CN103789452A

CN103789452A - 用于n9亚型禽流感病毒检测的rt-lamp引物组、检测方法及应用

Info

Publication number: CN103789452A
Application number: CN201410051878.8A
Authority: CN
Inventors: 包红梅; 王秀荣; 陈化兰
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2014-02-14
Filing date: 2014-02-14
Publication date: 2014-05-14

Abstract

本发明公开了一组用于N9亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组、检测方法及应用，所述的引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别如SEQ ID No.1、2所示，内引物对序列分别如SEQ ID No.3、4所示，环引物对序列分别如SEQ ID No.5、6所示。本发明的引物组可用于制备针对N9亚型禽流感病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括：反应混合液、酶混液和双蒸水、荧光检测试剂以及本发明的引物组。本发明检测试剂盒具有用样少、特异性强、敏感性高、快速准确等特点，为N9亚型禽流感的防控预警机制提供了简捷、有效的早期快速诊断途径。

Description

用于N9亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组、检测方法及应用

技术领域

本发明涉及禽流感病毒的检测方法，属于禽流感病毒的检测领域。

背景技术

禽流感的暴发和流行给畜牧业造成了巨大的经济损失，对人类健康造成了严重威胁。在禽流感的HA亚型中，只有H5和H7亚型对禽是高致病性的（Alexander DJ，1995），称为高致病性禽流感（High pathogenic avian influenza，HPAI），该类病毒可引起鸡群100%死亡，被国际兽疫局确定为A类传染病（Truszczynsky et al，2000）。A型流感病毒的自然宿主是野生水禽、鸥和岸基鸟，而家鸭也是AIVs巨大的储存库，同时也被认为是AIVs从自然宿主到家禽传播的一个重要中间宿主。许多家禽如鸡、火鸡、珍珠鸡、鹌鹑、鸭、鹅等都可感染发病，但以鸡、火鸡、鸭和鹅多见。

2013年发生了H7N9亚型流感病毒感染人甚至致死的事件，表明禽流感的危害已不仅是对养禽业的破坏，更为主要的是它对人类健康已构成潜在的威胁。

快速诊断和及时监测是禽流感防控的首要步骤和重要一环。目前，有关禽流感的检测方法较多，经典的流感病毒病原学诊断方法中病毒分离及其生物学特性的研究是最为可行和最能说明问题的，但病毒的分离鉴定需要将病料接种鸡胚或组织培养，需要较长的时间（几天到一周），不能够满足急性烈性传染病紧急疫情防治工作的需要，同时由于高致病性禽流感病毒存在感染哺乳动物的潜在危险，病毒的操作需要在生物安全三级实验室进行，一般检疫部门不具备这种试验条件。快速、灵敏、特异的分子生物学检测技术，如RT-PCR，RT-PCR-ELISA，real-time RT-PCR已经在禽流感病毒检测中发挥着重要作用(Shan,2003;Collins,2002;Wang,2005;Spackman,2003;Poddar,2002)，但都需要复杂的检测仪器（如PCR仪，荧光定量PCR仪等），在一些基层的实验室操作时受到限制。环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification Method，LAMP）技术是一种新的体外扩增特异性DNA片段的分子生物学方法（Notomi,2000），该方法不需要额外的反转录步骤，只需要简单的水浴锅，在30-90min内即可扩增大量的核酸，不需要通过核酸电泳的方法来检测结果，只需通过其副产物—白色的焦磷酸镁沉淀来观察结果（如果加入荧光染料后会更易观察）。LAMP所具有的简单、快速、高效、实用的特点，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。该方法已经成功地应用与H5和H9亚型AIV的检测。建立一种能够灵敏、特异的N9亚型AI V的RT-LAMP检测方法的前提是需要提供针对N9NA基因保守区的特异性引物。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能够灵敏、特异的检测N9亚型禽流感病毒RT-LAMP引物组；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一种用于N9亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组，其特征在于所述的RT-LAMP引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对序列分别为SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对序列分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

本发明的所述的RT-LAMP引物组可用于制备检测或诊断N9亚型禽流感病毒的生物试剂。

本发明的目的之二是提供一种N9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括反应混合液、酶混液和双蒸水，其特征在于还包括荧光检测试剂及权利要求1所述的引物组。

其中，反应混合液、酶混液和双蒸水均可按照常规现有方法制备；在本发明的一具体实施例中所述的反应混合液（Reaction Mix）、酶混液（Enzyme Mix）来自RNA Amplification Kit(RT-LAMP)（购自日本荣研公司）。

其中，所述的RT-LAMP引物由一对外引物（N9-F3和N9-B3），一对内引物（N9-FIP和N9-BIP）和一对环引物（N9-LF和N9-LB）组成；所述外引物对序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对序列为SEQ ID No.3和SEQID No.4所示，所述环引物对序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。所述引物可按照现有方法制成冻干粉，PAGE纯或HPLC纯。

在本发明中，优选的，所述的荧光检测试剂（Fluorescent Detection Reagent）购自日本荣研公司。

本发明还提供了所述的N9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒在制备检测或诊断N9亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。

本发明的目的之三是提供一种上述检测N9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒的使用方法，包括：

1、将下述组分加入到反应管中：

2、将反应管置于PCR仪或恒温水浴槽中，循环参数为62.5℃反应1h，80℃作用10min结束反应；

3、检测：

（1）直观检测：反应物中加入1.0μL Fluorescent Detection Reagent荧光染料，即可直接显示结果：阳性反应发出绿色荧光，阴性反应保持原黄色不变；

（2）琼脂糖凝胶电泳：用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行分析：阳性反应呈现特有的梯状条带，阴性反应则无条带出现。

本发明通过分析流感数据库中分布于世界各地的家鸡与野鸟的N9AIV的亚型流感病毒NA基因序列及其中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室保存的N9AIV的NA序列，找出NA基因保守区，在此基础上设计了RT-LAMP特异性引物。这些基因序列涵盖了多种家禽及野鸟的NA基因，具有普遍性和代表性。利用该引物建立的RT-LAMP检测试剂盒对N1～N9亚型禽流感病毒以及鸡新城疫病毒等其他7种禽病病原进行检测，结果表明该检测试剂盒仅能特异性扩增N9亚型禽流感病毒核酸，而不能扩增其他病毒核酸，具有很好的特异性。

禽流感病毒的潜伏期从数小时到数天，最长可达21天。禽流感暴发流行初期，最先做的应该是禁止家禽在市场上的流通，实行区域封锁，并寻找病毒的来源。因此对活禽和野禽的监测显得尤为重要（Sakar et al,2010），AIV带有囊膜，对消毒剂比较敏感，但在生产实际中，AIV常从感染禽的鼻腔分泌物中及粪便物中排出，使病毒处于有机物的保护之下，可通过空气、接触和粪便传播。据报道，试验鸡攻毒18h后即可从泄殖腔及喉头拭子中分离到病毒，持续到攻毒后第7d左右；攻毒后36h才可以从脑、肝、脾、肾、胰腺的混合样品中分离到病毒，可持续到攻毒后第10d左右（LIAO，et al,2004），这表明通过棉拭子可在未出现症状时即可检测到AIV，可真正做到早发现早防控。本发明通过鼻腔接种模仿自然感染，对感染后不同时间采取的棉拭子用病毒分离、RT-PCR和本发明N9-RT-LAMP检测试剂盒进行平行检测。其中，病毒分离和N9-RT-LAMP方法在感染后第1天即可检测到病毒，第3天三种方法均可检测到病毒。但检测所需时间却不同，应用本发明N9-RT-LAMP检测试剂盒检测病原仅需要60-30min；病毒分离方法至少需要2-3d；RT-PCR方法需要6-7h，用时虽短但敏感性低于本发明N9-RT-LAMP检测试剂盒。

本发明针对N9亚型禽流感病毒的血凝素基因建立了RT-LAMP检测试剂盒（N9-RT-LAMP），该试剂盒对N9AIV RNA的最小检测限为0.01PFU，其敏感性较常规的RT-PCR高100倍，可同时用于高致病力和低致病力N9亚型AIV的检测。通过对9个AIV亚型病毒和其他禽病毒病病原RNA的检测，表明该方法只能特异性扩增N9亚型AIV，具有良好的特异性。本发明检测试剂盒具有用样少、特异性强、敏感性高、快速准确等特点，为N9亚型禽流感的防控预警机制提供了简捷、有效的早期快速诊断途径。

附图说明

图1为不同浓度底物和样品进行N9-RT-LAMP以及RT-PCR的敏感性扩增结果;

图1A为N9-RT-LAMP扩增不同浓度A/chicken/Shanghai/S1053/2013(H7N9)RNA的实时监控图；图1B为N9-RT-LAMP扩增后加入荧光染色剂后的观察结果；图1C为RT-PCR的扩增A/chicken/Shanghai/S1053/2013(H7N9)RNA的结果;图1D为N9-RT-LAMP扩增不同浓度A/Duck/Memphis/546/76(H11N9）RNA的实时监控图；

图2为用RT-LAMP检测N1～N9亚型禽流感病毒的特异性实验结果；

图2A为RT-LAMP扩增后加入荧光染色剂后的观察结果；

1.A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1);2.A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2);

3.A/Duck/Germany/1215/73(H2N3);4.A/Turkey/Ontario/6118/68(H8N4);

5.A/Mallard/Gurjev/263/82(H14N5);6.A/Duck/Czech/56(H4N6);

7.A/equine/jingfang/1/74(H7N7);8.A/Duck/Ukraine/1/63(H3N8);

9.A/Duck/Memphis/546/76(H11N9);

10.A/chicken/Shanghai/S1053/2013(H7N9);

图2B为用RT-LAMP检测N1～N9亚型禽流感病毒的实时监控图；

图2B上图：CH1-CH8：1.A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1);

2.A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2);3.A/Duck/Germany/1215/73(H2N3);

4.A/Turkey/Ontario/6118/68(H8N4);5.AA/Mallard/Gurjev/263/82(H14N5);

6.A/Duck/Czech/56(H4N6);7.A/equine/jingfang/1/74(H7N7);

8.A/Duck/Ukraine/1/63(H3N8);

图2B下图：CH1：A/Duck/Memphis/546/76(H11N9);

CH2：A/chicken/Shanghai/S1053/2013(H7N9);

图3为用RT-LAMP检测其它禽病病毒核酸的特异性试验结果；

图3A为用RT-LAMP检测其它禽病病毒核酸的实时监控图显示结果，图3B为N9-RT-LAMP扩增后加入荧光染色剂后的观察结果；1,A/chicken/Shanghai/S1053/2013(H7N9)；2、鸡新城疫病毒（NDV）；3、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)；4、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)；5、鸡马立克氏病病毒（MDV）；6、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)；7、鸡传染性贫血病毒(CIAV)；8、鸡白血病病毒(ALV)。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1试验材料和方法

1.1毒株和试剂

本试验所用禽流感病毒N1～N9亚型标准参考毒株由中监所购入。

N9亚型禽流感病毒A/chicken/Shanghai/S1053/2013(H7N9)和A/Duck/Memphis/546/76(H11N9）及其鸡新城疫病毒（NDV）、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡马立克氏病病毒（MDV）、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡白血病病毒(ALV)由中监所购入。

RNA Amplification Kit(RT-LAMP)和荧光检测试剂（Fluorescent DetectionReagent）购自日本荣研公司；RNA

Total RNA Isolation系统和Access RT-PCR系统均购自Promega公司。10日龄SPF鸡胚、6周龄SPF鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供，所有SPF鸡都在负压隔离器内饲养。

1.2LAMP引物的设计和合成

利用DNA Star software分析了流感数据库中分布于世界各地的家鸡与野鸟的N9亚型流感病毒NA基因序列的同源性，找出NA基因保守区，设计了6个引物，分别是外引物（N9-F3(SEQ ID No.1)和N9-B3(SEQ ID No.2)），内引物（N9-FIP(SEQ ID No.3)和N9-BIP(SEQ ID No.4)）和环引物（N9-LF(SEQ ID No.5)和N9-LB(SEQ ID No.6)）(表1)。

表1RT-LAMP引物序列

1.3RNA提取

RNA的提取采用Trizol LS试剂盒（invitrogen公司）。病毒尿囊液或口咽泄殖腔拭子按常规处理后，取样品250ul，加750ul Trizol LS裂解液，混合震荡5分钟(尽量保证裂解后的液体透明)，加200ul氯仿，12000转，4℃离心15分钟，取上清，加500ul异丙醇，室温沉淀10-15分钟，12000转，4℃离心15分钟，弃上清，缓慢加入75%乙醇洗沉淀一次，倒置滤纸吸干管壁余液，真空抽干或37℃烘干，加入无RNA酶的水20ul,-70℃保存备用。

1.4RT-LAMP和RT-PCR的反应体系

N9-RT-LAMP反应总体积为25μL，组成成分如下：Reaction Mix12.5μL、100p mol N9FIP0.4μL、100p mol N9BIP0.4μL、10p mol N9F30.5μL、10p molN9B30.5μL，100p mol N9LF0.2μL，100p mol N9LB0.2μL，Enzyme mix1μL，加入5.0μL抽提获得的RNA到体系中，加Distilled Water至25μL，置于浊度仪、PCR仪或恒温水浴槽中，循环参数为62.5℃反应1h,80℃作用10min结束反应。反应物中加入1.0μL Fluorescent Detection Reagent，即可直接显示结果：

阳性反应发出绿色荧光，阴性反应保持原黄色不变；或用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行分析：阳性反应呈现特有的梯状条带，阴性反应则无条带出现。N9-RT-PCR的引物序列为:

N9Up：5’ATAATGAAACAAACATCACCAA3’；

N9Low：5’AGCATAGAACCTGCATTCATCT3’;

扩增片段大小为203bp。反应总体积为25μL，组成成分如下：5.0μL5X反应缓冲液、0.5μL10M dNTP、1.0μL15M硫酸镁、0.25μL20pmol N9Up、0.25μL20p mol N9Low、0.5μL A MV反转录酶、0.5μL Taq DNA聚合酶、14μL DEPC处理的灭菌双蒸水。加入2.5μL RNA到体系，置于PCR仪反应，循环参数为45℃逆转录45min，94℃预变性2min，94℃30s、52℃45s、68℃45s，35个循环，最后68℃延伸8min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。

1.5敏感性试验

对测定病毒含量的N9亚型标准参考毒株和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室保存的2个N9亚型禽流感病毒A/chicken/Shanghai/S1053/2013(H7N9)和A/Duck/Memphis/546/76（H11N9）的尿囊液提取核酸，将抽提所得的N9AIV总RNA进行10倍倍比稀释(分别为100000PFU、10000PFU、1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、0.1PFU、0.01PFU、0.001PFU）。对上述各浓度RNA用N9-RT-LAMP和N9-RT-PCR方法同时进行检测。

1.6特异性试验

用该N9-RT-LAMP方法分别检测N1～N9亚型禽流感标准参考毒株，检测不同亚型病毒之间是否存在非特异性扩增。检测鸡新城疫病毒（NDV）、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡马立克氏病病毒（MDV）、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡白血病病毒(ALV)等其他7种禽病病原，检测N9-RT-LAMP方法的特异性。N9AIV毒株作为阳性对照。

2实验结果

2.1RT-LAMP的敏感性结果

由病毒含量为105PFU的A/chicken/Shanghai/S1053/2013(H7N9)毒株的RNA，进行10倍倍比稀释后用本发明的RT-LAMP检测试剂盒和RT-PCR方法进行平行检测，发现RT-PCR方法可检测1PFU滴度的病毒，RT-LAMP反应的特征性绿色荧光亮度也渐渐变暗（图1B所示）。最终病毒在0.01PFU时仍然可以看到可视化的荧光（图1B所示），即可敏感地检测到0.01PFU的病毒核酸，比常规RT-PCR方法（图1C所示）敏感100倍，RT-LAMP扩增的实时监控图显示（图1A所示），随着稀释度的增加，反应曲线的起始点向后逐渐推移，表明该方法对浓度的变化很敏感。进一步对A/Duck/Memphis/546/76(H11N9）进行了敏感性检测，N9-RT-LAMP扩增的实时监控图显示，敏感性可检测到1PFU，结果见图1D所示。

2.2RT-LAMP的特异性结果

为了检测N9-RT-LAMP的引物的特异性，用RT-LAMP检测N1～N9亚型禽流感病毒标准参考毒株，结果表明仅对N9亚型禽流感病毒扩增呈现绿色荧光（图2所示)。同时对鸡新城疫等其他7种禽病病毒也进行了检测，结果发现这7种禽病病毒核酸没有显示出绿色荧光，N9-RT-LAMP扩增的实时监控图也显示仅有N9亚型禽流感病毒有扩增曲线，其它亚型病毒则呈阴性结果。表明本发明RT-LAMP检测试剂盒能特异性扩增N9亚型禽流感病毒，而不与其它亚型的AIV和其它禽病病毒核酸发生交叉反应(图3所示）。

Claims

1.一种用于N9亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组，其特征在于所述的RT-LAMP引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对序列分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

2.权利要求1所述的RT-LAMP引物组在制备检测或诊断N9亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。

3.一种N9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括反应混合液、酶混液和双蒸水，其特征在于还包括荧光检测试剂及权利要求1所述的引物组。

4.按照权利要求3所述的N9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的荧光检测试剂购自日本荣研公司。

5.权利要求3或4所述的N9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测试剂盒在制备检测或诊断N9亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。