schwann con anticuerpo dirigido contra la proteína S100 (Dako n° S0311, 1/100) durante 1 h a temperatura ambiente. Se marcó este anticuerpo según el protocolo descrito anteriormente para la inmunotinción de PMP22 pero sin incubación con anticuerpo terciario.

Resultados Los inventores observaron que los niveles del ARNm de PMP22 (Fig. 1) disminuían significativamente en células de Schwann primarias, y que una dosis de 1 µ? de pilocarpina indujo la regulación por disminución más importante de PMP22. *: p<0,05; ***: p<0.001 ; significativamente diferente del control (test de la t de Student de pares agrupados). A la derecha, expuesto 24 horas a pilocarpina, el nivel de expresión del ARNm de PMP22 está significativamente regulado por disminución en células de Schwann primarias incluso a dosis bajas (10 nM y 50 nM). De manera similar, los inventores observaron que pilocarpina (1 µ?) disminuyó significativamente el nivel de expresión de la proteína PMP22 después de 24 horas de incubación, en un 38 % en células de Schwann primarias. Este efecto siguió siendo significativo después de 48 horas de incubación (-18 %), p<0,001).

En otro experimento, se incubaron los fármacos (relacionados en la Tabla 1) con una línea celular de schwannoma de rata durante 8 horas y se cuantificó el nivel de expresión del ARNM de PMP22 mediante la RT-Q-PCR.

Los inventores han observado (Fig. 2) que mientras que Metimazol (0,1 nm) y Pilocarpina (0,001 nm), usados como fármacos individuales, no ejercen actividad significativa sobre el nivel de expresión del ARNm de PMP22, este último disminuyó significativamente mediante su combinación. En la figura 2 se ilustra la actividad sinérgica de estos dos fármacos. Estos datos demuestran que a las concentraciones seleccionadas, la combinación de pilocarpina y metimazol es capaz de regular por disminución la expresión del gen PMP22 en células de schwannoma cultivadas, mientras que pilocarpina y metimazol, que son activos a mayores concentraciones en células de Schwann primarias no disminuyen el nivel de expresión de este gen en este sistema.

II. EXPERIMENTOS IN VIVO EN UN MODELO ANIMAL DE CMT Los inventores han ensayado compuestos y combinaciones para el efecto terapéutico en un modelo de ratas transgénicas CMT, unas ratas transgénicas PMP22 hemicigóticas que soportan tres copias adicionales del gen PMP22 de ratón que muestran signos de desmielinación en los nervios periféricos y craneales, (Sereda y col., 1996; Grandis y col., 2004). En el ARNm, un expresión en exceso promedio de 1 ,6 veces de PMP22 en ratas CMT se correlaciona con el fenotipo clínico Un posible nivel umbral de aumento en la expresión de PMP22 al cual el gen natural se convierte en un gen de la enfermedad representa una "diana" obvia a alcanzar mediante el tratamiento que tiene como objetivo reducir la expresión del gen PMP22.

Este modelo de rata CMT es una buena aproximación de la enfermedad CMT1A humana desde un punto de vista clínico. Las ratas CMT adultas presentan una reducción de la velocidad motora de la conducción nerviosa con valores similares a los de los pacientes con CMT1A, es decir, de menos del 50 %. Tras la estimulación del nervio ciático, los potenciales de acción compuestos del músculo muestran amplitudes y desincronización reducidas. Los cambios histológicos y electrofisiológicos preceden a los signos clínicos patentes de deterioro motor (Sereda y col., 1996, 2003). La pérdida axonal, confirmada por la pronunciada atrofia muscular histológica, corresponde a los síntomas de la CMT1A humana.

Las ratas CMT ya habían servido como modelo para una terapia experimental de la CMT1A (Meyer zu Hórse y col, 2007). En este modelo de la enfermedad CMT1A, los signos patentes y ocultos de la patología (deficiencia locomotora, alteraciones particulares, en las características electrofisiológicas y de los tejidos y, finalmente, el nivel de aumento en la expresión de PMP22 parecen ser lo más cercano a lo encontrado en pacientes con CMT1A).

Los inventores han ensayado los compuestos y las combinaciones para el efecto terapéutico en un modelo de rata. Se formaron grupos experimentales con ratas jóvenes de ambos géneros por separado. Se asignaron las ratas a los grupos siguiendo el programa de aleatorización basado en el peso corporal. En algunos experimentos, la aleatorización se basó en las conductas de las ratas en la prueba de la barra. Se representaron ambos géneros en los grupos control formados por miembros de una misma carnada separados que eran numéricamente iguales o mayores que los grupos de tratamiento.

Se trataron las ratas crónicamente con fármacos -alimentadas a la fuerza o inyectadas por vía subcutánea mediante una bomba osmótica Alzet (DURECT Corporation Cupertino, CA), dependiendo de la biodisponibilidad de cada fármaco durante 3 ó 6 semanas.

Se pesaron los animales dos veces a la semana con el fin de ajusfar las dosis para hacer aumentar el peso corporal. Si se escogió la bomba osmótica para la administración del tratamiento, se calcularon las dosis del fármaco en función del peso corporal promedio estimado de los animales esperado para su edad durante el periodo de duración de la bomba (6 semanas). Se reimplantaron las bombas si fue necesario, con el protocolo de anestesia apropiado.

Pruebas conductuales Se sometieron los animales cada tres o cuatro semanas a una prueba conductual. Se llevó a cabo cada prueba por el mismo investigador en la misma habitación en el mismo momento del día; se mantuvo esta homogeneidad durante todo el experimento completo. Todos los tratamientos y la determinación del genotipo fueron ciegos para el investigador. Se han usado principalmente la "prueba de la barra" y la "fuerza de agarre" para acceder a la conducta a lo largo del estudio. El programa de la prueba de la barra puede cambiar a medida que el animal crece (con el fin de evitar el sesgo debido al aprendizaje, por ejemplo).

La prueba de la fuerza de agarre permite la detección de diferencias sutiles en la conducta de agarre que parecen estar compuestas por la fuerza muscular, el estado de sensibilidad (por ejemplo, las sensaciones táctiles dolorosas pueden cambiar los valores de la medida de la fuerza), el componente conductual (la "motivación"). Los valores difieren entre extremidades anteriores y posteriores y dependen mucho de la edad de los animales.

La prueba de la fuerza de agarre mide la fuerza con la cual un animal se sujeta en un agarre con sus patas delanteras o sus patas traseras por separado. Se colocó un dinamómetro con un agarre para medir la fuerza (Forcé Gauge FG-5000A).

El experimentador sujeta a la rata de forma que esta se agarra al agarre tanto con sus patas delanteras como con sus patas traseras e impulsa suavemente a la rata hacia atrás hasta que esta se libera del agarre. Se registra la fuerza medida cuando el animal se libera del agarre.

Se procesaron dos ensayos sucesivos midiendo la fuerza de las patas delanteras y dos ensayos sucesivos midiendo la fuerza de las patas traseras, únicamente se da cuenta de la puntuación máxima (una para las patas delanteras y una para las patas traseras) (en N).

La prueba de la barra La prueba de la barra evalúa la capacidad de las ratas para mantenerse sobre una barra fija. Las ratas Pmp22, que muestran debilidad muscular, presentan un déficit de rendimiento en esta prueba (Sereda y col, 1996). La rata se coloca sobre sus cuatro patas en la parte intermedia de la barra (diámetro: 2,5 cm; longitud: 50 cm; 30 cm por encima de la mesa). Se llevaron a cabo las pruebas consecutivamente, el número (5 ó 10) y la duración (30 ó 60 s) de las pruebas en los experimentos de los inventores se consideró dependiendo de los lotes de los animales. Se ha introducido esta variabilidad en el ensayo con el fin de determinar el programa apropiado para la mejor detección de la deficiencia motora en las ratas CMT en el curso de los experimentos.

Se registraron los índices de rendimiento en cada sesión: - El número de pruebas necesarias para mantenerse durante 60 s o 30 s sobre la barra.

- El promedio de tiempo pasado sobre la barra (es decir, la latencia de la caída) en cada prueba y el promedio en la sesión. En los procedimientos experimentales, la sesión finaliza después que la rata ha permanecido dos veces durante un tiempo de corte, es decir, 30 ó 60 s, sobre la barra. Se asignó un rendimiento del tiempo de corte (30 s ó 60 s) a las pruebas no completadas.

- El número de caídas.

Evaluación de la salud general Se vigilaron los pesos corporales, signos patentes (apariencia del pelo, postura corporal, temblor) de los animales durante todo el experimento. Se usó la escala de puntuación para registrar: 0 = normal, 1 = anormal.

La locomoción Se observó cada rata en una jaula nueva para ratas (dimensiones 55x33x18 cm) sin cama durante cinco minutos. Se evaluó la locomoción de las ratas con 4 parámetros: - Puntuación 0: locomoción normal (fluida) - Puntuación 1 : locomoción anormal (no fluida, o la rata tiene una ligera cojera) - Puntuación 2: incapacidad moderada (la rata arrastra una de sus patas y es capaz de ponerla derecha y caminar) - Puntuación 3: grave incapacidad (la rata arrastra una o ambas patas traseras pero es incapaz de ponerlas derechas).

Prueba del plano inclinado El equipo de deslizamiento tenía un plano de plexiglás de 30x50 cm que podría inclinarse desde un ángulo de 0o (horizontal) a 60°. Se colocó inicialmente cada rata en el plano inclinado con un ángulo de 25° en la posición con la cabeza erguida (orientación con la cabeza erguida); se llevaron a cabo dos ensayos separados por 1 min. 30 min después, se realizó el mismo experimento en un plano inclinado con un ángulo de 35°, a continuación en un plano inclinado con un ángulo de 40°. Durante este tiempo, se devolvió la rata a su jaula. Se limpió el plano después de cada ensayo.

Se evaluaron las conductas de las ratas mediante 4 puntuaciones diferentes: - puntuación 0: no se desliza - puntuación 1 : un pequeño desliz (una o dos patas) - puntuación 2: un desliz moderado (4 patas) pero no hasta el final del plano - puntuación 3: la rata se desliza hasta la parte más inferior del plano Electrofisioloqía Cuando fue apropiado, las ratas se sometieron a evaluación electrofisiológica: se midieron la velocidad de conducción de los nervios sensores así como las latencias y la amplitud potencial. Se llevaron a cabo la medida de la VCN y la adquisición de potencial (por vía subcutánea) con la ayuda de la cadena compuesta por un amplificador (AM System 1700 y/o EMG-UTC), un estimulador (equipo Havard 223) y un ordenador equipado con una tarjeta de adquisición de datos y un software para la adquisición de datos (SPATOL) y para el tratamiento de la señal (CALVISE).

Se anestesiaron los animales usando ketamina/xalazina y se mantuvieron en una placa termostática a 37 °C a lo largo de la prueba (se suplementaron anestésicos según fue necesario). Se insertaron electrodos estimuladores con aguja de plata en la parte proximal de la cola. Se insertó el electrodo registrador subcutáneamente a aproximadamente 1 mm de la piel en la parte distal de la cola (4 y 6 cm del electrodo estimulador). Se administraron estímulos de onda cuadrada a corriente constante, de 0,2 s de duración, a una frecuencia de 0,3 por segundo. Se visualizaron las respuestas, amplificadas 5.000-20.000, y se recogieron en un sistema informático de adquisición de datos. Se midieron las latencias a cada comienzo de la onda (definida como la primera deflexión claramente identificable a partir de los valores iniciales). Se calcularon las amplitudes pico a pico de las mayores deflexiones para determinar la amplitud máxima. Se llevaron a cabo las medidas, para cada registro sobre las respuestas promediadas en al menos diez estímulos idénticos.

Se calculó la velocidad de conducción relacionada a nivel sensorial (VCNS) mediante división de la distancia entre los cátodos estimuladores por la diferencia entre las latencias correspondientes obtenidas a partir de los dos sitios de estimulación.

Medidas histológicas Tras las pruebas finales (se continuaron los tratamientos hasta el último día), las ratas se sometieron a eutanasia. Se diseccionaron las patas traseras de las ratas no modificadas genéticamente y transgénicas y se fijaron mediante inmersión en una disolución de formol al 4 % durante 48 h, y se transfirieron a una disolución de formol al 10 % durante 2 días más. Tras enjuagarse 15 min con agua, se procesaron a continuación para la descalcificación durante 26 h (Descalcificante rápido n° 3 n° DC3_09128300 de Labonord).

A continuación se seccionaron las patas transversalmente en dos partes que se procesaron para la coloración con osmio.

Se suspendieron los tejidos encima de una disolución de tetróxido de osmio al 1 % (VWR, 0,5 g de óxido de osmio VIII n° 20551.076) durante 24 h y a continuación se lavaron con agua desmineralizada durante 4 a 6 horas. A continuación se deshidrataron en un sistema automatizado de inclusión (VIP2000 Vertical, Bayer Diagnostics) y se incluyeron a la manera clásica en parafina.

Se deshidrataron secciones de 4 pm de tejido en sucesivos baños de xileno y alcohol y se montaron (adhesivo Pertex, n° T/00811_MICROM) para el análisis posterior.

Análisis de imagen Se seleccionaron cuidadosamente secciones procedentes de los 6 animales para ilustrar el mismo nivel anatómico (articulación de los dedos) y se analizaron con un microscopio Olympus acoplado a un software Saisam de microvisión (Archimed Pro® 1997-2000 de Microvisión Instruments). Se localizó el nervio periférico y se analizó como sigue: se contaron las fibras mielinizadas circulares (en un haz de nervios, al menos 150 fibras/ahimal). Se determinaron los cilindroejes correspondientes a los perímetros internos de las fibras mielinizadas y los perímetros externos de las mismas fibras. A continuación, los inventores compararon la distribución del grosor de la mielina y el diámetro de los axones entre los animales no manipulados genéticamente y los transgénicos.

Además, los inventores midieron la densidad óptica de la misma sección de nervios para determinar si el contenido de fibras no mielinizadas (no visibles en secciones con osmio y, por tanto, no analizadas) es mayor en los animales transgénicos (reflejado por una apariencia pálida global de la sección de nervios).

Finalmente, todos los músculos de las patas, presentes en la misma sección que la usada para el análisis de los nervios, se perfilaron manualmente para determinar la superficie global del músculo. A continuación, los inventores calcularon la relación "contenido de músculo/superficie de la sección".

Se cortaron los nervios ciáticos y se usaron para llevar a cabo la pesada así como para los ensayos de biología molecular y/o bioquímico (RT-Q-PCR para el ARNm de PMP22 y transferencias Western para las cuantificaciones de las proteínas mielínicas, kits EIA de Cayman - para los marcadores biológicos tales como metabolitos del ácido araquidónico, cuantificación mediante HPLC para los esteroides y las aminas, ELISA para CNTF, IL-6, etc) según los protocolos generalmente usados y para los procedimientos analíticos (medidas de las concentraciones de los fármacos) Se muestrearon los músculos de las extremidades posteriores (soleo), se pesaron, se congelaron instantáneamente y se preservaron a -80 °C hasta el análisis (el mismo que para los nervios ciáticos).

Resultados Metimazol (0,35 mg/kg de dosis diaria) y pilocarpina (0,2 mg/kg de dosis diaria) administrados mediante alimentación forzada, mejoran las conductas en la prueba de la barra a lo largo del procedimiento de tratamiento (Fig. 3), mientras que el compuesto PXT25 (que se presenta aquí únicamente a efectos de comparación) muestra poca mejora.

Las conductas motoras fueron en promedio 3 veces menos satisfactorias en las diferentes ratas CMT TG tratadas con placebo en comparación con el grupo no manipulado genéticamente (WT). El tratamiento con metimazol y pilocarpina permitió una mejora de los animales TG en este experimento, el efecto llegó a ser estadísticamente significativo tan rápido como después de 8 semanas de alimentación forzada.

Los datos muestran que las ratas CMT tratadas con metimazol y pilocarpina a estas dosis relativamente altas llegaron a tener una conducta más significativa en comparación con el grupo placebo. El grupo tratado con el compuesto pilocarpina recuperó incluso el nivel de conducta que no difería significativamente del grupo WT tratado con placebo.

Se encontró que el SNAP medido en la porción distal de la cola estaba significativamente disminuido en el grupo TG tratado con placebo lo que a su vez puede reflejar la importante pérdida axonal que es debida a la vez a la desmielinización. Este parámetro electrofisiológico vuelve a estar significativamente mejorado tras el tratamiento con el compuesto A, (Fig. 4) mientras que el SNAP de las ratas tratadas con el compuesto B alcanza el umbral del 5 % nominal de la significancia.

Esta observación permite suponer a los inventores que la acción de metimazol puede evitar la pérdida axonal, incluso si el estado de mielinización de los nervios periféricos no mejora de manera mensurable. Parece que el efecto de pilocarpina es esencialmente el mismo, incluso si a causa de la variabilidad intragrupos, la diferencia con el parámetro del grupo placebo fracasó en alcanzar la significancia estadística. En CMT1A (la amplitud del potencial de acción de los nervios sensores (SNAP) fue más reducida y la duración del SNAP más prolongada que en CMT2. La reducción del potencial de acción del músculo compuesto (C AP) y de las amplitudes del SNAP en CMT1A es probablemente un efecto combinado de la desmielinización y de la disfunción axonal (Bienfait y col., 2006).

Al término del estudio se ha llevado a cabo el análisis morfométrico. La medida de los tejidos de las extremidades posteriores desvela que los nervios ciáticos y los músculos soleos se redujeron significativamente en ratas hembras CMT tratadas con placebo en comparación con las ratas WT de control (Fig. 5).

Estas diferencias parecen estar completamente corregidas por el tratamiento mediante el compuesto A: las masas absolutas de los músculos y los nervios son incluso mayores en las ratas WT de control, mientras que el peso corporal total está más bien disminuido en el grupo del compuesto A en comparación con el grupo placebo (no se muestran los dátos). El efecto del tratamiento de pilocarpina sobre los músculos y nervios de las extremidades posteriores parece ser más pequeño que el de metimazol.

La Mezcla 1 (Tabla 1) a dosis 50 veces inferiores de metimazol (4 mkg/kg) y pilocarpina (7 mkg/kg) mejora la puntuación de la locomoción de las ratas hembra después de 10 semanas de tratamiento con alimentación forzada, según se muestra en la Figura 6. Los inventores observaron una tendencia positiva después de 6 semanas de tratamiento.

Las siguientes figuras ilustran el efecto positivo de la mezcla 2 (Tabla 1) que contiene pilocarpina (7 mkg/kg); metimazol (4 mkg/kg), mifepristona (40 mkg/kg), naltrexona (4 mkg/kg; balclofeno (60 mkg/kg) y sorbitol (2 mg/kg) sobre ratas macho en 3 diferentes pruebas conductuales y electrofisiológicas.

La figura 7 desvela que la Mezcla 2 a estas dosis disminuye el incremento del umbral de la excitabilidad, que se encuentra en las ratas CMT tratadas con placebo, tras una estimulación eléctrica del nervio caudal.

La figura 8 muestra el efecto positivo de la Mezcla 2 en las conductas de los machos en la prueba de la barra, tras 4 semanas de tratamiento, disminuyó el número de caídas y aumentó el tiempo pasado en la barra.

La figura ilustra el hecho de que la Mezcla 2 mejora también las conductas de locomoción de las ratas macho tras 3 semanas de tratamiento; el porcentaje de ratas que andan con una locomoción fluida aumentó un 35 % en las ratas tratadas en comparación con las ratas CMT tratadas con placebo.

Se produjeron resultados similares para otras combinaciones y en la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados. f Tabla 1 POS: reversión de los síntomas de la enfermedad in vivo Estos datos muestran que, in vivo, las combinaciones y las pautas terapéuticas de esta invención podrían permitir un tratamiento efectivo de la CMT.

III. EFECTO IN VIVO EN UN MODELO DE NEUROPATÍA TÓXICA Los tratamientos o la pauta terapéutica de fármacos se administran oralmente desde el día anterior a la primera inyección intraperitoneal de 3 mg/kg de oxaliplatino (D -1) hasta el día anterior al último día del ensayo (D16). Los animales que pertenecen al grupo tratado con oxaliplatino se dosifican diariamente con agua destilada (10 ml/kg). Se dosifican los animales con el tratamiento ensayado y agua destilada diariamente por la mañana mientras que se administra oxaliplatino por la tarde.

Durante los días del ensayo (es decir, D1 , D4, D10), se administran el tratamiento y agua destilada después del ensayo. Con respecto al día del ensayo (D4), que incluye las administraciones de los compuestos y el vehículo y la inyección de oxaliplatino, se administran el tratamiento y el agua destilada antes de la inyección de oxaliplatino después del ensayo. Los animales del grupo tratado con la referencia se dosifican diariamente durante los días del ensayo (es decir, D1 , D4, D10 y D17).

Se evaluó la alodinia al frío midiendo las respuestas a la estimulación no nociceptiva térmica (prueba de la acetona) en el D1 (alrededor de 24 h después de la primera inyección de 3 mg/kg de oxaliplatino (efecto agudo del oxaliplatino), en el D4, D10 y (efecto crónico del oxaliplatino) y en D17 (efecto residual del oxaliplatino una semana después de la finalización del tratamiento).

Se lleva a cabo el ensayo usando la prueba de la acetona dos horas después de la administración de la referencia.

La sustancia de referencia es gabapentina, 100 mg/kg, por vía oral (una vez al día x 4 días de ensayo).

Prueba de la acetona Se evaluó la alodinia al frío usando la prueba de la acetona. En esta prueba, se midió la latencia de retirada de las patas traseras tras la aplicación de una gota de acetona en la superficie plantar de ambas patas traseras (tiempo de reacción) y se puntuó la intensidad de la respuesta (puntuación al frío).

Se midió el tiempo de reacción al efecto de enfriamiento en los 20 s (corte) después de la aplicación de la acetona. Se graduaron también las respuestas a la acetona en la siguiente escala de 4 puntos: 0 (sin respuesta); 1 (retirada rápida, latigazo de la pata); 2 (retirada prolongada o marcado latigazo de la pata); 3 (latigazos repetidos de la pata con lameduras o bocados).

Se llevaron a cabo 6 ensayos por rata. Para cada grupo experimental, se expresaron los resultados como la puntuación al frío acumulada definida como la suma de las 6 puntuaciones por cada rata en conjunto + SEM. Siendo la puntuación mínima 0 (sin respuesta a cualquiera de los 6 ensayos) y siendo la posible puntuación máxima 18 (latigazos repetidos y lameduras o bocados en las patas en cada uno de los seis ensayos).

Gabapentina: Fuente: Zhejiang Chiral Medicine Chemicals, China Oxaliplatino: Fuente: Sigma, Francia Resultados En la figura 10, se muestran los resultados del ensayo de la mezcla 2 en oxaliplatino. Es evidente que la mezcla de 2 protege a los animales de la neuropatía inducida por el tratamiento del fármaco tóxico.

IV. EFECTO IN VIVO EN UN MODELO DE ELA Modelo animal Los inventores han seleccionado el modelo SODIG93A de rata (generado por Howland DS y col, 2002) para imitar la patología de la Esclerosis Lateral Amiotrófica.

Este modelo muestra un aumento en la expresión del gen SODI mutado en la médula espinal, en muchas regiones cerebrales así como en tejidos periféricos (Howland DS y col, 2002). El inicio de la neuropatía motora en este modelo se produce en aproximadamente 115 días (Howland DS y col, 2002); aparece en forma de una locomoción anormal de las extremidades posteriores. En unos pocos días aparece la parálisis de los miembros posteriores.

Procedimientos experimentales Los inventores obtuvieron colonias cruzando ratas macho SODIG93A reproductores con ratas hembra Sprague Dawley. Se identificaron ratas SODIG93A heterocigóticas con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de la cola de ADN con cebadores específicos de hSODI (Howland DS y col, 2002). Se mantuvieron los animales en una habitación con iluminación (luz entre las 0500-1900 h) y temperatura (23 + 1 °C) controladas, y se les proporcionó acceso libre a alimentos y agua. Se llevaron a cabo todos los procedimientos animales en el presente estudio según las directrices estándares de cuidados animales.

Se llevó a cabo la medida del peso corporal cada semana y los ensayos de conducta comenzaron a una edad de 60 días y continuaron hasta el final. Se administraron los tratamientos cada día por vía oral o subcutánea desde la edad de 5 semanas.

Ensayo de observación: caracterización del aspecto general Se observó cada rata en una nueva jaula para ratas (dimensiones 55x33x18 cm) sin la carnada durante cinco minutos. Se registraron 5 parámetros diferentes: La locomoción - puntuación 0: locomoción normal (fluida) - puntuación 1 : locomoción anormal (no fluida, o la rata tiene una ligera cojera) - puntuación 2: incapacidad moderada (la rata arrastra una pata y es capaz de ponerla derecha y caminar) puntuación 3: grave incapacidad (la rata arrastra una o ambas patas traseras pero es incapaz de ponerlas derechas) El aspecto del pelo - puntuación 0: pelo limpio y sedoso - puntuación 1 : piloerección o pelo sucio El temblor - puntuación 0: sin temblor - puntuación 1 : temblor La posición del cuerpo - puntuación 0: normal - puntuación 1 : anormal (su lomo está aplanado o arqueado) La posición de las patas traseras - puntuación 0: normal - puntuación 1 : patas traseras extendidas Puntuación de la prueba motora: caracterización del déficit motor Esta prueba evalúa la capacidad de las ratas de enderezarse por sí mismas en los 30 s de hacerlas girar sobre cada uno de los lados (reflejo de enderezamiento) (Gale K. y col., 1985).

Se usó un sistema de puntuación no paramétrico siguiendo estos criterios (Matsumoto A. y col., 2006; Thonhoff JR y col., 2007): - puntuación 0: la rata es incapaz de enderezarse por sí misma en los 30 s desde cada uno de los lados; - puntuación 1 : la rata es incapaz de enderezarse por sí misma en los 30 s desde únicamente un lado; - puntuación 2: la rata es capaz de enderezarse por sí misma en los 30 s desde ambos lados pero es incapaz de alzarse en la jaula; está siempre arrastrando alguna parte del cuerpo; - puntuación 3: la rata es capaz de enderezarse por sí misma en los 30 s desde ambos lados, es incapaz de alzarse en la jaula pero no está arrastrando ninguna parte del cuerpo; - puntuación 4: la rata es capaz de enderezarse por sí misma en los 30 s desde ambos lados, es capaz de alzarse en la jaula pero tiene déficits funcionales visibles; - puntuación 5: la rata es capaz de enderezarse por sí misma en los 30 s desde ambos lados, es capaz de alzarse en la jaula y no tiene déficits funcionales visibles.

El punto final de la enfermedad se fija en la puntuación 0; a continuación se somete a eutanasia a la rata.

Prueba del plano inclinado: caracterización del déficit motor El equipo de deslizamiento tenía un plano de plexiglás de 30x50 cm que podía inclinarse desde un ángulo de 0° (horizontal) a 60°. Se colocó inicialmente cada rata en el plano inclinado con un ángulo de 25° en la posición con la cabeza erguida (orientación con la cabeza erguida): se llevaron a cabo dos ensayos separados por 1 min. 30 min después, se realizó el mismo experimento en un plano inclinado con un ángulo de 35°, a continuación en un plano inclinado con un ángulo de 40°. Durante este tiempo, se devolvió la rata a su jaula. Se limpió el plano después de cada ensayo.

Se evaluaron las conductas de las ratas mediante 4 puntuaciones diferentes: - puntuación 0: no se desliza - puntuación 1 : un pequeño desliz (una o dos patas) - puntuación 2: un desliz moderado (4 patas) pero no hasta el final del plano - puntuación 3: la rata se desliza hasta la parte más inferior del plano La prueba de la malla de alambre caracterización de la capacidad motora en una situación difícil Se colocó una malla de alambre en contacto con una caja en la parte superior (en un ángulo de 70°) y el borde de una mesa en la parte inferior (Thonhoff y col., 2007). Se colocó cada rata en la parte inferior de la malla de alambre y se la motivó a ascender colocando a sus compañeras de jaula en la caja de la parte superior. Se entrenó a cada rata una vez una semana (3 ensayos).

El parámetro registrado fue el tiempo de latencia para alcanzar la parte superior de la malla de alambre.

La prueba a campo abierto: caracterización de la actividad locomotora Se midió la actividad locomotora en una caja de plexiglás (45x45x30 cm, Anti-Track por BIOSEB, Lyon, Francia) con haces de 16 fotocélulas siguiendo los dos ejes, 1 y 5 cm por encima del suelo.

Se evaluó la actividad espontánea y exploradora de cada rata durante 3 horas. Se registraron 4 parámetros (la distancia total recorrida, el número de erguimientos, el porcentaje de distancia recorrida y de tiempo pasado en el centro del campo abierto).

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Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Una composición caracterizada porque comprende pilocarpina y metimazol, o un profármaco del mismo y, opcionalmente, un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

2. Una composición de la reivindicación 1 , para el tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie Tooth o de una dolencia relacionada con CMT.

3. Una composición caracterizada porque comprende pilocarpina y metimazol, o un profármaco del mismo y, opcionalmente, un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, para tratar CMT1A.

4. Un producto de combinación caracterizado porque comprende un agonista del receptor muscarínico y un inhibidor de la síntesis de la hormona tiroidea, o un profármaco del mismo, para una administración conjunta o individual a un sujeto, simultánea o secuencialmente.

5. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un agonista del receptor muscarínico y un inhibidor de la síntesis de la hormona tiroidea, o un profármaco del mismo, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

6. Un producto o composición de la reivindicación 4 ó 5, para tratar la enfermedad de Charcot-Marie Tooth o una dolencia relacionada con CMT, particularmente CMT1A.

7. Un producto o composición de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque el agonista del receptor muscarínico es pilocarpina o un profármaco del mismo.

8. Un producto o composición de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de la hormona tiroidea además muestra actividad en la señalización de la prostaglandina.

9. Un producto o composición de la reivindicación 8, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de la hormona tiroidea es metimazol o un profármaco del mismo, tal como carbimazol.

10. Un producto o composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende además al menos un principio activo adicional.

11. Un producto o composición según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho al menos un principio activo adicional se selecciona entre baclofeno, mifepristona, sorbitol, naltrexona, rapamicina, ketoprofeno y flurbiprofeno.

12. Un producto o composición según la reivindicación 10 u 11 , caracterizado porque dicho al menos un compuesto adicional es baclofeno o mifepristona.

13. Un producto o composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende metimazol, pilocarpina, baclofeno, mifepristona y sorbitol.

14. Un producto o composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende metimazol, pilocarpina, baclofeno, mifepristona, sorbitol y naltrexona.

15. Un producto o composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende cualquier combinación de fármacos según la Tabla 1.

16. Un producto o composición caracterizado porque contiene metimazol y baclofeno

17. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 caracterizada porque los compuestos están combinados para administración conjunta o individual, de forma simultánea o secuencial.

18. Una composición caracterizada porque comprende un agonista del receptor muscarínico y un inhibidor de la síntesis de la hormona tiroidea para el tratamiento de la CMT en un sujeto, en donde el tratamiento comprende adicionalmente una etapa de determinar si el paciente tiene CMT1A.