CN103768037B - 以双亲性化合物为载体的具有抗肿瘤和降低心脏毒性作用的缓释药物纳米微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了以双亲性化合物为载体的具有抗肿瘤和降低心脏毒性作用的缓释药物纳米微球及其制备方法，该纳米微球是由双亲性化合物为载体材料制备而成，具有双壳层核壳结构，抗肿瘤药物一部分被化学连接于双亲性化合物上，另一部分被物理包裹于核心，功能分子被物理包裹于核心。其特点是：药物通过化学连接和物理包裹的方法负载于纳米微球，增加了药物在纳米微球中的质量分数，减缓初期释放以及补充后期释放。该微球能使药物在体内具有缓释作用，减少病人痛苦和二次给药。有机硅氧烷水解在亲水和疏水层间形成另一层壳为释药又产生了一层屏障。磷酸肌酸在提高机体能量的同时能减少对人体正常组织、器官的损伤。

Description

以双亲性化合物为载体的具有抗肿瘤和降低心脏毒性作用的 缓释药物纳米微球及其制备方法

技术领域

本发明属于化学药物技术领域，涉及一种以双亲性化合物为中心载体的能降低心脏毒性的抗肿瘤药物及其微球的制法。

背景技术

恶性肿瘤是目前危害人类生命最严重的疾病之一，恶性肿瘤因为其顽固性在治疗中需要综合治疗，化学治疗是必不可少的手段之一。

阿霉素是一种广谱抗肿瘤药物，主要用于肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌等的治疗，但其注射给药后全身毒副作用较大，特别是对心脏的毒性比较严重，影响了药物的治疗效果。在肿瘤化学治疗中，通常在阿霉素给药的同时还要注射一定量的心肌保护药物来减少副作用。最常见的心肌保护剂即为磷酸肌酸。磷酸肌酸是一种高能磷酸化合物，在医疗上主要用于心脏问题。其应用能更好地恢复自发窦性心律，降低心肺复苏后心律失常和房室阻滞的发生以及降低直流电除颤的强度及所需的总脉冲次数。将磷酸肌酸和阿霉素同时连接到载体上，可以在治疗肿瘤的同时减少心肌损伤，提高给药效率。

近年来，国内外学者对于阿霉素单独或协同其他药物的临床做了很多研究，但是将其与功能基团磷酸肌酸共同应用于纳米药物载体上，并用于缓释剂型的研究还未受到重视。

微球是一种以适宜高分子材料为载体包裹或吸附药物而制成的球形或类球形的微粒。具有长效作用的贮库式生物降解的微球，将药物包裹在胶束或微球核心，可降低网状内皮吞噬系统(RES)对其的识别和吞噬,改变原药体内分布,也可减少在正常部位释药而导致的损害，实现药物在靶器官、靶组织的聚集和释放,提高药效,降低毒性为疾病的治疗提供了新的给药途径。

以两亲性嵌段高分子化合物作为微球载体的研究已经取得了很多的成就。因为其具有良好的生物相容性和安全性。同时伴随着它的降解，药物缓慢释放，没有明显的额崩解现象。聚乙二醇及其衍生物在用作药物载体发挥了巨大作用，因其是形成双亲性化合物的亲水段，分子式两端是羟基，很容易进行化学修饰成端羧基、端氨基或马来酰亚胺基。这些基团可以与其他化合物进行反应，连接化学药物和其他功能基团。聚乙二醇的分子量不同，其溶解度不同，在体内的降解速度不同，其与药物之间的键合方式也不同。据此，可以通过控制聚乙二醇的分子量来控制药物在人体内的释放速度。

发明内容

本发明的目的之一提供一种以双亲性化合物为载体的具有抗肿瘤和降低心脏毒性作用的缓释药物纳米微球。所述纳米微球具有双壳层核壳结构，其中壳层为双亲性化合物的亲水段，核为双亲性化合物的疏水段，所述纳米微球的另一层壳层位于双亲性化合物所形成的的壳层与核之间，由有机硅氧烷水解形成，抗肿瘤药物一部分被化学连接于双亲性化合物上，另一部分被物理包裹于核心，功能分子被物理包裹于核心。所述功能分子为磷酸肌酸；所述抗肿瘤药物为阿霉素，所述有机硅氧烷为四甲氧基硅烷。

本发明的另一目的是提供实现第一目的的载药纳米球的制备方法。

由以下步骤制备：

以具有良好生物相容性聚合物聚乙二醇为载体中心，通过使其活化，后连接疏水化合物，制备成双亲性化合物，该双亲性化合物的疏水端连接上抗肿瘤药物后，与有机硅氧烷混合，利用微乳技术物理包裹抗肿瘤药物和功能分子，制备成具有核壳结构的载药纳米微球；所述双亲性化合物为双亲性两嵌段化合物。

上述制备方法中，所述双亲性化合物为聚乙二醇-聚（乳酸-羟基乙酸）、聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-壳聚糖或聚乙二醇-聚己内酯。

上述制备方法中，所述功能分子为磷酸肌酸；所述抗肿瘤药物为阿霉素，所述有机硅氧烷为四甲氧基硅烷。

上述制备方法中，抗肿瘤药物与双亲性化合物进行化学连接的基团为能水解的酯基或酰胺基。

上述制备方法中，所述微乳技术为双乳化溶剂挥发法、纳米沉淀-透析法或旋转蒸发法。

上述制备方法中，所述的双亲性化合物由以下步骤制备得到：

（1）聚乙二醇的修饰活化：将聚乙二醇与丁二酸酐进行反应，将聚乙二醇两端羟基活化为双端羧基；具体步骤为将聚乙二醇（PEG）1-10g、丁二酸酐0.01-0.1g、4-二甲氨基吡啶（DMAP）0.01-0.2g和三乙胺0.01-1ml加入到20-40mL二氯甲烷（CH₂Cl₂）中，于60-90℃搅拌12-24h后，以3%-5%稀盐酸洗涤2-4次以除去DMAP，再加入50-70mL冰无水乙醚使其结晶，取沉淀，40-50℃真空干燥，得到双端羧基聚乙二醇HOOC-PEG-COOH；其化学反应式为：

（2）将步骤（1）产物一端羧基在叔丁醇保护下，连接疏水化合物，该疏水化合物有可反应化学官能团，所述疏水化合物包括聚（乳酸-羟基乙酸）、聚乳酸、壳聚糖或聚己内酯；

其具体步骤为：将1-5g步骤（1）产物（HOOC-PEG-COOH）、0.02-0.1g的叔丁醇（BuOH）和200-300uL三乙胺（Et₃N）加入到20-30mLCH₂Cl₂中，于0℃反应3-5h，再向其中加入0.02-0.1g DMAP、0.02-0.25g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和1-8g疏水化合物（HOOC-R₁-OH），在10-30℃反应12-24h，得到产物反应产物HOOC-R₁OOC-PEG-COOC(CH₃)₃；其化学反应式为：

（3）将步骤（2）产物与阿霉素进行反应，阿霉素的氨基与载体化合物疏水端的羧基酯化反应连接，之后去保护；

其具体步骤为：取步骤（2）反应产物HOOC-R₁-OOC-PEG-COOC(CH₃)₃2-5g溶于20-30mL二氯甲烷中，然后加入0.02-0.08gEDC，0.01-0.08g NHS,以及0.01-0.2g药物阿霉素，其中阿霉素与HOOC-R₁-OOC-PEG-COOC(CH₃)₃的物质的量之比为1.2-1.3，该体系于室温下反应12-24h，之后再向该反应体系中加入10%的三氟乙酸二氯甲烷溶液20-30mL，20-30℃下反应1-3小时，加入50-70mL冰无水乙醚使其结晶，取沉淀，40-50℃真空干燥，得到连接有药物的双亲性化合物R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH；

上述制备方法中，所述乳化溶剂挥发法包括如下步骤：

（1）以连接有药物的双亲性化合物R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH为溶质，配制浓度为10-200mg/mL的油相溶液；将药物阿霉素分散于上述基质溶液形成油相；再向所述的油相中地加入四甲氧基硅烷，在300-500rpm的转速下搅拌15-30min使其混合均匀；其中所述油相溶液以二氯甲烷、四氢呋喃或丙酮为溶剂；所述药物的质量为R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH的5%-20%，所述四甲氧基硅烷（TMOS）的质量为R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH的6%-30%；

（2）以磷酸肌酸为溶质，配制浓度为1-20mg/mL的油相溶液，并与（1）的溶液混合，得到溶液A；其中其中所述油相溶液以二氯甲烷、四氢呋喃或丙酮为溶剂；

（3）以聚乙烯醇为溶质，以水为溶剂，配置质量分数为0.5%-2.5%的水相溶液B；

（4）再将溶液A以30-40滴/min的速度加到步骤（3）所述B水溶液中，该水溶液的体积为A溶液体积的5-20倍，将该混合液于500-1000rpm的速度搅拌12-24h，使有机溶剂充分挥发；

（5）将步骤(4)所得的水/油乳液高速离心，取沉淀，加蒸馏水分散再重复离心取沉淀的步骤，该步骤重复2-4次，直至聚乙烯醇被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥，即得到以双亲性化合物为载体材料的具有抗肿瘤和降低心脏毒性作用的缓释药物纳米微球；所用离心速度8000-10000rpm。

上述制备方法中，所述纳米沉淀-透析法包括如下步骤：

（1）以连接有药物的双亲性化合物R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH为溶质，配制浓度为10-200mg/mL的油相溶液；将药物阿霉素分散于上述基质溶液形成油相；再向所述的油相中地加入四甲氧基硅烷，在300-500rpm的转速下搅拌15-30min使其混合均匀；其中所述油相溶液以二氯甲烷、四氢呋喃或丙酮为溶剂；所述药物的质量为R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH的5%-20%，所述四甲氧基硅烷（TMOS）的质量为R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH的6%-30%；

（2）以磷酸肌酸为溶质，配制成浓度为1-20mg/mL的油相溶液，并与（1）的溶液混合得到溶液A；所述油相溶液是以二氯甲烷、四氢呋喃或丙酮为溶剂；

（3）以聚乙烯醇为溶质，以水为溶剂，配置质量分数为0.5%-2.5%的水相溶液B；

（4）再将B溶液逐滴滴加到A油相溶液，水相的体积是油相的1-2倍；

（5）将步骤（4）所述的溶液以300-600rpm继续搅拌2-4小时；

（6）将步骤5）的产物在蒸馏水介质中进行透析，每2-5小时换一次水，透析36-48小时；

（7）将步骤（6）的产物冷冻干燥即得到以双亲性化合物为载体的具有抗肿瘤和降低心脏毒性作用的缓释药物纳米微球。

上述制备方法中，所述旋转蒸发法包括如下步骤：

（1）以连接有药物的双亲性化合物R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH为溶质，配制浓度为10-200mg/mL的油相溶液；将药物阿霉素分散于上述基质溶液形成油相；再向所述的油相中地加入四甲氧基硅烷，在300-500rpm的转速下搅拌15-30min使其混合均匀；其中所述油相溶液以二氯甲烷、四氢呋喃或丙酮为溶剂；所述药物的质量为R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH的5%-20%，所述四甲氧基硅烷（TMOS）的质量为R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH的6%-30%；（2）以磷酸肌酸为溶质，配制成浓度为1-20mg/mL的油相溶液，并与（1）的溶液混合得到溶液A；所述油相溶液是以二氯甲烷、四氢呋喃或丙酮为溶剂；

（3）将步骤（2）所述的油相逐滴滴加于蒸馏水中，蒸馏水的体积是油相的5-20倍；

（4）将步骤（3）所述的溶液以300-600rpm继续搅拌2-3小时；

（5）将步骤（4）所得的溶液转移至旋转蒸发仪，45℃-60℃旋转蒸发除去有机溶剂，再过0.22μm微孔滤膜，滤液冷冻干燥，得到以双亲性化合物为载体的具有抗肿瘤和降低心脏毒性作用的缓释药物纳米微球。

从实现本发明目的方案的过程中可以看出，由于该反应是以聚乙二醇作为亲水端连接上疏水化合物后形成双亲性中心载体，在亲疏水作用下，亲水段和疏水嵌段分别相互聚集，而形成疏水在内，亲水在外的核壳结构。亲疏水段的比例以及聚乙二醇相对分子量的不同会影响到该嵌段共聚物的亲水性和释药动力学，因此可以根据实际条件来适当调整聚乙二醇的分子量。其次，聚乙二醇和阿霉素之间是通过酯键连接，在生物体内逐渐水解，通过降解释放出化学药物。再次，药物以键合和物理包裹的形式存在于微球中，不仅提高了载药量，也使得药物释放时间延长，键和药物补充后期释药，增强了药效。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

（1）采用本发明制备的抗肿瘤药物微球将临床上分别给药的两种药物连接到同一药物载体上，能达到治疗肿瘤同时减少副作用的效果。

（2）本发明用简单制备方法得到的阿霉素药物载体有较好的生物相容性，增加的TMOS水解并在亲疏水段间形成的硅壳构成一层所构成的药物释放屏障，可以增加药物在体内循环时间并在到达作用部位时保持药物的活性，减少多次给药的繁琐步骤。

（3）本发明制备药物载体的高分子化合物分子量可控，分子链端活性基团可经改性，连接其他功能集团，为纳米药物载体的应用扩充了范围。

（4）本发明中，药物以化学键合和物理包裹状态存在于微球内部，能够提高微球的载药量。

（5）本发明中，通过物理包裹结合化学键接药物可以补充药物释放后期药物浓度的不足，现阶段的研究多是将药物以自由状态包裹于微球或纳米粒。这样因为随着物理包裹进去的药物释放，释药速度逐渐平缓，血药浓度降低，不能达到最佳治疗效果。然而药物经化学键接后就解决了此不足，在释药后期，通过药物和载体化合物之间的化学键的逐渐水解，药物释放，弥补自由药物分子释放浓度的不足。现有文献包裹药物的释放曲线到了60-90小时后，释放速度很慢，但是本发明的药物释放在90小时后仍能维持较快的水平。

附图说明

图1是实施例1的阿霉素键合高分子化合物形成双亲性载体的制备流程图。

图2为本发明实施例1形成双端羧基聚乙二醇和单羧基保护的聚乙二醇红外光谱图；

图3为本发明实施例1合成连接有阿霉素药物的载体核磁共振谱图。

图4为本发明实施例1纳米微球临界胶束浓度测量曲线图。

图5为本发明实施例1纳米微球临界胶束浓度计算结果图。

图6为本发明实施例1纳米微球的扫描电镜图。

图7为本发明实施例1纳米微球透射电镜图。

图8为本发明实施例1纳米微球粒径分布图。

图9为本发明实施例1TMOS组与无TMOS组纳米微球在pH5.4和pH7.4的PBS中的药物释放图。

具体实施方式

下面通过示例性的实施例具体说明本发明。应当理解，本发明的范围不应局限于实施例的范围。任何不偏离本发明主旨的变化或改变能够为本领域的技术人员所理解。本发明的保护范围由所附权利要求的范围确定。

本发明结合实施例进一步说明，其中采用的PEG的分子量均为10000,所采用的PLGA的分子量为10000，且一端为羧基一端为羟基。

实施例1

两嵌段化合物的合成（如图1所示）

1、双端羧基聚乙二醇的合成，产物CT-PEG

称取2g PEG、0.05g丁二酸酐和0.04g催化剂DMAP于带有空气冷凝管、搅拌器、温度计和通N₂保护装置的四口烧瓶中混合，向其加入0.02ml三乙胺和30mL CH₂Cl₂，通入N₂，加热，在70℃反应约14小时后冷却至室温，分理处产物。产物用4%稀HCl洗涤3次以除去DMAP，再用70mL冰无水乙醚萃取提纯3次，去除未反应的丁二酸酐，所得产物为棕色粘稠液体。加无水乙醚结晶，放入冰箱冷藏24h，过滤得白色固体，40℃真空干燥，得到双端羧基聚乙二HOOC-PEG-COOH(CT-PEG)，用凝胶渗透色谱（GPC Viscotek Max VE2001）测得其数均分子量为10256g/mol。

2、两嵌段化合物的合成,产物为PLGA-PEG-COOC(CH₃)₃

在0℃下向4g步骤1产物中加入叔丁醇0.04g，三乙胺250uL，二氯甲烷30mL，0℃反应4h后，让混合物升至室温，该步产物为HOOC-PEG-COOC(CH₃)₃。

向其中分别加入0.06g DMAP，0.08gEDC，4.5g聚（乳酸-羟基乙酸）（PLGA），该体系在氮气的作用下室温下反应24h。最后用20mL冰乙醚沉淀聚合物后过滤，滤出物再用10mL二氯甲烷溶解后滴加到20mL冰无水乙醚沉淀结晶，过滤，取滤出物于25℃真空干燥12小时，得到两嵌段化合物PLGA-PEG-COOC(CH₃)₃；

3、连接阿霉素后去羧基保护，产物为DOX-PLGA-PEG-COOH

取3g步骤2的产物PLGA-PEG-COOC(CH₃)₃将其溶于20mL二氯甲烷中，再向其中加入0.08g的阿霉素，在搅拌作用下加入0.04g的EDC和0.02g NHS，通N₂反应24h。之后向其滴入20mL10%的三氟乙酸，25℃下搅拌脱保护lh，滴至50mL冰无水乙醚中析出，40℃真空干燥，得到DOX-PLGA-PEG-COOH，测得其数均分子量为20744g/mol。

图1为本实施例步骤1、2和3的合成过程示意图。

用美国Nicolet NEXUS--670型FTIR对产物进行红外测试，取适量产物，与KBr固体混合、研磨、压片、扫描，得到PEG的段羟基改性结果红外谱图见图2。

图2中HOOC-PEG-COOH，HOOC-PEG-COOC(CH₃)₃与PEG的谱图特征大致相同，在3590cm^-1为分子链段-OH和-COOH的振动峰，2855cm^-1、1469cm^-1和842cm^-1处均出现C-H的伸缩振动、弯曲振动和摇摆振动的特征吸收峰。1186cm^-1和1089.6cm^-1为脂肪醚C-O特征峰。在1750cm^-1处，HOOC-PEG-COOH和HOOC-PEG-COOC(CH₃)₃都出现一个强振动峰为C=O的伸缩振动吸收峰，表明PEG发生了酯化反应。此外，在3590cm^-1处的峰形各不一样，发生端羟基改变后，该峰形变得扁平，HOOC-PEG-COOC(CH₃)₃因只有一个端羟基发生改变，故在3590cm^-1处的峰宽居于HOOC-PEG-COOH与PEG之间，证明了PEG成功发生了端羧基化和单羧基的保护。

本发明实施例1合成连接有阿霉素药物的载体核磁共振谱图如图3，¹HNMR谱由BrukerDRX500MHz核磁共振波谱仪测定,四甲基硅烷(TMS)为内标,溶剂为氖代氯仿(CDC1₃)。

在图3中，DOX-PLGA-PEG-COOH共聚物的谱图上明显可见核磁共振谱中各氢的化学位移:δ1.2-1.8(多重峰,PLGA中丙交酯的-CH₃);δ3.64(单峰,PEG骨架-CH2-);δ4.05(三重峰,H2,-CH₂-OCO-);δ7.2(-NH₂峰位)由于该物质为高聚物,δ2.23(d,overlapped)为DOX的质子化学位移峰。PEG主链中含有很多亚甲基,使得PEG骨架-CH₂-氢峰强度很高,峰面积很大,阿霉素上各氢峰与之相比显得非常小,特别是-NH-氢含量太小,其峰几乎看不到;但是将图放大以后,还是可以在相应的化学位移处观察到相应的峰。

图4是为测得聚合物DOX-PLGA-PEG-COOH的临界胶束浓度CMC而对具有相同芘浓度但不同聚合物胶束浓度的溶液进行荧光测试，得到的谱图结果。测试采用芘为荧光探针剂。众所周知，芘在水溶液中具有很小的溶解度，当其进入疏水环境中时，其荧光强度增大。对所配制的一系列具有相同芘浓度但不同聚合物胶束浓度的溶液进行荧光测试，发现其荧光强度随着聚合物胶束浓度的增大而增大，这是由于随着聚合物胶束浓度的增大，芘从水溶液中更多的进入到聚合物胶束疏水内核中。

图5为I₃₇₃/I₃₈₄比值与聚合聚合物溶液浓度对数（log C）的关系图。在聚合物胶束浓度较低时，I₃₇₃/I₃₈₄的比值几乎没有什么变化，保持在一个恒定的值周围。当聚合物胶束浓度增大时，荧光强度迅速升高，这意味着聚合物胶束大量的形成，同时芘大量进入到聚合物胶束疏水内核中。从图中可以看到，I₃₇₃/I₃₈₄的比值所形成的两条线的交叉点所对应的浓度值就是聚合物胶束的临界胶束浓度，约为3.01×10^-5g/mL。该较低的聚合物胶束浓度意味着聚合物能够在较低的浓度下形成聚合物胶束，这有利于药物载体在较低浓度情况下稳定存在，比如在人体环境中。

4、采用乳化-溶剂挥发法制备纳米微球的方法：

1）称取步骤3产物固体粉末DOX-PLGA-PEG-COOH1.8g，阿霉素0.3g和TMOS0.4g加入到20mL二氯甲烷溶液中，匀质机搅拌均匀形成油相。

2）称取磷酸肌酸0.05g，粉末分散于10mL二氯甲烷溶液，搅拌均匀，并与（1）的溶液混合。

3）把步骤2）与步骤1）溶液混合后所得的油相溶液逐滴加入到200mL1%的PVA水溶液中，将该混合液以600rpm速度搅拌13小时。使有机溶剂充分挥发。为加快挥发，也可采用常温减压挥发，时间不少于3小时。

4）以10000rpm速度离心步骤4）所得的纳米粒，不断进行取沉淀，加蒸馏水分散再重复离心取沉淀的步骤，直至PVA被洗干净。最后将沉淀冷冻干燥保存，即得到以双亲性化合物为载体的具有抗肿瘤和降低心脏毒性作用的缓释药物纳米微球。

5）步骤4）得到的载药纳米微球的载药量为14.2%，包封率为73.4%，消毒后可作为药物备用。

用扫描电镜和透射电镜对所得到的纳米微球进行测试表征，扫描电镜结果参见图6，透射电镜结果参见图7。从图6和图7可以清晰观察到样品为规则圆形及表面相对光滑。从透射电镜的结果还可以看到，药物多集中于微球中心。

图8为用激光粒度仪对所得到的纳米微球的粒径与粒径分布进行测试表征结果。从图8可以看到微球粒径呈现正态分布，且分布范围比较窄，表明制备的微球大小比较一致，在200nm左右，和扫描电镜和透射电镜的结果一致。

根据是否添加TMOS，本实施例制备两种载药纳米微球，其中一种加入TMOS组，即为本发明所述制备的纳米微球，记作TMOS组，另一种不加TMOS而制备的纳米微球为对比组记作无TMOS组。制备无TMOS组与TMOS组纳米微球的不同之处仅在于制备纳米微球过程中没有添加TMOS。

图9为通过本发明实施例1制备的TMOS组与无TMOS组的纳米微球分别在pH7.4和pH5.4的PBS缓冲溶液中的体外药物释放效果图，制备无TMOS组的纳米微球的物料比例除没有添加TMOS外，与实施例1相同，取本实施例制备得到的TMOS组与无TMOS组载药纳米微球溶解于等体积的pH7.4和pH5.4的PBS缓冲溶液的透析袋中，用透析夹扎紧透析袋两端，对应放入pH7.4和pH5.4的PBS缓冲溶液中，于37℃恒温振动箱中，在不同时间点取3mL释放介质用于测定释放药物量，同时向三角瓶中补入3mL pH5.4的PBS缓冲溶液。用紫外分光光度计测定释放介质的吸收值，根据标准曲线方程计算DOX释放浓度和累积释放量。以累积释药百分率对时间作图，绘制载药微球的药物释放曲线如图9。从中发现本发明制备的载药纳米微球具有良好的药物缓释效果,在经过初期约15h突释后达到稳定的药物释放速率,缓释时间长达200h以上,200h时的累积释放率分别约为81%和61%。而没有TMOS组纳米微球因为没有硅壳这层释药屏障，速度大于TMOS组，因此可以得出：TMOS对于纳米药物载体具有缓释作用。此外，阿霉素释放速率在pH7.4的环境中释放比较缓慢，这可能是由于微球内核与阿霉素的相互作用及阿霉素溶解性随不同pH的释放介质而发生变化所致，而且载体在pH为5.4的环境下更容易水解，从而影响了对阿霉素的控制释放。因此该微球还表现出一定的pH敏感性。

实施例2

本实施例与实施例1前3步合成方法相同，不同之处在于制备载药微球的方法改为纳米沉淀-透析法，油相溶剂改为四氢呋喃，包括如下步骤：

（1）称取固体粉末DOX-PLGA-PEG-COOH1.8g，阿霉素0.3g和TMOS0.4g加入到20mL四氢呋喃溶液中，匀质机搅拌均匀形成油相；

（2）称取磷酸肌酸0.05g，粉末分散于10mL二氯甲烷溶液，搅拌均匀，并与（1）的溶液混合。

（3）把50mL1%的PVA水溶液逐滴加入到步骤（2）与步骤（1）混合液中以600rpm速度搅拌2小时后在蒸馏水介质中进行透析，每2小时换一次水，透析48小时；

（4）将步骤（3）的产物冷冻干燥即得到目的产物。

实施例3

本实施例与实施例1前3步合成方法相同，不同之处在于制备载药微球的方法改为旋转蒸发法，油相溶剂改为丙酮，包括如下步骤：

（1）称取固体粉末DOX-PLGA-PEG-COOH1.8g加入到20mL丙酮溶液中，匀质机搅拌均匀形成油相；分别称取阿霉素0.3g和TMOS0.4g加入到上述油相中，在500rpm的转速下搅拌15min使其混合均匀；

（2）称取磷酸肌酸0.05g，粉末分散于10mL丙酮溶液，搅拌均匀，并与（1）的溶液混合。

（3）再将步骤（1）和步骤（2）混合液逐滴滴加到200mL水相溶液中，以600rpm继续搅拌2小时后，转移至旋转蒸发仪，45℃旋转蒸发除去有机溶剂，再过0.22μm微孔滤膜，滤液冷冻干燥，得到载药纳米微球。

实施例4

本实施例与实施例2的不同之处在于：

将实施例2中的步骤（3）聚乙烯醇水溶液的质量分数调整为0.5%。

用激光粒度仪和紫外分光光度计对所得到的纳米微球进行测试表征，发现本实施例纳米微球的粒径和粒径分布，载药量和包封率如表1所示。

实施例5

本实施例与实施例2的不同之处在于：

将实施例2中的步骤（3）聚乙烯醇水溶液的质量分数调整为1.5%。

用激光粒度仪和紫外分光光度计对所得到的纳米微球进行测试表征，发现本实施例纳米微球的粒径和粒径分布，载药量和包封率如表1所示。

实施例6

本实施例与实施例2的不同之处在于：

将实施例2中的步骤（3）聚乙烯醇水溶液的质量分数调整为2%。

用激光粒度仪和紫外分光光度计对所得到的纳米微球进行测试表征，发现本实施例纳米微球的粒径和粒径分布，载药量和包封率如表1所示。

实施例7

本实施例与实施例2的不同之处在于：

将实施例2中的步骤（3）聚乙烯醇水溶液的质量分数调整为2.5%。

用激光粒度仪和紫外分光光度计对所得到的纳米微球进行测试表征，发现本实施例纳米微球的粒径和粒径分布，载药量和包封率如表1所示。

从表1可以看出纳米粒子粒径随着乳化剂浓度升高，出现先减小后增大的趋势。包封率和载药量都有所增加。原因是：乳化剂浓度低，导致聚合物聚集不易分散，得到的的粒子粒径相对较大。乳化剂浓度过高时，水相粘度增加，粒子团聚的机会也会增加。纳米粒子也易于形成和稳定，药物的泄露机会减小，增加了包封率和载药量。综合上述结果可以看出,选择乳化剂浓度在1%-2%较合适"

表1

Claims (1)

1.一种以双亲性化合物为载体的具有抗肿瘤和降低心脏毒性作用的缓释药物纳米微球，其特征在于，所述纳米微球具有双壳层核壳结构，其中壳层为双亲性化合物的亲水段，核为双亲性化合物的疏水段，所述纳米微球的另一层壳层位于双亲性化合物所形成的壳层与核之间，由有机硅氧烷水解形成，抗肿瘤药物一部分被化学连接于双亲性化合物上，另一部分被物理包裹于核心，功能分子被物理包裹于核心；具体由以下步骤制备：

以具有良好生物相容性的聚乙二醇为载体中心，通过使其活化，后连接疏水化合物，制备成双亲性化合物，该双亲性化合物的疏水端连接上抗肿瘤药物后，与有机硅氧烷混合，利用微乳技术物理包裹抗肿瘤药物和功能分子，制备成具有核壳结构的载药纳米微球；所述双亲性化合物为双亲性两嵌段化合物；所述双亲性化合物为聚乙二醇-聚（乳酸-羟基乙酸）；所述功能分子为磷酸肌酸；所述抗肿瘤药物为阿霉素，所述有机硅氧烷为四甲氧基硅烷；抗肿瘤药物与双亲性化合物进行化学连接的基团为能水解的酰胺基；所述微乳技术为乳化溶剂挥发法、纳米沉淀-透析法或旋转蒸发法；所述的双亲性化合物由以下步骤制备得到：

（1）聚乙二醇的修饰活化：将聚乙二醇与丁二酸酐进行反应，将聚乙二醇两端羟基活化为双端羧基；具体步骤为将聚乙二醇（PEG）1-10g、丁二酸酐0.01-0.1g、4-二甲氨基吡啶（DMAP）0.01-0.2g和三乙胺0.01-1ml加入到20-40mL二氯甲烷（CH₂Cl₂）中，于60-90℃搅拌12-24h后，以3%-5%稀盐酸洗涤2-4次以除去DMAP，再加入50-70mL冰无水乙醚使其结晶，取沉淀，40-50℃真空干燥，得到双端羧基聚乙二醇HOOC-PEG-COOH；

（2）将步骤（1）产物一端羧基在叔丁醇保护下，连接疏水化合物，该疏水化合物有可反应化学官能团，所述疏水化合物为聚（乳酸-羟基乙酸）；

其具体步骤为：将1-5g步骤（1）产物（HOOC-PEG-COOH）、0.02-0.1g的叔丁醇（BuOH）和200-300 uL三乙胺（Et₃N）加入到20-30mLCH₂Cl₂中，于0℃反应3-5h，再向其中加入0.02-0.1g DMAP、0.02-0.25g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和1-8g疏水化合物（HOOC-R₁-OH），在10-30℃反应12-24h，得到产物反应产物HOOC-R₁OOC-PEG-COOC(CH₃)₃；

（3）将步骤（2）产物与阿霉素进行反应，阿霉素的氨基与载体化合物疏水端的羧基酯化反应连接，之后去保护；

其具体步骤为：取步骤（2）反应产物HOOC-R₁-OOC-PEG-COOC(CH₃)₃ 2-5g溶于20-30mL二氯甲烷中，然后加入0.02-0.08gEDC，0.01-0.08g NHS,以及0.01-0.2g药物阿霉素，其中阿霉素与HOOC-R₁-OOC-PEG-COOC(CH₃)₃的物质的量之比为1.2-1.3，该体系于室温下反应12-24h，之后再向该反应体系中加入10%的三氟乙酸二氯甲烷溶液20-30mL，20-30℃下反应1-3小时，加入50-70mL冰无水乙醚使其结晶，取沉淀，40-50℃真空干燥，得到连接有药物的双亲性化合物R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH；

所述乳化溶剂挥发法包括如下步骤：

（1）以连接有药物的双亲性化合物R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH为溶质，配制浓度为10-200mg/mL的基质溶液；将药物阿霉素分散于上述基质溶液形成油相；再向所述的油相中加入四甲氧基硅烷，在300-500rpm的转速下搅拌15-30min使其混合均匀；其中所述油相溶液以二氯甲烷、四氢呋喃或丙酮为溶剂；所述药物的质量为R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH的5%-20%，所述四甲氧基硅烷（TMOS）的质量为R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH的6%-30%；

（2）以磷酸肌酸为溶质，配制浓度为1-20mg/mL的油相溶液，并与（1）的溶液混合，得到溶液A；其中所述油相溶液以二氯甲烷、四氢呋喃或丙酮为溶剂；

（3）以聚乙烯醇为溶质，以水为溶剂，配置质量分数为0.5%-2.5%的水相溶液B；

（4）再将溶液A以30-40滴/min的速度加到步骤（3）所述B水溶液中，该水溶液的体积为A溶液体积的5-20倍，将该混合液于500-1000rpm的速度搅拌12-24h，使有机溶剂充分挥发；

（5）将步骤(4)所得的水/油乳液高速离心，取沉淀，加蒸馏水分散再重复离心取沉淀的步骤，该步骤重复2-4次，直至聚乙烯醇被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥，即得到以双亲性化合物为载体材料的具有抗肿瘤和降低心脏毒性作用的缓释药物纳米微球；所述离心速度8000-10000rpm；

所述纳米沉淀-透析法包括如下步骤：

（1）以连接有药物的双亲性化合物R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH为溶质，配制浓度为10-200mg/mL的基质溶液；将药物阿霉素分散于上述基质溶液形成油相；再向所述的油相中加入四甲氧基硅烷，在300-500rpm的转速下搅拌15-30min使其混合均匀；其中所述油相溶液以二氯甲烷、四氢呋喃或丙酮为溶剂；所述药物的质量为R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH的5%-20%，所述四甲氧基硅烷的质量为R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH的6%-30%；

（2）以磷酸肌酸为溶质，配制成浓度为1-20mg/mL的油相溶液，并与（1）的溶液混合得到溶液A；所述油相溶液是以二氯甲烷、四氢呋喃或丙酮为溶剂；

（3）以聚乙烯醇为溶质，以水为溶剂，配置质量分数为0.5%-2.5%的水相溶液B；

（4）再将B溶液逐滴滴加到A油相溶液，水相的体积是油相的1-2倍；

（5）将步骤（4）所述的溶液以300-600rpm继续搅拌2-4小时；

（6）将步骤5）的产物在蒸馏水介质中进行透析，每2-5小时换一次水，透析36-48小时；

（7）将步骤（6）的产物冷冻干燥即得到以双亲性化合物为载体的具有抗肿瘤和降低心脏毒性作用的缓释药物纳米微球；

所述旋转蒸发法包括如下步骤：

（1）以连接有药物的双亲性化合物R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH为溶质，配制浓度为10-200mg/mL的基质溶液；将药物阿霉素分散于上述基质溶液形成油相；再向所述的油相中加入四甲氧基硅烷，在300-500rpm的转速下搅拌15-30min使其混合均匀；其中所述油相溶液以二氯甲烷、四氢呋喃或丙酮为溶剂；所述药物的质量为R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH的5%-20%，所述四甲氧基硅烷的质量为R₂HNOC-R₁OOC-PEG-COOH的6%-30%；（2）以磷酸肌酸为溶质，配制成浓度为1-20mg/mL的油相溶液，并与（1）的溶液混合得到溶液A；所述油相溶液是以二氯甲烷、四氢呋喃或丙酮为溶剂；

（3）将步骤（2）所述的油相逐滴滴加于蒸馏水中，蒸馏水的体积是油相的5-20倍；

（4）将步骤（3）所述的溶液以300-600rpm继续搅拌2-3小时；

（5）将步骤（4）所得的溶液转移至旋转蒸发仪，45℃-60℃旋转蒸发除去有机溶剂，再过0.22μm微孔滤膜，滤液冷冻干燥，得到以双亲性化合物为载体的具有抗肿瘤和降低心脏毒性作用的缓释药物纳米微球。