CN103776772A - 一种基于金纳米锥聚集的圆二色信号检测dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于金纳米锥聚集的圆二色信号检测DNA的方法，具体是将含有DNA修饰的金纳米锥的溶液与含有待检测DNA的溶液混合进行退火反应；检测圆二色光谱，当检测到退火后相比退火前在550-850nm波段出现圆二色光谱的信号增强时，说明金纳米锥发生聚集，待检测DNA与金纳米锥上修饰的DNA存在互补序列。本发明的方法相比基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法信号更强、灵敏度更高、检出限更低且重复性更好，能够用于DNA的定量分析。

Description

一种基于金纳米锥聚集的圆二色信号检测DNA的方法

技术领域

本发明涉及应用纳米技术检测DNA的领域，尤其涉及一种基于金纳米锥聚集的圆二色信号检测DNA的方法。

背景技术

DNA（Deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸）是一种螺旋的手性生物分子，在纳米电子学、纳米材料和光学器件领域具有巨大的应用前景。已有研究报道（Chem.Soc.Rev.,2013,42,7028-7041），当金属纳米粒子和手性分子相互作用时可以产生等离子诱导的圆二色手性信号。DNA作为一种手性分子，相对于其他手性小分子，具有以下优势：（1）具有相对坚固的双螺旋结构可以提供更大的手性偶极，从而产生更强的手性信号；（2）DNA分子可设计性强，易于合成多种手性结构（Nano Lett.,2013,13,2128-2133）。

除了DNA分子强的手性偶极以外，贵金属纳米粒子强的表面等离子体共振强度也是获得强的圆二色手性信号的重要因素。这一方面的性能已经在DNA的检测中获得应用，如中国发明专利申请CN103487378A公开了一种基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法：将DNA修饰的金纳米棒与待检测DNA混合进行退火反应；检测圆二色光谱，当检测到退火后相比退火前在600-800nm波段出现正负对称圆二色光谱的信号增强时，说明金纳米棒发生聚集，待检测DNA与金纳米棒上修饰的DNA完全互补或者互补并含有粘性末端。所述方法相比于基于纳米材料的紫外可见吸收光谱检测DNA的方法，信号更强，检出限低；而且检测方法简单，重复性好。但是，本领域还需要信号更强、灵敏度更高、检出限更低且重复性更好的DNA检测方法。

已有研究表明（Nano Lett.,2011,11,5013-5019；Langmuir,2012,28,9027-9033），与各向同性的金纳米球形粒子、各向异性金纳米棒相比，金纳米锥具有更强的表面等离子体共振强度，这主要来源于金纳米锥尖端的增强效应。但是，金纳米锥与DNA相互作用时产生等离子诱导的圆二色手性信号的情况目前还缺乏研究和报道，更没有将金纳米锥应用于DNA检测中的技术。

发明内容

针对现有技术的DNA检测方法的不足，本发明提供一种基于金纳米锥聚集的圆二色信号检测DNA的方法，所述方法相比基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法信号更强、灵敏度更高、检出限更低且重复性更好。

本发明提供以下技术方案：

一种基于金纳米锥聚集的圆二色信号检测DNA的方法：将含有DNA修饰的金纳米锥的溶液与含有待检测DNA的溶液混合进行退火反应；检测圆二色光谱，当检测到退火后相比退火前在550-850nm波段出现圆二色光谱的信号增强时，说明金纳米锥发生聚集，待检测DNA与金纳米锥上修饰的DNA存在互补序列。

本发明中，所述圆二色光谱的信号强度与待检测DNA的浓度呈正相关，因此通过检测所述圆二色光谱的信号强度能够定量待检测DNA的浓度。具体地，可以通过检测一系列梯度浓度的DNA对应的圆二色光谱的信号强度，并制作出DNA浓度相对于圆二色光谱的信号强度的标准曲线，然后检测待检测DNA对应的圆二色光谱的信号强度，就可以通过标准曲线计算出待检测DNA的浓度。

本发明中，金纳米锥是通过各种制备方法得到的，但是各种制备方法制得的金纳米锥并非完全具有一致性，其中还会含有金纳米球和/或金纳米棒。目前报道的制备金纳米锥的方法中，得到的金纳米锥约占30%左右。因此，所述含有DNA修饰的金纳米锥的溶液中还可能含有金纳米球和/或金纳米棒，且所述金纳米锥的摩尔百分含量以金纳米锥、金纳米球和/或金纳米棒的总量计为30%以上，优选50%以上，更优选70%以上，最优选90%以上。研究发现金纳米锥的摩尔百分含量越高，得到的圆二色光谱的信号强度也越大，这是因为金纳米锥相比金纳米球和金纳米棒具有更强的表面等离子体共振强度，能够诱导更强的圆二色光谱信号。高含量的金纳米锥可以通过对制备的金纳米锥的初产物进行密度梯度离心得到，本发明的一个实施例通过密度梯度离心制得的金纳米锥的摩尔百分含量能够达到90%以上，为圆二色光谱信号检测DNA提供高度纯化的金纳米锥，为高灵敏地检测DNA提供保障。目前还没有通过密度梯度离心纯化或富集金纳米锥的报道。

本发明中，所述退火温度范围可以是从60-90℃任一温度（例如60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃、76℃、78℃、80℃、82℃、84℃、86℃、88℃或90℃）降至20-50℃任一温度（例如20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃或50℃），优选为从60℃降至20℃。

本发明中，所述金纳米锥上修饰的DNA与金纳米锥的摩尔比为50-100：1，例如55:1、60:1、70:1、80:1、90:1、95:1或98:1，优选为100：1。

本发明是基于互补DNA退火杂交引起金纳米锥聚集，从而导致550-850nm波段出现圆二色光谱的信号增强的现象，而完成的发明。因此，对于金纳米锥的修饰方式不作特别限定，目前已有的任何能够将DNA修饰到金纳米锥上的技术，以及未来开发出来的任何能够将DNA修饰到金纳米锥上的技术均可以用来为本发明提供DNA修饰的金纳米锥。

虽然如此，本发明还是提供了一种特别的DNA修饰的金纳米锥，即巯基DNA（SH-DNA）修饰的金纳米锥，所述巯基与金通过共价键连接将DNA修饰在金纳米锥上；优选地，所述巯基修饰在DNA的3’末端。

本发明对DNA修饰的金纳米锥与待检测DNA混合进行退火反应环境不作特别限定，只要能够提供退火反应的适宜条件即可。虽然如此，本发明还是特别提供一种退火反应的溶液环境为含0.25M氯化钠、0.01重量%十二烷基磺酸钠和0.01M的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液。

本发明中，所述待检测DNA的浓度为纳摩尔级，优选为5nM至40nM。本发明相比现有技术对DNA的检测限能够达到纳摩尔级，优于现有技术的检测方法。

本发明中，所述金纳米锥是通过对制备的金纳米锥的初产物通过密度梯度离心得到的。所述金纳米锥的初产物可以通过目前报道的各种方法制备，本发明不作特别限定。在本发明中，优选种子合成法（J.Phys.Chem.B2006,110,16377-16383）得到金纳米锥的初产物，具体包括以下步骤：

（1）在20-25℃条件下，将柠檬酸钠和氯金酸（HAuCl₄）水溶液混合，加入新制备的硼氢化钠（NaBH₄）溶液，得到金晶种；

（2）将十六烷基三乙基溴化铵（CTEAB）、HAuCl₄和硝酸银溶液混合均匀配成生长溶液，加入抗坏血酸溶液后搅拌均匀，然后加入步骤（1）中所述金晶种，在20-25℃条件下静置生长20-24小时，得到所述金纳米锥的初产物；

优选地，所述步骤（1）中HAuCl₄、NaBH₄、柠檬酸钠和水的摩尔比为1:（1-1.5）:（2-3）:（400-500）；

优选地，所述步骤（2）中HAuCl₄、十六烷基三乙基溴化铵、硝酸银、抗坏血酸和水的摩尔比为1：（240-260）：（0.13-0.16）：（0.13-0.16）：（1200-1250）。

在本发明中，通过调节金晶种的用量，可以得到不同等离子共振峰位的金纳米锥的初产物。

在本发明中，所述密度梯度离心的方法，层析液可以采用不同比例的乙二醇和水的混合物配制而成，如按体积百分含量计采用五种不同的混合物：90%乙二醇+10%水，80%乙二醇+20%水，70%乙二醇+30%水，60%乙二醇+40%水，50%乙二醇+50%水；分别取这五种不同的混合物1.5ml，按乙二醇的比重降低的顺序依次加入到离心管中，加入的过程要避免相互间的扰动，从而形成从上到下密度逐渐增大的层析液。也可以按体积百分含量计采用以下九种不同比例的乙二醇和水的混合物配制层析液：95%乙二醇+5%水，90%乙二醇+10%水，85%乙二醇+15%水，80%乙二醇+20%水，75%乙二醇+25%水，70%乙二醇+30%水，65%乙二醇+35%水，60%乙二醇+40%水，55%乙二醇+45%水。

优选地，将0.2-0.5ml浓缩的金纳米锥的初产物的溶液加入到上述预先配置好的层析液中，经过6000-8000rpm离心15-25分钟、优选7500rpm离心20分钟后，通过对分离的产物进行分层提取，最终得到高纯度的金纳米锥。

本发明中，对于SH-DNA修饰金纳米锥的方法没有特别的限定，只要能够得到SH-DNA修饰的金纳米锥的方法均可采用，本发明中优选盐熟化法修饰金纳米锥，具体可以是：

（1）向上述制备的高纯度的金纳米锥溶液中，加入SH-DNA，DNA和金纳米锥的比例可以是50-100：1的任何比例，优选为100：1；24小时后加入十二烷基磺酸钠（SDS）溶液和pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS），室温静置7天后，分批次加入NaCl溶液。

优选地，加入的SDS与PBS缓冲液混合液的体积为330μL/1mL金纳米锥溶液，其中最终溶液中SDS的质量分数为0.01-0.02%，磷酸缓冲液的浓度为0.01M-0.02M；分8次加入1M的NaCl溶液，每次33μl，每次时间间隔为4-6小时。

（2）将步骤（1）所得的修饰过DNA的金纳米锥的混合液离心，去除游离的多余SH-DNA，将沉淀重新分散到下步退火所需要的缓冲液体系中，优选为含有0.25M氯化钠、0.01%SDS和pH为7.4的0.01M的磷酸盐缓冲溶液。

本发明中，水可以为蒸馏水和/或去离子水等，所有药品均为分析纯及以上纯度。

本发明中，浓度单位M表示mol/L，mM表示mmol/L，μM表示μmol/L，nM表示nmol/L。

与现有技术相比，本发明基于金纳米锥聚集的圆二色信号检测DNA的方法信号更强、灵敏度更高、检出限更低且重复性更好，不但明显优于传统的基于纳米材料的紫外可见吸收光谱检测DNA的方法，而且与报道的基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法相比，由于金纳米锥可以诱导产生更强的圆二色信号，因此在灵敏度、检出限和重复性方面也明显具有优势。

附图说明

图1为本发明实施例1中得到的不同等离子共振峰位的金纳米锥的紫外可见光谱图。

图2为本发明实施例1中得到的不同等离子共振峰位的金纳米锥的扫描电子显微镜图。

图3为本发明实施例2中经过密度梯度离心后的溶液分层照片（A）和每层对应的扫描电镜照片，其中（B）为金纳米棒，（C）为金纳米锥，（D）为金纳米球。

图4为本发明实施例2中经过纯化后的金纳米锥和对应的金纳米锥的初产物的紫外可见光谱图。

图5为本发明实施例4中加入待检测DNA链段B后的金纳米锥溶液在60℃和20℃下的紫外可见光谱图和CD光谱图。

图6为本发明实施例4中不同浓度下的DNA的圆二色光谱图。

图7为本发明实施例4中DNA的浓度和对应的圆二色信号的线性关系图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

以下实施例中离心采用台式高速离心机（XiangYi H-1650）和HitachiCP80MX；扫描电镜图采用冷场发射扫描电子显微镜（Hitachi S-4800）得到；紫外可见吸收光谱采用紫外可见光谱仪（Hitachi U-3010）得到；圆二色光谱采用圆二色光谱仪（Jasco J-810spectropolarimeter）得到。

实施例1：金纳米锥的合成

金纳米锥的合成是通过种子生长法实现的。将0.15mL10mM的新鲜配制的NaBH₄溶液迅速加入到10mL含有0.25mM柠檬酸钠和0.125mM HAuCl₄的混合液中，搅拌2分钟后，置于23℃恒温水浴静置，2小时后备用。

向10mL含有0.1M CTEAB、0.4mM HAuCl₄、0.06mM抗坏血酸和0.06mM硝酸银的混合液中加入不同量的上述步骤中合成的晶种，加入的晶种的量依次为a:0.24ml，b:0.16ml，c:0.12ml，d:0.09ml，e:0.06ml和f:0.05ml。静置24小时后，将所得产物离心，重新分散至二次水中备用。将所得的金纳米锥用紫外可见光谱（图1）和扫描电子显微镜（图2）表征。如图1所示，随着加入晶种的量的不同，金纳米锥的等离子共振峰的峰位从690nm左右红移至860nm左右。图2显示的是对应于紫外可见光谱上不同峰位的金纳米锥的扫描电镜图片。从图中可以看出合成的金纳米锥的初产物是金纳米锥、金纳米球和金纳米棒的混合物。

实施例2：金纳米锥的纯化

高纯度的金纳米锥是通过对实施例1中的金纳米锥的初产物进行密度梯度离心分离得到的。具体方法如下：

采用以下5种不同体积比例的乙二醇和水的混合物配制层析液：90%乙二醇+10%水，80%乙二醇+20%水，70%乙二醇+30%水，60%乙二醇+40%水，50%乙二醇+50%水。分别取这5种不同的混合物1.5ml，按乙二醇的比重降低的顺序依次加入到离心管中，加入的过程要避免相互间的扰动，从而形成从上到下密度逐渐增大的层析液。最后向其加入0.3mL浓缩的实施例1中合成的金纳米锥的初产物溶液（浓缩比例为13：1），7500rpm离心20分钟后，得到明显分层的溶液（如图3A所示），从上到下依次对应于L1层、L2层和L3层。其对应的扫描电镜图片如图3B、C和D所示，分别为金纳米棒、金纳米锥和金纳米球。如图3C所示，相对于初产物的纯度（30%左右，如图2所示，通过统计扫描电镜图片中金纳米锥所占比例得到），分离后金纳米锥纯度可高达90%，这为下一步圆二色信号检测DNA提供了高度纯化的纳米粒子，为接下来的高灵敏检测提供了保障。

采用紫外可见光谱对比密度梯度离心分离前后的样品。图4是分离前后的紫外可见光谱图。从图中可以看到，经过纯化后的金纳米锥在520-550nm左右的吸收峰强度明显下降，证明原始初产物中的金纳米球和金纳米棒得到了很好的去除。这一结果与图3对应的扫描电子显微镜图片的结果相一致。

实施例3：金纳米锥的DNA修饰

1ml纯化的金纳米锥溶液，浓度为0.7nM，向其加入加入74μL浓度为100μM的DNA链段A（5’-AAGAATTTATAAGCAGAAAAAAAAAAAA-3’-SH，SEQ ID NO：1，在序列的3’末端修饰巯基）。静置24小时后，加入155μL0.1%SDS（十二烷基磺酸钠）溶液和155μL0.1M的pH=7.4的磷酸缓冲溶液，在室温下存放7天后，向其中加入1M NaCl溶液，每次加入32.5μL，共8次，时间间隔为4h。

将上述经过盐熟化后的金纳米锥和DNA的混合液离心两次（离心条件为8000rpm，离心10分钟），分散在含0.25M氯化钠（NaCl）、0.01%十二烷基磺酸钠（SDS）和0.01M的pH为7.4磷酸盐缓冲溶液（PBS）中备用。

实施例4：DNA的圆二色信号检测

取0.4mL实施例3中经过DNA修饰的金纳米锥的溶液，加入1.6mL含有0.25M NaCl、0.01%SDS的0.01M pH=7.4的PBS缓冲溶液。将0.8μL浓度为100μM的与链段A互补的DNA链段B（5’-TTTTTTTTTTTTCTGCTTATAAATTCTTGCGC-3’，SEQ ID NO：2），混合均匀后将上述溶液将加热至60℃然后退火至20℃，从而形成稳定的DNA双链结构，与此同时，测试溶液的紫外可见吸收光谱和CD光谱。图5显示的是加入待检测DNA链段B后的金纳米锥溶液在60℃和20℃下的紫外可见光谱图和CD光谱图。如图5A所示，在加入DNA链段B后，经过60℃退火，金纳米锥在550nm-850nm区间出现正负相反的圆二色信号，信号强度可达6左右。在对应的波段，金纳米锥的吸收强度发生降低（图5B），说明金纳米锥发生聚集。相对于紫外可见吸收光谱的变化（由0.6到0.4），圆二色信号的变化要明显得多（由0.5到5.8），说明基于圆二色信号变化的检测方法比传统的自外可见光谱检测方法具有更高的灵敏度。并且经过5次以上的循环退火，圆二色信号保持不变，说明该方法具有很好的重复性。与中国发明专利申请CN103487378A的实施例1得到的结果相比，在所用DNA序列相同而本实施例采用金纳米锥、CN103487378A的实施例1采用金纳米棒的情况下，本实施例中金纳米锥和待检测DNA的用量更少，但是其圆二色信号强度可达6左右；而CN103487378A的实施例1中圆二色信号强度只能达到2.5。说明本发明采用金纳米锥的圆二色信号更强、灵敏度更高。

针对上述的检测条件，可以调节加入的待检测DNA链段B的浓度。如图6所示，随着DNA链段B浓度的逐渐降低，由40nM到5nM，退火后对应的圆二色信号强度也由5.8下降至1.0左右。如图7所示，以DNA的浓度作为横坐标，对应的圆二色信号的强度作为纵坐标作图，可以发现二者存在很好的线性相关的关系。

综上所述，本发明提供了一种基于金纳米锥聚集的圆二色信号检测DNA的方法。与传统的DNA的检测方法相比，基于金纳米锥聚集的圆二色信号更强，具有更高的灵敏度和重复性，可以用来作为DNA的定量分析测试。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种基于金纳米锥聚集的圆二色信号检测DNA的方法，其特征在于，所述方法为：将含有DNA修饰的金纳米锥的溶液与含有待检测DNA的溶液混合进行退火反应；检测圆二色光谱，当检测到退火后相比退火前在550-850nm波段出现圆二色光谱的信号增强时，说明金纳米锥发生聚集，待检测DNA与金纳米锥上修饰的DNA存在互补序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述圆二色光谱的信号强度与待检测DNA的浓度呈正相关，通过检测所述圆二色光谱的信号强度定量待检测DNA的浓度。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有DNA修饰的金纳米锥的溶液中还含有金纳米球和/或金纳米棒，且所述金纳米锥的摩尔百分含量以金纳米锥、金纳米球和/或金纳米棒的总量计为30%以上，优选50%以上，更优选70%以上，最优选90%以上。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述退火温度范围为从60-90℃任一温度降至20-50℃任一温度，优选为从60℃降至20℃。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述金纳米锥上修饰的DNA与金纳米锥的摩尔比为50-100：1，优选为100：1。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA修饰的金纳米锥是巯基DNA修饰的金纳米锥，所述巯基与金通过共价键连接将DNA修饰在金纳米锥上；

优选地，所述巯基修饰在DNA的3’末端。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，退火过程中所用的缓冲液体系为含0.25M氯化钠、0.01重量%十二烷基磺酸钠和0.01M的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述待检测DNA的浓度为纳摩尔级，优选为5nM至40nM。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述金纳米锥是通过对制备的金纳米锥的初产物进行密度梯度离心得到的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述金纳米锥的初产物是通过如下方法制备得到的：

（1）在20-25℃条件下，将柠檬酸钠和HAuCl₄水溶液混合，加入新制备的NaBH₄溶液，得到金晶种；

（2）将十六烷基三乙基溴化铵、HAuCl₄和硝酸银溶液混合均匀配成生长溶液，加入抗坏血酸溶液后搅拌均匀，然后加入步骤（1）中所述金晶种，在20-25℃条件下静置生长20-24小时，得到所述金纳米锥的初产物；

优选地，所述步骤（1）中HAuCl₄、NaBH₄、柠檬酸钠和水的摩尔比为1:（1-1.5）:（2-3）:（400-500）；

优选地，所述步骤（2）中HAuCl₄、十六烷基三乙基溴化铵、硝酸银、抗坏血酸和水的摩尔比为1：（240-260）：（0.13-0.16）：（0.13-0.16）：（1200-1250）。

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