CN103736091B - 使用诸如呋咯地辛的pnp抑制剂与烷化剂或抗cd20剂的组合治疗血液学癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及血液学癌症的治疗方法，该治疗方法可包括例如给予嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)抑制剂、烷化剂和/或抗CD20剂，以及相关组合物和试剂盒。

Description

使用诸如呋咯地辛的PNP抑制剂与烷化剂或抗CD20剂的组合 治疗血液学癌症的方法
本申请是申请号为“200880126808.7”，发明名称为＂使用诸如呋咯地辛的PNP抑制剂与烷化剂或抗CD20剂的组合治疗血液学癌症的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本申请涉及通过包括给予嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)抑制剂来治疗血液学癌症(例如血癌)的方法。尤其描述了治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)的方法。
相关申请
本申请要求2007年12月10提交的序列号为61/012,762的美国申请的优先权，通过引用将该申请并入本文。
背景技术
癌症目前在美国是第二大死亡原因，在美国有超过8,000,000人已被诊断有癌症。1995年，癌症占美国所有死亡数的23.3％(例如参见U.S.Dept.of Health and HumanServices，National Center for Health Statistics(美国卫生及公共服务部，美国国家卫生统计中心)，Health United States1996-97和Injury Chartbook117(1997))。
目前主要用三种疗法，即手术、放射和化疗之一或其组合来治疗癌症。手术涉及整体去除有病的组织。虽然手术有时有效除去位于一定部位(例如乳腺、结肠和皮肤)的肿瘤，但不能用于治疗位于其他区域(例如脊椎)的肿瘤，也不能用于治疗弥散性肿瘤疾病(neoplastic conditions)例如白血病。放射疗法涉及将活组织暴露于电离辐射，引起暴露细胞的死亡或损害。放射疗法的副作用可以是急性的和暂时性的，而其它则可能是不可逆的。化疗涉及破坏细胞复制或细胞代谢。化疗最常用于治疗乳腺癌、肺癌和睾丸癌。这种癌症治疗的主要失败原因之一是癌细胞产生耐药性，这是可导致疾病复发或甚至死亡的一个严重问题。因此，需要更有效的癌症治疗。
概述
本文提供治疗对象(subject)的血液学癌症(例如CLL和ALL)的方法。该方法包括以下步骤：(a)对该对象给予有效量的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)抑制剂；以及(b)对该对象给予有效量的烷化剂或抗CD20剂。在某些实施方案中，PNP抑制剂是呋咯地辛(Forodesine)。在其它实施方案中，所述烷化剂选自芥衍生物(mustard derivative)、亚硝基脲衍生物、铂化合物和咪唑羧酰胺(imidazole carboxamide)化合物。在一些实施方案中，所述烷化剂是苯达莫司汀。在某些实施方案中，抗CD20剂是利妥昔单抗。
在一些实施方案中，同时给予PNP抑制剂和烷化剂或抗CD20剂，而在其它实施方案中，按序给予PNP抑制剂和烷化剂或抗CD20剂。在后一实施方案中，给予PNP抑制剂之前，可以给予烷化剂或抗CD20剂一次或多次。
在另一个实施方案中，治疗对一种或多种化疗剂(例如烷化剂，如苯达莫司汀和嘌呤核苷类似物例如氟达拉滨(Fluradabine))耐药的对象的血液学癌症的方法可以包括以下步骤：(a)鉴定对一种或多种化疗剂耐药的患者；以及对该对象给予PNP抑制剂。在具体实施方案中，PNP抑制剂是呋咯地辛。
在其它实施方案中，治疗患有血液学癌症的对象的方法可以包括以下步骤：(a)检测来自该对象的样本中一种或多种癌细胞中的p53缺失；和(b)对该对象给予PNP抑制剂。在某些实施方案中，PNP抑制剂是呋咯地辛。在一些实施方案中，该方法可进一步包括检测17p缺失的存在，和/或确定样本中的一种或多种癌细胞是否对一种或多种化疗剂(例如烷化剂和嘌呤核苷类似物)耐药。
本文进一步提供药物组合物，其包含PNP抑制剂和烷化剂或抗CD20剂。
本文还提供试剂盒，其包含PNP抑制剂和烷化剂或抗CD20剂。在一些实施方案中，该试剂盒可进一步包含PNP抑制剂、烷化剂、抗CD20剂或它们的任意组合的递送系统。在另一个实施方案中，该试剂盒还可包含治疗对象用的说明书。
在另一个实施方案中，试剂盒包含PNP抑制剂。在一个实施方案中，试剂盒进一步包含标签，该标签指出将内含物给予对烷化剂耐药(resistant to)的对象。在一些实施方案中，该试剂盒也包含标签，该标签指出将内含物给予具有p53缺失的对象。在最后的实施方案中，该试剂盒可以包含标签，该标签指出将内含物与烷化剂或抗CD20剂一起给药。
某些实施方案提供嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)抑制剂和烷化剂在制备用于治疗动物的血液学癌症的药物中的用途。
某些实施方案提供嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)抑制剂和抗CD20剂在制备用于治疗动物的血液学癌症的药物中的用途。
某些实施方案提供嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)抑制剂和烷化剂用于治疗血液学癌症的用途。
某些实施方案提供嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)抑制剂和抗CD20剂用于治疗血液学癌症的用途。
在附图和以下说明中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。其它特征、目的以及优点将从说明书、附图和权利要求书中变得明显。
附图说明
图1A和1B详细说明了呋咯地辛在表现高和低ZAP-70水平的CLL细胞中的细胞毒性效应。
图2示出了在呋咯地辛治疗之后的细胞内dGTP水平增加与所诱导的细胞死亡量之间的相关性。
图3示出了详细说明对呋咯地辛具有高度反应的缺失p53(p53deleted)的CLL病例的值。
图4示出了对苯达莫司汀或氟达拉滨治疗具有低敏感性或无敏感性的CLL病例的呋咯地辛治疗数据。
图5A和5B示出了呋咯地辛/苯达莫司汀和呋咯地辛/氟达拉滨的组合指数(combination index)数据。
图6详细说明了呋咯地辛/利妥昔单抗的组合指数数据。
详述
如本文所描述的，用呋咯地辛治疗诱导原代CLL细胞的依赖于时间和剂量的细胞死亡。使用2μM呋咯地辛和20μM dGuo，在48％的病例中观测到了高于60％的细胞毒反应，在仅仅9％的病例中，细胞毒性低于40％。对于基因异常，例如17p13(TP53)和11q22-q23(ATM)缺失、在晚期疾病中获得的且与耐药性和CLL患者的短期存活相关的基因异常而言，没有观察到反应的差别。具有p53或11q改变的那些CLL病例对呋咯地辛显示高度敏感(表示48小时时平均细胞毒性60.1％)，在化疗耐药(chemorefractory)CLL患者中获得良好的细胞毒反应。呋咯地辛与临床抗白血病治疗方案的组合增强体外细细胞毒反应，观察到呋咯地辛和低剂量的苯达莫司汀、单克隆抗体抗-CD20利妥昔单抗或环磷酰胺的联合具有强的协同效应。相反，发现与氟达拉滨存在拮抗效应。因此，呋咯地辛代表能够绕过ATM/p53途径而诱导CLL细胞凋亡的新颖化疗方法。
因此，某些实施方案提供治疗对象的血液学癌症的方法，其包括以下步骤：对该对象给予有效量的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)抑制剂；以及对该对象给予有效量的烷化剂或抗CD20剂。
在某些实施方案中，PNP抑制剂是呋咯地辛。
在某些实施方案中，烷化剂选自芥衍生物、亚硝基脲衍生物、铂化合物和咪唑羧酰胺化合物。
在某些实施方案中，烷化剂是芥衍生物。
在某些实施方案中，所述烷化剂是苯达莫司汀。
在某些实施方案中，抗-CD20剂是利妥昔单抗。
在某些实施方案中，同时给予PNP抑制剂和烷化剂或抗CD20剂。
在某些实施方案中，按序给予PNP抑制剂和烷化剂或抗CD20剂。
在某些实施方案中，给予PNP抑制剂之前，给予烷化剂或抗CD20剂一次或多次。
在某些实施方案中，血液学癌症选自慢性淋巴细胞白血病和急性成淋巴细胞白血病。
在某些实施方案中，血液学癌症是慢性淋巴细胞白血病。
在某些实施方案中，血液学癌症是急性成淋巴细胞白血病。
在某些实施方案中，对所述对象给予有效量的烷化剂。
在某些实施方案中，对所述对象给予有效量的抗CD20剂。
在该方法的某些实施方案中，该方法包括对所述对象给予有效量的PNP抑制剂、有效量的烷化剂和有效量的抗CD20剂。
在某些实施方案中，同时给予PNP抑制剂、烷化剂和抗CD20剂。
在某些实施方案中，按序给予PNP抑制剂、烷化剂和抗CD20剂。
在某些实施方案中，给予PNP抑制剂之前，给予烷化剂和抗CD20剂一次或多次。
某些实施方案提供治疗对一种或多种化疗剂耐药的对象的血液学癌症的方法，其包括以下步骤：鉴定对一种或多种化疗剂耐药的对象；以及对所述对象给予PNP抑制剂。
在某些实施方案中，所述对象对选自烷化剂和嘌呤核苷类似物的一种或多种化疗剂耐药。
在某些实施方案中，烷化剂是苯达莫司汀。
在某些实施方案中，嘌呤核苷类似物是氟达拉滨(fluradadine)。
某些实施方案提供治疗患有血液学癌症的对象的方法，包括以下步骤：检测来自该对象的样本中一种或多种癌细胞中的p53缺失；以及对所述对象给予PNP抑制剂。
在某些实施方案中，该方法可进一步包括检测17p缺失的存在。
在某些实施方案中，该方法可进一步包括确定样本中的一种或多种癌细胞是否对一种或多种化疗剂耐药。
在某些实施方案中，所述一种或多种癌细胞对选自烷化剂和嘌呤核苷类似物的一种或多种化疗剂耐药。
某些实施方案提供药物组合物，其包含PNP抑制剂和烷化剂或抗CD20剂。
在某些实施方案中，该组合物包含呋咯地辛和苯达莫司汀。
在某些实施方案中，该组合物包含呋咯地辛和利妥昔单抗。
在某些实施方案中，该组合物包含PNP抑制剂、烷化剂和抗CD20剂。
在某些实施方案中，该组合物包含呋咯地辛、苯达莫司汀和利妥昔单抗。
某些实施方案提供试剂盒，其包含PNP抑制剂和烷化剂或抗CD20剂。
在某些实施方案中，该试剂盒可进一步包含PNP抑制剂、烷化剂、抗CD20剂或它们的任意组合的递送系统。
在某些实施方案中，该试剂盒可进一步包含治疗对象用的说明书。
在某些实施方案中，该试剂盒包含PNP抑制剂和烷化剂。
在某些实施方案中，该试剂盒包含PNP抑制剂和抗CD20剂。
在某些实施方案中，该试剂盒包含呋咯地辛和苯达莫司汀。
在某些实施方案中，该试剂盒包含呋咯地辛和利妥昔单抗。
在某些实施方案中，该试剂盒包含PNP抑制剂、烷化剂和抗CD20剂。
在某些实施方案中，该试剂盒包含呋咯地辛、苯达莫司汀和利妥昔单抗。
某些实施方案提供包含PNP抑制剂的试剂盒。
在某些实施方案中，该试剂盒包含标签，该标签指出将内含物给予对烷化剂耐药的患者。
在某些实施方案中，该试剂盒进一步包含标签，该标签指出将内含物给予具有p53缺失的对象。
在某些实施方案中中，该试剂盒进一步包含标签，该标签指出将内含物与烷化剂或抗CD20剂一起给药。
不像其它核苷类似物，呋咯地辛不并入DNA中。呋咯地辛治疗导致CLL细胞中dGTP增加，并且该增加与细胞的细胞毒性相关，这表明在呋咯地辛治疗之后达到的dGTP水平将是指示细胞毒反应的代用标志(surrogate marker)。CLL对呋咯地辛的敏感性可能归因于在该细胞中观察到的高dCK活性(由Ser-74上的dCK磷酸化所正调节的活性)。在磷酸-dCK/dCK比率与呋咯地辛诱导的凋亡之间观察到显著的正相关。dCK也催化数种抗白血病核苷类似物(如氟达拉滨、吉西他滨或克拉屈滨)的活化所需的磷酸化。在呋咯地辛与氟达拉滨之间观察到的拮抗效应可以通过联合氟达拉滨与呋咯地辛之后观察到的dGTP水平的下降来解释。这些结果显示，dCK磷酸化和后续的dGTP增加作为CLL细胞中呋咯地辛的凋亡诱导(apoptosis induction)的第一步而发挥重要作用。
已经提议数种dGTP介导的细胞死亡的机制。例如，积累的脱氧核苷可以通过脱氧鸟苷激酶和胸苷激酶在线粒体中被磷酸化，导致了可能干涉线粒体DNA合成和修复的dNTP的异常积累，提供对线粒体损害、p53活化和凋亡的增加的敏感性。线粒体dGTP的不平衡还可以影响线粒体ATP合成和/或线粒体电子传递链的抗氧化剂酶的失活，导致ROS产生。线粒体基因组对可迅速引发凋亡的氧化应激损害高度敏感。如本文所述，呋咯地辛通过产生ROS和Δψm损失而激活线粒体凋亡途径，导致胱冬酶依赖性和胱冬酶非依赖性的凋亡。通过线粒体电子传递来产生ROS，并且在严重的氧化应激下，O2 -、OH-或H2O2水平的增加引起Δψm的损失和细胞死亡。由呋咯地辛诱导的这些事件通过用Tiron和NAC(O2 -的特异性清除剂)预孵育CLL细胞来回复(reverted)，这支持了在线粒体凋亡途径的活化之前的氧化应激的作用。p53的磷酸化和活化通过DNA损害反应来诱导，而且通过数个应激信号来诱导。超氧化物超量生产和后续的DNA损害的诱导能够通过活化ROS介导的线粒体途径和p53活化来诱发凋亡。在这种意义上讲，由呋咯地辛诱导的ROS产生可以用作p53活化的上游调节剂。本文描述了证明野生型p53CLL病例中的p53稳定化以及呋咯地辛在具有p53改变的病例中活化线粒体凋亡途径的结果，显示呋咯地辛通过与p53无关的不同的和/或另加的机制起作用。氧化应激和ROS产生还导致转录因子E2F-1的活化，其通过不同途径调节依赖于p53的凋亡以及与p53无关的凋亡。E2F-1增加也响应DNA损害而发生磷酸化的残基处的p53磷酸化，而且能够通过经由与p53无关的凋亡途径活化p53同源性p73来诱导细胞死亡。对ROS产生如何能够调节E2F-1、p53和/或p73活化以及细胞死亡仍然认识甚少。
线粒体凋亡途径的一个早期事件是形成凋亡体和活化胱冬酶-9，其裂解并活化胱冬酶-3以及胱冬酶-8。呋咯地辛诱导胱冬酶-9和胱冬酶-3的与时间有关的活化，以及与胱冬酶-9活化同时(发生)的胱冬酶-8酶原(pro-caspase-8)的与时间有关的活化。进而，胱冬酶-8诱导BID蛋白裂解为其促凋亡的截短形式，这激活线粒体凋亡途径。胱冬酶-8的选择性抑制减少了由呋咯地辛诱导的Δψm损失，但对于晚期阶段细胞死亡的效应被节制，这表明胱冬酶-8/BID导致线粒体凋亡途径的放大环路(amplification loop)。胱冬酶-9活化可能本身不足以诱导凋亡，所以胱冬酶-8/BID的活化与凋亡XIAP和存活蛋白(survivin)的抑制剂的减少一起提高胱冬酶-9和胱冬酶-3活性，因此加强由呋咯地辛诱导的凋亡。
蛋白的BCL-2家族控制细胞凋亡的执行。在促存活BCL-2成员(如BCL-2和MCL-1)与促凋亡BCL-2成员(BAX、BAK和唯BH3域蛋白BIM、PUMA、NOXA、BAD、BID、BMF、BIK和HRK)之间的平衡控制许多死亡信号转导途径的输出。在CLL患者中，高水平的BCL-2和MCL-1与疾病进程、低存活率和无法获得对使用烷化剂、核苷类似物和利妥昔单抗的疗法的完全反应相关。呋咯地辛诱导积累BIM蛋白以及降低MCL-1水平，而不改变BCL-2水平。在CLL细胞中，BIM与MCL-1相关，所以降低MCL-1水平将使得CLL细胞对该唯BH3域蛋白敏感。BIM与截短Bid均具有作为抗凋亡BCL-2成员的抑制剂和促凋亡BAX和BAK的直接活化剂的双重功能。在这种意义上讲，增加BIM水平连同活化Bid将导致BAX和BAK活化，并且随着MCL-1的降低，剩余的BCL-2抗凋亡能力将被倾覆。本文提供的结果表明，呋咯地辛所产生的MCL-1降低程度以及BIM增加程度显著地与凋亡诱导相关，且MCL-1和BIM基础水平可以确定CLL细胞对呋咯地辛的敏感性。
已经证明线粒体凋亡途径的活化不依赖于p53状态。已有报道，p73诱导(p53的转录靶标)能够克服对缺乏功能性p53的CLL细胞的凋亡的抗性。响应于数种化疗药物，p73的促凋亡形式(TAp73)反式激活数种p53靶基因，所述靶基因以依赖性方式但与p53状态无关地控制细胞周期停滞和凋亡。已经发现，呋咯地辛在具有功能性(functional)p53的CLL细胞中诱导p53以及TAp73，但有趣的是，p73mRNA和蛋白水平在具有p53缺失的CLL细胞中也得到增加。氧化应激和ROS产生导致TAp73以及E2F1的活化，二者均为牵涉到通过依赖于p53的机制和与p53无关的机制活化线粒体凋亡途径的蛋白。因此，由呋咯地辛诱导的ROS的升高可提供活化E2F-1和/或上调TAp73的信号。转录因子的FOXO家族调节涉及凋亡的许多基因的表达，并且可通过增加的氧化应激来活化。FOXOl和FOXO3a是E2F-1的转录靶标，并且已表明对于ROS诱导的凋亡是必需的，同时是造血细胞中BIM表达的转录因子。另外，在数种凋亡刺激下，ROS清除剂阻断FOXO3a和BIM的诱导。已有描述，FOXOla和BIM二者的表达以及后续的凋亡通过缺乏p53的肿瘤细胞中的p73来调节。在呋咯地辛治疗后，显示了与p53状态无关的p73和BIM的蛋白和mRNA显著上调，同时FOXOl和F0X03a水平增加，与在早期阶段检测到的水平相比增加。可以通过任何FOXO成员来控制FOXO调节的靶基因的表达，如由FOXO1A和FOXO3A二者产生的BIM转录调节所示，表明了具有丰富(redundant)的作用机理。
因此，本文所述的结果提供涉及呋咯地辛在CLL细胞中诱导与p53状态无关的细胞死亡的机制的证据，揭示了不同程序性细胞死亡途径可以在相同细胞中共存，并且可以被各种刺激选择性诱导。
这些结果显示，呋咯地辛作为单一药剂，或者与苯达莫司汀或利妥昔单抗组合，在CLL的治疗中是高度有效的。因此，例如在具有低毒性特性(profiles)的口服和静脉内制剂中可利用的呋咯地辛是对预后差(例如17p-)的患者、具有难治疾病的患者的治疗选择和/或对年长患者的治疗选择。在复发CLL患者中已经启动呋咯地辛的多中心、开放标记I期临床试验。
A.血液学癌症的治疗方法
本文提供治疗对象的血液学癌症(例如血癌)的方法。这些类型的癌症的实例包括例如急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤和脊髓发育不良综合征、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(恶性淋巴瘤)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom′smacroglobulinemia)。在一些实施方案中，血液学癌症是CLL。在其它实施方案中，血液学癌症是ALL。
对象可以包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物包括例如人；非人灵长目，例如猿和猴；牛；马；绵羊；大鼠；小鼠；猪；和山羊。非哺乳动物包括例如鱼和鸟。
在一个实施方案中，该方法包括对所述对象给予嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)抑制剂和烷化剂或抗CD20剂。在某些实施方案中，给予PNP抑制剂和烷化剂。在另一个实施方案中，给予PNP抑制剂和抗CD20剂。在又一个实施方案中，在鉴定对一种或多种化疗剂(例如苯达莫司汀或氟达拉滨)耐药的对象之后给予PNP抑制剂。在又一个实施方案中，在检测对象中的p53缺失之后给予PNP抑制剂。
不受理论约束，PNP抑制剂可以诱导血浆2′-脱氧鸟苷(dGuo)的升高和细胞内三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)的积累，导致细胞死亡诱导。PNP抑制剂的非限制性例子可以包括转让给BioCryst Pharmaceuticals，Inc.的美国专利Nos.4,985,433；4,985,434；5,008,265；5,008,270；5,565,463和5,721,240中所公开的那些抑制剂，这些专利的公开内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，PNP抑制剂是呋咯地辛或其盐，包括HCI盐：
不受理论约束，烷化剂是指化学上修饰DNA并破坏其功能的化疗化合物。一些烷化剂引起在双链DNA分子的同一条链或互补链上的核苷酸之间形成交联，而另一些烷化剂引起DNA链之间的碱基对错配。烷化剂可以是芥衍生物、亚硝基脲衍生物、铂化合物或咪唑羧酰胺化合物。烷化剂的实例包括苯达莫司汀、白消安、卡铂、卡莫司汀、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、六甲基三聚氰胺、异环磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法仑、米托坦、丝裂霉素、哌泊溴烷、丙卡巴肼、链佐星、塞替派和曲他胺。在一些情况下，烷化剂可以是苯达莫司汀或其盐，包括HCI盐：
抗CD20剂可以是靶向B细胞表面蛋白CD20(例如选择性结合于B细胞表面蛋白CD20)的任何药剂。在一些实施方案中，抗CD20剂是CD20的特异性抗体。不受理论约束，据认为，这些药剂可以通过三种机制之一来发挥作用：(1)补体介导的细胞毒性；(2)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；和(3)凋亡的诱导。抗CD20剂的实例包括利妥昔单抗、替伊莫单抗、曲妥单抗、吉姆单抗和阿仑单抗。在一些实施方案中，抗CD20剂是利妥昔单抗。
可以通过任何途径给予PNP抑制剂、烷化剂和/或抗CD20剂，所述途径例如手术中、鞘内、椎间盘内(intradiskal)、椎间盘外周(peridiskal)、硬膜外(包括根周(periradicular)和经椎间孔(transforaminal))、椎间盘内、硬膜外(epidural)和硬膜外(peridural)的任意组合、脊椎旁、静脉内、肌内、SC、口服、鼻内、吸入、透皮和胃肠外。
PNP抑制剂、烷化剂和/或抗CD20剂可与药学上可接受的载体配制，基于所选择的给药途径和标准制药实践来选择所述药学上可接受的载体。可按照药物制剂领域中的标准实践将PNP抑制剂、烷化剂和/或抗CD20剂配制成剂型。参见Alphonso Gennaro编，雷明登氏制药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版(1990)，Mack PublishingCo.，Easton，PA。适合的剂型可以包括例如片剂、胶囊、溶液、注射溶液、药片、栓剂或混悬剂。
对于肠胃外给药，可将PNP抑制剂、烷化剂和/或抗CD20剂与适合的载体或稀释剂混合，所述载体或稀释剂例如为水、油(尤其植物油)、乙醇、盐溶液、右旋糖(葡萄糖)水溶液和有关糖溶液、甘油或二醇(如丙二醇或聚乙二醇)。用于肠胃外给药的溶液优选含有PNP抑制剂、烷化剂和/或抗CD20剂的水溶性盐。还可以添加稳定剂、抗氧剂和防腐剂。适合的抗氧剂包括亚硫酸盐、抗坏血酸、柠檬酸及其盐、以及乙二胺四乙酸钠。适合的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、和氯丁醇。用于肠胃外给药的可以采取水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液的形式。
对于口服给药，可将PNP抑制剂、烷化剂和/或抗CD20剂与一种或多种用于制备片剂、胶囊、药丸、散剂、颗粒或其他适合的口服剂型的固体非活性成分组合。例如，可将PNP抑制剂、烷化剂和/或抗CD20剂与至少一种赋形剂(如填料、粘结剂、保湿剂、崩解剂、溶解阻滞剂(solution retarders)、吸收促进剂、润湿剂、吸收剂或润滑剂)组合。
PNP抑制剂、烷化剂和/或抗CD20剂的具体剂量当然由个体患者的特定情况来确定，所述情况包括患者的尺寸、体重、年龄和性别；所治疗疾病的性质和阶段；疾病的侵袭性以及化合物的给药途径。化合物(例如呋咯地辛、苯达莫司汀和利妥昔单抗)的剂量和时间表，可以根据例如FDA批准标签中指示的剂量和时间表来单独或联合给药。
在一些实施方案中，同时给予PNP抑制剂和烷化剂或抗CD20剂，而在其它实施方案中，按序给予PNP抑制剂和烷化剂或抗CD20剂。在一个实施方案中，可在给予PNP抑制剂之前给予烷化剂或抗CD20剂一次或多次(例如两次、三次、四次、五次、10次或20次)。在其他实施方案中，可在给予烷化剂或抗CD20剂之前给予PNP抑制剂一次或多次(例如两次、三次、四次、五次、10次或20次)。
在一些实施方案中，对象的血液学癌症的治疗可以包括鉴定对一种或多种化疗剂耐药的对象。癌症治疗中的主要失败原因之一是癌细胞所发展的耐药性。这是可以导致疾病复发或甚至死亡的非常严重的问题。在一个实施方案中，可以通过本领域已知的方式来鉴定对一种或多种化疗剂耐药的对象。该对象可以对任何已知的化疗剂耐药。在某些实施方案中，该对象可以对烷化剂(例如苯达莫司汀)和/或嘌呤核苷类似物(例如氟达拉滨(fluradadine))耐药。
在鉴定耐化疗的对象之后，可对该对象给予PNP抑制剂。在一些实施方案中，PNP抑制剂是盐酸呋咯地辛。
在另一个实施方案中，对象的血液学癌症的治疗可以包括检测p53缺失(例如17p缺失)在来自对象的样本中一个或多个癌细胞中的存在。17p缺失是可鉴定可显示出不同生物学和临床行为的血液学癌症对象的标志物。例如，p53改变可以传送耐药性和较短的存活期。
在一个实施方案中，可对存在p53缺失的对象给予PNP抑制剂。在选择的实施方案中，PNP抑制剂是盐酸呋咯地辛。
以上讨论的治疗方法涉及单一疗法和联合疗法两者。在联合疗法方面，本公开内容设想给予两种或更多种化疗剂，尤其PNP抑制剂和烷化剂或PNP抑制剂和抗CD20剂。这些化合物中的一些已经被批准用于治疗一种或多种癌症适应症。其它处于临床前和临床开发的各种阶段。
在一些实施方案中，给予PNP抑制剂和烷化剂或抗CD20剂可以产生协同效应。该效应可以通过组合指数(CI)的产生来证实。在某些实施方案中，该指数可作为根据Chou等人的程序(Advance Enz.Regul.，22，27-55(1985))感染的细胞的百分率的函数来计算。这是针对一系列细胞死亡比例来评价系数相互作用的众所周知的试验。例如，如果使用药物A的治疗导致30％细胞死亡，且使用药物B的治疗导致50％细胞死亡，那么可以预期该两种药物的组合将导致65％细胞死亡。因此，如果预测的细胞死亡与对于药物组合所实际测定的细胞死亡的比率低于1，那么观察到协同效应。然而，如果该比率大于1，那么观察到拮抗效应。在一个实施方案中，呋咯地辛和苯达莫司汀的组合显示协同效应，而呋咯地辛和氟达拉滨的组合显示拮抗效应(参见实施例5)。
B.药物组合物
本文提供药物组合物，其包含PNP-抑制剂和烷化剂或PNP-抑制剂和抗CD20剂。在一些实施方案中，PNP-抑制剂可包括呋咯地辛(BCX-1777)。在某些实施方案中，烷化剂可包括苯达莫司汀。在其它实施方案中，抗CD20剂是利妥昔单抗。
本文提供的药物组合物含有可用于治疗血液学癌症的量的PNP抑制剂和烷化剂或PNP抑制剂和抗CD20剂、以及药学上可接受的载体。适合于给予本文提供的化合物的药物载体包括本领域技术人员已知适合于特定给药方式的任何此类载体。
所述组合物在一个实施方案中可以配制成合适的药物制剂，如用于口服给药的溶液、混悬剂、片剂、可分散片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂或酏剂，或用于肠胃外给药的无菌溶液或混悬剂，以及透皮贴片制剂和干粉吸入剂(参见例如Ansel Introduction toPharmaceutical Dosage Forms，第四版1985，126)。
PNP抑制剂和烷化剂或PNP抑制剂和抗CD20剂在药物组合物中的浓度取决于化合物的吸收、钝化和排泄率；化合物的物理化学特性；剂量日程表；给药量以及本领域技术人员已知的其他因素。例如，所递送的量足以治疗如本文所述的慢性淋巴细胞白血病。
所述药物组合物可以一次给药，或者可以分为按时间间隔给药的许多更小剂量。应理解，治疗的精确剂量和持续时间是所治疗的疾病的函数，并可以使用已知的试验规程(protocol)或通过从体内或体外试验数据外推而根据经验来确定。应当注意，浓度和剂量值还可以随所要减缓的病症的严重性而改变。应进一步理解，对于任何特定对象，具体的给药方案应该根据个体需要，以及给予组合物的人员或监督组合物给药的人员的专业判断而随时间调节，并且本文所给出的浓度范围仅仅是示例性的，并无意限制所要求的组合物的范围或实践。
提供所述药物组合物用于以单位剂型给予人和动物，所述单位剂型例如含有合适量的化合物或其药学上可接受的衍生物的片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒、无菌注射溶液或混悬剂以及口服溶液或混悬剂和油-水乳剂。在一个实施方案中以单位剂型或多剂量剂型来配制和给予药物治疗活性化合物及其衍生物。本文所使用的单位剂型是指适用于人和动物对象且如本领域已知的那样单独包装的物理上分立的单位。各单位剂量含有预定量的足以产生所需治疗效应的治疗活性化合物以及所需的药物载体、赋形剂或稀释剂。单位剂型的实例包括安瓿和注射器以及单独包装的片剂或胶囊。单位剂型可以按其分数或倍数给药。多剂量剂型是按分开的单位剂型给药的、包装在单一容器内的多个相同的单位剂型。多剂量剂型的实例包括管形瓶、含片剂或胶囊的瓶、或者品脱瓶或加仑瓶。因此，多剂量剂型是没有以包装分开的多个单位剂量。
可以液体药物给予的组合物可以通过以下方式制备：例如将如上所定义的活性化合物和任选的药物佐剂溶解、分散或其它形式混合于载体(如水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、二醇、乙醇等)中，从而形成溶液或悬浮液。如果需要，待给予的药物组合物还可含有少量的无毒辅助物质如润湿剂、乳化剂、增溶剂、pH缓冲剂等，例如乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、油酸三乙醇胺酯和其他此类试剂。
制备此类剂型的实际方法是已知的，或对于本领域技术人员是显而易见的；例如参见雷明登氏制药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，第15版，1975。
可以制备含有0.005％至100％的PNP抑制剂和烷化剂或PNP抑制剂和抗CD20剂，余量由无毒的载体补足的剂型或组合物。制备这些组合物的方法是本领域技术人员所已知的。所考虑的组合物可以含有0.001％-100％活性成分，在一个实施方案中为0.1-95％活性成分，在另一个实施方案中为75-85％活性成分。
C.试剂盒
本文还提供试剂盒。典型地，试剂盒包含PNP抑制剂和烷化剂或PNP抑制剂和抗CD20剂。在某些实施方案中，试剂盒可包含一种或多种递送体系，例如PNP抑制剂、烷化剂、抗CD20剂或它们的任何组合的递送体系；以及试剂盒的使用说明(例如，用于治疗对象的说明书)。在某些实施方案中，试剂盒可包含PNP抑制剂和/或烷化剂。在另一个实施方案中，试剂盒可包含PNP抑制剂和/或抗CD20剂。在一些实施方案中，试剂盒可包含PNP抑制剂和指出将内含物给予对烷化剂(如苯达莫司汀)耐药的患者的标签。在另一个实施方案中，试剂盒可包含PNP抑制剂和指出将内含物给予具有p53缺失(例如17p缺失)的对象的标签。在又一个实施方案中，试剂盒可包含PNP抑制剂和指出内含物将与烷化剂或抗CD20剂一起给药的标签。
D.定义
本文使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指称，除非上下文中另有明确规定。
当用于描述化合物在方法中的量时，表述“有效量”是指获得所需药学效应或其他效应的量，例如，抑制异常生长或增殖或诱导癌细胞凋亡而获得有效作用的化合物的量。
术语“治疗”是指产生治疗上的有益效果，例如改善现存的症状，防止另外症状，改善或防止症状的主要(underlying)代谢原因，延迟或防止疾病的进一步发展和/或减轻将发生或预期发生的症状的严重性。
实施例
实施例1：在CLL-ZAP-70高与ZAP-70低中的呋咯地辛细胞毒性
将来自具有高ZAP-70水平(＞20％)的16名CLL患者的细胞和来自具有低ZAP-70水平(＜20％)的13名CLL患者的细胞用呋咯地辛2μM+dGuo20μM处理48小时。通过AnnexinV-FITC染色来分析细胞毒性(表示为对照的、未处理细胞的百分率)。结果显示，高ZAP-70水平和低ZAP-70水平二者的平均细胞毒性均大于50％(参见图1A和1B)。
实施例2：dGTP水平的细胞内增加
将来自26名CLL患者的细胞用呋咯地辛处理20小时。提取(60％甲醇)总核苷酸，并通过DNA聚合酶试验来定量dGTP水平。通过AnnexinV-FITC染色在48小时分析与对照(未处理细胞)相比的细胞成活力。在呋咯地辛处理之后的dGTP水平的细胞内增加与诱导的细胞死亡充分相关(参见图2)。
实施例3：缺失p53的CLL病例对呋咯地辛的反应
来自具有17p缺失的11名CLL患者(g=＞85％的细胞，FISH分析)用呋咯地辛2μM+dGuo20μM、苯达莫司汀25μM或氟达拉滨1μg/mL处理48小时。结果显示，缺失p53的CLL病例显示出对呋咯地辛的高度反应(参见图3)。
实施例4：呋咯地辛对具有化疗耐药性的CLL病例的影响
将来自发现对苯达莫司汀或氟达拉滨具有低敏感性或无敏感性的CLL患者的细胞用呋咯地辛2μM和dGuo10-20μM处理。结果显示，这些细胞显示出对呋咯地辛处理的良好反应(参见图4)。
实施例5：呋咯地辛/苯达莫司汀和呋咯地辛/氟达拉滨组合的效应
将来自CLL患者的细胞用呋咯地辛2μM+dGuo10-20μM和苯达莫司汀10-25μM或氟达拉滨3.75-7.5μM处理48小时。48小时之后分析组合指数(CI)。CI值小于1表示协同效应(Chour&Talalay算法)，而CI值大于1表示拮抗效应。结果显示，呋咯地辛/苯达莫司汀具有协同效应，而呋咯地辛/氟达拉滨具有拮抗效应(参见图5A和5B)。
实施例6：呋咯地辛/利妥昔单抗组合的效应
来自7名CLL患者(3名具有高水平的ZAP-70(＞35％)和4名具有p53缺失)的细胞用盐酸呋咯地辛2μM+dGuo10-20μM和利妥昔单抗25-50μM处理24-48小时。48小时之后分析组合指数(CI)。通过使用Annexin V-FITC染色和PI渗透性试验的流式细胞术来分析细胞。CI值小于1表示协同效应(Chour&Talalay算法)，而CI值大于1表示拮抗效应。结果显示，呋咯地辛/利妥昔单抗组合具有协同效应(参见图6)。
实施例7：呋咯地辛诱导与p53无关的线粒体凋亡
如本文所述，嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂呋咯地辛在慢性淋巴细胞白血病细胞中通过Mcl-1下调以及p73和Bim的诱导来诱导与p53无关的线粒体凋亡。
慢性淋巴细胞白血病(CLL)是从具有异常凋亡调节和低增殖率的长寿命CD5+B淋巴细胞的单克隆扩增获得的临床异质实体(clinical heterogeneous entity)。不管最新进展如何，CLL治疗中的新疗法尚未改善患者的总存活率，且许多患者最后产生了耐药性。免疫球蛋白基因的未突变特性(unmutated profile)、ZAP-70蛋白的高表达、高的CD38表达和某些细胞遗传学异常的存在(尤其17p13(TP53)和11q22-q23(ATM)的缺失)与CLL患者较差的总存活率和在较短时间达到疾病进展(to disease progression)有关。化疗性抗癌药物通常经由DNA损害反应和p53活化和/或直接经由线粒体功能的干扰而诱导凋亡。DNA损害反应途径看上去在CLL药物诱导的凋亡中起着关键作用，因为来自具有TP53异常的CLL患者的细胞显示对常规化疗的耐药性和短的存活率。由p53缺失和剩余等位基因的突变引起的p53功能的缺乏在化疗难治的CLL患者中增加，在废除p53的转录和线粒体凋亡活性的耐药性的获取过程中是“双重打击(double-hits)”。因此，新的有效方法应该通过与DNA损害无关的途径和/或与p53无关的凋亡途径的直接活化来诱导凋亡。
CLL细胞的标志是它们对凋亡诱导的抗性，是CLL细胞中凋亡和存活的Bcl-2家族蛋白关键性调节剂。高水平的抗凋亡Bcl-2和Mcl-1蛋白与侵袭性疾病和CLL中的化疗耐药性有关。MCL-1也在延长CLL细胞存活中具有重要作用，因为MCL-1水平与对数种药物的体外反应和临床反应负相关(inversely correlated with)。
嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)是在嘌呤补救途径中将嘌呤类似物磷酸化为它们各自的碱和脱氧核糖磷酸的酶。呋咯地辛或immucillin H(BCX-1777)是在体外和体内证明具有T细胞增殖抑制作用的有效的PNP过渡态类似物抑制剂。Bantia等人，Int Immunopharmacol，1(6)，1199-210(2001)；Kicska等人，.PNAS，98(8)，4593-4598(2001)；Bantia等人，IntImmunopharmacol，3(6)，879-887(2003)；以及Gandhi等人，Semin Oncol，34(6Suppl5)，S8-12(2007))。呋咯地辛已经显示了低毒性特性(Gandhi等人，Blood，106(13)，4253-4260(2005)；以及Korycka等人，Mini Rev Med Chem，7(9)，976-983(2007))，并且正在临床试验中对患有T细胞前淋巴细胞白血病、皮肤T细胞淋巴瘤和B细胞急性成淋巴细胞白血病的患者进行研究(Galmarini等人，IDrugs，9(10)，712-722(2006))。还有，呋咯地辛似乎在CLL细胞中发挥体外细胞毒效应(Balakrishnan等人，Blood，108(7)，2392-2398(2006))。PNP抑制导致血浆2’脱氧鸟苷(dGuo)水平的升高和后续的三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)在具有高水平脱氧核苷激酶活性的那些细胞中的细胞内积累，导致T淋巴细胞中的凋亡诱导。CLL细胞具有高(dCK)活性，它是用于将dGuo转化为dGMP，然后转化为dGTP的主要的酶，是对PNP抑制敏感的CLL细胞。不像其它嘌呤核苷类似物(如氟达拉滨或苯达莫司汀)，呋咯地辛并入DNA中，并且代表具有新颖但未充分理解的作用机制的一类新的选择性抗肿瘤药。
如本文所述，对呋咯地辛在来自43名CLL患者的原代白血病细胞中的细胞毒效应以及呋咯地辛与在临床实践中使用的药物如氟达拉滨、苯达莫司汀和利妥昔单抗的体外组合进行评价。基于这些结果，呋咯地辛看起来在CLL患者的治疗中是高度有效的治疗剂，与它们的ZAP-70、CD38、p53状态或细胞遗传学异常无关。此外，呋咯地辛看起来通过降低Mcl-1蛋白水平以及诱导p73和促凋亡Bim蛋白来诱导线粒体凋亡途径的活化。有趣地，基于p53状态，在这些凋亡标志中没有观察到有意义的差别，表明普通凋亡途径与p53-介导的细胞死亡无关。
与ZAP-70、CD38和细胞遗传学状态无关的呋咯地辛在来自CLL患者的原代细胞中诱导的凋亡。
进行剂量加大研究来评价来自CLL患者的原代白血病淋巴细胞中的体外呋咯地辛细胞毒性。为了获得体外细胞毒效应，将外部来源的dGuo与呋咯地辛一起添加。将CLL细胞用药理学上可实现的水平的呋咯地辛(2-5-10μM)与增加剂量的dGuo(10-20或30μM)孵育48小时，诱导了细胞死亡(通过Annexin-V+染色来分析)，而单独的呋咯地辛或dGuo没有诱导细胞毒效应。使用更高剂量的呋咯地辛(甚至高达15μM)没有观察到细胞死亡的差异。相反，增加dGuo的剂量导致细胞死亡的更高诱导，所以随后使用单剂量的呋咯地辛(2μM)连同10或20μM的dGuo进行研究。
接着，对来自43名CLL患者的原代白血病细胞分析呋咯地辛和dGuo的细胞毒效应。在24小时和48小时分别观察到44.2％±11.4和57.4％±13.1的相对于对照的平均细胞毒性。21个病例(总数的48.8％)中，细胞毒效应高于60％，18个病例(总数的41.8％)中细胞毒效应为40-60％，并且在仅仅4个病例(总数的9.4％)中细胞毒效应低于40％。在使用低温保存的原代CLL样本(n=32，在48小时为58.3％±11)和CLL新鲜样本(n=10，在48小时为56.6％±6.4)之间没有观察到细胞死亡的差异。与在CLL细胞中(在T-淋巴细胞(CD3+细胞)和B-淋巴细胞(CD19+细胞)两者中)的相比，呋咯地辛2μM和dGuo(10-20μM)在来自健康供体的PBMC中的细胞毒性相对较低。
在CLL患者中，ZAP-70和/或CD38蛋白的表达水平与较差的总存活率和较短时间达到疾病进展有关(Hus等人，Ann Oncol，17(4)，683-690(2006))。在具有低水平的ZAP-70(17名CLL患者；相对于对照的平均细胞毒性为58.1％±11)的那些CLL细胞中与表达高水平的ZAP-70(22名CLL患者；平均细胞毒性为57.9％±12)的那些CLL细胞中由呋咯地辛诱导的细胞死亡以及关于CD38表达水平(CD38低52.3％±12对比CD38高62.1％±12的平均细胞毒性)没有观察到显著的差异。此外，最常见的CLL细胞中的细胞遗传学改变，例如与体外和体内耐药性和CLL患者的短存活期有关的13q缺失、11q缺失和17p缺失不与呋咯地辛诱导的细胞毒性相关，在这些情况下也获得良好的反应。
还对经呋咯地辛处理的CLL细胞的细胞毒反应与氟达拉滨或苯达莫司汀细胞毒性进行比较，后二者是用于CLL的两种主要化疗剂(Aivado等人，Semin Oncol，29，(4Suppl13)，19-22(2002)；以及Montserrat，Hematol J，5，Suppl1，S2-S9(2004)。将来自32名CLL患者(他们中的11名具有p53缺失)的原代CLL细胞用单独或组合的呋咯地辛2μM和dGuo20μM、苯达莫司汀10-25μM和氟达拉滨1μg/mL孵育48小时。作为单一药剂，呋咯地辛、氟达拉滨和苯达莫司汀在没有17p缺失的CLL中的平均细胞毒性分别为55.3±8、50.6±11和49.2±18。导致p53改变的17p缺失的获取与CLL患者中体外和体内氟达拉滨耐药性有关(Dohner等人，Blood，85(6)，1580-1589(1995)；以及Turgut等人，Leuk Lymphoma，48(2)，311-320(2007))。显著地，具有17p缺失的大多数CLL患者对呋咯地辛显示高度反应，在48小时的平均细胞毒性为60.1％±21(呋咯地辛2μM和dGuo20μM)。相反，这些病例对氟达拉滨(25.1±13的平均细胞毒性)和苯达莫司汀(36.2％±17的平均细胞毒性)显示较低的反应。另外，在所分析的32个CLL患者样本中的12个中，观察到对苯达莫司汀25μM和/或氟达拉滨1μg/ml没有体外细胞反应或体外反应低(相对于对照，细胞毒性低于35％)，但它们对呋咯地辛显示高度反应。对苯达莫司汀或氟达拉滨具有低或极低反应的具有17p缺失的三名病例对呋咯地辛显示高度反应(67％±20的平均细胞毒性)，仅仅2名CLL患者对呋咯地辛显示低反应。
呋咯地辛与氟达拉滨、苯达莫司汀和利妥昔单抗的组合
评价用于治疗的氟达拉滨与呋咯地辛的组合。还评价呋咯地辛与苯达莫司汀、烷化剂和嘌呤类似物的组合。呋咯地辛2μM和dGuo(10-20μM)与氟达拉滨(0.5-1μg/ml)的组合没有增加作为单一药剂的任一种药物的细胞毒效应，且观察到对细胞死亡诱导的负面效应。为了评价两种药物之间的组合效应，使用Chou和Talalay的算法(Chou等人，Adv EnzymeRegul，22，27-55(1984))计算组合指数或CI值，作为两种不同药物的组合的拮抗效应或协同效应的指示性标志。简要地说，高于1的CI值表示拮抗效应，而低于1的CI值表示协同效应。用氟达拉滨和呋咯地辛进行的组合研究在所分析的全部CLL病例中显示了高于l的CI值(48小时)，这表明在两种药物之间具有拮抗效应。用呋咯地辛和氟达拉滨组合所获得的平均细胞毒性低于由该两种药物引起的平均细胞毒性。呋咯地辛在对苯达莫司汀具有低反应的CLL病例中也是有效的，但与氟达拉滨相反，使用苯达莫司汀和呋咯地辛的组合观察到了细胞死亡的高度增加，观察到有效的协同效应(CI＜1)。Frodesine明显增强了对低剂量苯达莫司汀的细胞毒反应(10μM，平均细胞毒性为32.95％)，该两种药物的组合获得了70.5％的平均细胞毒效应。
还评价呋咯地辛和利妥昔单抗(抗CD20的人源化单克隆抗体)的组合。在24小时，使用作为单一药剂的利妥昔单抗(25-50μg/ml)所观察到的细胞死亡是低的，其与呋咯地辛的组合明显改进了两种药物的细胞毒效应。在利妥昔单抗和呋咯地辛之间的有效协同效应也被证明，CI值接近0.5。
细胞内dGTP水平增加和Ser-74处的dCK磷酸化与呋咯地辛诱导的细胞死亡的相关性。
分析来自经呋咯地辛2μM和dGuo10μM处理的26名CLL患者的原代细胞中dGTP的细胞内水平。观察到在18小时分析的dGTP水平增加倍数与在48小时的呋咯地辛细胞毒性之间存在显著的直接相关性(p＜0.05)。呋咯地辛诱导了细胞内dGTP水平的高度增加(相对于对照基础水平，高达96倍增加，达到6-129皮摩尔dGTP/106百万细胞的值)。四个CLL病例显示dGTP水平没有增加或少量增加，在这些病例中观察到了低的对呋咯地辛的细胞毒反应。为了证实在呋咯地辛处理之后的dGTP水平增加由通过dCK的dGuo磷酸化来介导，分析在脱氧胞苷的存在下的细胞死亡诱导。由于脱氧胞苷是dCK的主要底物，它应该通过dCK抑制dGuo的磷酸化，影响dGTP的细胞内增加和随后由呋咯地辛诱导的凋亡。用脱氧胞苷(5-10μM)对细胞的预孵育抑制了呋咯地辛-诱导的细胞死亡。用于抗癌化疗的一些核苷类似物(尤其嘌呤类似物氟达拉滨和脱氧胞苷类似物吉西他滨)通过dCK而磷酸化以便具有活性。脱氧胞苷还回复由氟达拉滨诱导的细胞成活力的损失，而由苯达莫司汀(可能不依赖于dCK而起作用的药物)诱导的细胞死亡没有回复。
一经呋咯地辛处理，通过蛋白质印迹分析dCK的磷酸化状态，因为最近有人描述了在CLL细胞中，dCK活性通过Ser-74处的磷酸化来正调节(Smal等人，J Biol Chem，281(8)，4887-4893(2006)；Smal等人，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids，25(9-11)，l141-1146(2006)；Smal等人，Cancer Lett，253(1)，68-73(2007))。观察到了CLL细胞中dCK的磷酸化形式(Ser-74处)的增加，一种不是由苯达莫司汀引起的增加。在呋咯地辛处理之后进行磷酸-dCK/dCK比率的光密度分析，在24小时(p=0.05，补充数据)和48小时(p=0.05)均观察到与细胞毒性的相关性。
为了调查在氟达拉滨和呋咯地辛之间观察到的拮抗效应，在CLL细胞用氟达拉滨(1μg/ml)和呋咯地辛(2μM和dGuo10μM)孵育之后观察细胞内dGTP增加。单独的氟达拉滨没有诱导dGTP水平的增加，而氟达拉滨与呋咯地辛(灰色条形图)的组合减少了由单独的呋咯地辛(黑色条形图)所引起的dGTP增加倍数。因此，用氟达拉滨和呋咯地辛组合所观察到的dGTP增加的减少将解释两种药物之间观察到的拮抗效应。由于氟达拉滨需要通过dCK磷酸化而具有活性，且dGuo也通过该酶进行磷酸化，两种药物可能竞争该相同的酶，因此将减少dGTP或氟达拉滨活性形式的形成。
与p53无关的呋咯地辛诱导的线粒体凋亡途径活化。
为了阐明呋咯地辛诱导CLL细胞凋亡的作用机制，分析了线粒体凋亡途径的数种标志。呋咯地辛在早期阶段诱导线粒体跨膜电位(ΔΨm)的损失。活性氧类(ROS)可以在线粒体损害之后产生，随后可以介导凋亡(Villamor等人，Curr Pharm Des，10(8)，841-853(2004))。呋咯地辛还诱导CLL原代细胞中的ROS产生。线粒体去极化和ROS产生作为早期事件被观察到，因为它们在用呋咯地辛处理10小时之后是明显的。氧化应激在调节程序性细胞死亡中发挥重要作用，所以分析数种ROS清除剂的效应。用谷胱甘肽还原型乙酯(GSH)、N-乙酰基半胱氨酸(NAC)或Tiron预孵育CLL细胞减少了ΔΨm损失和由呋咯地辛诱导的ROS产生。NAC和Tiron(O2的特异性清除剂)实际上回复ROS产生，而GSH(H2O2的选择性清除剂)的效应被节制。
以前的CLL细胞体外研究报道，呋咯地辛导致p53稳定化和凋亡诱导(Balakrishnan等人，Blood，108(7)，2392-2398(2006))，该结果与诱导DNA损害和p53-介导的凋亡的其他抗癌药物一致。但是，不像其它嘌呤核苷类似物，呋咯地辛未被并入DNA中。有趣地，所分析的线粒体凋亡途径的早期标志也在具有17p(p53)缺失或11q(ATM)缺失的CLL患者中被观察到，表示凋亡引发的机制与DNA损害p53介导的反应无关。
呋咯地辛触发顺序的胱冬酶-9和胱冬酶-8活化以及BID的加工，表明由胱冬酶-8介导的线粒体凋亡途径的放大环路的作用。
为了调查导致线粒体凋亡的下游信号转导途径，调查呋咯地辛接触之后的胱冬酶活化的方式。观察依赖于剂量和时间的胱冬酶-9、胱冬酶-8和胱冬酶-3的活化，并通过它们的非活性原(pro-inactive)形式的加工来分析。胱冬酶原-9、胱冬酶原-8的裂解产物几乎与10小时的呋咯地辛处理一样早地存在，首先是胱冬酶原-9的p37裂解形式，随后增加胱冬酶-8的p43/41裂解形式。后来检测到胱冬酶原-3的裂解及其活性形式的存在。与胱冬酶-8的活化相关，呋咯地辛也诱导唯BH3域蛋白BID(胱冬酶-8的主要底物)的降低，以得到它的截短的促凋亡形式，其也活化线粒体凋亡途径。还观察到凋亡XIAP和存活蛋白的抑制剂的减少以及PARP(胱冬酶-3底物)的蛋白酶解裂解(proteolityic cleavage)，与凋亡诱导相干。接着，调查胱冬酶活化在呋咯地辛诱导的凋亡中的作用，因为线粒体凋亡途径的活化导致胱冬酶依赖性以及胱冬酶非依赖性的细胞死亡。用宽范围的胱冬酶抑制剂z-VAD.fmk处理细胞部分减少了在呋咯地辛处理24小时以后的磷脂酰丝氨酸接触，表明二者的胱冬酶依赖性和非依赖性作用机制。
胱冬酶-8/BID的活化可能在由呋咯地辛引起的凋亡诱导过程中具有重要作用，或者是归因于胱冬酶-9活化的继发性附带事件，因此在线粒体的下游。有趣地，通过AnnexinV染色分析的凋亡诱导被特异性胱冬酶-8抑制剂z-EETD.fmk部分阻断，而所观察到的ΔΨm损失的回复更为显著。总起来说，这些结果表明，胱冬酶-8活化和BID在由呋咯地辛诱导的线粒体凋亡途径过程中发挥早期放大作用。
线粒体介导的细胞死亡的促凋亡调节剂和抗凋亡调节剂的分析。
通过属于BCL-2家族蛋白的促凋亡成员和抗凋亡成员之间的紧密平衡来调节线粒体凋亡途径，所述蛋白例如抗凋亡BCL-2和MCL-1蛋白和促凋亡BAX、BAK、BID和BIM蛋白等。CLL细胞表达高水平的抗凋亡蛋白MCIL-1和BCL-2，其与对化疗的体外及临床反应负相关。调查呋咯地辛孵育对这些抗凋亡蛋白的水平的影响。一经呋咯地辛处理，抗凋亡MCL-1蛋白的水平明显降低，而BCL-2蛋白水平不受影响。唯BH3域蛋白BIM与BCL-2及其他抗凋亡BCL-2家族成员相互作用，以诱导凋亡。呋咯地辛诱导了促凋亡BIM蛋白水平的增加。在用呋咯地辛处理的七个CLL病例中通过光密度分析来证实BIM和MCL-1蛋白水平的变化。在促凋亡BIMEL蛋白水平的增加或MCL-1水平的降低与对呋咯地辛的细胞毒反应之间观察到了直接相关，MCL-1降低是显著的(p=0.04)。另外，当我们绘制MCL-1的减小和BIM EL诱导之间的比率(相对于对照)与在呋咯地辛处理之后观察到的细胞毒性的关系曲线，发现显著相关(p=0.04)。
BCL-2和MCL-1用作线粒体膜的保护者，保护其完整性以免受到效应器促凋亡蛋白(如BAX和BAK)的作用。BIM和截短的BID是唯一的唯BH3域蛋白，其具有用作BAX和BAK的直接活化剂的能力，在CLL细胞用呋咯地辛孵育之后通过流式细胞术分析BAX和BAK的活化。呋咯地辛诱导了BAX和BAK的构象变化，这允许这些蛋白插入到外部线粒体膜中；它的低聚；后续的线粒体膜透化的诱导和细胞死亡机制的活化。
呋咯地辛处理触发mRNA和蛋白水平上的p73增加以及FOXO1和FOX03A的诱导。
虽然与p53状态无关，呋咯地辛在所有CLL病例中发挥了细胞毒效应，但呋咯地辛能够在无17p缺失的CLL病例中诱导p53蛋白的稳定化。TAp73蛋白(p53-介导的凋亡所需的p53相关蛋白)的诱导能够克服对缺乏功能性p53的CLL细胞的凋亡的抗性(Dicker等人，Blood，108(10)，3450-3457(2006))。呋咯地辛处理在所分析的全部CLL病例中诱导了p73mRNA和TAp73蛋白水平的明显的上调。p73通过在肿瘤细胞中以p53依赖性以及p53非依赖性方式上调转录因子FOXO1和FOXO3a来调节促凋亡蛋白BIM的诱导(Amin等人，CancerRes，67(12)，5617-5621(2007))，但尚不知FOXO诱导的机制。调查经呋咯地辛处理的CLL细胞中的FOXO1和FOXO3a的水平。呋咯地辛诱导FOXO1和foxo3a二者的增加，与所观察到的p73和BIM蛋白水平的增加相关。
材料和方法
药物和化学品
供实验室使用的呋咯地辛(BCX-1777/immucillin H)由BioCrystPharmaceuticals Inc.(Birmingham，USA)提供，脱氧鸟苷(dGuo)购自Sigma。为了定量三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)，从Amersham Biosciences获得dNTP和[3H]dATP。氟达拉滨(Shering，Berlin，Germany)、盐酸苯达莫司汀(TreandaTM，由Cephalon，Inc.，Frazer，PA提供)、利妥昔单抗(Roche，Basel，Switzerland)和2′-脱氧胞苷(Sigma)用于细胞毒性试验。
CLL原代细胞和来自健康供体的外周血单核细胞的分离和培养
在来自按世界卫生组织分类法诊断有CLL的43名患者的原代白血病淋巴细胞中进行本体外研究。从各患者获得了知情同意书(informed consent)。
通过Ficoll/Hypaque沉降(Seromed，Berlin，Germany)来分离外周血单核细胞(PBMC)。细胞直接使用或者在10％二甲亚砜和90％热灭活的胎牛血清(FBS，GibcoPaisley，Scotland，UK)的存在下在液氮中低温保存。在解冻之后，将来自CLL患者的单核细胞(2x106个细胞/mL)在RPMI1640培养基(Gibco)中于含有5％二氧化碳的37℃加湿气氛中培养，所述培养基补充有10％FBS、2mM谷氨酰胺和50μg/mL青霉素-链霉素。通过流式细胞术分析肿瘤细胞(CD19+，CD5+)的百分率、ZAP-70和CD38的表达水平，并且如前所述进行定量(Crespo等人，N Engl J Med，348(18)，1764-1775(2003))。ZAP-70的高表达水平的截止点是＞20％，CD38的高表达水平的截止点为＞30％(Hus等人，Ann Oncol，17(4)，683-690(2006))。在本研究中使用的所有CLL样本携带超过95％的肿瘤细胞。使用购自Vysis(Downers Grove，IL)的多探针商品试剂盒，通过荧光原位杂交(FISH)来评价细胞遗传学改变，所述试剂盒含有用于测定17p13.1(p53)、11q22.3(ATM)和13q14.3(D13S319)缺失的基因座专一性探针以及用于检测12三体的着丝粒探针。p53基因的突变通常是错义突变，并且该突变蛋白具有能使其通过蛋白质印迹检测的延长的半衰期。另外，通过按照IARC TP53联盟的直接测序来证实p53突变。
凋亡诱导
用1-12μM剂量的呋咯地辛在存在或不存在10-20-30μM脱氧鸟苷(dGuo)的情况下孵育细胞，持续不同时间点。在指出时，用80μM的泛胱冬酶抑制剂(pan-caspaseinhibitor)z-VAD.fmk(苄氧基-羰基-Val-Ala-Asp-氟甲基酮；Bachem，Bubendorf，Switzerland)、50μM的胱冬酶-8抑制剂z-IETD.fink(Z-Ile-Glu(OMe)Thr-DL-Asp(OMe)-氟甲基酮，Bachem)、2′-脱氧胞苷(5-10-20μM，Sigma)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC，25mM)、Tiron(5mM，4，5-二羟基-1，3-苯-二磺酸，Sigma)或GSH(2mM；Sigma)将细胞预孵育1小、时。对于药物组合研究，在添加呋咯地辛(2μM)+dGuo(10-20μM)之前，将细胞用氟达拉滨或苯达莫司汀预处理4、12或24小时，或者用单克隆抗体抗-CD20利妥昔单抗预处理1小时。利用FSC/SSC，通过用缀合于异硫氰酸荧光素(FITC)的Annexin-V和碘化丙啶(propidiumiodide)(PI)(BenderMedsystems，Vienna，Austria)双重染色来定量磷脂酰丝氨酸(PS)暴露量，根据细胞复杂性(cell complexity)的变化来分析细胞成活力和凋亡诱导。为了分析CD3+和CD19+群体中的凋亡，同时用抗-CD3-FITC(Immunotech，Marseille，France)、抗-CD19-PE(Becton Dickinson)和Annexin-V-APC标记PBMC。作为相对于对照细胞的百分率绘制细胞成活力和细胞毒性。线粒体跨膜电位(ΔΨm)的损失通过用20nM的DiOC6(3，3′-二己氧基羰花青碘化物，Molecular Probes)染色细胞来评价，通过用2μM二氢乙啶(dihydroethidine)(DHE；Molecular Probes)染色和流式细胞术分析来测定活性氧类(ROS)产生。归因于构象变化的促凋亡Bax和Bak蛋白的活化通过用免疫细胞学标记细胞来分析，如前所述，抗体再次对准Bax或Bak蛋白的NH2-末端(Bellosillo等人，Blood，100(5)，1810-1816(2002))。该区域在基础条件下被封闭，且不被氨基末端表位特异性抗体结合。在凋亡刺激之后，这些蛋白的构象变化暴露了NH2-末端和疏水性COOH-末端，其靶向线粒体，在由线粒体介导的细胞死亡机制的诱导中发挥重要作用。简言之，在PBS中洗涤细胞一次，并在4％低聚甲醛中固定，用0.1％皂角苷和0.5％牛血清清蛋白(BSA)透化。用1μg/ml的抗构象活性Bak一抗(Oncogene Research)或抗Bax一抗(克隆6A7，BDPharmingen)在室温下染色细胞。在用透化缓冲液洗涤数次之后，细胞用山羊抗小鼠FITC二抗(DAKO)或山羊抗兔FITC(Supertechs)二抗孵育，用透化缓冲液再次洗涤。然后通过流式细胞术对每一样本分析1万个染色细胞。
细胞内dGTP水平的测量
将15x106个CLL原代细胞用或不用呋咯地辛(2μM)和dGuo(10μM)或氟达拉滨(1μg/ml)孵育18小时，用60％甲醇提取核苷酸，通过如由Sherman和Fyfe所修改的DNA聚合酶试验(Sherman等人，Anal Biochem，180(2)，222-226(1989))来定量细胞内dGTP水平。数据以相对于对照细胞的细胞内dGTP水平的诱导倍数来表示。同时，也评价在24小时和48小时的细胞成活力。
免疫印迹
将细胞在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(亮抑酶肽10μg/ml，apoprotinine10μg/ml，1μM PMSF，1μM原钒酸钠，1μM NaF，2μM焦磷酸钠十水合物)(Sigma)的RIPA缓冲液中溶解15分钟。将总细胞蛋白通过SDS-PAGE在还原条件下分离，并转移到Immobilon-P(Millipore)膜上。对于蛋白检测，膜用下列一抗进行探针检查(probed)：抗-Bim、抗-Bak(Ab1)、抗-胱冬酶-8(Ab-3)、抗-p53(Ab-2)(Calbiochem)；抗-Bid、抗-胱冬酶-9、抗-FoxOl和抗-XIAP(Cell Signaling Technologies)；抗-Bcl-2、抗-dCK、抗-Mcl-1(S-19)和抗-p73(克隆58429)(Santa Cruz Biotechnology)；抗-PARP(Roche)；抗-胱冬酶-3和抗-Bax(克隆6A7)(BD-Pharmingen)；抗-存活蛋白(Abeam)；抗-β-肌动蛋白和抗-α-微管蛋白(Sigma)和抗-FoxO3A(Upstate)。兔抗-磷酸dCK(Ser79)和兔抗-dCK由Caroline Smal和FrancoiseBontemps(Universite Catholique de Louvain，Belgium)友好提供。在用适当的一抗孵育之后，通过使用增强的化学发光(ECL试剂(Pierce)，用辣根过氧化酶(HRP)标记的抗小鼠抗体(Sigma)、抗兔抗体(Sigma)或抗山羊抗体(Dako)显现印迹。相等的蛋白加量(proteinloading)用β-肌动蛋白或α-微管蛋白表达来证实，用Image Gauge Fujifilm软件(Fuji)进行相对蛋白定量。
通过实时RT-PCR来定量mRNA
使用TRIZOL试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)按照制造商的说明书从107个细胞中提取总RNA。然后，使用随机引物和M-MLV逆转录酶(Invitrogen)将1微克总RNA反转录为cDNA。在ABI Prism7900HT序列检测系统(Sequence Detection System)(AppliedBiosystems，Foster City，CA)中使用预先设计的按需分析(Assay-on-demand)(AppliedBiosystems)来测定p73和Mcl-1的表达水平。每一基因的相对表达通过比较循环阈值(Ct)方法(ΔΔCt)使用GUS作为内源性对照来定量。mRNA表达水平作为任意定量PCR单位给出，取每一例的对照样本(未处理)作为校准器。
统计学分析
将数据表示为三个独立实验的平均值±标准差(SD)。使用Graphpad Prism3.0软件(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)进行所有统计学分析。两组样本之间的比较通过非参数Mann-whitney试验来评价，并使用Spearman试验来评价相关系数。当p值≤0.05(＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.0001)时，认为结果具有统计学显著性。为了评价两种不同药物之间的组合效应，使用Chou和Talalay所述的算法(Calcusyn软件2.0版，Biosoft,Cambridge，UK)(Chou等人，Adv Enzyme Regul，22，27-55(1984))分析组合指数或CI值。该CI值是两种不同药物的组合效应的拮抗效应或协同效应的指示性标志。两种药物之间的相互作用在CI值小于1时被认为是协同的，在等于1时被认为是相加的，而在CI高于1时被认为是拮抗的。
已经描述了本发明的许多实施方案。然而，应理解，可以作出各种修改而不背离本发明的精神和范围。因此，其它实施方案在所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文。

Claims (19)

1.嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂和抗-CD20剂在制备用于治疗对象的慢性淋巴细胞白血病的药物中的应用，其中所述嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂是呋咯地辛，并且所述抗-CD20剂是利妥昔单抗。
2.权利要求1所述的应用，其中同时给予所述嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂和抗-CD20剂。
3.权利要求1所述的应用，其中按序给予所述嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂和抗-CD20剂。
4.权利要求3所述的应用，其中给予所述嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂之前，给予所述抗-CD20剂或一次或多次。
5.权利要求1-4中任一项所述的应用，其中对所述对象给予有效量的抗-CD20剂。
6.权利要求1-4中任一项所述的应用，其中对所述对象给予有效量的嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂。
7.药物组合物，其包含嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂和抗-CD20剂，其中所述嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂是呋咯地辛，并且所述抗-CD20剂是利妥昔单抗。
8.试剂盒，其包含嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂和抗-CD20剂，其中所述嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂是呋咯地辛，并且所述抗-CD20剂是利妥昔单抗。
9.权利要求8所述的试剂盒，其进一步包含所述嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂、所述抗-CD20剂或它们的任何组合的递送体系。
10.权利要求8所述的试剂盒，其进一步包含用于治疗对象的说明书。
11.权利要求9所述的试剂盒，其进一步包含用于治疗对象的说明书。
12.权利要求10所述的试剂盒，其中用于治疗对象的说明书指定同时给予所述嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂和抗-CD20剂。
13.权利要求11所述的试剂盒，其中用于治疗对象的说明书指定同时给予所述嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂和抗-CD20剂。
14.权利要求10所述的试剂盒，其中用于治疗对象的说明书指定按序给予所述嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂和抗-CD20剂。
15.权利要求11所述的试剂盒，其中用于治疗对象的说明书指定按序给予所述嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂和抗-CD20剂。
16.权利要求14所述的试剂盒，其中用于治疗对象的说明书指定给予所述嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂之前，给予所述抗-CD20剂一次或多次。
17.权利要求15所述的试剂盒，其中用于治疗对象的说明书指定给予所述嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂之前，给予所述抗-CD20剂一次或多次。
18.权利要求10-17中任一项所述的试剂盒，其中用于治疗对象的说明书指定对所述对象给予有效量的抗-CD20剂。
19.权利要求10-17中任一项所述的试剂盒，其中用于治疗对象的说明书指定对所述对象给予有效量的嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂。
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