KR101545367B1 - 항-ｃｄ20 약제 또는 알킬화제와 함께 포로데신과 같은 ｐｎｐ 억제제를 사용한 혈액계 암의 치료 방법 - Google Patents

항-ｃｄ20 약제 또는 알킬화제와 함께 포로데신과 같은 ｐｎｐ 억제제를 사용한 혈액계 암의 치료 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101545367B1
KR101545367B1 KR1020107015164A KR20107015164A KR101545367B1 KR 101545367 B1 KR101545367 B1 KR 101545367B1 KR 1020107015164 A KR1020107015164 A KR 1020107015164A KR 20107015164 A KR20107015164 A KR 20107015164A KR 101545367 B1 KR101545367 B1 KR 101545367B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
delete delete
agent
porodecin
cll
cells
Prior art date
Application number
KR1020107015164A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100101139A (ko
Inventor
샨타 반샤
필립 브라이트펠드
얄라가다 에스. 바부
Original Assignee
바이오크리스트 파마수티컬즈, 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 바이오크리스트 파마수티컬즈, 인코퍼레이티드 filed Critical 바이오크리스트 파마수티컬즈, 인코퍼레이티드
Publication of KR20100101139A publication Critical patent/KR20100101139A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101545367B1 publication Critical patent/KR101545367B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

본 출원은 예를 들어 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (PNP) 억제제, 알킬화제 및/또는 항-CD20 약제의 투여를 포함할 수 있는 혈액계 암의 치료, 및 관련 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

항-ＣＤ20 약제 또는 알킬화제와 함께 포로데신과 같은 ＰＮＰ 억제제를 사용한 혈액계 암의 치료 방법{METHODS OF TREATING HEMATOLOGIC CANCERS USING PNP INHIBITORS SUCH AS FORODESINE IN COMBINATION WITH ALKYLATING AGENTS OR ANTI-CD20 AGENTS}
본 출원은 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (PNP) 억제제의 투여를 포함하는 방법에 의한 혈액계 암, 예를 들어 혈액암의 치료에 관한 것이다. 특히, 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 급성 림프구성 백혈병 (ALL)의 치료 방법이 기술된다.
관련 출원(들)
본 출원은 본 명세서에 참고문헌으로 도입된, 2007년 12월 10일자로 출원된 미국 출원 제61/012,762호의 우선권의 이점을 청구한다.
암은 현재 미국에서 사망의 두번째 주 원인이며 미국에서 8,000,000명이 넘는 사람들이 암 진단을 받았다. 1995년, 암은 미국에서의 전체 사망 중 23.3 %의 이유이었다 (예를 들어, 문헌 [U.S. Dept. of Health and Human Services, National Center for Health Statistics, Health United States 1996-97 및 Injury Chartbook 117 (1997)] 참조).
암은 현재 세 종류의 요법: 수술, 방사선, 및 화학요법 중 하나 또는 이들의 병용으로 주로 치료된다. 수술은 질환 조직의 대량 제거를 수반한다. 수술은 특정한 부위, 예를 들어 유방, 결장, 및 피부에 위치한 종양을 제거하는데 때때로 효과적이지만, 이는 등뼈와 같이 다른 구역에 위치한 종양의 치료에서나, 또는 백혈병과 같은 파종 신생물성 상태(disseminated neoplastic condition)의 치료에서 사용될 수 없다. 방사선 요법은 노출된 세포의 사멸 또는 손상을 초래하는 이온화 방사선에 살아있는 조직을 노출시키는 것을 수반한다. 방사선 요법의 부작용은 급성이고 일시적일 수 있으나, 다른 것들은 비가역적일 수 있다. 화학요법은 세포 복제 또는 세포 대사의 파괴를 수반한다. 이는 유방, 폐, 및 고환 암의 치료에 가장 흔히 사용된다. 이러한 암 치료에서의 실패의 주된 원인 중 하나는 암 세포에 의한 약물 내성의 발달이고 이는 질환의 재발 또는 심지어 사망을 야기할 수 있는 심각한 문제이다. 따라서, 보다 효과적인 암 치료가 필요하다.
대상체에서의 혈액계 암 (예를 들어, CLL 및 ALL)의 치료 방법이 본 명세서에서 제공된다. 이러한 방법은 (a) 유효량의 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (PNP) 억제제를 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) 유효량의 알킬화제 또는 항-CD20 약제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 어떠한 실시양태에서, PNP 억제제는 포로데신(Forodesine)이다. 다른 실시양태에서, 알킬화제는 머스타드 유도체, 니트로소우레아 유도체, 백금 화합물, 및 이미다졸 카르복스아미드 화합물로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 알킬화제는 벤다무스틴(Bendamustine)이다. 어떠한 실시양태에서, 항-CD20 약제는 리툭시맵(Rituximab)이다.
일부 실시양태에서, PNP 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제가 동시에 투여되는 반면, 다른 실시양태에서는, PNP 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제가 순차적으로 투여된다. 후자의 실시양태에서, 알킬화제 또는 항-CD20 약제는 PNP 억제제의 투여에 앞서 1회 이상 투여될 수 있다.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 화학요법제 (예를 들어, 벤다무스틴과 같은 알킬화제 및 플루다라빈(Fluradabine)과 같은 퓨린 뉴클레오시드 유사체)에 내성인 대상체에서의 혈액계 암의 치료 방법은 (a) 하나 이상의 화학요법제에 내성인 대상체를 확인하는 단계, 및 (b) PNP 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, PNP 억제제는 포로데신이다.
다른 실시양태에서, 혈액계 암을 가진 대상체의 치료 방법은 (a) 대상체의 샘플에서 하나 이상의 암 세포에서 p53 결실을 검출하는 단계, 및 (b) 대상체에게 PNP 억제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 어떠한 실시양태에서, PNP 억제제는 포로데신이다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 17p 결실의 존재를 검출하는 단계, 및/또는 샘플에서의 하나 이상의 암 세포가 하나 이상의 화학요법제 (예를 들어, 알킬화제 및 퓨린 뉴클레오시드 유사체)에 내성인지 알아내는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
PNP 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제를 포함하는 제약 조성물이 본 명세서에서 추가적으로 제공된다.
PNP 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제를 포함하는 키트가 본 명세서에서 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 PNP 억제제, 알킬화제, 항-CD20 약제, 또는 이들의 임의의 조합물을 위한 전달 시스템을 추가적으로 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 키트는 또한 대상체의 치료에 대한 지시사항을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 키트는 PNP 억제제를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 키트는 내용물이 알킬화제에 내성인 대상체에게 투여될 것을 표시하는 라벨을 추가적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 내용물이 p53 결실을 갖는 대상체에게 투여될 것을 표시하는 라벨을 또한 포함한다. 최종 실시양태에서, 키트는 내용물이 알킬화제 또는 항-CD20 약제와 함께 투여될 것을 표시하는 라벨을 포함할 수 있다.
어떠한 실시양태는 동물에서의 혈액계 암 치료에 유용한 의약을 제조하기 위한 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (PNP) 억제제 및 알킬화제의 사용을 제공한다.
어떠한 실시양태는 동물에서의 혈액계 암 치료에 유용한 의약을 제조하기 위한 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (PNP) 억제제 및 항-CD20 약제의 사용을 제공한다.
어떠한 실시양태는 혈액계 암의 치료를 위한 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (PNP) 억제제 및 알킬화제의 사용을 제공한다.
어떠한 실시양태는 혈액계 암의 치료를 위한 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (PNP) 억제제 및 항-CD20 약제의 사용을 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부사항들은 다음의 첨부된 도면 및 설명에 나타난다. 다른 특징, 목적, 및 장점은 설명 및 도면으로부터, 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1A 및 1B는 고 및 저 ZAP-70 수치 모두를 보이는 CLL 세포에서의 포로데신의 세포독성 효과를 상세히 보여준다.
도 2는 포로데신 치료 후 dGTP 수치의 세포내 증가 및 유도된 세포 사멸의 양 사이의 상관관계를 나타낸다.
도 3은 포로데신에 높은 반응을 가지는 p53 결실 CLL 경우를 상세히 보여주는 값을 나타낸다.
도 4는 벤다무스틴 또는 플루다라빈 치료에 낮은 또는 무 민감도를 갖는 CLL 경우의 포로데신으로의 치료에 대한 데이터를 나타낸다.
도 5A 및 5B는 포로데신/벤다무스틴 및 포로데신/플루다라빈의 병용 지수 데이터를 나타낸다.
도 6은 포로데신/리툭시맵의 병용 지수 데이터를 상세히 보여준다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 포로데신으로의 치료는 주요 CLL 세포에서의 시간 및 투여량-의존 세포 사멸을 유발하였다. 포로데신 2 μM 및 dGuo 20 μM으로 60 % 보다 높은 세포독성 반응이 48 %의 경우들에서 관찰되었고, 오직 9 %의 경우에서 세포독성이 40 % 보다 낮았다. 유전자 이상, 예를 들어 17pl3 (TP53) 및 11q22-q23 (ATM)의 결실 (진행 질환에서 획득되고 약물 내성 및 CLL 환자들의 짧은 생존과 관련된 유전자 이상)에 대하여 반응에서 아무런 차이도 관찰되지 않았다. p53 또는 11q 변경을 갖는 CLL 경우는 화학요법불응성 CLL 환자들에게서 달성된 좋은 세포독성 반응과 함께, 포로데신에 높은 민감도 (48시간에서 평균 세포독성 60.1 %)를 나타냈다. 임상 항-백혈병성 요법과 포로데신의 병용은 시험관내 세포독성 반응을 향상시켜, 포로데신 및 저 투여량의 벤다무스틴, 단일클론 항체 항-CD20 리툭시맵 또는 시클로포스파미드의 병용으로 강한 상승작용적 효과가 관찰되었다. 대조적으로, 플루다라빈에서는 길항 효과가 발견되었다. 따라서, 포로데신은 ATM/p53 경로를 우회(bypass)하는 CLL 세포의 세포자멸사를 유도할 수 있는 신규 화학요법 접근법을 나타낸다.
그런 이유로, 특정 실시양태는 유효량의 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (PNP) 억제제를 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) 유효량의 알킬화제 또는 항-CD20 약제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 혈액계 암의 치료 방법을 제공한다.
어떠한 실시양태에서, PNP 억제제는 포로데신이다.
어떠한 실시양태에서, 알킬화제는 머스타드 유도체, 니트로소우레아 유도체, 백금 화합물, 및 이미다졸 카르복스아미드 화합물로부터 선택된다.
어떠한 실시양태에서, 알킬화제는 머스타드 유도체이다.
어떠한 실시양태에서, 알킬화제는 벤다무스틴이다.
어떠한 실시양태에서, 항-CD20 약제는 리툭시맵이다.
어떠한 실시양태에서, PNP 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제는 동시에 투여된다.
어떠한 실시양태에서는, PNP 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제는 순차적으로 투여된다.
어떠한 실시양태에서, 알킬화제 또는 항-CD20 약제는 PNP 억제제의 투여에 앞서 1회 이상 투여된다.
어떠한 실시양태에서, 혈액계 암은 만성 림프구성 백혈병 및 급성 림프모구 백혈병으로부터 선택된다.
어떠한 실시양태에서, 혈액계 암은 만성 림프구성 백혈병이다.
어떠한 실시양태에서, 혈액계 암은 급성 림프모구 백혈병이다.
어떠한 실시양태에서, 유효량의 알킬화제가 대상체에게 투여된다.
어떠한 실시양태에서, 유효량의 항-CD20 약제가 대상체에게 투여된다.
방법들의 어떠한 실시양태에서, 방법은 유효량의 PNP 억제제, 유효량의 알킬화제, 및 유효량의 항-CD20 약제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
어떠한 실시양태에서, PNP 억제제, 알킬화제 및 항-CD20 약제는 동시에 투여된다.
어떠한 실시양태에서, PNP 억제제, 알킬화제 및 항-CD20 약제는 순차적으로 투여된다.
어떠한 실시양태에서, 알킬화제 및 항-CD20 약제는 PNP 억제제의 투여에 앞서 1회 이상 투여된다.
어떠한 실시양태는 하나 이상의 화학요법제에 내성인 대상체를 확인하는 단계 및 PNP 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 화학요법제에 내성인 대상체에서의 혈액계 암의 치료 방법을 제공한다.
어떠한 실시양태에서, 대상체는 알킬화제 및 퓨린 뉴클레오시드 유사체로 구성된 군으로부터 선택된 화학요법제 중 하나 이상에 내성이다.
어떠한 실시양태에서, 알킬화제는 벤다무스틴이다.
어떠한 실시양태에서, 퓨린 뉴클레오시드 유사체는 플루다라빈이다.
어떠한 실시양태는 대상체의 샘플에서의 하나 이상의 암 세포에서 p53 결실을 검출하는 단계, 및 대상체에게 PNP 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 혈액계 암을 가진 대상체의 치료 방법을 제공한다.
어떠한 실시양태에서, 방법은 17p 결실의 존재를 검출하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
어떠한 실시양태에서, 방법은 샘플에서의 하나 이상의 암 세포가 하나 이상의 화학요법제에 내성인지 알아내는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
어떠한 실시양태에서, 암 세포 또는 세포들은 알킬화제 및 퓨린 뉴클레오시드 유사체로 구성된 군으로부터 선택된 화학요법제 중 하나 이상에 내성이다.
어떠한 실시양태는 PNP 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
어떠한 실시양태에서, 조성물은 포로데신 및 벤다무스틴을 포함한다.
어떠한 실시양태에서, 조성물은 포로데신 및 리툭시맵을 포함한다.
어떠한 실시양태에서, 조성물은 PNP 억제제, 알킬화제, 및 항-CD20 약제를 포함한다.
어떠한 실시양태에서, 조성물은 포로데신, 벤다무스틴 및 리툭시맵을 포함한다.
어떠한 실시양태는 PNP 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제를 포함하는 키트를 제공한다.
어떠한 실시양태에서, 키트는 PNP 억제제, 알킬화제, 항-CD20 약제, 또는 이들의 임의의 조합물을 위한 전달 시스템을 추가적으로 포함할 수 있다.
어떠한 실시양태에서, 키트는 대상체의 치료에 대한 지시사항을 추가적으로 포함할 수 있다.
어떠한 실시양태에서, 키트는 PNP 억제제 및 알킬화제를 포함한다
어떠한 실시양태에서, 키트는 PNP 억제제 및 항-CD20 약제를 포함한다.
어떠한 실시양태에서, 키트는 포로데신 및 벤다무스틴을 포함한다.
어떠한 실시양태에서, 키트는 포로데신 및 리툭시맵을 포함한다.
어떠한 실시양태에서, 키트는 PNP 억제제, 알킬화제, 및 항-CD20 약제를 포함한다.
어떠한 실시양태에서, 키트는 포로데신, 벤다무스틴 및 리툭시맵을 포함한다.
어떠한 실시양태는 PNP 억제제를 포함하는 키트를 제공한다.
어떠한 실시양태에서, 키트는 내용물이 알킬화제에 내성인 대상체에게 투여될 것을 표시하는 라벨을 추가적으로 포함한다.
어떠한 실시양태에서, 키트는 내용물이 p53 결실을 갖는 대상체에게 투여될 것을 표시하는 라벨을 추가적으로 포함한다.
어떠한 실시양태에서, 키트는 내용물이 알킬화제 또는 항-CD20 약제와 함께 투여될 것을 표시하는 라벨을 추가적으로 포함한다.
다른 뉴클레오시드 유사체와 달리, 포로데신은 DNA로 혼입되지 않는다. 포로데신 치료는 CLL 세포에서 dGTP 증가를 초래하고, 이러한 증가는 세포 세포독성과 상관관계가 있어서 포로데신 치료 후 도달한 dGTP 수치가 세포독성 반응을 나타내는 대리 마커(surrogate marker)일 것임을 나타낸다. 포로데신에 대한 CLL의 감수성은 Ser-74상에서 dCK의 인산화에 의해 양성 조절되는 활성인, 이러한 세포에서 관찰된 높은 dCK 활성으로 인한 것일 수 있다. 포스포-dCK/dCK 비율 및 포로데신-유도 세포자멸사 사이에 유의한 양성 상관관계가 관찰되었다. dCK는 또한 여러개의 항-백혈병성 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 젬시타빈 또는 클라드리빈(cladribine)의 활성화에 필요한 인산화를 촉매한다. 포로데신 및 플루다라빈 사이에 관찰된 길항 효과는 포로데신과 플루다라빈의 병용 후 관찰된 dGTP 수치상의 감소에 의해 설명될 수 있다. 이러한 결과는 dCK 인산화 및 뒤이은 dGTP의 증가는 CLL 세포에서 포로데신에 의한 세포자멸사 유도에서 첫 단계로서 중요한 역할을 함을 나타낸다.
dGTP-매개 세포 사멸에 대하여 여러가지의 메커니즘이 제안되었다. 예를 들어, 축적된 데옥시뉴클레오시드는 데옥시구아노신 키나아제 및 티미딘 키나아제에 의해 미토콘드리아에서 인산화되어, 미토콘드리아 DNA 합성 및 복구에 방해될 수 있는 dNTP의 이상 축적을 초래하여 미토코드리아 손상, p53 활성화 및 세포자멸사에 대해 증가된 민감도를 제공할 수 있다. 미토콘드리아 dGTP에서의 불균형은 또한 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 항-산화제 효소의 미토콘드리아 ATP 합성 및/또는 불활성화에 영향을 미쳐, ROS 생성을 초래할 수 있다. 미토콘드리아 게놈은 급속하게 세포자멸사를 개시할 수 있는 산화적 스트레스 손상에 매우 민감하다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 포로데신은 ROS의 생성 및 Δψm 손실에 의해 미토콘드리아 세포자멸사 경로를 활성화하여, 카스파제-의존적 및 독립적 세포자멸사를 초래한다. ROS는 미토콘드리아 전자 수송에 의해 생산되고, 심각한 산화적 스트레스하에서 O2-, OH- 또는 H2O2 수치의 증가는 Δψm 손실 및 세포 사멸을 유발한다. 포로데신에 의해 유도된 이러한 상황은 미토콘드리아 세포자멸사 경로의 활성화에 앞서 산화적 스트레스의 역할을 지원하는, O2-의 특정 스케빈저인, 티론(Tiron) 및 NAC와 함께 CLL 세포의 예비-인큐베이션에 의해 복귀된다. p53의 인산화 및 활성화는 DNA 손상 반응뿐 아니라 여러가지 스트레스 신호에 의해서도 유도된다. 과산화물 과잉생산 및 뒤이은 DNA 손상의 유도는 ROS-매개 미토콘드리아 경로 및 p53 활성화의 활성화에 의해 세포자멸사를 유도할 수 있다. 이러한 점에서, 포로데신에 의해 유도된 ROS 생산은 p53 활성화의 상류 조절인자로 작용할 수 있다. 야생형 p53 CLL 경우에서의 p53 안정화를 입증하고, 또한 포로데신 p53 변경의 경우에서 미토콘드리아 세포자멸사 경로를 활성화하였고 이는 포로데신이 p53와는 독립적인 상이 및/또는 추가적 메커니즘에 의해 작용한다는 것을 나타내는 결과들이 본 명세서에서 기술된다. 산화적 스트레스 및 ROS 생성은 또한 상이한 경로를 통하여 p53 의존적 및 독립적 세포자멸사 양자를 조절하는, 전사 인자 E2F-1의 활성화를 야기한다. E2F-1은 DNA 손상에 응하여 또한 인산화되는 잔기에서의 p53 인산화를 증가시킬 뿐 아니라, p53-독립적 세포자멸사 경로를 통하여 p53 상동체 p73의 활성화에 의해 세포 사멸을 유도할 수 있다. 어떻게 ROS 생산이 E2F-1, p53 및/또는 p73 활성화 및 세포 사멸을 조절할 수 있는지는 잘 이해되지 않고 있다.
미토콘드리아 세포자멸사 경로의 조기 사건은 아폽토좀(apoptosome)의 형성 및 카스파제-3 및 카스파제-8을 절단 및 활성화시키는 카스파제-9의 활성화이다. 포로데신은 카스파제-9 활성화와 동시에 카스파제-9 및 -3뿐 아니라 프로-카스파제-8의 시간-관련 활성화를 유도하였다. 또한 카스파제-8은 미토콘드리아 세포자멸사 경로를 활성화하는, 이의 프로-세포자멸사 말단절단(truncated) 형태로 BID 단백질의 전달을 유도하였다. 카스파제-8의 선택적 억제는 포로데신에 의해 유도된 Δψm 손실을 감소시켰으나, 나중 시간에서의 세포 사멸에 대한 효과는 완화되었고, 이는 카스파제-8/BID는 미토콘드리아 세포자멸사 경로의 증폭 루프로 이어짐을 암시한다. 카스파제-9 활성화는 세포자멸사를 유도하기에 그 자체로는 충분할 수 없고, 그래서 세포자멸사 XIAP의 억제제(inhibito) 및 서비빈(survivin)의 감소와 함께 카스파제-8/BID의 활성화는 카스파제-9 및 -3 활성을 증가시키고, 따라서 포로데신에 의해 유도된 세포자멸사를 강화할 것이다.
단백질의 BCL-2 계열은 세포자멸사 세포 사멸의 수행을 제어한다. BCL-2 및 MCL-1와 같은 프로-생존(pro-survival) 및 프로-세포자멸사 BCL-2 구성원 (BAX, BAK 및 BH3-단독(only) 단백질 BIM, PUMA, NOXA, BAD, BID, BMF, BIK 및 HRK) 사이의 균형은 많은 사멸 신호 경로의 결과를 제어한다. CLL 환자에서, BCL-2 및 MCL-1의 높은 수치는 질환 진행, 좋지못한 생존 및 알킬화제, 뉴클레오시드 유사체 및 리툭시맵으로의 요법에 대한 완전한 반응의 달성 실패와 상관관계가 있다. 포로데신은 BCL-2 수치의 변화 없이, BIM 단백질의 축척 및 MCL-1 수치상의 감소를 유도하였다. CLL 세포에서, BIM은 MCL-1와 관계있고, MCL-1 수치의 감소는 CLL 세포를 이러한 BH3-단독 단백질에 민감하게 만들 것이다. BIM 및 말단절단형 Bid는 항-세포자멸사 BCL-2 구성원의 억제제 및 프로-세포자멸사 BAX 및 BAK의 직접적 활성자 모두로서의 이중 기능을 가진다. 이러한 점에서, BIM 수치의 증가 및 Bid 활성화는 BAX 및 BAK 활성화를 초래할 것이고, MCL-1 감소와 함께, BCL-2의 남은 항-세포자멸사 능력은 압도될 것이다. 본 명세서에서 제공된 결과는 포로데신에 의해 가해진 BIM 증가 및 MCL-1 감소의 정도가 세포자멸사 유도와 상당히 상관관계가 있으며, MCL-1 및 BIM 기저 수치가 포로데신에 대한 CLL 세포의 민감도를 구할 수 있음을 보여준다.
p53 상태에 독립적인 미토콘드리아 세포자멸사 경로의 활성화가 입증되었다. p53의 전사 표적인 p73 유도가 기능성 결여된 CLL 세포의 세포자멸사에 대한 내성을 극복할 수 있음이 보고되었다. 여러가지의 화학요법 약물에 반응하여, p73의 프로-세포자멸사 형태인 TAp73는 p53 상태에 의존적이나 또한 독립적인 방식으로 세포 주기 정지 및 세포자멸사를 제어하는 여러개의 p53 표적 유전자를 트랜스활성화한다. 포로데신이 기능성 p53를 가진 CLL 세포에서 p53뿐만 아니라 TAp73을 유도하나, 흥미롭게도 p73 mRNA 및 단백질 수치가 p53 결실을 가진 CLL 세포에서 또한 증가하였다는 것이 발견되었다. 산화적 스트레스 및 ROS 생성은 p53-의존적 및 독립적 메커니즘을 통하여 미토콘드리아 세포자멸사 경로 활성화에 연루된 단백질인 TAp73 및 E2F1의 활성화를 야기한다. 따라서, 포로데신에 의해 유도된 ROS의 상승은 E2F-1를 활성화하고 및/또는 TAp73을 상승조절하는 신호를 제공할 수 있다. 전사 인자의 FOXO 계열은 세포자멸사에 관여하는 많은 유전자의 발현을 조절하고, 증가된 산화적 스트레스에 의해 활성화될 수 있다. FOXO1 및 FOXO3a는 E2F-1의 전사 표적이고 ROS-유도 세포자멸사에 필수적이며 또한 조혈세포에서 BIM 발현의 전사 인자인 것으로 밝혀졌다. 또한, 여러가지의 세포자멸사 자극시에, ROS 스케빈저는 FOXO3a 및 BIM의 유도를 차단한다. FOXO1a 및 BIM 양자의 발현 및 뒤이은 세포자멸사는 p53 결손 종양 세포에서 p73에 의해 조절된다는 것이 기술되어 왔다. 포로데신 치료 후, p53 상태에 독립적인 p73 및 BIM의 단백질 및 mRNA로 표시된 상향조절이 나타났으며, 또한 FOXO1 및 FOXO3a 수치의 증가 또한 초기에 검출된 것을 증가시켰다. FOXO1A 및 FOXO3A 양자에 의해 가해진 BIM의 전사 조절에 의해 보여진 바와 같이, FOXO-조절된 표적 유전자의 발현은 임의의 FOXO 구성원에 의해 제어될 수 있고, 이는 과잉 작용 메커니즘을 암시한다.
따라서, 본 명세서에 기술된 결과는 p53 상태에 독립적인 CLL 세포에서의 포로데신 유도 세포 사멸에 관여하는 메커니즘의 증거를 제공하고, 이는 상이한 프로그램된 세포 사멸 경로가 동일한 세포에서 공존할 수 있고 다양한 자극에 의해 선택적으로 유도될 수 있음을 드러낸다.
이러한 결과는 단일 약제로서 또는 벤다무스틴 또는 리툭시맵과 함께의 포로데신이 CLL의 치료에서 매우 효과적일 것을 나타낸다. 그러므로, 예를 들어 낮은 독성 프로파일을 가지는 경구 및 정맥내 제제로 이용가능한 포로데신은 좋지못한(poop) 예후를 가진 환자 (예를 들어, 17p-), 불응성 질환을 가진 환자를 위해 선택할 수 있는 치료방법 및 또는 노인 환자를 위해 선택할 수 있는 치료방법이다. 재발 CLL 환자에서의 포로데신의 다기관, 개방표지 임상 제1상 시험이 착수되었다.
A. 혈액계 암의 치료 방법
대상체에서 혈액계 암, 예를 들어 혈액암의 치료 방법이 본 명세서에서 제공된다. 이러한 유형의 암들의 예는 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 골수증식 질환, 다발골수종, 및 골수형성이상 증후군, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종 (악성 림프종) 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈액계 암은 CLL이다. 다른 실시양태에서, 혈액계 암은 ALL이다.
대상체는 포유동물 및 비-포유동물 모두를 포함할 수 있다. 포유동물은 예를 들어 인간; 비인간 영장류, 예를 들어, 유인원 및 원숭이; 소; 말; 양; 쥐(rat); 마우스; 돼지; 및 염소를 포함한다. 비-포유동물은 예를 들어 물고기 및 새를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 이러한 방법은 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (PNP) 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 어떠한 실시양태에서, PNP 억제제 및 알킬화제가 투여된다. 다른 실시양태에서, PNP 억제제 및 항-CD20 약제가 투여된다. 또다른 실시양태에서, PNP 억제제는 하나 이상의 화학요법제 (예를 들어, 벤다무스틴 또는 플루다라빈)에 내성인 대상체의 확인 후 투여된다. 추가적인 실시양태에서, PNP 억제제는 대상체에서 p53 결실의 검출 후 투여된다.
이론에 의해 구속되지 않으면서, PNP 억제제는 세포 사멸 유도를 야기하는 세포내 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP)의 축척 및 혈장 2'-데옥시구아노신 (dGuo)의 증가를 유도할 수 있다. PNP 억제제의 비제한적인 예는 그 개시가 본 명세서에 참고문헌으로 도입된, 바이오크리스트 파마슈티컬즈, 인코퍼레이티드에 양도된 미국 특허 제4,985,433호; 제4,985,434호, 제5,008,265호; 제5,008,270호; 제5,565,463호 및 제5,721,240호에 개시된 것들을 포함할 수 있다. 어떠한 실시양태에서, PNP 억제제는 포로데신 또는 이들의 염 (HCl 염을 포함)이다:
Figure 112010044295414-pct00001
이론에 구속받지 않으면서, 알킬화제는 DNA를 화학적으로 변형시키고 이의 기능을 파괴하는 화학요법 화합물을 지칭한다. 일부 알킬화제는 이중 가닥의 DNA 분자의 동일한 가닥, 또는 상보적인 가닥상의 뉴클레오티드 사이에서 교차결합의 형성을 유발하는 반면, 또다른 것들은 DNA 가닥들 사이에서 염기-쌍 미스매치(mismatching)를 유발한다. 알킬화제는 머스타드 유도체, 니트로소우레아 유도체, 백금 화합물, 또는 이미다졸 카르복스아미드 화합물일 수 있다. 알킬화제의 예는 벤다무스틴, 부술판(Busulfan), 카르보플라틴(Carboplatin), 카르무스틴(Carmustine), 시스플라틴(Cisplatin), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드, 다카르바진(Dacarbazine), 헥사메틸멜라민, 이포스파미드(Ifosphamide), 로무스틴(Lomustine), 메클로레타민(Mechlorethamine), 멜팔란(Melphalan), 미토탄(Mitotane), 마이토마이신(Mytomycin), 피포브로만(Pipobroman), 프로카르바진(Procarbazine), 스트렙토조신(Streptozocin), 티오테파(Thiotepa), 및 트리에틸렌멜라민을 포함한다. 일부 경우에서, 알킬화제는 벤다무스틴, 또는 이들의 염 (HCl 염을 포함)일 수 있다:
Figure 112010044295414-pct00002
항-CD20 약제는 B-세포 세포 표면 단백질 CD20를 표적화 (예를 들어, 이에 선택적으로 결합하는) 임의의 약제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD20 약제는 CD20에 특이적인 항체이다. 이론에 구속받지 않으면서, 이러한 약제가 세 매커니즘: (1) 보체 매개 세포독성; (2) 항체-의존 세포-매개 세포독성; 및 (3) 세포자멸사의 유도 중 하나에 의해 작동할 수 있다고 여겨진다. 항-CD20 약제의 예는 리툭시맵, 이브리투모맵(Ibritumomab), 트라스투주맵(Trastuzumab), 젬투주맵(Gemtuzumab), 및 알렘투주맵(Alemtuzumab)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD20 약제는 리툭시맵이다.
PNP 억제제, 알킬화제, 및/또는 항-CD20 약제는 임의의 경로, 예를 들어, 수술중, 경막내, 디스크내(intradiskal), 디스크주위(peridiskal), 경막외 (치근주위 및 대후두공(transforaminal) 포함), 디스크내, 경막외, 및 경막주위의 임의의 조합, 척수주위, 정맥내, 근육내, 피하, 경구, 비측, 흡입, 경피, 및 비경구적으로 투여될 수 있다.
PNP 억제제, 알킬화제, 및/또는 항-CD20 약제는 선택된 투여 경로 및 표준 제약 관행에 근거하여 선택된 제약학상 허용가능한 운반체와 함께 제제화될 수 있다. PNP 억제제, 알킬화제, 및/또는 항-CD20 약제는 제약 제조의 분야의 표준 관행에 따른 투여형으로 제제화될 수 있다. 문헌 [Alphonso Gennaro, ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA] 참조. 적합한 투여형은 예를 들어, 정제, 캡슐제, 용액제, 비경구용 용액제, 트로케제, 좌제, 또는 현탁액제를 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위하여, PNP 억제제, 알킬화제, 및/또는 항-CD20 약제는 적합한 운반체 또는 희석제, 예를 들면, 물, 오일 (특히 식물성유), 에탄올, 식염 용액, 수성 텍스트로오스 (글루코스) 및 관련 당 용액, 글리세롤, 또는 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜과 혼합될 수 있다. 비경구 투여를 위한 용액제는 바람직하게 PNP 억제제, 알킬화제, 및/또는 항-CD20 약제의 수용성 염을 함유한다. 안정화제, 항산화제 및 방부제가 또한 첨가될 수 있다. 적합한 항산화제는 술파이트, 아스코르브산, 시트르산 및 이의 염, 및 소듐 EDTA를 포함한다. 적합한 방부제는 염화벤잘코늄, 메틸- 또는 프로필-파라벤, 및 클로르부탄올을 포함한다. 비경구 투여를 위한 조성물은 수성 또는 비-수성 용액제, 분산액제, 현탁액제 또는 에멀젼제의 형태를 취할 수 있다.
경구 투여를 위하여, PNP 억제제, 알킬화제, 및/또는 항-CD20 약제는 정제, 캡슐제, 환제, 산제, 과립 또는 다른 적합한 경구 투여형의 제조를 위하여 하나 이상의 고체 비활성 성분과 합쳐질 수 있다. 예를 들어, PNP 억제제, 알킬화제, 및/또는 항-CD20 약제는 하나 이상의 부형제, 예를 들어 충전제, 결합제, 보습제, 붕해제, 용해 지연제, 흡수 촉진제, 습윤제 흡수제 또는 윤활제와 합쳐질 수 있다.
PNP 억제제, 알킬화제, 및/또는 항-CD20 약제의 구체적인 투여량은 물론 환자의 크기, 체중, 연령 및 성별을 비롯한 개별 환자의 특정 상황, 치료되는 질환의 성질 및 단계, 질환 질병의 침습성, 및 화합물의 투여 경로에 의해 결정될 것이다. 화합물, 예를 들어, 포로데신, 벤다무스틴 및 리툭시맵의 투여량 및 스케쥴은 예를 들어 FDA 승인된 라벨에 표시된 투여량 및 스케쥴에 따라 단독으로 또는 함께 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, PNP 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제가 동시에 투여되는 반면, 다른 실시양태에서는 PNP 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제는 순차적으로 투여된다. 하나의 실시양태에서, 알킬화제 또는 항-CD20 약제는 PNP 억제제의 투여에 앞서 1회 이상 투여될 수 있다 (예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회, 10회, 또는 20회). 추가적인 실시양태에서, PNP 억제제는 알킬화제 또는 항-CD20 약제의 투여에 앞서 1회 이상 투여될 수 있다 (예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회, 10회, 또는 20회).
일부 실시양태에서, 대상체에서의 혈액계 암의 치료는 하나 이상의 화학요법제에 내성인 대상체를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 암의 치료에서 실패의 주된 원인 중 하나는 암 세포에 의한 약물 내성의 발달이다. 이는 질환의 재발 또는 심지어 사망을 야기할 수 있는 매우 심각한 문제이다. 하나의 실시양태에서, 하나 이상의 화학요법제에 내성인 대상체는 당업계에 공지된 수단으로 확인될 수 있다. 대상체는 임의의 공지된 화학요법제에 내성일 수 있다. 어떠한 실시양태에서, 대상체는 알킬화제 (예를 들어, 벤다무스틴) 및/또는 퓨린 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 플루다라빈)에 내성일 수 있다.
화학요법 내성 대상체의 확인에 뒤이어, 대상체는 PNP 억제제를 투여받을 수 있다. 일부 실시양태에서, PNP 억제제는 포로데신 HCl이다.
다른 실시양태에서, 대상체에서의 혈액계 암의 치료는 대상체의 샘플에서의 하나 이상의 암 세포에서 p53 결실, 예를 들어, 17p 결실의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 17p 결실은 상이한 생물학적 및 임상 거동을 보일 수 있는 혈액계 암 대상체를 확인할 수 있는 마커이다. 예를 들어, p53 변경은 약물 내성 및 보다 짧은 생존 기간을 전달할 수 있다.
하나의 실시양태에서, p53 결실을 나타내는 대상체는 PNP 억제제를 투여받을 수 있다. 엄선된 실시양태에서, PNP 억제제는 포로데신 HCl이다.
상기 논의된 치료 방법은 단일요법 및 병용 요법 모두를 수반한다. 병용 요법에 관련하여, 본 개시는 둘 이상의 화학요법제, 특히, PNP 억제제 및 알킬화제 또는 PNP 억제제 및 항-CD20 약제의 투여를 계획한다. 이러한 화합물들의 일부는 하나 이상의 암 징조의 치료용으로 이미 승인되었다. 다른 것들은 임상전 및 임상 개발의 다양한 단계에 있다.
일부 실시양태에서, PNP 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제의 투여는 상승작용적 효과를 낳을 수 있다. 이러한 효과는 병용 지수 (CI)의 전개를 통하여 입증될 수 있다. 어떠한 실시양태에서, 이 지수는 문헌 [Chou et al ., Advance Enz. Regul ., 22, 27-55 (1985)]의 절차에 따라 영향을 받은 세포의 분율의 함수로서 계산될 수 있다. 이는 일정 범위의 세포 사멸 비에 대한 계수 상호관계를 평가하는 널리 공지된 시험이다. 예를 들어, 약물 A로의 치료가 30 % 세포 사멸을 야기하고 약물 B로의 치료가 50 % 세포 사멸을 야기한다면, 이 두 약물의 병용은 65 % 세포 사멸을 야기할 것으로 예상될 것이다. 그런 이유로, 약물의 병용시 실제로 측정된 것에 대한 예측된 세포 사멸의 비율이 1 보다 작다면, 상승작용적 효과가 관찰된다. 그러나, 이 비율이 1 보다 크다면, 길항 효과가 관찰된다. 하나의 실시양태에서, 포로데신 및 벤다무스틴의 병용은 상승작용적 효과를 보이는 반면, 포로데신 및 플루다라빈의 병용은 길항 효과를 보인다 (실시예 5 참조).
B. 제약 조성물
PNP-억제제 및 알킬화제 또는 PNP-억제제 및 항-CD20 약제를 포함하는 제약 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시양태에서, PNP-억제제는 포로데신 (BCX-1777)을 포함할 수 있다. 어떠한 실시양태에서, 알킬화제는 벤다무스틴을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항-CD20 약제는 리툭시맵이다.
본 명세서에서 제공되는 제약 조성물은 혈액계 암의 치료에 유용한 양의 PNP 억제제 및 알킬화제 또는 PNP-억제제 및 항-CD20 약제, 및 제약학상 허용가능한 운반체를 함유한다. 본 명세서에서 제공되는 화합물의 투여에 적합한 제약 운반체는 특정 방식의 투여에 적합하다고 당업자에게 공지된 임의의 이러한 운반체를 포함한다.
조성물은 하나의 실시양태에서 경구 투여를 위하여 용액제, 현탁액제, 정제, 분산성 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 서방형 제제 또는 엘릭시르제와 같은 적합한 제약 제제로, 또는 비경구 투여를 위하여 멸균 용액 또는 현탁액내로, 또한 경피 패치 제제 및 건조 분말 흡입제로 제제화될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition 1985, 126] 참조).
제약 조성물에서의 PNP 억제제 및 알킬화제 또는 PNP-억제제 및 항-CD20 약제의 농도는 화합물의 흡수, 불활성 및 배출 속도, 화합물의 생리화학적 특징, 투여량 스케쥴, 및 투여되는 양 및 당업자에게 공지된 다른 인자들에 의존할 것이다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 전달되는 양은 만성 림프구성 백혈병을 치료하기에 충분하다.
제약 조성물은 한번에 투여될 수 있거나, 또는 일정 시간 간격으로 투여되도록 다수의 보다 작은 투여량으로 나누어질 수 있다. 정확한 투여량 및 치료의 지속기간은 치료되는 질환의 함수이며 공지된 시험 프로토콜을 사용하여 실험적으로 또는 생체내 또는 시험관내 실험 데이터로부터 외삽법에 의해 구해질 수 있다고 이해된다. 농도 및 투여량 값은 또한 완화되어야 할 상태의 중증도에 따라 차이가 날 수 있음을 염두에 두어야 할 것이다. 임의의 특정 대상체에 있어서, 구체적인 투약법은 개인의 필요성 및 조성물을 투여 또는 이의 투여를 감독하는 자의 전문적 판단에 따라 시간에 걸쳐 조정되어야 하고, 또한 본 명세서에 설명된 농도 범위는 예시적일 뿐이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하도록 의도되지 않았음이 추가적으로 이해되어야 할 것이다.
제약 조성물은 적합한 양의 화합물 또는 이들의 제약학상 허용가능한 유도체를 함유하는 정제, 캡슐제, 환제, 산제, 과립, 멸균 비경구용 용액제 또는 현탁액제, 및 경구용 용액제 또는 현탁액제, 및 유-수 에멀젼제와 같은 단위 투여형으로 인간 및 동물에게 투여된다. 제약학적 치료적 활성 화합물 및 이들의 유도체는 하나의 실시양태에서 단위-투여형 또는 다중-투여형으로 제제화 및 투여된다. 본 명세서에서 사용된 단위-투여형은 인간 및 동물 대상체에게 적합하고 당업계에서 공지된 바와 같이 개별적으로 포장된 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다. 각 단위-투여량은 요구되는 제약 운반체, 비히클 또는 희석제와 함께, 요망되는 치료 효과를 낳기에 충분한 소정의 양의 치료적 활성 화합물을 함유한다. 단위-투여형의 예는 앰풀 및 주사기 및 개별 포장된 정제 또는 캡슐제를 포함한다. 단위-투여형은 부분 또는 이들의 다수로 투여될 수 있다. 다중-투여형은 분리된 단위-투여형으로 투여될 단일 용기내 포장된 복수개의 동일한 단위-투여형이다. 다중-투여형의 예는 바이알, 정제 또는 캡슐제의 병 또는 파인트 또는 갤런의 병을 포함한다. 따라서, 다중 투여형은 포장에서 분리되지 않은, 다수의 단위-투여량이다.
액체 제약학상 투여가능한 조성물은 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 활성 화합물 및 예를 들어, 물, 염수, 수성 덱스트로오스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올 등과 같은 운반체내 임의의 제약 아쥬반트를 용해, 분산, 또는 그 외 혼합시켜 용액 또는 현탁액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 요망되는 경우, 투여될 제약 조성물은 또한 소량의 무독성 보조 물질, 예를 들어, 습윤제, 유화제, 가용화제, pH 완충제 등, 예를 들어 아세테이트, 소듐 시트레이트, 시클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 다른 이러한 약제를 함유할 수 있다.
이러한 투여형 제조의 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 명백할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15th Edition, 1975] 참조).
0.005 % 내지 100 % 범위의 PNP 억제제 및 알킬화제 또는 PNP-억제제 및 항-CD20 약제를 함유하고, 나머지는 무독성 운반체로 구성되는 투여형 또는 조성물이 제조될 수 있다. 이러한 조성물의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예상 조성물은 0.001 % 내지 100 %, 하나의 실시양태에서는 0.1 내지 95 %, 다른 실시양태에서는 75 내지 85 %의 유효 성분을 함유할 수 있다.
C. 키트
키트가 본 명세서에서 또한 제공된다. 전형적으로, 키트는 PNP 억제제 및 알킬화제 또는 PNP-억제제 및 항-CD20 약제를 포함한다. 어떠한 실시양태에서, 키트는 예를 들어, PNP 억제제, 알킬화제, 항-CD20, 또는 이들의 임의의 조합물을 위한 하나 이상의 전달 시스템, 및 키트의 사용을 위한 지침 (예를 들어, 대상체의 치료를 위한 지시사항)을 포함할 수 있다. 어떠한 실시양태에서, 키트는 PNP 억제제 및/또는 알킬화제를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 키트는 PNP 억제제 및/또는 항-CD20 약제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 PNP 억제제 및 내용물이 벤다무스틴과 같은 알킬화제에 내성인 대상체에게 투여될 것을 표시하는 라벨을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 키트는 PNP 억제제 및 내용물이 p53 결실 (예를 들어, 17p 결실)을 갖는 대상체에게 투여될 것을 표시하는 라벨을 포함할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 키트는 PNP 억제제 및 내용물이 알킬화제 또는 항-CD20 약제와 함께 투여될 것을 표시하는 라벨을 포함할 수 있다.
D. 정의
본 명세서에서 사용된 단수형 "하나(a)," "하나(an)," 및 "하나(the)"는 문맥이 명확하게 달리 서술하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
방법에서 화합물의 양을 기술하는데 사용될 때의 표현 "유효량"은 요망되는 약리 효과 또는 다른 효과를 달성하는 화합물의 양, 예를 들어, 암 세포의 비정상적 성장 또는 증식을 억제하거나, 또는 이의 세포자멸사를 유도하여 유용한 효과를 야기하는 양을 지칭한다.
용어 "치료하는" 및 "치료"는 치료적으로 이로운 효과, 예를 들어 기존의 증상의 개선, 추가적인 증상의 예방, 증상의 근본 대사 원인의 개선 또는 예방, 질병의 추가적인 전개의 연기 또는 예방 및/또는 발생할 것이거나 또는 발생할 것으로 예상되는 증상의 중증도의 감소를 유발함을 의미한다.
<실시예>
<실시예 1: CLL 에서의 포로데신 세포독성 - ZAP -70 고 대 ZAP -70 저 >
높은 ZAP-70 수치 (20 % 초과)를 갖는 16명의 CLL 환자 및 낮은 ZAP-70 수치 (20 % 미만)를 갖는 13명의 CLL 환자의 세포를 48시간 동안 포로데신 2 μM + dGuo 20 μM으로 치료하였다. 세포독성을 아넥신(Annexin) V-FITC 염색으로 분석하였다 (대조군, 미치료 세포의 백분율로 표현됨). 결과는 높은 및 낮은 ZAP-70 수치 모두에 대한 평균 세포독성이 50 %를 초과하였음을 나타냈다 (도 1A 및 1B 참조).
<실시예 2: dGTP 수치에서의 세포내 증가>
26명의 CLL 환자의 세포를 20시간 동안 포로데신으로 치료하였다. 전체 뉴클레오티드를 추출하였고 (60 % 메탄올) dGTP 수치를 DNA 폴리머라제 분석에 의해 정량화하였다. 대조군 (미치료 세포)과 비교한 세포 생활력을 48시간에 아넥신 V-FITC 염색에 의해 분석하였다. 포로데신 치료 후 dGTP 수치의 세포내 증가는 유도된 세포 사멸과 상당히 상관관계가 있다 (도 2 참조).
<실시예 3: 포로데신에 대한 p53 결실 CLL 경우의 반응>
17p 결실을 갖는 11명의 CLL 환자의 세포 (g ⇒ 세포의 85 %, FISH 분석)를 48시간 동안 포로데신 2 μM + dGuo 20 μM, 벤다무스틴 25 μM 또는 플루다라빈 1 ㎍/mL으로 치료하였다. 결과는 p53 결실 CLL 경우가 포로데신에 높은 반응을 보였음을 나타냈다 (도 3 참조).
<실시예 4: 화학요법 내성을 가지는 CLL 경우에 미치는 포로데신의 효과>
벤다무스틴 또는 플루다라빈에 낮은 또는 무 민감도를 갖는 것으로 발견된 CLL 환자의 세포를 포로데신 2 μM 및 dGuo 10 내지 20 μM으로 치료하였다. 결과는 이러한 세포가 포로데신 치료에 좋은 반응을 보였음을 나타냈다 (도 4 참조).
<실시예 5: 포로데신 / 벤다무스틴 및 포로데신 / 플루다라빈 병용의 효과>
CLL 환자의 세포를 48시간 동안 포로데신 2 μM + dGuo 10 내지 20 μM 및 벤다무스틴 10 내지 25 μM 또는 플루다라빈 3.75 내지 7.5 μM으로 치료하였다. 병용 지수 (CI)를 48시간 후 분석하였다. 1 미만의 CI 값은 상승작용적 효과의 지표 (슈어(Chour) & 탈랄레이(Talalay)의 알고리즘)인 반면, 1 초과의 CI 값은 길항 효과의 지표이다. 결과는 포로데신/벤다무스틴은 상승작용적 효과를 가지는 반면, 포로데신/플루다라빈은 길항 효과를 가짐을 나타냈다 (도 5A 및 5B 참조).
<실시예 6: 포로데신 / 리툭시맵 병용의 효과>
7명의 CLL 환자 (높은 수치의 ZAP-70 (35% 초과)를 갖는 3명 및 p53 결실을 갖는 4명)의 세포를 24 내지 48시간 동안 포로데신 HCl 2 μM + dGuo 10 내지 20 μM 및 리툭시맵 25 내지 50 μM으로 치료하였다. 병용 지수 (CI)를 48시간 후 분석하였다. 세포를 PI 투과성 분석 및 아넥신 V-FITC 염색을 사용하여 흐름 세포측정에 의해 분석하였다. 1 미만의 CI 값은 상승작용적 효과의 지표 (슈어 & 탈랄레이의 알고리즘)인 반면, 1 초과의 CI 값은 길항 효과의 지표이다. 결과는 포로데신/리툭시맵 병용은 상승작용적 효과를 가짐을 나타냈다 (도 6 참조).
<실시예 7: 포로데신은 p53 -독립적 미토콘드리아 세포자멸사를 유도한다>
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 억제제 포로데신은 만성 림프구성 백혈병 세포에서 Mcl-1 하향조절(downregulate) 및 p73 및 Bim의 유도를 통하여 p53-독립적 미토콘드리아 세포자멸사를 유도한다.
만성 림프구성 백혈병 (CLL)은 세포자멸사의 비정상적 조절 및 낮은 증식 속도를 가지는 긴-수명 CD5+ B-림프구의 단일클론 팽창으로부터 유도된 임상 불균질 실체이다. 최근의 발전에도 불구하고, CLL 치료에서 새로운 요법은 환자의 전반적인 생존을 개선시키지 않았고 많은 환자들은 결국 약물 내성을 발달시켰다. 면역글로불린 유전자의 비변이 프로파일, ZAP-70 단백질의 높은 발현, 높은 CD38 발현 및 특정 세포유전 이상 (특히 17pl3 (TP53) 및 11q22-q23 (ATM)의 결실)의 존재는 CLL 환자의 보다 좋지못한 전반적인 생존 및 질환 진행까지의 보다 짧은 시간과 관련된다. 화학요법적 항암 약물은 일반적으로 DNA 손상 반응 및 p53 활성화를 통하여, 및/또는 직접적으로 미토콘드리아 기능의 동요를 통하여 세포자멸사를 유도한다. TP53 이상을 갖는 CLL 환자의 세포가 종래 화학요법에의 내성 및 짧은 생존을 보이는바, DNA-손상 반응 경로는 CLL 약물-유도 세포자멸사에서 핵심 역할을 하는 것으로 보인다. p53의 결실 및 남은 대립유전자의 돌연변이에 의한 p53 기능의 결여는 p53의 전사 및 미토콘드리아 세포자멸사적 활성을 중단시키는 약물 내성의 획득 동안 "이중-타격(hit)"으로, CLL 환자의 화학요법에의 불응성을 증가시킨다. 따라서, 새 효과적인 접근법이 DNA-손상-독립적 경로 및/또는 p53에 독립적인 세포자멸사 경로의 직접적 활성화를 통하여 세포자멸사를 유도해야 한다.
CLL 세포의 특징은 세포자멸사 유도에 대한 이들의 내성이고, CLL 세포에서 Bcl-2 계열 단백질은 세포자멸사 및 생존의 중요 조절인자이다. 높은 수치의 항-세포자멸사 Bcl-2 및 Mcl-1 단백질은 CLL에서 침습성 질환 및 화학요법에의 내성과 관련된다. MCL-1 수치는 여러가지 약물에 대한 시험관내 및 임상적 반응과 역비례의 상관관계를 보이는바, MCL-1은 또한 CLL 세포 생존의 지속에서 중요한 역할을 가진다.
퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (PNP)는 퓨린 유사체를 이들 각자의 염기 및 데옥시리보스 포스페이트로 인산화하는 퓨린 재이용 경로에서의 효소이다. 포로데신 또는 이뮤실린 H (BCX-1777)는 시험관내 및 생체내 T-세포 증식의 억제를 입증한, 강력한 PNP의 천이-상태 유사체 억제제이다 (문헌 [Bantia et al ., Int Immunopharmacol, 1(6), 1199-210 (2001); Kicska et al.,. PNAS , 98(8), 4593-4598 (2001); Bantia et al ., Int Immunopharmacol , 3(6), 879-887 (2003); 및Gandhi et al., Semin Oncol , 34(6 Suppl 5), S8-12 (2007)] 참조). 포로데신은 낮은 독성 프로파일을 보였고 (문헌 [Gandhi et al ., Blood , 106(13), 4253-4260 (2005); 및 Korycka et al ., Mini Rev Med Chem , 7(9), 976-983 (2007)] 참조) T-세포 전림프구성 백혈병, 피부 T-세포 림프종 및 B-세포 급성 림프모구 백혈병을 갖는 환자를 위한 임상 시험에서 연구되고 있다 (문헌 [Galmarini et al ., IDrugs , 9(10), 712-722 (2006)] 참조). 또한, 포로데신은 CLL 세포에 생체밖 세포독성 효과를 가하는 것으로 보여진다 (문헌 [Balakrishnan et al ., Blood , 108(7), 2392-2398 (2006)] 참조). PNP 억제는 높은 수치의 데옥시뉴클레오시드 키나아제 활성을 가지는 세포에서 혈장 2'데옥시구아노신 (dGuo) 수치의 상승 및 이어진 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP)의 세포내 축척을 야기하여, T-림프구에서 세포자멸사 유도를 초래한다. CLL 세포는 높은 (dCK) 활성을 가지고, 이는 dGuo의 dGMP (그다음 이는 dGTP로 전환됨)로의 전환을 위한 주요 효소이고, CLL 세포는 PNP 억제에 민감하다. 플루다라빈 또는 벤다무스틴과 같은 다른 퓨린 뉴클레오시드 유사체와 달리, 포로데신은 DNA내로 혼입되지 않고 신규하고 완전히 이해되지 않은 작용 매커니즘을 가진 새로운 부류의 선택적 항-종양 약제에 해당한다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, CLL을 가진 43명의 환자의 일차 백혈병 세포에서 포로데신의 세포독성 효과, 및 플루다라빈, 벤다무스틴 및 리툭시맵과 같은, 임상 진료에서 사용되는 약물과 포로데신의 시험관내 병용의 평가를 평가하였다. 이러한 결과에 근거하여, 포로데신은 ZAP-70, CD38, p53 상태 또는 세포유전 이상에 독립적인 CLL 환자의 치료에 매우 효과적인 요법으로 보여진다. 또한, 포로데신은 Mcl-1 단백질의 수치 및 p73 및 프로-세포자멸사 Bim 단백질의 유도를 감소시킴으로써 미토콘드리아 세포자멸사 경로의 활성화를 유도시키는 것으로 보여진다. 흥미롭게도, p53 상태에 기초하여 이러한 세포자멸사 마커에서 유의한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 p53-매개 세포 사멸에 독립적인 공통의 세포자멸사 경로를 암시한다.
포로데신은 ZAP -70, CD38 및 세포유전 상태에 독립적인 CLL 환자의 일차 세포에서 세포자멸사를 유도하였다.
CLL 환자의 일차 백혈병 림프구에서 시험관내 포로데신 세포독성을 평가하기 위해 투여량 점증 연구를 수행하였다. 시험관내 세포독성 효과를 얻기 위하여, dGuo의 외부 공급원을 포로데신과 함께 첨가하였다. 48시간 동안의 약리적으로 달성가능한 수치의 포로데신 (2 내지 5 내지 10 μM)과 증가하는 투여량의 dGuo (10 내지 20 또는 30 μM)과 함께 CLL 세포의 인큐베이션은 세포 사멸을 유도하였지만 (아넥신-V+ 염색에 의해 분석), 포로데신 또는 dGuo는 단독으로 세포독성 효과를 유도하지 않았다. 보다 높은 투여량의 포로데신 (심지어 최대 15 μM)을 사용하여 세포 사멸에서 차이가 관찰되지 않았다. 반대로, dGuo 투여량의 증가는 보다 높은 세포 사멸의 유도를 야기하였고, 그래서 단일 투여량의 포로데신 (2 μM)과 10 또는 20 μM의 dGuo를 사용하여 후속 연구를 실시하였다.
다음으로, CLL를 가진 43명의 환자의 일차 백혈병 세포에서 포로데신 및 dGuo의 세포독성 효과를 분석하였다. 24시간 및 48시간에서 각각 44.2 %± 11.4 및 57.4 % ± 13.1의 대조군에 대한 평균 세포독성이 관찰되었다. 세포독성 효과는 21 경우 (전체의 48.8 %)에서 60 %보다 높았고, 18 경우 (전체의 41.8 %)에서 40 내지 60 %이었고, 오직 4 경우 (전체의 9.4 %)에서 40 %보다 낮았다. 냉동보존된 일차 CLL 샘플 (48시간에서 n=32, 58.3 % ± 11) 및 CLL 신선 샘플 (48시간에서 n=10, 56.6 % ± 6.4)의 사용간에 세포 사멸에서 차이가 관찰되지 않았다. 건강한 제공자의 PBMC에서의 포로데신 2 μM 및 dGuo (10 내지 20 μM)의 세포독성은 T-림프구 (CD3+ 세포) 및 B-림프구 (CD19+ 세포) 모두에서, CLL 세포와 비교하여 상대적으로 보다 낮았다.
CLL 환자에서, ZAP-70 및/또는 CD38 단백질의 발현 수치는 보다 좋지못한 전반적인 생존 및 질환 진행까지의 보다 짧은 시간과 관련된다 (문헌 [Hus et al ., Ann Oncol , 17(4), 683-690 (2006)] 참조). 낮은 수치의 ZAP-70을 갖는 CLL 세포 (17명의 CLL 환자; 58.1 % ± 11의 대조군에 대한 평균 세포독성) 및 높은 수치의 ZAP-70을 발현하는 CLL 세포 (22명의 CLL 환자; 57.9 % ± 12의 평균 세포독성) (CD38 발현 수치에 관해서도 (CD38 저 52.3 % ± 12 대 CD38 고 62.1 % ± 12의 평균 세포독성))에서 포로데신에 의해 유도된 세포 사멸 사이에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 또한, 시험관내 및 생체내 약물 내성 및 CLL 환자의 짧은 생존과 관련된 13q 결실, 11q 결실 및 17p 결실과 같은 CLL 세포에서의 가장 흔한 세포유전적 변경은 포로데신-유도 세포독성과 상관관계를 보이지 않았고, 이러한 경우에서도 또한 좋은 반응이 달성되었다.
포로데신으로 치료된 CLL 세포의 세포독성 반응 대 CLL에서 사용되는 두 주요 화학요법제인 플루다라빈 또는 벤다무스틴 세포독성 (문헌 [Aivado et al ., Semin Oncol , 29, (4 Suppl 13), 19-22 (2002); 및 Montserrat, Hematol J, 5, Suppl 1, S2-S9 (2004)] 참조)을 또한 비교하였다. 32명의 CLL 환자 (이 중 11명은 p53 결실을 가짐)의 일차 CLL 세포를 48시간 동안 단독의 또는 조합된 포로데신 2 μM 및 dGuo 20 μM, 벤다무스틴 10 내지 25 μM 및 플루다라빈 1 ㎍/mL으로 인큐베이션하였다. 단일 약제로서 17p 결실을 가지지 않는 CLL에서 평균 세포독성은 포로데신, 플루다라빈 및 벤다무스틴에 있어서 각각 55.3 ± 8, 50.6 ± 11 및 49.2 ± 18이었다. p53 변경을 초래하는 17p 결실의 획득은 CLL 환자에서 시험관내 및 생체내 플루다라빈 내성과 관련된다 (문헌 [Dohner et al ., Blood , 85(6), 1580-1589 (1995); 및 Turgut et al ., Leuk Lymphoma , 48(2), 311-320 (2007)] 참조). 현저하게, 17p 결실을 가진 대부분의 CLL 환자들은 48시간에서 60.1 % ± 21의 평균 세포독성을 가져, 포로데신에 높은 반응을 보였다 (포로데신 2 μM 및 dGuo 20 μM). 반대로, 이 경우들은 플루다라빈 (25.1 ± 13의 평균 세포독성) 및 벤다무스틴 (36.2 % ± 17의 평균 세포독성)에 보다 낮은 반응을 보였다. 추가로, 분석된 32명의 CLL 환자 샘플 중 12개에서 벤다무스틴 25 μM 및/또는 플루다라빈 1 ㎍/ml에 무 또는 낮은 시험관내 반응이 관찰되었으나 (대조군에 대하여 35 % 보다 낮은 세포독성), 이들은 포로데신에 높은 반응을 보였다. 벤다무스틴 또는 플루다라빈에의 낮은 또는 매우 낮은 반응을 가지는 17p 결실을 가진 세 경우는 포로데신에 높은 반응을 보였고 (67 % ± 20의 평균 세포독성) 오직 두명의 CLL 환자만이 포로데신에 낮은 반응을 보였다.
플루다라빈 , 벤다무스틴 및 리툭시맵과 포로데신의 병용.
치료를 위한 포로데신과 플루다라빈의 병용을 평가하였다. 벤다무스틴, 알킬화제 및 또한 퓨린-유사 유사체와 포로데신의 병용을 또한 평가하였다. 플루다라빈 (0.5 내지 1 ㎍/ml)과 포로데신 2 μM 및 dGuo (10 내지 20 μM)의 병용은 단일 약제로서의 어느 약물의 세포독성 효과도 증가시키지 않았고, 세포 사멸 유도에 미치는 부정적인 효과가 관찰되었다. 두 약물간의 병용 효과를 평가하기 위하여, 병용 지수 또는 CI 값을 두개의 다른 약물의 병용에 대한 길항 또는 상승작용적 효과의 지표 마커로서 슈 및 탈랄레이의 알고리즘 (문헌 [Chou et al ., Adv Enzyme Regul, 22, 27-55 (1984)] 참조)을 사용하여 계산하였다. 간략하게, 1 초과의 CI 값은 길항 효과의 지표인 반면, 1 미만의 CI 값은 상승작용적 효과의 지표이다. 플루다라빈 및 포로데신으로 실시된 병용 연구는 분석된 모든 CLL 경우에서 1 보다 높은 CI 값을 보였고 (48시간), 이는 두 약물간의 길항 효과를 나타낸다. 포로데신 및 플루다라빈 병용으로 달성된 평균 세포독성은 두 약물에 의해 야기된 것보다 낮았다. 포로데신은 또한 벤자무스틴에 낮은 반응을 가지는 CLL 경우에서 효과적이였으나, 플루다라빈과는 반대로, 벤다무스틴 및 포로데신의 병용에서 세포 사멸에서의 높은 증가가 관찰되었고 강력한 상승작용적 효과 (1 미만의 CI)가 관찰되었다. 포로데신은 명백히 낮은 투여량의 벤다무스틴의 세포독성 반응을 향상시켜 (10 μM, 32.95 %의 평균 세포독성) 두 약물의 병용에 대한 평균 세포독성 효과 70.5 %를 달성한다.
포로데신 및 CD20에 대항하는 인간화 단일클론 항체인 리툭시맵의 병용을 또한 평가하였다. 24시간에서, 단일 약제로서 리툭시맵 (25 내지 50 ㎍/ml)에서 관찰된 세포 사멸은 낮았고, 포로데신과의 병용은 명백히 두 약물의 세포독성 효과를 개선시켰다. 리툭시맵 및 포로데신간의 강력한 상승작용적 효과가 0.5에 근접하는 CI 값으로 또한 입증되었다.
포로데신 유도 세포 사멸과 Ser -74에서의 dCK 인산화 및 세포내 dGTP 수치 증가의 상관관계.
포로데신 2 μM 및 dGuo 10 μM으로 치료된 26명의 CLL 환자의 일차 세포에서 dGTP의 세포내 수치를 분석하였다. 18시간에서 분석된 dGTP 수치의 배수(fold) 증가 및 48시간에서 포로데신-세포독성간의 유의한 직접 상관관계 (p<0.05)가 관찰되었다. 포로데신은 세포내 dGTP 수치에서 높은 증가를 유도하였다 (6 내지 129 pmole의 dGTP/106 백만 세포의 값에 도달하는, 대조군 기초 수치에 대하여 최대 96배 배수 증가). 네 CLL 경우는 dGTP 수치에서 증가를 보이지 않거나 낮은 증가를 보였고, 이러한 경우에서 포로데신에의 낮은 세포독성 반응이 관찰되었다. 포로데신 치료 후 dGTP 수치상의 증가가 dCK에 의한 dGuo의 인산화에 의해 매개된 것임을 확인하기 위하여, 데옥시시티딘의 존재하에서 세포 사멸 유도를 분석하였다. 데옥시시티딘이 dCK의 주요 기질인바, 이는 dCK에 의한 dGuo의 인산화를 억제해야 하며, 포로데신에 의해 유도된 dGTP의 세포내 증가 및 뒤이은 세포자멸사에 영향을 미친다. 데옥시시티딘 (5 내지 10 μM)과 세포의 예비-인큐베이션은 포로데신-유도 세포 사멸을 억제하였다. 항암 화학요법에 사용된 일부 뉴클레오시드 유사체, 특히 퓨린 유사체 플루다라빈 및 데옥시시티딘 유사체 젬시타빈은 활성을 가지기 위하여 dCK에 의해 인산화된다. 데옥시시티딘은 또한 플루다라빈에 의해 유도된 세포 생활력의 손실을 복귀시켰는 반면, 벤다무스틴 (dCK와 독립적으로 작용할 수 있는 약물)에 의해 유도된 세포 사멸은 복귀되지 않았다.
CLL 세포에서 dCK 활성이 Ser-74에서 인산화에 의해 양성적으로 조절된다는 것이 최근 기술된바, dCK의 인산화 상태를 포로데신 치료시에 웨스턴 불롯(western blot)으로 분석하였다 (문헌 [Smal et al ., J Biol Chem , 281 (8), 4887-4893 (2006); Smal et al ., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids , 25(9-11), 1141-1146 (2006); Smal et al , Cancer Lett , 253(1), 68-73(2007)] 참조). 벤다무스틴에 의해 가해지지 않은 증가인, CLL 세포에서 dCK의 인산화된 형태의 증가 (Ser-74에서)가 관찰되었다. 포로데신 치료 후 포스포-dCK/dCK 비율의 농도측정적 분석을 실시하였고, 24 (p=0.05, 추가 데이터) 및 48시간 (p=0.05) 모두에서, 세포독성과의 상관관계가 관찰되었다.
플루다라빈 및 포로데신 간에 관찰된 길항 효과를 연구하기 위하여, 플루다라빈 (1 ㎍/ml) 및 포로데신 (2 μM 및 dGuo 10 μM)과의 CLL 세포의 인큐베이션 후 세포내 dGTP 증가가 관찰되었다. 플루다라빈은 단독으로 dGTP 수치의 증가를 유도하지 않았으나, 플루다라빈과 포로데신의 병용 (회색 막대)은 포로데신 단독 (흑색 막대)에 의해 가해진 dGTP 배수 증가를 감소시켰다. 따라서 플루다라빈 및 포로데신 병용에서 관찰된 dGTP 증가의 감소는 두 약물 사이에서 관찰된 길항 효과를 설명할 것이다. 플루다라빈은 활성을 가지기 위하여 dCK에 의해 인산화되어야 하고, dGuo가 또한 이 효소에 의해 인산화되는바, 두 약물은 동일한 효소에 대해 경쟁하고 있을 수 있으며, 따라서 dGTP 또는 플루다라빈의 활성형의 형성이 감소될 것이다.
포로데신은 p53 에 독립적인 미토콘드리아 세포자멸사 경로의 활성화를 유도하였다.
CLL 세포에서 포로데신이 세포자멸사를 유도하는 작용 매커니즘을 밝히기 위하여, 미토콘드리아 세포자멸사 경로의 몇몇 특징을 분석하였다. 포로데신은 초기 시간에서 미토콘드리아 막전위 (ΔΨm)의 손실을 유도하였다. 반응성 산소종 (ROS)은 미토콘드리아 손상 후 생산될 수 있고 후속적으로 세포자멸사를 매개할 수 있다 (문헌 [Villamor et al ., Curr Pharm Des , 10(8), 841-853 (2004)] 참조). 포로데신은 또한 CLL 일차 세포에서 ROS의 생성을 유도하였다. 미토콘드리아 탈분극 및 ROS 생성은 포로데신으로의 치료 10시간 후 뚜렷하였던바, 초기 사건으로 관찰되었다. 산화적 스트레스는 프로그램된 세포 사멸의 조절에서 역할을 하여서, 몇몇 ROS 스케빈저의 효과를 분석하였다. 글루타티온-감소된 에틸 에스테르 (GSH), N-아세틸 시스테인 (NAC) 또는 티론과의 CLL 세포의 예비-인큐베이션은 포로데신에 의해 유도된 ΔΨm 손실 및 ROS 생성을 감소시켰다. NAC 및 티론 (O2의 특이적 스케빈저)은 실제로 ROS 생성을 복귀시켰으나, H2O2에 선택적인 스케빈저인 GSH의 효과는 완화되었다.
CLL 세포에서 앞선 시험관내 연구는 포로데신이 p53 안정화 및 세포자멸사 유도을 야기한다고 보고하였고 (문헌 [Balakrishnan et al ., Blood , 108(7), 2392-2398 (2006)] 참조), 이 결과는 DNA 손상 및 p53-매개 세포자멸사를 유도하는 다른 항암 약물과 일치한다. 그러나, 다른 퓨린 뉴클레오시드 유사체와 달리, 포로데신은 DNA로 혼입되지 않는다. 흥미롭게도, 분석된 미토콘드리아 세포자멸사 경로의 초기 특징이 또한 17p (p53) 결실 또는 11q (ATM) 결실을 가진 CLL 환자에서 관찰되었고, 이는 DNA 손상 p53-매개 반응에 독립적인 세포자멸사 개시의 매커니즘을 나타낸다.
포로데신은 순차적 카스파제 -9 및 -8 활성화 및 BID 의 처리를 촉발시켰고, 이는 카스파제 -8에 의해 매개되는 미토콘드리아 세포자멸사 경로의 증폭 루프의 역할을 암시한다.
미토콘드리아 세포자멸사를 초래하는 하류 신호 경로를 연구하기 위하여, 포로데신 노출 후 카스파제 활성화의 패턴을 연구하였다. 카스파제-9, -8 및 -3의 투여량- 및 시간-의존 활성화를 이들의 프로-불활성형의 처리에 의해 관찰 및 분석하였다. 프로-카스파제-9 및 -8의 절단 생성물은 포로데신 치료 10시간과 같이 초기에 거의 동시에 존재하였고, 먼저 프로-카스파제-9의 p37 절단 형태에 이어 카스파제-8의 p43/41 절단 형태의 증가가 뒤따른다. 프로-카스파제-3의 절단 및 이의 활성형의 존재가 나중에 검출되었다. 카스파제-8의 활성화와의 상관관계에서, 포로데신은 또한 카스파제-8의 주요 기질인, BH3-단독 단백질 BID의 감소를 유도하여 미토콘드리아 세포자멸사 경로를 또한 활성화하는 이의 말단절단 프로-세포자멸사 형태를 제공하였다. 세포자멸사 유도와의 상관관계에서, 카스파제-3 기질인 PARP의 단백분해 절단 및 세포자멸사의 억제제 XIAP 및 서비빈의 감소가 또한 관찰되었다. 미토콘드리아 세포자멸사 경로의 활성화가 카스파제-의존 및 독립적 세포 사멸을 초래하는바, 그다음, 포로데신-유도 세포자멸사에서 카스파제 활성화의 역할을 연구하였다. 광범위 카스파제 억제제 z-VAD.fmk으로의 세포의 치료는 24시간 동안 포로데신 치료 후 포스파티딜세린 노출을 부분적으로 감소시켰고, 이는 카스파제-의존 및 독립적 작용 매커니즘 모두의 연루를 암시한다.
카스파제-8/BID의 활성화는 포로데신에 의해 가해진 세포자멸사 유도 동안 핵심 역할을 할 수 있거나, 또는 카스파제-9 활성화로 인한 이차 부-사건 및 따라서 미토콘드리아의 하류일 수 있다. 흥미롭게도, 아넥신 V 염색에 의해 분석된 세포자멸사 유도는 특이적 카스파제-8 억제제 z-IETD.fmk에 의해 부분적으로 차단되었던 반면, 관찰된 ΔΨm 손실에 대한 복귀는 보다 뚜렷하였다. 총합하여, 이러한 결과들은 카스파제-8 활성화 및 BID가 포로데신에 의해 유도된 미토콘드리아 세포자멸사 경로 동안 초기 증폭 역할을 함을 암시한다.
미토콘드리아 매개 세포 사멸의 프로- 세포자멸사 및 항- 세포자멸사 조절인자의 분석.
미토콘드리아 세포자멸사 경로는 여럿 중에서 항-세포자멸사 BCL-2 및 MCL-1 단백질 및 프로-세포자멸사 BAX, BAK, BID 및 BIM 단백질과 같은, BCL-2 계열 단백질에 속하는 프로- 및 항-세포자멸사 구성원들 간의 팽팽한 균형에 의해 조절된다. CLL 세포는 화학요법에 대한 시험관내 및 임상적 반응과 역비례의 상관관계를 보이는 항-세포자멸사 단백질 MCL-1 및 BCL-2의 높은 수치를 발현한다. 이러한 항-세포자멸사 단백질의 수치상에 미치는 포로데신 인큐베이션의 효과를 연구하였다. 포로데신 치료시, 항-세포자멸사 MCL-1 단백질의 수치가 상당히 감소한 반면, BCL-2 단백질 수치는 영향을 받지 않았다. BH3-단독 단백질 BIM은 BCL-2 및 다른 항-세포자멸사 BCL-2 계열 구성원들과 상호작용하여 세포자멸사를 유도한다. 포로데신은 프로-세포자멸사 BIM 단백질 수치의 단백질 수치 증가를 유도하였다. BIM 및 MCL-1 단백질 수치에서의 변화를 포로데신으로 치료한 7 CLL 경우에서 농도측정적 분석으로 확인하였다. 프로-세포자멸사 BIM EL 단백질 수치에서의 증가 또는 MCL-1 수치에서의 감소 및 포로데신에의 세포독성 반응간에 직접 상관관계가 관찰되었고, 이는 MCL-1 감소 (p=0.04)를 표시한다. 추가로, 포로데신 치료 후 관찰된 세포독성에 대하여 BIM EL 유도 및 MCL-1의 감소 간의 비율 (대조군에 대하여)을 플로팅하였을때, 유의한 상관관계 (p=0.04)가 발견되었다.
BCL-2 및 MCL-1은 미토콘드리아 막의 가디언으로서 작용하여, BAX 및 BAK와 같은, 이펙터 프로-세포자멸사 단백질의 작용으로부터 이의 일체성을 보존한다. BIM 및 말단절단 BID는 BAX 및 BAK의 직접 활성제로서 작용할 수 있는 능력을 가지는 유일한 BH3-단독 단백질이고, 포로데신과의 CLL 세포의 인큐베이션 후 흐름 세포측정에 의한 BAX 및 BAK의 활성화를 분석하였다. 포로데신은 BAX 및 BAK가 외 미토콘드리아 막으로 삽입될 수 있게 하고, 이의 올리고머화, 후속적 미토콘드리아 막 투과화의 유도 및 세포 사멸 기구의 활성화를 가능하게 하는 BAX 및 BAK의 입체형태적 변화를 유도한다.
포로데신 치료는 mRNA 및 단백질 수치에서 p73 의 증가 및 FOXO1 및 FOXO3A 의 유도를 촉발시켰다.
포로데신은 p53 상태와 무관하게 모든 CLL 경우에서 세포독성 효과를 발휘했으나, 포로데신은 17p 결실을 갖지 않는 CLL 경우에서 p53 단백질의 안정화를 유도할 수 있었다. p53-매개 세포자멸사에 필요한 p53 관련 단백질인 TAp73 단백질의 유도는 기능성 p53이 결여된 CLL 세포의 세포자멸사에 대한 내성을 극복할 수 있다 (문헌 [Dicker et at, Blood, 108(10), 3450-3457 (2006)] 참조). 포로데신 치료는 분석된 모든 CLL 경우에서 p73 mRNA 및 TAp73 단백질 수치의 명백한 상승-조절을 유도한다. FOXO 유도의 매커니즘이 알려지지 않았으나, p73는 종양 세포에서 p53-의존적일뿐 아니라 또한 p53-독립적인 방식으로 전사 인자 FOXO1 및 FOXO3a의 상승조절을 통하여 프로-세포자멸사 단백질 BIM의 유도를 조절한다 (문헌 [Amin et al., Cancer Res , 67(12), 5617-5621 (2007)] 참조). 포로데신으로 치료한 CLL 세포에서 FOXO1 및 FOXO3a의 수치를 연구하였다. 포로데신은 관찰된 p73 및 BIM 단백질 수치에서의 증가와 상관관계로, FOXO1 및 FOXO3a 모두의 증가를 유도하였다.
재료 및 방법
약물 및 화학물질
실험실용 포로데신 (BCX-1777/이뮤실린 H)은 바이오크리스트 파마슈티컬즈, 인코퍼레이티드 (Birmingham, USA)가 제공하였고, 데옥시구아노신 (dGuo)는 시그마(Sigma)로부터 구입하였다. 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP)의 정량화를 위하여, dNTP 및 [3H]dATP를 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences)로부터 입수하였다. 플루다라빈 (쉐링(Shering), Berlin, Germany), 벤다무스틴 히드로클로라이드 (트리안다(Treanda)™, 세팔론, 인코퍼레이티드(Cephalon, Inc.), Frazer, PA)가 제공), 리툭시맵 (로슈(Roche), Basel, Switzerland) 및 2'-데옥시시티딘 (시그마)을 세포독성 분석을 위하여 사용하였다.
건강한 제공자의 말초혈 단핵세포 및 CLL 일차 세포의 단리 및 배양
본 시험관내 연구를 세계보건기구(World Health Organization) 분류에 따라 CLL로 진단받은 43명의 환자의 일차 백혈병 림프구에서 수행하였다. 각 환자로부터 숙지 동의서를 받았다.
말초혈 단핵세포 (PBMC) 세포를 피콜/히파크(Ficoll/Hypaque) 침전 (세로메드(Seromed), Berlin, Germany)에 의해 단리하였다. 세포는 즉시 사용되거나 또는 10 % 디메틸 술폭사이드 및 90 % 열-불활성화 소태아 혈청 (FBS, 깁코 페이즐리(Gibco Paisley), Scotland, UK)의 존재하에서 액체 질소에서 냉동보존되었다. 해동 후, CLL 환자의 단핵세포 (2 x 106 세포/mL)를 5 % 이산화탄소를 함유하는 37 ℃의 가습 대기에서, 10 % FBS, 2mM 글루타민 및 50 ㎍/mL 페니실린-스트렙토마이신으로 보강된, RPMI 1640 배양 배지 (깁코)에서 배양하였다. 종양 세포 (CD19+, CD5+), ZAP-70 및 CD38 발현 수치의 백분율을 흐름 세포측정에 의해 분석하였고, 앞서 기술된 바와 같이 정량화하였다 (문헌 [Crespo et al., N Engl J Med , 348(18), 1764-1775 (2003)] 참조). ZAP-70의 높은 발현 수치의 컷오프점은 20 %이상이었고 CD38에서는 30 % 이상이었다 (문헌 [Hus et al ., Ann Oncol , 17(4), 683-690 (2006)] 참조). 본 연구에서 사용된 모든 CLL 샘플은 95 % 초과의 종양 세포를 수반하였다. 세포유전적 변경은 17pl3.1 (p53), 1lq22.3 (ATM) 및 13ql4.3 (D13S319)의 결실을 알아내기 위한 유전자자리-특이적 프로브 및 세염색체 12를 검출하기 위한 중심체 프로브를 포함하는, 비시스(Vysis) (Downers Grove, IL)의 다수프로브 시판 키트를 사용하여 형광 계내 혼성화 (FISH)에 의해 평가하였다. p53 유전자의 돌연변이는 일반적으로 과오 돌연변이이고, 변이 단백질은 연장된 반감기를 가져 웨스턴 블롯에 의한 검출을 가능하게 한다. 추가로, p53 돌연변이를 IARC TP53 협회에 따른 직접 서열분석으로 확인하였다.
세포자멸사 유도
세포를 10 내지 20 내지 30 μM의 데옥시구아노신 (dGuo)의 존재 또는 부재하에서 1 내지 12 μM의 투여량에서의 포로데신과 함께 상이한 시점 동안 인큐베이션하였다. 지시된 때, 세포를 80 μM에서 팬-카스파제 억제제 z-VAD.fmk (벤질옥시-카르보닐-Val-Ala-Asp-플루오로-메틸케톤; 바쳄(Bachem), Bubendorf, Switzerland), 50 μM에서 카스파제-8 억제제 z-IETD.fmk (Z-Ile-Glu(OMe)Thr-DL-Asp (OMe)-플루오로메틸케톤, 바쳄), 2'-데옥시시티딘 (5 내지 10 내지 20 μM, 시그마), N-아세틸-L-시스테인 (NAC, 25 mM), 티론 (5 mM, 4,5-디히드록시-1,3-벤젠-디술폰산, 시그마) 또는 GSH (2 mM; 시그마)와 1시간 동안 예비-인큐베이션하였다. 약물 병용 연구를 위하여, 포로데신 (2 μM) 및 dGuo (10 내지 20 μM)의 첨가에 앞서 세포를 플루다라빈 또는 벤다무스틴과 4, 12, 또는 24시간 동안, 또는 단일클론 항체 항-CD20 리툭시맵과 1시간 동안 예비-치료하였다. FSC/SSC, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 및 요오드화프로피듐 (PI)에 접합된 아넥신-V으로의 이중 염색에 의한 포스파티딜 세린 (PS) 노출의 정량화 (벤더메드시스템즈(BenderMedsystems), Vienna, Austria)로 세포 복합도에서의 변화로 세포 생활력 및 세포자멸사 유도를 분석하였다. CD3+ 및 CD19+ 모집군에서의 세포자멸사 분석을 위하여, PBMC를 항-CD3-FITC (이뮤노테크(Immunotech), Marseille, France), 항-CD19-PE (벡튼 딕킨슨(Becton Dickinson)) 및 아넥신-V-APC으로 동시에 표지하였다. 세포 생활력 및 세포독성을 대조군 세포에 대한 백분율로 플로팅하였다. 미토콘드리아 막전위 (ΔΨm)의 손실을 20 nM의 DiOC6 (3,3-디엑실옥사카르보시아닌 요오다이드, 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))으로의 세포 염색에 의해 평가하였고, 반응성 산소종 (ROS) 생성을 2 μM 디히드로에티딘 (DHE; 몰레큘라 프로브스)으로의 세포 염색 및 흐름 세포측정 분석에 의해 구하였다. 입체형태적 변화로 인한 프로-세포자멸사 Bax 및 Bak 단백질의 활성화를 앞서 기술된 바와 같이 Bax 또는 Bak 단백질의 NH2-말단에 대한 항체로 세포를 표지하는 면역세포측정(immunocytometry)에 의해 분석하였다 (문헌 [Bellosillo et al, Blood, 100(5), 1810-1816 (2002)] 참조). 이 영역은 기초 조건에서 폐쇄되고, NH2-말단 에피토프-특이적 항체에 의한 결합에 이용가능하지 않다. 세포자멸사 자극 후, 이러한 단백질의 입체형태적 변화는 미토콘드리아를 표적화하는 소수성 COOH-말단 및 NH2-말단을 노출시켜, 미토콘드리아에 의해 매개되는 세포 사멸 기구의 유도에서 중요한 역할을 한다. 간단히 말해서, 세포를 PBS에서 1회 세척하였고 파라포름알데히드 4 %에서 고정하여 0.1 % 사포닌 및 0.5 % 소혈청 알부민 (BSA)로 투과화하였다. 세포를 실온에서 입체형태적 활성 Bak (온코진 리서치(Oncogene Research)), 또는 Bax (클론 6A7, BD 파민젠(Pharmingen)) 항체에 대한 일차 항체 1 ㎍/ml으로 염색하였다. 투과화 완충액에서 수회 세척 후, 세포를 이차 염소 항-마우스 FITC (DAKO) 또는 염소 항-토끼 FITC (수퍼테크스(Supertechs)) 항체와 인큐베이션하였고 투과화 완충액으로 다시 세척하였다. 샘플 당 염색된 1만개 세포를 그다음 흐름 세포측정에 의해 분석하였다.
세포내 dGTP 수치의 측정
15x106개의 CLL 일차 세포를 18시간 동안 포로데신 (2 μM) 및 dGuo (10 μM) 또는 플루다라빈 (1 ㎍/ml)과 함께 또는 없이 인큐베이션하였고 뉴클레오티드를 60 % 메탄올로 추출하였고 세포내 dGTP 수치를 셔먼(Sherman) 및 파이페(Fyfe)에 의해 변형된 바와 같은 DNA 폴리머라제 분석에 의해 정량화하였다 (문헌 [Sherman et al ., Anal Biochem , 180(2), 222-226 (1989)] 참조). 데이터를 대조군 세포와 관련하여 세포내 dGTP 수치의 배수 유도로 표현하였다. 동시에, 24 및 48시간에서의 세포 생활력을 또한 평가하였다.
면역블로팅
세포를 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 (류펩틴(leupeptine) 10 ㎍/ml, 아포프로티닌(apoprotinine) 10 ㎍/ml, 1 μM PMSF, 1 μM 소듐 오르토바나데이트, 1 μM NaF, 2 μM 소듐 피로포스페이트 데카히드레이트 (시그마))로 보충된 RIPA 완충액에서 15분 동안 분해하였다. 전체 세포 단백질을 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였고 이모빌론(Immobilon)-P (밀리포어(Millipore)) 막으로 전달하였다. 단백질 검출을 위하여, 다음의 일차 항체로 막을 탐색하였다: 항-Bim, 항-Bak (Ab1) 항-카스파제-8 (Ab-3), 항-p53 (Ab-2) (칼바이오켐(Calbiochem)); 항-Bid, 항-카스파제-9, 항-FoxO1 및 항-XIAP (셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies)); 항-Bcl-2, 항-dCK, 항-Mcl-1 (S-19) 및 항-p73 (클론 5B429) (산타 클루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)); 항-PARP (로슈); 항-카스파제-3 및 항-Bax (클론 6A7) (BD-파민젠); 항-서비빈 (압캠(Abcam)); 항-β-액틴 및 항-α-투불린 (시그마) 및 항-FoxO3A (업스테이트(Upstate)). 토끼 항-포스포 dCK (Ser79) 및 토끼 항-dCK는 친절히 캐롤린 스말(Caroline Smal) 및 프랑수아 본템프스(Francoise Bontemps) (유니버시테 카톨리크 드 루뱅(Universite Catholique de Louvain), Belgium)가 제공하였다. 적절한 일차 항체와의 인큐베이션 후, 향상된 화학발광(chemiluminiscence) (ECL) 시약 (피어스(Pierce))을 사용함으로써 호스래디시페록시다제 (HRP)-표지 항-마우스 (시그마), 항-토끼 (시그마) 또는 항-염소 (다코(Dako) 항체로 블롯을 전개하였다. 동일한 단백질 부하를 β-액틴 또는 α-투불린 발현으로 확인하였고 상대적 단백질 정량화를 이미지 게이지 후지필름(Image Gauge Fujifilm) 소프트웨어 (후지)로 행하였다.
실시간 RT - PCR 에 의한 mRNA 정량화
제조자의 지시사항에 따라 TRIZOL 시약 (인비트로젠(Invitrogen), Carlsbad, CA)을 사용하여 전체 RNA를 107 세포로부터 추출하였다. 전체 RNA의 1 ㎍을 그다음 무작위의 프라이머 및 M-MLV 역전사효소 (인비트로젠)을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. p73 및 Mcl-1의 발현 수치를 예비-설계된 요구에 따른 분석(Assay-on-demand) (어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), Foster City, CA)을 사용하여 ABI 프리즘 7900HT 시퀸스 디텍션 시스템(Sequence Detection System) (어플라이드 바이오시스템스)에서 구하였다. 각 유전자의 상대적 발현을 내인성 대조군으로 GUS를 사용하여 비교 주기 역치 (Ct) 방법 (ΔΔCt)에 의해 정량화하였다. mRNA 발현 수치는 검정기로서 각 경우의 대조군 샘플 (미처리)을 취하여 임의의 정량적 PCR 단위로 주어진다.
통계적 분석
데이터는 세 독립적 실험의 평균 ± 표준 편차 (SD)로 나타난다. 모든 통계적 분석은 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 3.0 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어 인코퍼레이티드(GraphPad Software Inc.), San Diego, CA)를 사용하여 수행되었다. 샘플 두 그룹간의 비교는 비-변수 맨-휘트니(Mann-Whitney) 시험에 의해 평가하였고 상관관계 계수는 스피어맨(Spearman) 시험을 사용하여 평가하였다. 결과들은 p-값이 0.05 이하 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<O.OOOl)일때 통계적으로 유의하다고 여겨졌다. 상이한 두 약물간의 병용 효과를 평가하기 위하여, 병용 지수 또는 CI 값을 슈 및 탈랄레이가 기술한 알고리즘 (칼쿠신(Calcusyn) 소프트웨어 v2.0, 바이오소프트(Biosoft), Cambridge, UK))을 사용하여 분석하였다 (문헌 [(Chou et al ., Adv Enzyme Regul , 22, 27-55 (1984)] 참조). 이 CI 값은 상이한 두 약물의 병용 효과의 길항 또는 상승작용적 효과에 대한 지표 마커이다. 두 약물들간의 상호작용은 CI 값이 1 미만일때 상승작용적, 1일때 부가적, 및 CI가 1을 초과할때 길항성이라 여겨졌다.
본 발명의 다수의 실시양태가 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 그러므로, 다른 실시양태들은 다음의 특허청구범위의 범위내에 속한다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 본 명세서에서 참고문헌으로 도입된다.

Claims (54)

  1. (a) 유효량의 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (PNP) 억제제인 포로데신; 및
    (b) 유효량의 알킬화제인 벤다무스틴 또는 항-CD20 약제인 리툭시맵
    을 포함하는, 대상체에서 혈액계 암을 치료하기 위해 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 제약 조합물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 PNP 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제가 동시에 투여되는 것인 제약 조합물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 PNP 억제제 및 알킬화제 또는 항-CD20 약제가 순차적으로 투여되는 것인 제약 조합물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 알킬화제 또는 항-CD20 약제가 PNP 억제제의 투여에 앞서 1회 이상 투여되는 것인 제약 조합물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 혈액계 암이 만성 림프구성 백혈병 및 급성 림프모구 백혈병으로부터 선택되는 것인 제약 조합물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 혈액계 암이 만성 림프구성 백혈병인 제약 조합물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 혈액계 암이 급성 림프모구 백혈병인 제약 조합물.
  13. 제1항에 있어서, 성분 (b)로서 유효량의 알킬화제를 포함하는 제약 조합물.
  14. 제1항에 있어서, 성분 (b)로서 유효량의 항-CD20 약제를 포함하는 제약 조합물.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
KR1020107015164A 2007-12-10 2008-12-10 항-ｃｄ20 약제 또는 알킬화제와 함께 포로데신과 같은 ｐｎｐ 억제제를 사용한 혈액계 암의 치료 방법 KR101545367B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1276207P 2007-12-10 2007-12-10
US61/012,762 2007-12-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100101139A KR20100101139A (ko) 2010-09-16
KR101545367B1 true KR101545367B1 (ko) 2015-08-18

Family

ID=40431122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107015164A KR101545367B1 (ko) 2007-12-10 2008-12-10 항-ｃｄ20 약제 또는 알킬화제와 함께 포로데신과 같은 ｐｎｐ 억제제를 사용한 혈액계 암의 치료 방법

Country Status (26)

Country Link
US (5) US20110038858A1 (ko)
EP (3) EP2237778A2 (ko)
JP (2) JP5543362B2 (ko)
KR (1) KR101545367B1 (ko)
CN (2) CN103736091B (ko)
AU (1) AU2008335167B2 (ko)
CA (2) CA2881035C (ko)
CY (1) CY1120203T1 (ko)
DK (1) DK2564846T3 (ko)
EA (2) EA018415B1 (ko)
ES (1) ES2670714T3 (ko)
GE (2) GEP20156288B (ko)
HR (1) HRP20180712T1 (ko)
HU (1) HUE037342T2 (ko)
IL (1) IL206264A (ko)
LT (1) LT2564846T (ko)
MY (2) MY163023A (ko)
NO (1) NO2564846T3 (ko)
NZ (3) NZ601072A (ko)
PH (1) PH12014501454A1 (ko)
PL (1) PL2564846T3 (ko)
PT (1) PT2564846T (ko)
SG (1) SG188870A1 (ko)
SI (1) SI2564846T1 (ko)
UA (2) UA104579C2 (ko)
WO (1) WO2009076455A2 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3010340A4 (en) 2013-06-22 2017-08-02 Nitor Therapeutics Compositions and methods for potentiating immune response, enhancing immunotherapy, and increasing vaccine potency
ES2909662T3 (es) * 2014-08-07 2022-05-09 Laevoroc Immunology Ag Composiciones que comprenden un inhibidor de PNP para uso en el tratamiento de la recaída de malignidad después de un trasplante de células madre hematopoyéticas

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002529426A (ja) 1998-11-09 2002-09-10 アイデック・ファーマシューティカルズ・コーポレイション キメラ抗ｃｄ２０抗体を用いた、循環腫瘍細胞に関連した血液学的悪性疾患の治療

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US199697A (en) 1878-01-29 Improvement in butter-sharers
ES2106732T3 (es) 1989-02-27 1997-11-16 Biocryst Pharm Inc Desazaguaninas substituidas en 9 y no substituidas en 8.
US4985433A (en) 1989-10-31 1991-01-15 Biocryst, Inc. 2-amino-7-(pyridinylmethyl)-3H,5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-4-ones and pharmaceutical uses and compositions containing the same
US5008270A (en) 1989-10-31 1991-04-16 Biocryst, Inc. 2-amino-7-(heterocyclomethyl)-3H,5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-4-ones and pharmaceutical uses and compositions containing the same
US4985434A (en) 1989-10-31 1991-01-15 Biocryst, Inc. 7-substituted derivatives of 2-amino-3H,5H-pyrrolo(3,2-d)pyrimidin-4-ones and pharamceutical uses and compositions containing the same
US5008265A (en) 1989-10-31 1991-04-16 Biocryst, Inc. 2-amino-7-(alicyclomethyl)-3H,5H,-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-4-ones and pharmaceutical uses and compositions containing the same
US5595721A (en) * 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
PL319485A1 (en) * 1994-10-05 1997-08-04 Chiroscience Ltd Purinic and guanic compounds as pnp inhibitors
US6387923B2 (en) * 2000-03-22 2002-05-14 Biocryst Pharmacueticals, Inc. Imminoribitol PNP inhibitors, preparation thereof and use thereof
DE10306724A1 (de) * 2002-02-28 2003-09-18 G O T Therapeutics Gmbh Vesikuläre Verkapselung von Bendamustin
CN103393681B (zh) * 2002-05-17 2017-04-12 细胞基因公司 用于治疗和控制多发性骨髓瘤的方法及组合物
US8003625B2 (en) * 2005-06-29 2011-08-23 Threshold Pharmaceuticals, Inc. Phosphoramidate alkylator prodrugs
EP2007423A2 (en) 2006-04-05 2008-12-31 Pfizer Products Incorporated Ctla4 antibody combination therapy

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002529426A (ja) 1998-11-09 2002-09-10 アイデック・ファーマシューティカルズ・コーポレイション キメラ抗ｃｄ２０抗体を用いた、循環腫瘍細胞に関連した血液学的悪性疾患の治療

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALAKRISHNAN et al, Blood, 2006, 108, 2392-2398*
RUMMEL et al, Journal of clinical oncology, 2005, 23, 15, 3383-3389*

Also Published As

Publication number Publication date
PH12014501454B1 (en) 2016-01-18
GEP20135855B (en) 2013-06-25
EA201370055A1 (ru) 2013-11-29
IL206264A (en) 2017-04-30
JP2014094962A (ja) 2014-05-22
SI2564846T1 (en) 2018-06-29
PT2564846T (pt) 2018-05-23
KR20100101139A (ko) 2010-09-16
GEP20156288B (en) 2015-05-25
US11110092B2 (en) 2021-09-07
US20140178372A1 (en) 2014-06-26
CA2881035C (en) 2019-04-16
IL206264A0 (en) 2010-12-30
EP2564846B1 (en) 2018-02-28
CN103736091A (zh) 2014-04-23
PH12014501454A1 (en) 2016-01-18
NO2564846T3 (ko) 2018-07-28
HUE037342T2 (hu) 2018-08-28
NZ601072A (en) 2014-01-31
CN101969947A (zh) 2011-02-09
HRP20180712T1 (hr) 2018-06-15
JP5543362B2 (ja) 2014-07-09
US20190255058A1 (en) 2019-08-22
UA109571C2 (uk) 2015-09-10
AU2008335167A1 (en) 2009-06-18
CY1120203T1 (el) 2018-12-12
DK2564846T3 (en) 2018-05-22
CN103736091B (zh) 2016-09-28
NZ586416A (en) 2012-07-27
EP2237778A2 (en) 2010-10-13
EA025340B1 (ru) 2016-12-30
ES2670714T3 (es) 2018-05-31
US20240100055A1 (en) 2024-03-28
MY163023A (en) 2017-07-31
WO2009076455A2 (en) 2009-06-18
WO2009076455A3 (en) 2009-08-27
UA104579C2 (uk) 2014-02-25
CA2708606A1 (en) 2009-06-18
SG188870A1 (en) 2013-04-30
EA201070669A1 (ru) 2010-12-30
CN101969947B (zh) 2014-10-22
LT2564846T (lt) 2018-05-10
US20220040188A1 (en) 2022-02-10
PL2564846T3 (pl) 2018-08-31
EP2564846A1 (en) 2013-03-06
EA018415B1 (ru) 2013-07-30
CA2881035A1 (en) 2009-06-18
AU2008335167B2 (en) 2014-02-13
NZ617989A (en) 2015-05-29
US20110038858A1 (en) 2011-02-17
MY193789A (en) 2022-10-27
JP2011506345A (ja) 2011-03-03
CA2708606C (en) 2015-04-28
EP2581083A1 (en) 2013-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2023036582A (ja) がんのための治療方法及び診断方法
Saha et al. MDM2 antagonist nutlin plus proteasome inhibitor velcade combination displays a synergistic anti-myeloma activity
US20240100055A1 (en) Methods of treating hematologic cancers
US20230266324A1 (en) Predicting response to pd-1 axis inhibitors
US11859252B2 (en) Diagnostic and therapeutic methods for cancer
AU2013201347B2 (en) Methods of treating hematologic cancers
US20230227917A1 (en) Predicting response to pd-1 axis inhibitors
WO2024108256A1 (en) Compositions and methods for improved cancer treatment

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180718

Year of fee payment: 4