CN103773773A

CN103773773A - 中华绒螯蟹双wap结构域蛋白基因及其编码蛋白的应用

Info

Publication number: CN103773773A
Application number: CN201410021219.XA
Authority: CN
Inventors: 李凤梅
Original assignee: Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: Qingdao University of Science and Technology
Priority date: 2013-11-08
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2014-05-07

Abstract

中华绒螯蟹双WAP结构域蛋白基因及其编码蛋白的应用。本发明公开了一种中华绒螯蟹EsDWD-2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并提供了其重组表达与纯化方法。本发明还提供了中华绒螯蟹EsDWD-2基因编码的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，并提供了该基因序列所编码成熟肽的用途：本发明的EsDWD-2重组蛋白既对革兰氏阳性菌有抑菌活性，还对革兰氏阴性菌有抑菌活性。利用本发明获得的EsDWD-2可用于开发抗菌类药物和饲料添加剂。

Description

中华绒螯蟹双WAP结构域蛋白基因及其编码蛋白的应用

技术领域：

本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体是涉及中华绒螯蟹双WAP结构域蛋白基因及其编码的双WAP结构域蛋白（EsDWD-2）在抑制细菌生长中的应用。

背景技术：

抗菌肽是由动物和植物细胞特定基因编码的一类小分子多肽，从低等的软体动物到高等的哺乳动物都发现了广谱抗菌肽的存在。在甲壳动物蟹和对虾中分离到penaeidin、Crustin及抗脂多糖因子（ALF）等多种抗菌肽，它们在甲壳动物对细菌，真菌和病毒的防御中发挥着重要作用。

WAP结构域大约由50个氨基酸残基组成，含有8个高度保守的半胧氨酸残基，可以形成4对二硫键。具有WAP结构域的蛋白质在哺乳动物和无脊椎动物的免疫系统中发挥着重要的功能，这类蛋白质具有抗菌活性或者蛋白酶抑制因子活性，所以在实际水产养殖中具有较大的应用前景。目前在甲壳动物中发现多种WAP结构域蛋白，CrustinⅠ、CrustinⅡ、CrustinⅢ、单WAP结构域蛋白和双WAP结构域蛋白，它们对不同的微生物具有不同的抑菌作用。中国明对虾的单WAP结构域蛋白对革兰氏阳性、阴性细菌和真菌都有抑制作用，斑节对虾的单WAP结构域蛋白仅对革兰氏阳性细菌有抑制作用。克氏原鳌虾单WAP结构域蛋白具有结合细菌的活性以及抑制分泌型蛋白酶的活性，中国明对虾双WAP结构域蛋白具有能够抑制枯草芽抱杆菌和绿脓杆菌分泌的蛋白酶的活性。

中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹，属甲壳纲，十足目，方蟹科，绒螯蟹属，具有很高的营养价值和经济价值，是我国重要的水产养殖品种之一。随着中华绒鳌蟹养殖环境的恶化，病害频繁发生，鉴于此，研究中华绒鳌蟹的抗菌肽对于了解蟹免疫防御机制有着重要的作用。目前WAP结构域蛋白在甲壳动物基因序列和功能有已有不同程度的研究，但是在双WAP结构域蛋白报到较少。双WAP结构域蛋白在中华绒螯蟹中的研究，有利于更好的揭示固有免疫作用的途径及其机制，并且对开发广谱抗菌药物提供指导。

发明内容：

本发明提供了中华绒螯蟹EsDWD-2基因及其编码蛋白和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种中华绒螯蟹EsDWD-2基因，具体为序列SEQ ID No.1中碱基序列所示。其是从中华绒螯蟹中克隆到溶菌酶基因Eslysozyme的cDNA序列，该序列全长为1223bp，包括开放阅读框423bp，5’非编码区长为73bp，3’非编码区长为727bp，具有推测的一个多聚腺苷酸加尾信号AATAAA和polyA尾巴，其理论分子量为15.15kDa。利用pET30a表达载体在大肠杆菌BL21中重组表达了该蛋白，表达产物具有抑菌活性。

中华绒螯蟹EsDWD-2基因的编码蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，完整编码蛋白含有140个氨基酸，其中编码序列的1-22个氨基酸为信号肽序列。成熟肽包括118个氨基酸。成熟肽具有两个典型的WAP结构域。

本发明利用表达序列标签技术和cDNA末端快速扩增技术从中华绒螯蟹中克隆到EsDWD-2基因的cDNA的全长序列，通过PCR技术，扩增编码EsDWD-2成熟肽的基因片段并将其克隆到pET30a表达载体中，在大肠杆菌BL21中实现原核体外重组表达。重组产物经镍琼脂糖凝胶纯化，透析复性后，获得了重组溶菌酶蛋白，经检测此重组蛋白具有较高的抑菌活性。本发明为中华绒螯蟹免疫防御机制提供了理论基础，并为中华绒螯蟹的病害防治，开发医药产品和饲料添加剂奠定应用基础。

附图说明

图示为本发明中华绒螯蟹EsDWD-2重组蛋白对大肠杆菌（E.coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生长的抑菌作用。

具体实施方式：

下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实施例1：

一种克隆得到的中华绒螯蟹EsDWD-2基因，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

从http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站下载中华绒螯蟹cDNA文库（Taxonomy ID:95602）的EST序列,将这些序列进行拼接，其中一条1223bp的拼接序列推导出的氨基酸序列与褐家鼠Rattus norvegicus的乳清酸蛋白有一定的同源性。经SMART软件进行预测，该序列具有两个典型的WAP结构域。根据这条拼接序列设计正向引物P1(5'-TTCGAATTGCAAGTCAAG-3'）和P2引物（5'-TACCAGAGCAATGCTTTATTC-3'），中华绒螯蟹的cDNA为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的片段，连接至pMD-18T载体，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞中，选取阳性克隆送至生物公司进行测序。

本发明的中华绒螯蟹EsDWD-2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中所示信息为：

(a)序列特征：

●长度：1223碱基对

●类型：碱基序列

●链型：双链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：中华绒螯蟹鳌蟹（Eriocheir sinensis）

(f)序列描述：SEQ ID NO.1

ttcgaattgc aagtcaaggc aggaacacgt ctcacacact cggtctttta accacaccgc 60

cccttcctta accatgttcc ctagacgctt tcctcaagtg gcacttgccc tcctggtcct 120

tgtagctgcc gtgcacgccc agggcacaag gggaggactg gggccgccat cgtccaaccc 180

aagggcagtg tgtcctgacc cgaacagctt cggtcgagtc tgcttccagt acttcgacca 240

gtgtgcctct gacagacagt gtcgccgggg ggagaggtgt tgcctagtgg ccggctgtgg 300

cagggagtgc atagcacgca gctctggcgg gggcccagtg tccaagcctg ggacgtgtcc 360

agtcattcag ttcatcgtgg ccccgcagtg tagccctcgg gacagaatcg accgttgcca 420

gtcagaccgg cagtgcccag ggacccaaaa gtgctgcttc ctcgtctgca acagacagtg 480

ttcggagcca ttgtagatat aagtttgtca attcgtacgc acccttccag tggatctaat 540

ctaggagtaa ctttgctaat tctttcccac tgcagattca agggctcatg cgacagagat 600

tagcaccgag gccacgtgca gctatatcat atgctcccaa cgttacttgc ttccatttat 660

tcactcctaa tgtggtgccg agacccgcct gatgggcgag catcccaaaa ctcgctctac 720

gaggggggtg ctacctcgtt ggctttcccg tctcgctggt cgcgggtttg atccccggtg 780

caggcgaaac ctctatactt gtctggatta atttatcgtg tgcttcgtta cacgctgtgg 840

tcatgaggga agggaaggga aattctgtca tttcaataag agtcattgca gactccttta 900

tgttcttttg ctctcgtata aaattgaggg cttacgttat ggcctctgtg ctaatatcca 960

tcacattaac ccttgagctt gttgtgggta agaaatgaaa ggaaaaaaca tgaccgtaga 1020

tacttgtgtg gcataaatta tcttgcaccc ttgttttaaa gtaagtacga agcatacttt 1080

ctcttcagag cagcataggt gagccaacca tttgccgacg cctgatgtag accttttaac 1140

ctttttcttg cttttttgtt cgtgaataaa gcattgctct ggtaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1223

本发明的中华绒螯蟹EsDWD-2基因编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中所示信息为：

(a)序列特征：

●长度：140氨基酸

●类型：氨基酸

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.2

本发明提供了SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列有一个22个氨基酸的信号肽和两个典型的WAP结构域（Arg37-Arg82；Lys91-Leu140）。

实施例2：

中华绒螯蟹EsDWD-2基因编码区原核重组表达载体的构建、表达和纯化

1、重组表达载体的构建

根据中华绒螯蟹EsDWD-2基因序列和表达载体pET30a（Novagen公司）的克隆位点，本发明采用pET30a中的EcoRI和Xho I酶切位点，设计引物时在上游引物引入EcoRI酶切位点，下游引物引入Xho I酶切位点。设计并合成用于扩增中华绒螯蟹EsDWD-2基因编码区片段的引物，P3(5'-GAATTCAAGTGGCACTTGCCCTCCTG-3')和P4（5'-CTCGAG CTACAATGGCTCCGAACACTGT-3'）。以中华绒螯蟹的cDNA作为模板扩增EsDWD-2片段，16℃下连接pMD18-T和EsDWD-2片段，将连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用卡那霉素及PCR技术筛选阳性克隆，获得pMD18-T-EsDWD-2重组质粒。在37℃水浴条件下，用EcoRI和Xho I分别酶切pET30a和pMD18-T-EsDWD-2。酶切结束，用1%的琼脂糖凝胶电泳酶切产物，回收pET30a载体大片段和带有EcoRI和Xho I酶切位点的EsDWD-2片段，然后在T4DNA连接酶作用下，在16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌TOP10，用氨苄青霉素筛选和菌落PCR筛选并测序。

2、重组蛋白的表达和纯化

本研究中使用的重组表达菌株为BL21，其带有的plysS质粒可以表达T7溶菌酶，能抑制诱导物加入之前插入基因的泄漏表达，因此可以提高宿主菌对毒性表达物的耐受能力。

重组蛋白的诱导表达步骤如下：

（1）挑取单克隆，于带有氨苄青霉素的LB培养基中，220rpm，37℃培养至OD₆₀₀约为0.5。

（2）加入终浓度为0.8mmol L^-1的IPTG，220rpm，37℃继续培养4-6h。

（3）4℃，5000rpm，离心10min，收集菌体沉淀。加入100μl上样缓冲液，沸水浴中裂解10min后离心，取上清，于15％的SDS-PAGE电泳分析，考马斯亮蓝R-250染色，脱色后用凝胶成像系统记录结果。

同时做未诱导对照，取1ml菌液离心，弃去上清后，加入80μl水和20μl5X蛋白上样缓冲液，100℃沸水煮沸10分钟，稍离心，收集上清液和和沉淀，SDS-PAGE检测表达产物。

重组蛋白的纯化步骤如下：

采用金属螯合层析方法，利用组氨酸侧链上的咪唑基与金属离子（Ni²⁺）等螯合的特性，使基因重组技术制备的His-Tag融合重组蛋白和pET32a空载体诱导表达的TRX蛋白得到纯化。主要实验步骤操作如下：（1）变性状态下纯化His标签重组蛋白所需缓冲液配方：

A.缓冲液I：配制：0.5mol L^-1NaH₂PO₄19ml，0.5mol L^-1Na₂HPO₄81ml，NaCl29.3g和尿素480g，溶解后定容到1L。

B.缓冲液II：配制：0.5mol L^-1NaH₂PO₄19ml，0.5mol L^-1Na₂HPO₄81ml，NaCl29.3g，咪唑34g和尿素480g，溶解后定容到1L。

C.缓冲液III：咪唑浓度为50mmol L^-1的缓冲液B：缓冲液I90ml，加缓冲液II10ml；咪唑浓度为400mmol L^-1的缓冲液B：缓冲液I20ml，加缓冲液II80ml。

（2）纯化步骤

A.离心收集菌体，加20-30ml缓冲液I。超声波破碎菌体后离心取上清。细菌破碎液用0.45μm滤膜过滤。

B.用缓冲液I平衡10个床体积，控制流速为1ml min^-1。

C.将细菌破碎液以流速为1ml min^-1上样。

D.用缓冲液I洗10个柱床体积，流速为1ml min^-1。

E.用分别含50mmol L^-1、400mmol L^-1咪唑的缓冲液III进行阶段洗脱，流速为2ml min^-1，收集各阶段洗脱峰，每个浓度洗脱5个柱床体积，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度。

F.用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗5个柱床体积，将柱子于4～8℃环境中保存。

重组蛋白以包涵体形式存在，以常规方法经过包涵体纯化、复性获得中华绒螯蟹EsDWD-2重组蛋白。

实施例3：

中华绒螯蟹EsDWD-2重组蛋白的抑菌活性测定

重组蛋白的抑菌活性是根据Rathinakumar等的方法略微改动。测定重组蛋白EsDWD-2对细菌生长的影响。

（1）测试菌为大肠杆菌（E.coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。当被测菌长到对数生长期时，离心，沉淀用Tris-HCl(50mmol l^-1,pH=8.0)溶解，使浓度达到每毫升为10³菌落形成单位。

（2）在平底96孔板（Costar，Fisher）中每孔加50μl菌悬液。蛋白用Tris-HCl梯度稀释后，蛋白终浓度为400μg ml^-1加到96孔板中，每个浓度设5个重复，对照蛋白TRX设为对照组。

（3）室温孵育3小时，再加入150μl的培养基。

（4）混匀。放入28℃培养箱中过夜培养。

（5）用酶标仪于600nm检测各孔OD值。

抑菌实验结果：重组溶菌酶蛋白对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌活性，如图所示。

Claims

1.中华绒螯蟹双WAP结构域蛋白基因，其特征在于：中华绒螯蟹双WAP结构域蛋白基因的cDNA序列为序列表SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列。

2.一种按权利要求1所述的中华绒螯蟹双WAP结构域蛋白基因的编码蛋白，其特征在于：所述编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2中所示。

3.一种按权利要求1所述的中华绒螯蟹双WAP结构域蛋白基因的重组蛋白作为杀菌剂的应用，其特征在于：在大肠杆菌中进行了表达，获得具有抑菌活性的双WAP结构域蛋白。