CN103760346B - 一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法 - Google Patents

一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法，是将待测样品研磨，制备检测样品上样液，配制阳性、阴性及空白对照上样液，测出阳性对照上样液的病毒粒体平均数d。将2.0~2.5μl检测样品上样液、阳性、阴性及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上，将膜干燥后封闭0.8~1.2h，依次加入稀释后的一抗、二抗，分别反应0.8~1.2h，每次反应后洗膜3~4次，每次5~6min。将膜稍干燥后置于荧光分光光度计中检测荧光强度m，按照下述公式计算检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数d。阳性对照上样液m值：阳性对照上样液d值=检测样品上样液m值：检测样品上样液d值。所述方法能够实现植物病毒的灵敏准确、快捷高效的定量分析，推广应用价值较高。

Description

一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法
技术领域
本发明属于植物病毒定量检测技术领域，具体涉及一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法。
背景技术
斑点免疫结合法（DIBA）是一种以硝基纤维素薄膜为固相载体进行抗原——抗体免疫学反应的检测和鉴定植物病毒的基础性方法。该方法具有灵敏度高，准确性好，操作简便快捷等优点，但也存在着一些弊端：首先，判断阴、阳性反应只能靠目测，所以在色差较小的样品中，就可能造成错判或漏判；其次，阳性反应的颜色差异虽然从一定程度上反映了阳性样品中病毒的多少，但仍无法实现真正的定量检测。荧光标记技术是利用能发荧光的物质通过共价结合或物理吸附在所要研究的分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息的一种手段。若将斑点免疫结合法与荧光标记技术联合应用，利用荧光显色技术减少斑点免疫结合法的定性误差，提高其定量准确性，对于实现植物病毒灵敏准确、快捷高效的定量分析将具有十分重要的现实意义和推广应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法。
本发明的目的是这样实现的，一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法，包括检测样品及试剂配制、检测及定量分析工序，具体包括：
A、检测样品及试剂配制：按重量体积比1：2.5~3.5g/ml，将0.8~1.2g待检测植物样品加入磨样缓冲液中，将植物样品磨碎备用，作为检测样品上样液；按体积比1：1000，将提纯的待检测植物病毒用磨样缓冲液稀释备用，作为阳性对照上样液，并于电镜下测算出阳性对照上样液的病毒粒体平均数d；按重量体积比1:2.5~3.5g/ml，将0.8~1.2g无待检测病毒的植物样品加入磨样缓冲液中，将植物样品磨碎备用，作为阴性对照上样液；空白对照上样液即为磨样缓冲液；
B、检测：将检测样品上样液2.0~2.5μl点在硝酸纤维素膜上，再将同样体积的阳性对照上样液、阴性对照上样液及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜干燥后，置于容器内，加入封闭液浸没0.8~1.2h，弃去封闭液，加入用稀释缓冲液稀释的一抗，反应0.8~1.2h，弃去一抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次5~6min，再加入用稀释缓冲液稀释的二抗，反应0.8~1.2h，弃去二抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次5~6min；
C、定量分析：将洗涤后的硝酸纤维素膜稍干燥，置于荧光分光光度计中检测荧光强度m，按照下述公式即可算出检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数d：
阳性对照上样液m值：阳性对照上样液d值=检测样品上样液m值：检测样品上样液d值
其中，阳性对照上样液d= N1+N2+N3+……Ny/y；
y：电镜下观察视野的个数；
N：第y个观察视野中的病毒粒体数。
本发明所述方法将斑点免疫结合法与荧光标记技术联合应用，利用荧光显色技术避免了斑点免疫结合法可能出现的假阳性干扰，通过对固相支持物及底物的选择，进一步减少了定性误差，有效提高了定量准确性，对于实现植物病毒灵敏准确、快捷高效的定量分析具有十分重要的现实意义和较高的推广应用价值。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法，包括检测样品及试剂配制、检测及定量分析工序，具体包括：
A、检测样品及试剂配制：按重量体积比1：2.5~3.5g/ml，将0.8~1.2g待检测植物样品加入磨样缓冲液中，将植物样品磨碎备用，作为检测样品上样液；按体积比1：1000，将提纯的待检测植物病毒用磨样缓冲液稀释备用，作为阳性对照上样液，并于电镜下测算出阳性对照上样液的病毒粒体平均数d；按重量体积比1:2.5~3.5g/ml，将0.8~1.2g无待检测病毒的植物样品加入磨样缓冲液中，将植物样品磨碎备用，作为阴性对照上样液；空白对照上样液即为磨样缓冲液；
B、检测：将检测样品上样液2.0~2.5μl点在硝酸纤维素膜上，再将同样体积的阳性对照上样液、阴性对照上样液及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜干燥后，置于容器内，加入封闭液浸没0.8~1.2h，弃去封闭液，加入用稀释缓冲液稀释的一抗，反应0.8~1.2h，弃去一抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次5~6min，再加入用稀释缓冲液稀释的二抗，反应0.8~1.2h，弃去二抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次5~6min；
C、定量分析：将洗涤后的硝酸纤维素膜稍干燥，置于荧光分光光度计中检测荧光强度m，按照下述公式即可算出检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数d：
阳性对照上样液m值：阳性对照上样液d值=检测样品上样液m值：检测样品上样液d值
其中，阳性对照上样液d= N1+N2+N3+……Ny/y；
y：电镜下观察视野的个数；
N：第y个观察视野中的病毒粒体数。
所述的磨样缓冲液为加入0.01%吐温20的pH为7.0的PBST，稀释缓冲液为pH为7.0的PBST，洗涤缓冲液为加入0.01%吐温20的pH为7.0的PBST。
步骤A所述的植物样品可以为植物的叶、花、果或茎中的任一种。
步骤A所述的将植物样品磨碎备用，指的是将植物样品置于加厚的自封袋中，用研钵棒磨出汁液即可，但保证所有组织都研磨到。
步骤A所述的测算出阳性对照上样液的病毒粒体平均数d，指的是在电子显微镜下观察阳性对照上样液的y个视野，数取每个视野的病毒粒体数N，用下述公式计算出y个视野的病毒粒体平均数d。
d= N1+N2+N3+……Ny/y
y：电镜下观察视野的个数；
N：第y个观察视野中的病毒粒体数。
y值取25~35即可，优选取30。
步骤B所述的将检测样品上样液、阳性对照上样液、阴性对照上样液及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上，指的是用移液器吸取2.0~2.5μl检测样品上样液点在硝酸纤维素膜上，然后用移液器吸取同样体积的阳性对照上样液点在检测样品上样液的旁边，再依次将同样体积的阴性对照上样液点在阳性对照上样液的旁边，将空白对照上样液点在阴性对照上样液的旁边。
步骤B所述的封闭液为用稀释缓冲液配制的质量百分比为4~6%的脱脂奶粉。
步骤B所述的将硝酸纤维素膜干燥，指的是将硝酸纤维素膜置于室温下自然干燥，或是将硝酸纤维素膜置于37℃培养箱中干燥。
所述的室温为20~25℃。
步骤B所述的将硝酸纤维素膜干燥后，置于容器内，加入封闭液浸没，指的是将硝酸纤维素膜置于容器中，加入5~20ml封闭液，淹没硝酸纤维素膜，再将容器置于37℃培养箱中封闭0.8~1.2h。
所述的容器为培养皿。
所述的加入5~20ml封闭液，淹没硝酸纤维素膜，指的是直径为6cm的培养皿加入5ml；直径为9 cm的培养皿加入15ml；直径为12 cm的培养皿加入20ml，即按需加入，要求能淹没硝酸纤维素膜即可。
步骤B所述的用稀释缓冲液稀释的一抗，指的是用稀释缓冲液按体积比1:100~1000000倍稀释的一抗（不同病毒，它的一抗的稀释稀释效价不同，稀释倍数根据实际病毒确定），所述的用稀释缓冲液稀释的二抗，指的是用稀释缓冲液按体积比1:100~1000000倍稀释的二抗（二抗，不同公司生产的，它的稀释效价不同，稀释倍数根据实际情况确定）。
步骤B所述的加入用稀释缓冲液稀释的一抗，反应0.8~1.2h，指的是加入5~20ml用稀释缓冲液稀释的一抗，淹没硝酸纤维素膜，置于37℃培养箱中反应0.8~1.2h；所述的加入用稀释缓冲液稀释的二抗，反应0.8~1.2h，指的是加入5~20ml用稀释缓冲液稀释的二抗，淹没硝酸纤维素膜，置于37℃培养箱中反应0.8~1.2h。
所述的加入5~20ml用稀释缓冲液稀释的一抗或二抗，淹没硝酸纤维素膜，指的是直径为6cm的培养皿加入5ml；直径为9 cm的培养皿加入15ml；直径为12 cm的培养皿加入20ml，即按需加入，要求能淹没硝酸纤维素膜即可。
步骤B所述的用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜，指的是用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次均置于水平摇床上振荡洗涤5~6min。
步骤C所述的将洗涤后的硝酸纤维素膜稍干燥，指的是将洗涤后的硝酸纤维素膜用吸湿性材料吸干。
所述的吸湿性材料为滤纸。
步骤C所述的荧光分光光度计为美国Thermo Scientific公司制造的Lumina型号荧光分光光度计。
步骤C所述的荧光分光光度计的检测条件为：波长范围：190-900nm；光源：150W无臭氧氙灯。
步骤C所述的将洗涤后的硝酸纤维素膜稍干燥，置于荧光分光光度计中检测荧光强度m，对检测结果的评判标准如下：
（1）当阳性对照上样液有荧光读数，阴性对照上样液和空白对照上样液没有荧光读数时，检测即为成功。
（2）当检测样品上样液有荧光读数时，可判断为阳性样品，没有荧光读数时，可判断为阴性样品。即在荧光分光光度计的读数中，阴性反应的读数应为0，而阳性反应的读数应大于0。
（3）若检测样品上样液为阳性样品，则按照下述公式算出检测样品上样液中待检测病毒的粒体数d：
阳性对照上样液m值：阳性对照上样液d值=检测样品上样液m值：检测样品上样液d值
其中，阳性对照上样液d= N1+N2+N3+……Ny/y；
y：电镜下观察视野的个数；
N：第y个观察视野中的病毒粒体数。
实施例1
——烟草叶片样品中烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的检测
所用试剂如下：
磨样缓冲液：加入0.01%吐温20的pH为7.0的PBST。
稀释缓冲液：pH为7.0的PBST。
洗涤缓冲液：加入0.01%吐温20的pH为7.0的PBST。
封闭液：用稀释缓冲液配制的质量百分比为5%的脱脂奶粉。
一抗：TMV兔源抗体
二抗：荧光素标记的羊抗兔
A、检测样品及试剂配制：按重量体积比1：3.0g/ml，将1.0g待检测烟叶加入磨样缓冲液中，将烟叶样品置于加厚的自封袋中，用研钵棒磨出汁液（保证所有烟叶组织都研磨到）作为检测样品上样液。按体积比1：1000，将提纯的TMV用磨样缓冲液稀释备用，作为阳性对照上样液，在电子显微镜下观察阳性对照上样液的30个视野，数取每个视野的病毒粒体数N，如表1所示。用下述公式计算出30个视野的病毒粒体平均数d。
d= N1+N2+N3+……N30/30=524/30≈17
表1 30个视野中的病毒粒体数
视野 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10
病毒粒体数 13 18 21 15 13 13 19 17 15 19
视野 N11 N12 N13 N14 N15 N16 N17 N18 N19 N20
病毒粒体数 21 14 17 15 18 19 20 23 20 15
视野 N21 N22 N23 N24 N25 N26 N27 N28 N29 N30
病毒粒体数 17 16 17 13 18 14 21 23 19 21
按重量体积比1:3.0g/ml(即1g加入3ml)，将1.0g无TMV的健康烟叶样品加入磨样缓冲液中，将烟叶样品磨碎备用，作为阴性对照上样液。空白对照上样液即为磨样缓冲液。
B、检测：用移液器吸取检测样品上样液2.5μl点在硝酸纤维素膜上，再将同样体积的阳性对照上样液、阴性对照上样液及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜置于37℃培养箱中彻底干燥，然后置于直径为6cm的培养皿中，加入5ml封闭液，再将培养皿置于37℃培养箱中封闭1.0h。弃去封闭液，加入5ml用稀释缓冲液稀释的一抗，置于37℃培养箱中反应1.0h。弃去一抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3次，每次均置于水平摇床上振荡洗涤5min。接着加入5ml用稀释缓冲液稀释的二抗，置于37℃培养箱中反应1.0h。弃去二抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3次，每次均置于水平摇床上振荡洗涤5min。
C、定量分析：将洗涤后的硝酸纤维素膜用滤纸吸干，置于美国Thermo Scientific公司制造的Lumina型号荧光分光光度计中检测荧光强度m。具体参数设定如下：激发波长：490nm，发射波长：520nm，激发狭缝：10nm，发射狭缝：10nm，积分时间：0.1s，激发滤光片：自动，发射滤光片：自动，检测器电压：400v。
对检测结果的评判标准如下：
（1）当阳性对照上样液有荧光读数，阴性对照上样液和空白对照上样液没有荧光读数时，检测即为成功。
（2）当检测样品上样液有荧光读数时，可判断为阳性样品，没有荧光读数时，可判断为阴性样品。即在荧光分光光度计的读数中，阴性反应的读数应为0，而阳性反应的读数应大于0。
（3）若检测样品上样液为阳性样品，则按照下述公式算出检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数d。
检测结果如表2所示。
表2 荧光分光光度计检测结果
样品 荧光读数
阳性对照上样液 945.726
阴性对照上样液 000.000
空白对照上样液 000.000
检测样品上样液 832.314
    根据：阳性对照上样液m值：阳性对照上样液d值=检测样品上样液m值：检测样品上样液d值
即：  945.726:17=832.314：检测样品上样液d值
检测样品上样液d≈15
计算结果表明：检测样品上样液的30个电镜视野中平均有15个TMV病毒粒子。

Claims (10)

1.一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法，其特征在于包括检测样品及试剂配制、检测及定量分析工序，具体包括：
A、检测样品及试剂配制：按重量体积比1：2.5~3.5g/ml，将0.8~1.2g待检测植物样品加入磨样缓冲液中，将植物样品磨碎备用，作为检测样品上样液；按体积比1：1000，将提纯的待检测植物病毒用磨样缓冲液稀释备用，作为阳性对照上样液，并于电镜下测算出阳性对照上样液的病毒粒体平均数d；按重量体积比1:2.5~3.5g/ml，将0.8~1.2g无待检测病毒的植物样品加入磨样缓冲液中，将植物样品磨碎备用，作为阴性对照上样液；空白对照上样液即为磨样缓冲液；
B、检测：将检测样品上样液2.0~2.5μl点在硝酸纤维素膜上，再将同样体积的阳性对照上样液、阴性对照上样液及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜干燥后，置于容器内，加入封闭液浸没0.8~1.2h，弃去封闭液，加入用稀释缓冲液稀释的一抗，反应0.8~1.2h，弃去一抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次5~6min，再加入用稀释缓冲液稀释的二抗，反应0.8~1.2h，弃去二抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次5~6min；所述的二抗为荧光素标记的二抗；
C、定量分析：将洗涤后的硝酸纤维素膜稍干燥，置于荧光分光光度计中检测荧光强度m，按照下述公式即可算出检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数d：
阳性对照上样液m值：阳性对照上样液d值=检测样品上样液m值：检测样品上样液d值
其中，阳性对照上样液d= N1+N2+N3+……Ny/y；
y：电镜下观察视野的个数；
N：第y个观察视野中的病毒粒体数。
2.根据权利要求1所述的荧光免疫斑点法，其特征在于所述的磨样缓冲液为加入0.01%吐温20的pH为7.0的PBST，稀释缓冲液为pH为7.0的PBST，洗涤缓冲液为加入0.01%吐温20的pH为7.0的PBST。
3.根据权利要求1所述的荧光免疫斑点法，其特征在于步骤B所述的封闭液为用稀释缓冲液配制的质量百分比为4~6%的脱脂奶粉。
4.根据权利要求1所述的荧光免疫斑点法，其特征在于步骤B所述的将硝酸纤维素膜干燥，指的是将硝酸纤维素膜置于室温下自然干燥，或是将硝酸纤维素膜置于37℃培养箱中干燥。
5.根据权利要求1所述的荧光免疫斑点法，其特征在于步骤B所述的将硝酸纤维素膜干燥后，置于容器内，加入封闭液浸没，指的是将硝酸纤维素膜置于容器中，加入5~20ml封闭液，淹没硝酸纤维素膜，再将容器置于37℃培养箱中封闭0.8~1.2h。
6.根据权利要求1所述的荧光免疫斑点法，其特征在于步骤B所述的用稀释缓冲液稀释的一抗，指的是用稀释缓冲液按体积比1:100~1000000倍稀释的一抗，所述的用稀释缓冲液稀释的二抗，指的是用稀释缓冲液按体积比1:100~10000倍稀释的二抗。
7.根据权利要求1所述的荧光免疫斑点法，其特征在于步骤B所述的加入用稀释缓冲液稀释的一抗，反应0.8~1.2h，指的是加入5~20ml用稀释缓冲液稀释的一抗，淹没硝酸纤维素膜，置于37℃培养箱中反应0.8~1.2h；所述的加入用稀释缓冲液稀释的二抗，反应0.8~1.2h，指的是加入5~20ml用稀释缓冲液稀释的二抗，淹没硝酸纤维素膜，置于37℃培养箱中反应0.8~1.2h。
8.根据权利要求1所述的荧光免疫斑点法，其特征在于步骤B所述的用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜，指的是用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次均置于水平摇床上振荡洗涤5~6min。
9.根据权利要求1所述的荧光免疫斑点法，其特征在于步骤C所述的将洗涤后的硝酸纤维素膜稍干燥，指的是将洗涤后的硝酸纤维素膜用吸湿性材料吸干。
10.根据权利要求1所述的荧光免疫斑点法，其特征在于步骤C所述的荧光分光光度计为美国Thermo Scientific公司制造的Lumina型号荧光分光光度计。
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