CN103776929A - 一种高效液相色谱法检测多抗霉素b的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效液相色谱法检测多抗霉素B的方法，采用如下色谱条件：色谱柱：以嵌入极性基团的烷基硅烷键合硅胶为固定相；流动相：有机相-水相；流速：0.5-1.5mL/min；检测波长：240-290nm；柱温：10-40℃；进样量：5-20μL；检测器采用紫外检测器或二极管阵列检测器。与现有技术中的生测法、HPLC法相比，本发明通过所述色谱柱与所述流动相的配合使用，取得了很好的分离度良好，准确度高，通过本检测方法使多抗霉素B与结构相似的同系物达到很好的分离，提高了多抗霉素B检测的准确度；该检测方法的运行时间短；多抗霉素B主峰出峰时间在8min。
Description
技术领域
本发明属于农药检测分析技术领域，具体涉及一种多抗霉素B的高效液相色谱检测方法。
背景技术
多抗霉素又叫多氧霉素，在日本是从可可链霉菌素阿索变种（S.cacaoi var.asoensis）中分离到一种核苷类抗生素。而在我国是金色产色链霉菌（S.aurea chromogenes 4896）的代谢产物。
多抗霉素是由A至N 共14种不同的同系物组成的混合物，主要活性成分为多抗霉素B，属于多氧嘧啶核苷类农用抗生素类杀菌剂，能有效地抑制真菌细胞壁骨架成分——几丁质的合成，使菌体细胞壁不能进行生物合成导致病菌死亡。多抗霉素B是一种高效、低毒、无环境污染的安全农药，所以被广泛用于苹果斑点落叶病、烟草赤星病、三七黑斑病等病害的防治。
目前关于多抗霉素B检测方法的报道有生测法、HPLC法。如中国专利申请200810039564.0多氧霉素B的定量分析检测方法，报道了多氧霉素B的牛津杯生物测定法，该检测方法缺点：可靠性差，检测时间较长。
如《化学分析计量》1999第8卷第3期的《用液相色谱二极管阵列检测器测定多氧霉素B》公开了一种检测多氧霉素B的HPLC方法，色谱条件：色谱柱：YWG-CN，250mm×4.5 mm，粒径5μm，检测波长：270nm，流速：0.8mL/min，流动相：pH=4乙酸铵缓冲溶液。如《农药》2008年第47卷第3期的《多抗霉素B的高效液相色谱分析方法》公开了一种多抗霉素B的HPLC方法,色谱条件：色谱柱：Kromasil C18不锈钢色谱柱,250mm×4.6 mm（5μm），检测波长262 nm，流速：0.6 mL/min,柱温：30℃，进样量5μL，流动相：甲醇-水（用磷酸调pH=4.0）（体积比10:90）。
多抗霉素B与多抗霉素同系物结构相似，在HPLC检测中，容易受到某些同系物的干扰。在现有HPLC检测方法中，多抗霉素B和某些同系物之间不能达到较好的分离，影响分析的准确性。因此，本领域迫切需要一种分离度良好，运行时间短的检测多抗霉素B的方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明旨在提供一种准确、快速的高效液相色谱法检测多抗霉素B的方法，实现多抗霉素B与其他同系物的分离，从而达到产品质量的控制。
本发明提供的高效液相色谱法检测多抗霉素B的方法，采用如下色谱条件：
色谱柱：以嵌入极性基团的烷基硅烷键合硅胶为固定相；
流动相：有机相-水相；
流速：0.5 -1.5 mL/min，优选1.0 mL/min；
检测波长：240-290nm，优选260nm；
柱温：10-40℃，优选25℃；
进样量：5-20μL，优选10μL；
检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器。
在本发明的优选的实施方案中，上述以嵌入极性基团的烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，优选以嵌入极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱。
在本发明的优选的实施方案中，所述流动相中的有机相选自甲醇、乙腈。
在本发明的优选的实施方案中，所述流动相中的水相含有三氟乙酸，三氟乙酸的浓度范围为0.05%-0.13%（以重量百分比计），优选0.1%。
在本发明的优选的实施方案中，所述流动相中有机相-水相的体积比例为0：100-3:94，优选0:100。
在本发明的优选的实施方案中，所述的色谱柱和流动相配合使用。
本发明还提供一种高效液相色谱法检测多抗霉素B的方法，通过以下步骤实现：
（1）称取含适量多抗霉素B的标品，于50mL容量瓶中，用纯水溶解、定容、摇匀，过0.45μm滤膜，备供试标品溶液用。
（2）称取含适量多抗霉素B的样品，于50mL容量瓶中，用纯水溶解、定容、摇匀，过0.45μm滤膜，备供试样品溶液用。
（3）取供试标品和样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照上述条件进行高效液相色谱分析。
与现有技术中的生测法、HPLC法相比，本发明通过所述色谱柱与所述流动相的配合使用，分离度良好，准确度高，通过本检测方法使多抗霉素B与结构相似的同系物达到很好的分离，提高了多抗霉素B检测的准确度；该检测方法的运行时间短；多抗霉素B主峰出峰时间在8min。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明：
图1：按照实施例1条件分离的多抗霉素B样品高效液相色谱图；
图2：按照实施例2条件分离的多抗霉素B样品高效液相色谱图；
图3：按照实施例3条件分离的多抗霉素B样品高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
实施例1
试验仪器和条件：
Waters 1525高效液相色谱仪，Waters 2487紫外检测器；
色谱柱：嵌入极性基团的C18（250×4.6mm，5μm）；
流动相：0.1%三氟乙酸水溶液；
流速： 1.0 mL/min；
检测波长：260nm；
柱温：25℃；
进样量：10μL。
试验步骤：
称取含0.02g多抗霉素B标品，于50mL容量瓶中，用纯水溶解、定容、摇匀，过0.45μm滤膜，备供试标品溶液用。
称取含0.02g多抗霉素B样品，于50mL容量瓶中，用纯水溶解、定容、摇匀，过0.45μm滤膜，备供试样品溶液用。
取上述供试标品和样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见图1，多抗霉素B主峰出峰时间为8.97min。
实施例2
试验仪器和条件：
Waters 1525高效液相色谱仪，Waters 2487紫外检测器；
色谱柱：嵌入极性基团的C18（250×4.6mm，5μm）；
流动相：0.05%三氟乙酸水溶液；
流速： 0.8 mL/min；
检测波长：260nm；
柱温：25℃；
进样量：10μL；
试验步骤：
称取含0.02g多抗霉素B标品，于50mL容量瓶中，用纯水溶解、定容、摇匀，过0.45μm滤膜，备供试标品溶液用。
称取含0.02g多抗霉素B样品，于50mL容量瓶中，用纯水溶解、定容、摇匀，过0.45μm滤膜，备供试样品溶液用。
取上述供试样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见图2，多抗霉素B主峰出峰时间为8.92min。
实施例3
试验仪器和条件：
Waters 1525高效液相色谱仪，Waters 2487紫外检测器；
色谱柱：嵌入极性基团的C18（250×4.6mm，5μm）；
流动相：甲醇：0.13%三氟乙酸水溶液=3%：97%；
流速： 0.8 mL/min；
检测波长：260nm；
柱温：25℃；
进样量：10μL；
试验步骤：
称取含0.02g多抗霉素B标品，于50mL容量瓶中，用纯水溶解、定容、摇匀，过0.45μm滤膜，备供试标品溶液用。
称取含0.02g多抗霉素B样品，于50mL容量瓶中，用纯水溶解、定容、摇匀，过0.45μm滤膜，备供试样品溶液用。
取上述供试标品和样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见图3，多抗霉素B主峰出峰时间为8.68min。
分析方法的线性相关性试验
取供试标品溶液，按照本发明检测方法进行分析，进样量分别为2、4、6、8、10μL，以多抗霉素B质量为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线，得线性方程为Y=483.52X+15.856，相关系数为0.9989。
分析方法的准确度试验
于已知质量分数的多抗霉素B样品中称取5个试样，分别加入一定量多抗霉素B标品，按照本发明检测方法进行分析，测得多抗霉素B平均回收率为98.98%。
分析方法的精密度试验
从同一样品中准确称取5个试样，按照本发明的检测方法进行分析，测得多抗霉素B的标准偏差为0.018%，相对标准偏差1.17%。
试验结果表明，本发明的检测方法具有较高的准确度和精密度，线性关系良好。
本发明的液相色谱条件与现有的液相色谱条件相比，对多抗霉素B具有较好的分离度，从而保证检测的准确性。 本发明人对已报道《用液相色谱二极管阵列检测器测定多氧霉素B》和《多抗霉素B的高效液相色谱分析方法》中的液相色谱条件进行多抗霉素B检测，结果表明，多抗霉素B与前后同系物的分离度较差，而使用本发明的液相色谱条件，多抗霉素B与前后同系物的分离度较好，分离度达1.98。
以上较佳实施例仅用于说明本发明的内容，除此之外，本发明还有其他实施方式，但凡本领域技术人员因本发明所涉及之技术启示，而采用等同替代或等效变形方式形成的技术方案均落在本发明保护范围内。
Claims (8)
1.一种高效液相色谱法检测多抗霉素B的方法，其特征在于，采用如下色谱条件：
色谱柱：以嵌入极性基团的烷基硅烷键合硅胶为固定相；
流动相：有机相-水相；
流速：0.5 -1.5 mL/min；
检测波长：240-290nm；
柱温：10-40℃；
进样量：5-20μL；
检测器采用紫外检测器或二极管阵列检测器。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流速为1.0 mL/min，检测波长为260nm，柱温为25℃，进样量为10μL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述以嵌入极性基团的烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱为以嵌入极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相中的有机相选自甲醇、乙腈，所述流动相中的水相含有三氟乙酸，三氟乙酸的浓度范围为0.05%-0.13%。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动相中有机相-水相的体积比例为0：100-3:94。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，三氟乙酸的浓度范围为0.1%。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述流动相中有机相-水相的体积比例为0:100。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）称取含适量多抗霉素B的标品，于50mL容量瓶中，用纯水溶解、定容、摇匀，过0.45μm滤膜，备供试标品溶液用；
（2）称取含适量多抗霉素B的样品，于50mL容量瓶中，用纯水溶解、定容、摇匀，过0.45μm滤膜，备供试样品溶液用；
（3）取供试标品和样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照权利要求1-7中任一项所述的条件进行高效液相色谱分析。
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