EA018415B1 - Фармацевтическая композиция, набор и способ лечения гематологического злокачественного новообразования - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу лечения гематологического злокачественного новообразования, причём указанный способ включает введение ингибитора фосфорилазы пуриновых нуклеозидов (PNP) и анти-CD20 агента, а также к соответствующей фармацевтической композиции и набору.

Description

Область техники

Данное изобретение относится к лечению гематологических злокачественных новообразований, таких как, например, злокачественные новообразования крови, способом, который включает введение ингибитора фосфорилазы пуриновых нуклеозидов (ΡΝΡ). В частности, описывается способ лечения хронической лимфоцитарной лейкемии (СЬЬ) и острой лимфоцитарной лейкемии (ЛЬЬ).

Родственные заявки

Данное изобретение испрашивает приоритет на основании заявки США № 61/012762, от 10 декабря 2007 г., ссылка на которую приведена в настоящем описании.

Уровень техники

В настоящее время злокачественные опухоли являются второй основной причиной смерти в Соединённых Штатах, где более чем 8 млн граждан поставлен диагноз рак (злокачественной опухоли). В 1995 году злокачественные новообразования послужили причиной 23,3% всех смертей в США (см., например, статистику Департамента общественного здоровья при Правительстве Соединённых Штатов, Национальный центр статистики здоровья, Здоровье Соединённых Штатов, 1996-97 и Справочник травм, 117 (1и)шу СйайЬоок 117, 1997)).

В настоящее время злокачественные опухоли лечат в основном одним из нижеперечисленных способов или их комбинацией: хирургически, облучением или химиотерапией. Хирургическое лечение включает в себя удаление массы поражённой ткани. В то время как хирургическое вмешательство часто эффективно при удалении определённо локализованных опухолей, например опухолей груди, толстой кишки и кожи, этот способ не может быть применён при лечении опухолей, поражающих другие области, такие как позвоночник, или при лечении диссеминированных неопластических состояний, таких как лейкемия. Облучение включает ионизирующее облучение живой ткани, вызывающее гибель или повреждение обработанных клеток. Побочные эффекты облучения могут быть острыми и преходящими, однако некоторые могут быть необратимыми. Химиотерапия включает нарушение клеточной репликации или метаболизма. Чаще всего её применяют при лечении злокачественных опухолей груди, лёгких или яичек. Одна из главных причин неудачи такого лечения злокачественных опухолей - это выработка опухолевыми клетками устойчивости к препаратам - серьёзная проблема, которая может привести к рецидиву заболевания или даже к смерти. Таким образом, нужны более эффективные способы лечения злокачественных новообразований.

Сущность изобретения

В данном изобретении описан способ лечения гематологических злокачественных новообразований (например, СЬЬ и АЬЬ) у субъекта. Указанный способ включает следующие стадии: (а) введение указанному субъекту эффективного количества ингибитора фосфорилазы пуриновых нуклеозидов (ΡΝΡ) и (Ь) введение указанному субъекту эффективного количества анти-СЭ20 агента, специфичного к СЭ20 (анти-СЭ20 агента). Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор ΡΝΡ представляет собой фородезин. Согласно определённым вариантам реализации анти-СЭ20 агент представляет собой ритуксимаб.

Согласно некоторым вариантам реализации ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент вводят одновременно, в то время как согласно другим вариантам реализации ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент вводят последовательно. Согласно последнему варианту реализации анти-СЭ20 агент можно вводить однократно или несколько раз до введения ингибитора ΡΝΡ.

Далее, в данном изобретении описана фармацевтическая композиция, которая содержит ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент.

Также данное изобретение обеспечивает набор (кит), который включает ингибитор ΡΝΡ и антиСЭ20 агент. Согласно некоторым вариантам реализации набор согласно настоящему изобретению может дополнительно включать систему доставки ингибитора ΡΝΡ, анти-СЭ20 агента или их комбинации. Согласно другому варианту реализации набор согласно настоящему изобретению может дополнительно включать инструкции по лечению субъекта.

Подробное описание одного или нескольких вариантов реализации согласно настоящему изобретению приведено ниже с сопутствующими иллюстрациями и пояснениями. Другие характеристики, цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания, иллюстраций и формулы изобретения.

Описание иллюстраций

Фиг. 1А и 1В детально иллюстрируют цитотоксический эффект фородезина в клетках СЬЬ, характеризующихся как высоким, так и низким уровнем ΖΑΡ-70.

На фиг. 2 показана корреляция между повышением внутриклеточного уровня дГТФ после лечения фородезином и количеством вызванных смертей клеток.

На фиг. 3 показаны значения, детально описывающие случаи клеток СЬЬ с делецией р53, сильно реагирующих на фородезин.

Фиг. 4 иллюстрирует данные по лечению фородезином для случаев СЬЬ с низкой или отсутствующей чувствительностью к бендамустину или флударабину.

Фиг. 5А и 5В иллюстрируют данные комбинационного индекса для комбинаций фороде

- 1 018415 зин/бендамустин и фородезин/флударабин.

Фиг. 6 иллюстрирует данные комбинационного индекса для комбинации фородезин/ритуксимаб.

Подробное описание изобретения

Как описано в настоящем патенте, лечение фородезином вызывает зависимую от продолжительности и дозы клеточную гибель в клетках первичной СЬЬ. С 2 мкМ фородезином и 20 мкМ бСио был выявлен более чем 60%-ный цитотоксический эффект в 48% случаев и лишь в 9% случаев цитотоксичность была ниже чем 40%. Не были выявлены различия в отношении реакции на лечение для генетических аномалий, таких как делеции в 17р13 (ТР53) и 11с|22-с|23 (АТМ), генетические аномалии, возникшие при прогрессировании заболевания и связанные с устойчивостью к препарату и ухудшению выживаемости пациентов с СЬЬ. Случаи СЬЬ с изменениями в р53 или 11д характеризовались высокой чувствительностью к фородезину (средняя цитотоксичность 60,1% через 48 ч) с хорошим цитотоксическим эффектом, наблюдаемым у устойчивых к химиотерапии пациентов с СЬЬ. Комбинирование фородезина с клиническими антилейкемическими режимами усилило цитотоксическую реакцию ίη νΐίτο, с сильным синергетическим эффектом, проявляющимся при комбинировании фородезина и малых доз бендамустина, моноклонального анти-СЭ20 антитела ритуксимаба или циклофосфамида. С флударабином, напротив, наблюдали антагонистический эффект. Поэтому фородезин предоставляет новый химиотерапевтический подход, который может вызывать апоптоз клеток, у которых не действует путь АТМ/р53.

Соответственно, определённые варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают способ лечения гематологического злокачественного новообразования у субъекта, включающий стадии введения указанному субъекту эффективного количества ингибитора фосфорилазы пуриновых нуклеозидов (ΡΝΡ) и введения указанному субъекту эффективного количества анти-СЭ20 агента.

Согласно определённым вариантам реализации настоящего изобретения ингибитор ΡΝΡ представляет собой фородезин. Согласно определённым вариантам реализации анти-СЭ20 агент представляет собой ритуксимаб. Согласно определённым вариантам реализации настоящего изобретения ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент вводят одновременно, в то время как согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент вводят последовательно.

Согласно определённым вариантам реализации анти-СЭ20 агент можно вводить однократно или несколько раз до введения ингибитора ΡΝΡ.

Согласно определённым вариантам реализации гематологическое злокачественное новообразование представляет собой хроническую лимфоцитарную лейкемию или острую лимфобластную лейкемию.

Согласно определённым вариантам реализации настоящего изобретения гематологическое злокачественное новообразование представляет собой хроническую лимфоцитарную лейкемию.

Согласно определённым вариантам реализации гематологическое злокачественное новообразование представляет собой острую лимфобластную лейкемию. Согласно определённым вариантам реализации вводят эффективное количество анти-СЭ20 агента.

Согласно определённым вариантам реализации способов согласно настоящему изобретению указанные способы включают введение субъекту эффективного количества ингибитора ΡΝΡ и эффективного количества анти-СЭ20 агента.

Согласно определённым вариантам реализации ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент вводят одновременно.

Согласно определённым вариантам реализации ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент вводят последовательно.

Согласно определённым вариантам реализации настоящего изобретения анти-СЭ20 агент можно вводить однократно или несколько раз до введения ингибитора ΡΝΡ.

Согласно определённым вариантам реализации аналог пуриновых нуклеозидов представляет собой флударабин. Определённые варианты реализации обеспечивают фармацевтические композиции, содержащие ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент.

Согласно определённым вариантам реализации композиция согласно настоящему изобретению содержит фородезин и ритуксимаб.

Согласно определённым вариантам реализации композиция согласно настоящему изобретению содержит ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент. Согласно определённым вариантам реализации указанная композиция содержит фородезин и ритуксимаб.

Определённые варианты реализации обеспечивают наборы, включающие ингибитор ΡΝΡ и антиСЭ20 агент.

Согласно определённым вариантам реализации наборы дополнительно включают систему доставки ингибитора ΡΝΡ, анти-СЭ20 агента или их комбинации.

Согласно определённым вариантам реализации наборы также могут включать инструкции по лечению субъектов.

Согласно определённым вариантам реализации наборы включают фородезин и ритуксимаб.

В отличие от других аналогов нуклеозидов фородезин не внедряется в ДНК. Лечение фородезином приводит к увеличению уровня дГТФ в клетках СЬЬ, притом что это увеличение связано с клеточной цитотоксичностью, что свидетельствует о том, что увеличенный уровень дГТФ, вызванный лечением

- 2 018415 фородезином, будет суррогатным маркером, показывающим цитотоксическую реакцию. Чувствительность клеток СЬЬ к фородезину может быть обусловлена высокой активностью ЙСК, наблюдаемой в этих клетках, позитивно регулируемой фосфорилированием ЙСК в Сер-74. Выявлена значительная положительная корреляция между соотношением фосфо-йСК/йСК и индуцированным фородезином апоптозом. ЙСК также катализирует фосфорилирование, необходимое для активации многих противолейкемических аналогов нуклеозидов, как флударабин, гемцитабин или кладрибин. Антагонистический эффект, наблюдаемый между фородезином и флударабином, может быть объяснён понижением уровня дГТФ, отмеченным после комбинирования флударабина с фородезином. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фосфорилирование ЙСК и последующее увеличение уровня дГТФ играет важную роль на начальном этапе стимулирования апоптоза фородезином в клетках СЬЬ.

Предложено несколько механизмов дГТФ-опосредованной клеточной гибели. Например, аккумулированные дезоксинуклеозиды могут быть фосфорилированы в митохондриях дезоксигуанозин киназой и тимидин киназой и вызывать аномальное накопление дНТФов, которые могут нарушать митохондриальный синтез и репарацию ДНК, приводя к повышенной чувствительности к повреждениям митохондрий, активации р53 и апоптозу. Дисбаланс митохондриального дГТФ также может влиять на митохондриальный синтез АТФ и/или инактивацию антиоксидантных ферментов электрон-транспортной цепи митохондрий, приводя к выработке активных форм кислорода (Κ.Ο8). Митохондриальный геном высокочувствителен к повреждениям от окислительного стресса, которые могут сразу вызвать апоптоз. Как описано в данном изобретении, фородезин активировал митохондриальный путь апоптоза, вызванный выработкой активных форм кислорода и снижением Δψιη (митохондриального потенциала), приводящий к каспазо-зависимому и -независимому апоптозу. Активные формы кислорода генерируются при митохондриальном транспорте электронов и в условиях серьёзного оксидантного стресса повышения уровня О₂ ^-, ОН^- или Н₂О₂ вызывают снижение Δψт и гибель клеток. Эти явления, вызванные фородезином, предотвращала предварительная инкубация клеток СЬЬ с бренцкатехин:3,5-дисульфанатом (Τίτοη) и ЫАС, специфическими утилизаторами О2^-, что подтверждает роль окислительного стресса, предшествующего активации митохондриального пути апоптоза. Фосфорилирование и активация р53 вызываются при ответе на повреждения ДНК, а также различными стрессовыми сигналами. Перепроизводство супероксидов и вызванное им повреждение ДНК могут привести к апоптозу через активацию опосредованного активными формами кислорода митохондриального пути и активацию р53. В этом смысле, выработка активных форм кислорода, вызванная фородезином, может выступать как регулятор активации р53, действующий выше по цепи передачи сигналов. В данном изобретении описаны результаты, демонстрирующие стабилизацию р53 в случае с р53 дикого типа клеток СЬЬ, а также тот факт, что фородезин активировал митохондриальный путь апоптоза и в случаях с мутированным р53, что указывает на то, что фородезин включает другой и/или дополнительный механизм, независимый от р53. Окислительный стресс и выработка активных форм кислорода также приводит к активации фактора транскрипции Е2Е-1, который регулирует как зависимый, так и независимый от р53 апоптоз через различные пути передачи сигналов. Е2Е-1 увеличивает фосфорилирование р53 по разным остаткам, которые также фосфорилируются в ответ на повреждение ДНК, но он также способен вызывать клеточную смерть путём активации гомолога р53 белка р73, используя р-53 независимый апоптотический путь. Как выработка активных форм кислорода может регулировать активацию Е2Е-1, р53 и/или р73 и клеточную смерть, изучено недостаточно.

Ранним событием в митохондриальном пути апоптоза является формирование апоптосомы и активация каспазы-9, расщепляющей и активирующей каспазу-3 и каспазу-8. Фородезин вызвал зависимую от времени активацию каспазы-9 и -3, а также прокаспазы-8, одновременно с активацией каспазы-9. В свою очередь, каспаза-8 вызвает расщепление белка ВШ с образованием его укороченной проапоптотической формы, которая активирует митохондриальный апоптотический путь. Селективное ингибирование каспазы-8 уменьшило снижение Δψт, вызванное фородезином, но эффект на клеточную смерть позже был ослаблен, что означало, что комплекс каспаза-8/ВШ включил циклическую амплификацию митохондриального апоптотического пути. Активация каспазы-9 могла быть недостаточной рег 5С для запуска апоптоза, поэтому активация каспазы-8/ВШ вместе со снижением уровня ингибиторов апоптоза ΧΙΑΡ и сюрвивина бы увеличила активность каспазы-9 и -3, таким образом, усиливая апоптоз, вызванный фородезином.

Семейство белков ВСЬ-2 контролирует способность (готовность) клеток к апоптотической смерти. Баланс между антиапоптотическими членами, как ВСЬ-2 и МСЬ-Ι, и проапоптотическими членами семейства ВСЬ-2 (ВАХ, ВАК и ВН3- белки В1М, РИМА, ΝΟΧΑ, ВАС. ВШ, ВМЕ, В1К и НЕК) контролирует исход многих сигнальных путей клеточной смерти. У пациентов с СЬЬ высокий уровень ВСЬ-2 и МСЬ-Ι связан с прогрессированием заболевания, низкой выживаемостью и невозможностью получить полноценную реакцию на лечение алкилирующими агентами, аналогами нуклеозидов и ритуксимабом. Фородезин вызвал накопление белка В1М и понижение уровня МСЬ-Ι, не вызвав изменений в уровне ВСЬ-2. В клетках СЬЬ, В1М связан с МСЬ-Ι, поэтому понижение уровня МСЬ-Ι сделает клетки СЬЬ восприимчивыми к этому ВН3-белку. ВГМ, как и укороченный В1й, несут двойную функцию, как ингибирования антиапоптотических членов семейства ВСЬ-2, так и прямых активаторов проапоптотических бел

- 3 018415 ков ВАХ и ВАК. В этом смысле, повышение уровня ΒΙΜ и активация Βίά приведут к активации ВАХ и ВАК, что вместе с понижением уровня МСЬ-Ι приведёт к тому, что оставшаяся антиапоптотическая активность ВСЬ-2 окажется недостаточной. Приведённые в данном изобретении данные показывают, что степень снижения уровня МСЬ-Ι и повышения уровня В1М, вызванных фородезином, в значительной степени коррелировала с индукцией апоптоза, а базовые уровни МСЬ-Ι и В1М могли показать чувствительность клеток СЬЬ к фородезину.

Была продемонстрирована активация митохондриального апоптотического пути, не зависящая от статуса р53. По имеющимся сведениям, индукция р73 - транскрипционной мишени р53, может преодолеть устойчивость клеток СЬЬ, не имеющих функциональный р53, к апоптозу. Реагируя на некоторые химиотерапевтические препараты, проапоптотическая форма р73-Тар73 трансактивирует различные гены-мишени белка р53, которые контролируют блокировку клеточного цикла и апоптоз как зависимо от статуса р53, так и независимо от него. Оказалось, что фородезин индуцировал р53 и ТАр73 в клетках СЬЬ с функциональным р53, однако любопытно, что уровень иРНК р73 и самого белка также повысился в клетках СЬЬ с делецией р53. Окислительный стресс и выработка активных форм кислорода вызывают активацию ТАр73 и Е2Б1, которые участвуют в активации митохондриального апоптотического пути посредством р53-зависимого и р53-независимого механизма. Поэтому повышение уровня активных форм кислорода, вызванное фородезином, может обеспечить сигнал, активирующий Е2Е-1 и/или повышающим образом регулирующий ТАр73. Члены семейства факторов транскрипции ЕОХО регулируют экспрессию многих генов, участвующих в апоптозе, и могут быть активированы усилившимся окислительным стрессом. ЕОХО1 и ЕОХО3а являются транскрипционными мишенями Е2Е-1, очевидно, необходимыми для вызванного активными формами кислорода апоптоза, в то же время являясь факторами транскрипции при экспрессии В1М в кроветворных клетках. Кроме того, под действием различных апоптотических стимулов утилизаторы активных форм кислорода блокируют индукцию ЕОХО3а и В1М. Было показано, что экспрессия как ЕОХО1а, так и В1М и последующий апоптоз регулируется белком р73 к опухолевых клетках с дефектным р53. После лечения фородезином выявлена повышающая регуляция белка и иРНК белков р73 и В1М, независимая от статуса р53, а также на ранних этапах было выявлено повышение уровня ЕОХО1 и ЕОХО3а. Экспрессия регулируемых ЕОХО генов-мишеней может находиться под контролем любого члена семейства ЕОХО, что подразумевает избыточный (дублирующий) механизм действия, как показано регуляцией транскрипции В1М, осуществляемой как ЕОХО1А, так и ЕОХО3А.

Таким образом, результаты, описанные в данном изобретении, обеспечивают доказательство существования механизма, участвующего в вызванной фородезином смерти клеток СЬЬ, независимого от статуса р53, что свидетельствует о возможности сосуществования различных путей программируемой клеточной смерти в одной клетке, которые могут быть селективно запущены различными стимулами.

Эти результаты показывают, что фородезин как одиночный агент, так и в комбинации с бендамустином или ритуксимабом является высокоэффективным при лечении СЬЬ. Поэтому фородезин, доступный, например, в оральной или внутривенной форме с профилем низкой токсичности, является одной из возможностей для лечения пациентов с плохим прогнозом (например, 17р-), пациентов с рефракторным заболеванием и/или опцией лечения пожилых пациентов. Инициирована фаза 1 мультицентрального клинического курса фородезина пациентов СЬЬ в стадии рецидива без контроля плацебо.

А. Способы лечения гематологических злокачественных новообразований.

В настоящем изобретении обеспечены способы лечения гематологических злокачественных новообразований, например злокачественных новообразований крови у субъектов. К примерам этого типа новообразований относятся, например, острая миелоидная лейкемия, хроническая миелоидная лейкемия, острая лимфобластная лейкемия (АЬЬ), хроническая лимфоцитарная лейкемия (СЬЬ), миелопролиферативные заболевания, множественная миелома, миелодиспластический синдром, лимфома Ходжкина, неходжкинская лимфома (злокачественная лимфома) и макроглобулинемия Вальденстрема. Согласно некоторым вариантам реализации гематологической злокачественной опухолью является СЬЬ. Согласно другим вариантам реализации гематологической злокачественной опухолью является АЬЬ.

Субъект может представлять собой млекопитающее или отличное от млекопитающего животное. Млекопитающим может являться, к примеру, человек; другие приматы, например высшие и низшие обезьяны; крупный рогатый скот; лошади; овцы; крысы; мыши; свиньи и козы. Отличные от млекопитающих виды могут включать в себя, к примеру, рыб и птиц.

Согласно одному из вариантов реализации способ согласно настоящему изобретению включает в себя введение субъекту ингибитора фосфорилазы пуриновых нуклеозидов (ΡΝΡ) и алкилирующего агента или анти-СЭ20 агента. Согласно определённым вариантам реализации вводят ингибитор ΡΝΡ и алкилирующий агент. Согласно другому варианту реализации вводят ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент. Согласно другому варианту реализации ингибитор ΡΝΡ вводят после выявления устойчивости субъекта к одному или нескольким химиотерапевтическим агентам (например, бендамустину или флуарабину). Согласно следующему варианту реализации ингибитор ΡΝΡ вводят после выявления у субъекта делеции р53. Без какого-либо ограничения теорией ингибитор ΡΝΡ может вызывать повышение уровня плазменного 2'-дезоксигуанозина (бОио) и накапливание внутриклеточного дезоксигуанозин трифосфата (дГТФ),

- 4 018415 что приводит к гибели клетки. Не ограничивающие каким-либо образом примеры ингибиторов ΡΝΡ могут включать в себя упомянутые в патентах США № 4985433; 4985434, 5008265; 5008270; 5565463 и 5721240, принадлежащих ВюСтук! Рйагтасеибса1к, 1пс., содержание которых включено в настоящее изобретение посредством ссылки. Согласно определённым вариантам реализации ингибитором ΡΝΡ является фородезин или его соль, включая соль хлороводородной кислоты

Не ограничиваясь как-либо теорией, термин алкилирующий агент относится к химиотерапевтическому соединению, которое химически модифицирует ДНК и нарушает её функцию. Некоторые алкилирующие агенты вызывают образование сшивок между нуклеотидами одной и той же цепи либо комплементарных цепей двухцепочечной молекулы ДНК, в то время как другие вызывают ошибочное спаривание оснований между цепями ДНК. Алкилирующий агент может быть производным иприта, производным нитрозомочевины, соединением платины, либо соединением имидазол-карбоксамида. Примеры алкилирующих агентов включают в себя бендамустин, бусульфан, карбоплатин, кармустин, цисплатин, хлорамбуцил, циклофосфамид, дакарбазин, гексаметилмеламин, ифосфамид, ломустин, мехлорэтамин, мефалан, митотан, митомицин, пипоброман, прокарбазин, стрептозацин, тиотепа и триэтиленмеламин. В некоторых случаях алкилирующим агентом может быть бендамустин либо его соль, включая соль хлороводородной кислоты

Анти-СЭ20 агентом может быть любой агент, мишенью которого (например, для селективного присоединения) является белок СЭ20 на поверхности В-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации анти-СЭ20 агент представляет собой антитело, специфичное к СЭ20. Не ограничиваясь как-либо теорией, считается, что такие агенты могут действовать через один из трёх механизмов: (1) комплементопосредованную цитотоксичность; (2) антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность и (3) индукцию апоптоза. Примеры анти-СЭ20 агентов включают в себя ритуксимаб, ибритумомаб, трастузумаб, гемтузумаб и алемтузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации анти-СЭ20 агент представляет собой ритуксимаб.

Ингибитор ΡΝΡ, алкилирующий агент и/или анти-СЭ20 агент можно вводить любым путём, например интраоперативно, интратекально, интрадискально, перидискально, эпидурально (включая перирадикулярное и трансфораминальное введение), любой комбинацией интрадискального, эпидурального, перидурального, периспинального, внутривенного, внутримышечного, подкожного, орального, интраназального, ингаляционного, трансдермального и парентерального способов введения.

Ингибитор ΡΝΡ, алкилирующий агент и/или анти-СЭ20 агент могут находиться в рецептуре с фармацевтически приемлемым носителем, выбранным с учётом желаемого пути введения и стандартной фармацевтической практикой. Ингибитор ΡΝΡ, алкилирующий агент и/или анти-СЭ20 агент могут быть сформулированы в дозированные формы, в соответствии со стандартной практикой в области приготовления фармацевтических препаратов. См. А1рйопко Сеппато, Еб., Кеттд1оп'к Ρйа^тасеиΐ^са1 8с1епсек, 18111 Ебйюп (1990), Маск ΡυόΙίκΗίπβ Со., ЕакЮп, ΡΑ. Приемлемые дозированные формы могут включать в себя, например, таблетки, капсулы, растворы, парентеральные растворы, пастилки, свечи или суспензии.

Для парентерального введения ингибитор ΡΝΡ, алкилирующий агент и/или анти-СЭ20 агент можно смешивать с приемлемым носителем или растворителем, таким как вода, масло (в частности, растительного происхождения), этанол, солевой раствор, водный раствор декстрозы (глюкозы) и родственные растворы сахаров, глицерин или гликоль, как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. Растворы для парентерального введения предпочитаемо содержат растворимую в воде соль ингибитора ΡΝΡ, алкилирующего агента и/или анти-СЭ20 агента. Также могут быть добавлены стабилизирующие агенты, антиоксидантные агенты и консерванты. К приемлемым антиоксидантным агентам относятся сульфиты, аскорбиновая кислота, лимонная кислота и её соли, а также натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ΕΌΤΑ). К приемлемым консервантам относятся хлорид бензалкония, метил- или пропилпарабен и хлорбутанол. Композиция для парентерального введения может быть в форме водного или неводного раствора, дисперсии, суспензии или эмульсии.

- 5 018415

Для орального введения ингибитор ΡΝΡ, алкилирующий агент и/или анти-СЭ20 агент могут быть получены в виде комбинации с одним или несколькими твёрдыми неактивными ингредиентами для приготовления таблеток, капсул, пилюль, порошков, гранул или других приемлемых оральных форм. Например, ингибитор ΡΝΡ, алкилирующий агент и/или анти-СЭ20 агент могут быть получены в виде комбинации по меньшей мере с одним вспомогательным веществом, таким как наполнитель, связующее вещество, смачивающее вещество (гумектант), дезинтегрирующий агент, замедлитель растворения, ускоритель абсорбции, абсорбент увлажняющего агента или лубрикант.

Специфическая доза ингибитора ΡΝΡ, алкилирующего агента и/или анти-СЭ20 агента, естественно, определяется конкретными условиями для каждого отдельного пациента, включая телосложение, массу, возраст и пол пациента, природу и стадию лечимого заболевания, агрессивность вызванных заболеванием нарушений и путь введения вещества. Дозировка и режим применения препаратов, например фородезина, бендамустина и ритуксимаба, могут быть установлены по отдельности, либо в комбинации, в соответствии, например, с дозировкой и режимом, указанными в одобренных Управлением по лекарственным средствам и пищевым продуктам США (ΕΌΑ) рекомендациях.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ингибитор ΡΝΡ и алкилирующий агент или анти-СЭ20 агент вводят одновременно, в то время как согласно другим вариантам реализации ингибитор ΡΝΡ и алкилирующий агент или анти-СЭ20 агент вводят последовательно. Согласно одному из вариантов реализации алкилирующий агент или анти-СЭ20 агент можно вводить однократно или несколько раз до введения ингибитора ΡΝΡ (например, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз или 20 раз). Согласно дополнительным вариантам реализации ингибитор ΡΝΡ можно вводить один или несколько раз до введения алкилирующего агента или анти-СЭ20 агента (например, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз или 20 раз).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лечение гематологической злокачественной опухоли субъекта может включать в себя выявления субъекта, устойчивого к одному или нескольким химиотерапевтическим агентам. Одной из главных причин неудачного лечения злокачественных новообразований является выработка устойчивости к препаратам опухолевыми клетками. Это весьма серьёзная проблема, которая может привести к рецидиву заболевания или даже смерти. Согласно одному из вариантов реализации устойчивого к одному или нескольким химиотерапевтическим агентам субъекта можно выявить способами, известными в данной области знаний. Субъект может быть устойчивым ко всем известным химиотерапевтическим агентам. Согласно определённым вариантам реализации субъект может быть устойчивым к алкилирующему агенту (например, бендамустину) и/или аналогу пуриновых нуклеозидов (например, флударабину).

После выявления устойчивого к химиотерапии субъекта ему может быть введён ингибитор ΡΝΡ. Согласно некоторым вариантам реализации ингибитором ΡΝΡ является фородезин-НС1.

Согласно другому варианту реализации лечение гематологического злокачественного новообразования может включать в себя выявление наличия делеции р53, например делеции 17р в одной или нескольких клетках образца, полученного от субъекта. Делеция 17р является маркером, который может помочь выявить субъекта с гематологической злокачественной опухолью, характеризующегося необычными биологическими и клиническими проявлениями. К примеру, изменения р53 могут свидетельствовать об устойчивости к препаратам и пониженной выживаемости.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения субъекту с делецией р53 можно ввести ингибитор ΡΝΡ. Согласно предпочтительным вариантам реализации ингибитором ΡΝΡ является фородезин-НС1. Способы лечения, описанные выше, включают в себя как монотерапию, так и комбинированную терапию. В контексте комбинированной терапии данное описание подразумевает введение двух и более химиотерапевтических агентов, в частности ингибитора ΡΝΡ и алкилирующего агента, либо ингибитора ΡΝΡ и анти-СО20 агента. Некоторые из данных соединений уже одобрены к применению для лечения одного или нескольких признаков злокачественных новообразований. Остальные находятся на различных стадиях преклинических и клинических разработок.

Согласно некоторым вариантам реализации введение ингибитора ΡΝΡ и алкилирующего агента или анти-СЭ20 агента может привести к синергетическому эффекту. Данный эффект может быть продемонстрирован путём определения комбинационного индекса (С1). Согласно определённым вариантам реализации индекс может быть вычислен как функция фракции клеток, подвергшихся воздействию в соответствии с процедурой Сбои с1 а1., Абуапсе Εηζ. Рсщ.11.. 22, 27-55 (1985). Это хорошо известный тест, оценивающий взаимодействия коэффициентов и спектра пропорций клеточных смертей. Например, если лечение препаратом А приводит к 30%-ной клеточной гибели, а лечение препаратом В приводит к 50%-ной клеточной гибели, ожидается, что комбинирование этих двух препаратов приведёт к 65%-ной клеточной гибели. Соответственно, если отношение значения предсказанной клеточной смерти к значению фактической клеточной смерти при комбинировании препаратов меньше единицы, можно говорить о наличии синергетического эффекта. Напротив, если это значение больше единицы, имеет место антагонистический эффект. Согласно одному из вариантов реализации комбинирование фородезина и бендамустина характеризуется синергетическим эффектом, в то время как комбинирование фородезина и флударабина характеризуется антагонистическим эффектом (см. пример 5).

- 6 018415

В. Фармацевтические композиции.

В настоящем патенте описаны фармацевтические композиции, которые содержат ингибитор ΡΝΡ и алкилирующий агент или ингибитор Р№ и анти-СЭ20 агент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ингибитор ΡΝΡ может включать в себя фородезин (ВСХ-1777). Согласно определённым вариантам реализации алкилирующий агент может включать в себя бендамустин. Согласно другим вариантам реализации анти-СЭ20 агентом является ритуксимаб.

Фармацевтические композиции, описанные в данном изобретении, содержат ингибитор ΡΝΡ и алкилирующий агент или ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент в количествах, применимых для лечения гематологических злокачественных новообразований, и приемлемый носитель. Фармацевтические носители, применимые для введения соединений, описанных в данном изобретении, включают в себя любые такие носители, известные специалистам в данной области знаний, пригодные для определённых способов введения.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения композиции могут быть сформулированы в применимые фармацевтические препараты, как растворы, суспензии, таблетки, диспергируемые таблетки, пилюли, капсулы, порошки, формы с замедленным высвобождением или эликсиры, для орального применения, либо в форме стерильных растворов или суспензий для парентерального введения, а также трансдермальные пластыри и ингаляционные сухие порошки (см., например, Лп5с1 Ιηίτοбисйои ίο Рйаттасеийса1 Иокаде Роттк, Роийй Εάίίίοη 1985, 126).

Концентрация ингибитора ΡΝΡ и алкилирующего агента или ингибитора ΡΝΡ и анти-СЭ20 агента в фармацевтических композициях зависит от скорости всасывания, инактивации и выведения соединений, физико-химических характеристик соединений, режима дозировки и вводимого количества, наряду с другими факторами, известными специалистам в данной области знаний. Например, вводимое количество является достаточным для лечения хронической лимфоцитарной лейкемии, как описано в данном изобретении. Фармацевтическая композиция может быть введена за один раз, либо может быть разделена на несколько меньших доз, вводимых через временные интервалы. Очевидно, что точная доза и продолжительность лечения являются функциями заболевания, которое лечат, и могут быть определены эмпирически с применением известных тестовых протоколов, либо экстраполяцией данных тестов ίη νίνο или ίη νίίτο. Необходимо помнить, что концентрации и величина доз могут также варьировать в зависимости от серьёзности состояния, которое подвергают лечению. Кроме того, необходимо понимать, что для каждого отдельного субъекта нужно устанавливать специфические режимы дозировки в соответствии с его индивидуальными потребностями и на основании профессиональных решений лица, проводящего лечение или руководящего процессом введения композиций, и что приведённые ниже в данном изобретении диапазоны концентраций являются исключительно иллюстративными и не ограничивают спектр применения описанных композиций каким-либо образом.

Фармацевтические композиции обеспечиваются для введения людям и животным в стандартных лекарственных формах, как таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы, стерильные парентеральные растворы или суспензии и водно-масляные эмульсии, содержащие приемлемое количество соединений, либо их фармацевтически применимых производных. Фармацевтически терапевтически активные вещества и их производные согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения формулируют и вводят в лекарственных формах единичного дозирования или в лекарственных формах, содержащих множественные дозы. Лекарственные формы единичного дозирования согласно настоящему изобретению относятся к физически отдельным единицам дозы, подходящим для людей и животных и упакованным отдельно, как известно в данной области знаний. Каждая единичная доза содержит заранее определённое количество терапевтически активного вещества, достаточное для того, чтобы вызвать желаемый терапевтический эффект, в совокупности с необходимым фармацевтическим носителем, средством доставки или растворителем. Примеры лекарственных форм единичного дозирования включают в себя ампулы, шприцы-тюбики, а также отдельно упакованные таблетки или капсулы. Лекарственные формы единичного дозирования можно вводить по фракциям либо по несколько штук. Лекарственная форма, содержащая множественные дозы, - это множество идентичных лекарственных форм единичного дозирования, помещённых в контейнер для введения отдельными стандартными дозами. К примерам составных лекарственных форм относятся пузырьки, баночки таблеток или капсул, либо бутылки большого объёма. Таким образом, лекарственная форма, содержащая множественные дозы, является множеством лекарственных форм единичного дозирования, не изолированных друг от друга при упаковке.

Жидкие фармацевтические вводимые композиции могут, например, быть приготовлены растворением, диспергированием или каким-либо другим методом смешивания активного вещества, как определено выше, и произвольного фармацевтического адъюванта в носителе, таком как, например, вода, солевой раствор, водный раствор декстрозы, глицерин, этанол и т.п., таким образом, получая раствор или суспензию. При желании, вводимая фармацевтическая композиция может дополнительно содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажняющие вещества, эмульгаторы, растворяющие агенты, буферные агенты и т.п., например, ацетат, цитрат натрия, производные циклодекстрина, монолаурата сорбитан, ацетат триэтаноламина натрия, олеат триэтаноламина и другие подобные агенты.

- 7 018415

Фактические способы получения таких лекарственных форм известны либо будут очевидными для специалистов в данной области знаний, например, см. РетшЦопХ Рйаттасеийса1 Зе1спес5. Маск РиЫкк1пд Сотраиу, Еайоп, Ра., 15111 Εάίίίοη, 1975.

Могут быть получены лекарственные формы композиций, содержащих ингибитор ΡΝΡ и алкилирующий агент либо ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент в интервале от 0,005 до 100%, сбалансированные с нетоксичным носителем. Способы получения таких композиций известны специалистам в данной области знаний. Предполагаемые композиции могут содержать 0,001-100% активного ингредиента, согласно одному из вариантов реализации - 0,1-95%, согласно другому варианту реализации - 75-85%.

С. Наборы.

Также в настоящем патенте описаны наборы. Как правило, набор включает в себя ингибитор ΡΝΡ и алкилирующий агент либо ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент. Согласно определённым вариантам реализации набор может включать в себя одну или несколько систем доставки, например, для ингибитора ΡΝΡ, для алкилирующего агента, для анти-СЭ20 либо для любой их комбинации, а также инструкцию по применению набора (например, инструкции по лечению субъекта). Согласно определённым вариантам реализации набор может включать в себя ингибитор ΡΝΡ и/или алкилирующий агент. Согласно другому варианту реализации набор может включать в себя ингибитор ΡΝΡ и/или анти-СЭ20 агент. Согласно некоторым вариантам реализации набор может включать в себя ингибитор ΡΝΡ и этикетку, указывающую, что содержимое вводится субъекту, устойчивому к алкилирующим агентам, как бендамустин. Согласно другому варианту реализации набор может включать в себя ингибитор ΡΝΡ и этикетку, указывающую, что содержимое вводится субъекту с делецией р53 (например, делецией 17р). Согласно следующему варианту реализации набор может включать в себя ингибитор ΡΝΡ и этикетку, указывающую, что содержимое вводится с алкилирующим агентом или анти-СЭ20 агентом.

Ό. Определения.

В настоящем патенте формы, использованные в единственном числе, относятся к множественным формам, если контекст ясно не подразумевает противное. Выражение эффективное количество, применяемое в описании количества вещества в способе, относится к количеству вещества, позволяющему достигнуть желаемый фармакологический эффект либо иной эффект, например к количеству, ингибирующему аномальный рост или пролиферацию, либо вызывает апоптоз опухолевых клеток, что приводит к полезному эффекту. Термины лечение и излечение означают оказание терапевтически благотворного эффекта, как облегчение имеющихся симптомов, предотвращение возникновения новых симптомов, облегчение или предотвращение метаболических причин, вызвавших и лежащих в основе симптомов, отсрочивание либо предотвращение дальнейшего развития нарушения и/или уменьшение тяжести симптомов, которые возникнут или могут возникнуть.

Примеры

Пример 1. Цитотоксичность фородезина в СЬЕ - ΖΑΡ-70^высок в сравнении с ΖΑΡ-70^низк

Клетки от 16 пациентов с СЬЕ с высоким уровнем ΖΑΡ-70 (>20%) и от 13 пациентов СЬЕ с низким уровнем ΖΑΡ-70 (<20%) обрабатывали 2 мкМ фородезином + 20 мкМ бСио в течение 48 ч. Цитотоксичность оценили с помощью окрашивания АппехшУ-МТС (ФИТЦ, флуоресцеин изотиоцианат) (выражена в виде процента от контрольных, необработанных клеток). Результаты показали, что средняя цитотоксичность как для высокого, так и для низкого уровня ΖΑΡ-70 превысила 50% (см. фиг. 1Α и 1В).

Пример 2. Повышение уровня внутриклеточного дГТФ.

Клетки от 26 пациентов с СЬЕ обрабатывали фородезином в течение 20 ч. Совокупные нуклеотиды подвергли экстракции (60% метанол), после чего уровень дГТФ количественно оценили с помощью теста с ДНК-полимеразой. Жизнеспособность клеток по сравнению с контрольным образцом (необработанными клетками) оценили через 48 ч окрашиванием АппехшУ-НТС. Повышение уровня внутриклеточного дГТФ после обработки фородезином хорошо коррелирует с вызванной клеточной смертью (см. фиг. 2).

Пример 3. Реакция клеток СЬЬ с делецией р53 на фородезин.

Клетки от 11 пациентов с СЬЕ с делецией 17р (д=>85% клеток, флуоресцентная гибридизация ίη δίΐιτ ΡΙ8Η) обрабатывали 2 мкМ фородезином + 20 мкМ бСио, 25 мкМ бендамустином или 1 мкг/мл флударабином в течение 48 ч. Результаты показали, что клетки СЬЕ с делецией р53 обладают высокой чувствительностью к фородезину (см. фиг. 3).

Пример 4. Эффект фородезина в случаях СЬЕ с химиотерапевтической устойчивостью.

Клетки от пациентов с СЬЕ, характеризовавшиеся низкой чувствительностью к бендамустину или флударабину, либо характеризовавшиеся отсутствием чувствительности, обработали 2 мкМ фородезином и 10-20 мкМ бСио. Результаты показали, что эти клетки хорошо реагируют на лечение фородезином (см. фиг. 4).

Пример 5. Эффект от комбинаций фородезин/бендамустин и фородезин/флударабин.

Клетки от пациентов с СЬЕ обрабатывали 2 мкМ фородезином + 10-20 мкМ бСио и 10-25 мкМ бендамустином или 3,75-7,5 мкМ флударабином в течение 48 ч. Затем, оценили комбинационный индекс (С1). Значение индекса ниже единицы говорит о синергичном эффекте (алгоритм Сйоит и Та1а1ау), в то время как превышающее единицу значение индекса свидетельствует об антагонистическом эффекте. Результаты показали, что комбинация фородезин/бендамустин характеризуется синергетическим эффек

- 8 018415 том, а комбинация фородезин/флударабин характеризуется антагонистическим эффектом (см. фиг. 5А и 5В).

Пример 6. Эффект от комбинации фородезин/ритуксимаб.

Клетки от 7 пациентов с СЬЬ (3 с высоким уровнем ΖΑΡ-70 (>35%) и 4 с делецией р53) обрабатывали 2 мкМ фородезин-НС1 + 10-20 мкМ бОио и 25-50 мкМ ритуксимабом в течение 24-48 ч. Через 48 ч оценили комбинационный индекс (С1). Клетки исследовали способом поточной цитометрии с окрашиванием Аппех1пУ-Е1ТС и тестом проницаемости ΡΙ. Значение индекса ниже единицы говорит о синергетическом эффекте (алгоритм Сйои и Та1а1ау), в то время как превышающее единицу значение индекса свидетельствует об антагонистическом эффекте. Результаты показали, что комбинация фородезин/ритуксимаб характеризуется синергетическим эффектом (см. фиг. 6).

Пример 7. Фородезин вызывает р53-независимый митохондриальный апоптоз.

Как описано в настоящем патенте, ингибитор фосфорилазы пуриновых нуклеозидов фородезин вызывает р53-независимый митохондриальный апоптоз в клетках хронической лимфоцитарной лейкемии путём отрицательной регуляции Мс1-1, а также индукции р73 и ΒΙΜ.

Хроническая лимфоцитарная лейкемия (СЬЬ) - это клиническое гетерогенное образование, происходящее от моноклональной экспансии долгоживущих СИ5+ В-лимфоцитов с аномальной регуляцией апоптоза и низкой скоростью пролиферации. Несмотря на недавние достижения, новые способы лечения СЬЬ в целом не улучшили выживаемость пациентов, и многие из последних, в конце концов, выработали устойчивость к препаратам. Немутированный профиль генов иммуноглобулина, высокий уровень экспрессии белка ΖΑΡ-70 и высокий уровень экпрессии С.П38. а также наличие определённых цитогенных аномалий (особенно делеции 17р13 (ТР53) и 11с|22-с|23 (АТМ)) связаны с худшей общей выживаемостью и быстрым прогрессированием заболевания у пациентов с СЬЬ. Химиотерапевтические противоопухолевые препараты вызывают апоптоз, как правило, либо в виде реакции на повреждение ДНК и последующей активации р53 и/или напрямую в результате расстройства митохондриальной функции. Путь ответа на повреждение ДНК, по-видимому, играет ключевую роль в вызываемом препаратом апоптозе клеток СЬЬ, в то время как клетки пациентов с СЬЬ с аномалиями ТР53 обладают устойчивостью к традиционной химиотерапии и характеризуются коротким сроком выживания. Потеря функции р53 в результате делеции и мутация оставшегося аллеля увеличивают устойчивость пациента с СЬЬ к химиотерапии, нанося своего рода двойной удар во время приобретения устойчивости за счёт выключения транскрипционной и митохондриальной апоптотической активности р53. Поэтому новые эффективные способы должны вызывать апоптоз с помощью независимых от повреждения ДНК путей и/или прямой активации апоптотических путей, независимых от р53.

Отличительной чертой клеток СЬЬ является их устойчивость к индукции апоптоза, причём белки семейства Вс1-2 являются критическими регуляторами апоптоза и выживания клеток СЬЬ. Высокий уровень антиапоптотических белков Вс1-2 Мс1-1 связан с агрессивностью заболевания и устойчивости к химиотерапии при СЬЬ. МСЬ-Ι также играет важную роль в продлении выживания клеток СЬЬ, так как уровень МСЬ-Ι обратно коррелирует с ίη νίίτο и клинической реакцией на многие препараты.

Фосфорилаза пуриновых нуклеозидов (ΡΝΡ) - это фермент пути реутилизации пуринов, фосфорилирующий аналоги пуринов с формированием соответствующих оснований и фосфата дезоксирибозы. Фородезин, или иммуциллин Н (ВСХ-1777), является эффективным аналоговым ингибитором переходного состояния ΡΝΡ, подавляющим пролиферацию Т-клеток ίη νίίτο и ίη νίνο (Βαηίία еί а1., Ιηί 1ттипорйагтасо1, 1(6), 1199-210 (2001); Кюкка еί а1., ΡΝΑ8, 98(8), 4593-4598 (2001); Вапба еί а1., !п( Iттиηοрйагтасо1, 3(6), 879-887 (2003); ОапбЫ еί а1., 8етт Опсо1, 34(6 8ирр1 5), 88-12 (2007)). Фородезин характеризуется низкотоксичным профилем (ОапбЫ еί а1., В1ооб, 106(13), 4253-4260 (2005); Когуска еί а1., М1Ы Вет Меб Сйет, 7(9), 976-983 (2007)) и изучается в клинических исследованиях с больными Т-клеточной пролимфоцитарной лейкемией, кожной Т-клеточной лимфомой и острой В-клеточной лимфобластной лейкемией (Оа1тапш еί а1., ГОтидк, 9(10), 712-722 (2006)). Также фородезин, судя по всему, оказывает ех νί\Ό цитотоксический эффект на клетки СЬЬ (Ва1акт18Йпап еί а1., В1ооб, 108(7), 2392-2398 (2006)). Ингибирование ΡΝΡ приводит к повышению уровня плазменного 2'-дезоксигуанозина (бОио) и последующему накоплению внутриклеточного дезоксигуанозин трифосфата (дГТФ) в клетках с высоким уровнем активности дезоксинуклеозид киназы, что вызывает индукцию апоптоза в Т-лимфоцитах. Клетки СЬЬ обладают высокой (бСК) активностью, притом что бСК является основным ферментом при преобразовании бОио в дГМФ, который затем фосфорилируется до дГТФ, делая клетки СЬЬ восприимчивыми к ингибированию ΡΝΡ. В отличие от других аналогов пуриновых нуклеозидов, как флударабин или бендамустин, фородезин не внедряется в ДНК и представляет собой новый класс селективных противоопухолевых агентов с ранее неизвестным и не изученным до конца механизмом действия. Как описано в настоящем патенте, произвели оценку цитотоксического эффекта фородезина в первичных лейкемических клетках, взятых от 43 пациентов с СЬЬ, а также цитотоксического эффекта ш уйго комбинации фородезина с препаратами, применяемыми в клинической практике, такими как флударабин, бендамустин и ритуксимаб. Основываясь на полученных результатах, можно заключить, что фородезин является весьма эффективным терапевтическим средством при лечении пациентов с СЬЬ вне зависимости от их статуса ΖΑΡ-70, СИ38 и р53, либо цитогенетических аномалий. Более того, фородезин вызывает активацию ми

- 9 018415 тохондриального апоптотического пути, понижая уровень белка Мс1-1 и индуцируя р73 и проапоптотический белок ΒΙΜ. Любопытно, что не обнаружено значительной разницы в уровне этих апоптотических маркеров, зависимой от статуса р53, что даёт основания предположить существование общего апоптотического пути независимого от р53-опосредованной клеточной смерти.

Апоптоз, вызываемый фородезином в первичных клетках, взятых от пациентов с СЬЬ, вне зависимости от статуса ΖΑΡ-70, СЭ38 и цитогенетического статуса.

Для оценки цитотоксичности фородезина ίη νίίτο в первичных лейкемических лимфоцитах пациентов с СЬЬ провели исследование с повышением дозы. Для цитотоксического эффекта получения ίη νίίτο вместе с фородезином добавили внешний источник бОио. Инкубация клеток СЬЬ с фармакологически доступным уровнем фородезина (2-5-10 мкМ) и повышаемыми дозами бОио (10-20 или 30 мкМ) в течение 48 ч вызвала гибель клеток (под контролем АппехшУ+окрашивающего вещества), в то время как фородезин или бОио поодиночке не проявили цитотоксический эффект. Повышение дозы фородезина (даже до 15 мкМ) не вызвало изменений интенсивности гибели клеток. В свою очередь, повышение дозы бОио привело к более выраженной индукции клеточной смерти, поэтому последующие исследования проводились с применением неизменной дозы фородезина (2 мкМ) вместе с 10 или 20 мкМ бОио.

Затем, оценили цитотоксический эффект фородезина и бОио в первичных лейкемических клетках, взятых от 43 пациентов с СЬЬ. Относительно контроля определили среднюю цитотоксичность, равную 44,2%±11,4 и 57,4%±13,1 через 24 и 48 ч соответственно. В 21 случае цитотоксический эффект превысил 60% (48,8% от общего количества образцов), 40-60% в 18 случаях (41,8% от общего количества образцов) и ниже 40% всего в 4 случаях (9,4% от общего количества образцов). Не обнаружено разницы в случае с криопрезервированными первичными образцами СЬЬ (п=32, 58,3%±11 через 48 ч) и свежими образцами СЬЬ (п=10, 56,6%±6,4 через 48 ч). Цитотоксичность 2 мкМ фородезина и бОио (10-20 мкМ) в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС), взятых от здоровых доноров, была относительно ниже по сравнению с цитотоксичностью в клетках СЬЬ как в Т-лимфоцитах (СИ3⁺ клетках), так и в В-лимфоцитах (СИ19⁺ клетках).

У пациентов с СЬЬ уровень экспрессии белка ΖΑΡ-70 и/или СИ38 связан с худшей общей выживаемостью и более кратким временем, необходимым для прогрессирования заболевания (Низ е! а1., Апп Опсо1, 17(4), 683-690 (2006)). Не обнаружено существенной разницы между вызванной фородезином гибелью клеток в случае СЬЬ с низким уровнем ΖΑΡ-70 (17 пациентов с СЬЬ; 58,1%±11 средней цитотоксичности относительно контроля) и СЬЬ с высоким уровнем ΖΑΡ-70 (22 пациентов с СЬЬ; 57,9%±12 средней цитотоксичности относительно контроля), ту же ситуацию наблюдали в отношении уровня экспрессии СИ38 (низкий СИ38 52,3%±12 и высокий С.П38 62,1%±12 средней цитотоксичности относительно контроля). Более того, наиболее часто встречающиеся цитогенетические нарушения клеток СЬЬ, как делеции 13ц. 11ц и 17р, связанные с устойчивостью к препаратам ш νίΙΐΌ и ш νί\Ό. а также короткой продолжительностью жизни пациентов с СЬЬ, не коррелировали с вызванной фородезином цитотоксичностью, поскольку хорошую реакцию на препарат наблюдали и в этих случаях.

Также сравнили цитотоксическую реакцию клеток СЬЬ, обработанных фородезином, с реакцией клеток, обработанных флударабином или бендамустином - двух основных химиотерапевтических агентов, применяемых при СЬЬ (АУабо е! а1., 8ешш Опсо1, 29, (4 8ирр1 13), 19-22 (2002); апб Мойзегга!, Неша!о1 1., 5, 8ирр1 1, 82-89 (2004)). Первичные клетки СЬЬ от 32 пациентов, 11 из которых несли делеции р53, 48 ч инкубировали с 2 мкМ фородезином и 20 мкМ бОио, 10-25 мкМ бендамустином и 1 мкг/мл флударабином поодиночке или в комбинации. При отдельном применении препаратов средняя цитотоксичность в клетках СЬЬ без делеции 17р составила 55,3±8, 50,6±11 и 49,2±18 для фородезина, флударабина и бендамустина соответственно. Делеция 17р, приводящая к альтерации р53, связана с ш νίΙΐΌ и ш νί\Ό устойчивости к флударабину у пациентов с СЬЬ (Лобпег е! а1., В1ооб, 85(6), 1580-1589 (1995); и ТигЩ.11 е! а1., Ьеик Ьушркоша, 48(2), 311-320 (2007)). Примечательно, что большая часть пациентов с СЬЬ с делецией 17р характеризовалась высокой чувствительностью к фородезину, со средней цитотоксичностью через 48 ч, равной 60,1%±21 (2 мкМ фородезин и 20 мкМ бОио). Напротив, чувствительность к флударабину и бендамустину в этих случаях была существенно ниже (средняя цитотоксичность 25,1±13) и (средняя цитотоксичность 36,2%±17) соответственно. Более того, в 12 из 32 образцов, взятых от пациентов с СЬЬ, ш νίΙΐΌ цитотоксическая реакция на 25 мкМ бендамустин и/или 1 мкг/мл флударабин не проявилась, либо была низкой (ниже 35% относительно контроля), в то время как клетки этих образцов показали высокую чувствительность к фородезину. Три случая с делецией 17р и отсутствием либо очень низкой чувствительностью к бендамустину или флударабину оказались высокочувствительными к фородезину (средняя цитотоксичность 67%+20), и лишь 2 пациента с СЬЬ показали слабую реакцию на фородезин.

Комбинации фородезина с флударабином, бендамустином и ритуксимабом.

Провели оценку лечебного эффекта комбинации флударабина с фородезином. Также оценили комбинацию фородезин с бендамустином - алкилирующим агентом и также пуриновым аналогом. Комбинации 2 мкМ фородезина и бОио (10-20 мкМ) с флударабином (0,5-1 мкг/мл) не усилили цитотоксический эффект по сравнению с таковым, проявляемым отдельными препаратами, напротив, наблюдался нега

- 10 018415 тивный эффект на индукцию клеточной гибели. Для оценки комбинационного эффекта этих двух препаратов с помощью алгоритма Сйои и Та1а1ау (Сйои е! а1., Αάν Епхутс К.еди1, 22, 27-55 (1984)) в качестве маркера антагонистического или синергичного эффекта вычислили комбинационный индекс (С1). Вкратце, значение С1 выше 1 является показателем антагонистического эффекта, а значение С1 ниже 1 говорит о синергетическом эффекте. Комбинационные исследования, проведённые с флударабином и фородезином, дали значения С1, превышающие 1, во всех исследованных образцах СЬЬ (48 ч), свидетельствуя об антагонистическом эффекте, проявляемом этими препаратами. Средняя цитотоксичность, вызванная комбинацией фородезина и флударабина, оказалась ниже таковой каждого отдельного препарата. Фородезин был эффективным также в отношении СЬЬ с низкой чувствительностью к бендамустину, но, в отличие от флударабина, в случае с комбинацией бендамустина и фородезина наблюдали сильное повышение уровня клеточной гибели и сильный синергичный эффект (С1<1). Очевидно, что фородезин усиливает цитотоксический эффект малых доз бендамустина (10 мкМ, средняя цитотоксичность 32,95%), достигая средней цитотоксичности комбинации этих препаратов, равной 70,5%.

Также оценили комбинацию фородезина и ритуксимаба, гуманизированного моноклонального антитела, специфичного к СЭ20. Через 24 ч уровень клеточной гибели при лечении только ритуксимабом (25-50 мкг/мл) был низким, а комбинирование с фородезином явно усилило цитотоксический эффект обоих препаратов. Ритуксимаб и фородезин показали выраженный синергичный эффект со значением С1, близким 0,5.

Взаимосвязь между повышением уровня внутриклеточного дГТФ и фосфорилированием 6СК по Сер-74 с вызванной фородезином смертью клеток.

Произвели оценку уровня внутриклеточного дГТФ в первичных клетках, взятых от 26 пациентов с СЬЬ, которым ввели 2 мкМ фородезина и 10 мкМ бСио. Обнаружили значительную прямую корреляцию (р<0,05) между кратным увеличением уровня дГТФ, обнаруженным через 18 ч, и вызванной фородезином цитотоксичностью, выявленной через 48 ч.

Фородезин вызвал резкое повышение уровня внутриклеточного дГТФ (увеличение почти в 96 раз по сравнению с контрольным базовым уровнем, достигая значений 6-129 пмоль дГТФ/10⁶ миллионов клеток). В четырёх случаях повышения уровня дГТФ обнаружено не было либо оно было незначительным, в этих случаях цитотоксическая реакция на фородезин была незначительной. Чтобы подтвердить, что повышение уровня дГТФ после обработки фородезином было вызвано фосфорилированием бСио ферментом ЙСК. исследовали индукцию клеточной гибели в присутствии дезоксицитидина. Будучи основным субстратом 6СК, дезоксицитидин должен ингибировать фосфорилирование бСио белком 6СК, подавляя повышения уровня внутриклеточного дГТФ и последующий вызванный фородезином апоптоз. Преинкубация клеток с дезоксицитидином (5-10 мкМ) ингибировала вызываемую фородезином смерть клеток. Некоторые аналоги нуклеозидов, применяемые в противоопухолевой терапии, в частности аналог пуринов флударабин и аналог дезоксицитидина гемцитабин, должны фосфорилироваться ферментом 6СК, чтобы перейти в активную форму. Дезоксицитидин также устранял потерю клеточной жизнеспособности, вызванную флударабином, в то время как эффект в отношении клеточной гибели, индуцируемой бендамустином (препарат, который может действовать независимо 6СК), не наблюдали.

Статус фосфорилирования 6СК проконтролировали с помощью Вестерн-блоттинга после обработки фородезином, так как согласно недавним исследованиям активность 6СК в клетках СЬЬ положительно регулируется фосфорилированием по Сер-74 (8та1 е! а1., 1. Вю1. Сйет., 281 (8), 4887-4893 (2006); 8та1 е! а1., Хис1ео81бе8 Хис1ео!1бек Хис1ею Ас1бк, 25(9-11), 1141-1146 (2006); 8та1 е! а1., Сапсег Ье!!, 253(1), 68-73(2007)). Обнаружили повышение уровня фосфорилированной формы (по Сер-74) 6СК в клетках СЬЬ, которое не было вызвано бендамустином. Денситометрический анализ отношения фосфо6СК/6СК после лечения фородезином показал взаимосвязь с цитотоксичностью как через 24 (р=0,05, дополнительные данные), так и через 48 ч (р=0,05). Для исследования антагонистического эффекта между флударабином и фородезином произвели наблюдения повышения уровня внутриклеточного дГТФ после инкубации клеток СЬЬ с флударабином (1 мкг/мл) и фородезином (2 мкМ и бСио 10 мкМ). Флударабин в одиночку не вызвал повышения уровня дГТФ, в то время как комбинация флударабина с фородезином (серые полоски) ослабило кратное повышение уровня дГТФ по сравнению с наблюдаемым в случае с одним фородезином (чёрные полоски). Поэтому ослабление повышения уровня дГТФ, наблюдаемое с комбинацией флударабина и фородезина, может объяснить антагонистический эффект, проявляемый комбинацией этих двух препаратов. Так как флударабин должен быть фосфорилирован 6СК, чтобы стать активным, и бСио также фосфорилируется этим ферментом, оба вещества конкурируют за фермент, а поэтому формирование дГТФ или активной формы флударабина замедляется.

Фородезин запустил митохондриальный путь апоптоза, независимый от р53.

Для выявления механизма индукции фородезином апоптоза в клетках СЬЬ исследовали различные отличительные характеристики митохондриального апоптотического пути. Фородезин вызвал понижение митохондриального трансмембранного потенциала (Δ'1'т) на ранних стадиях. После повреждения митохондрий возможна выработка активных форм кислорода, которые впоследствии могут опосредовать апоптоз (УШатог е! а1., Сигг Рйагт Эек, 10(8), 841-853 (2004)). Фородезин также вызвал выработку активных форм кислорода в первичных клетках СЬЬ. Деполяризация митохондрий и выработка активных

- 11 018415 форм кислорода были ранними явлениями, так как проявились уже через 10 ч после обработки фородезином. Так как окислительный стресс играет роль в регуляции программируемой клеточной смерти, проанализировали эффект различных реутилизаторов активных форм кислорода. Предварительная инкубация клеток СЬЬ с восстановленным глутатионом (С8Н), Ν-ацетил цистеином (ΝΑΟ) или Τίτοη уменьшили понижение А'Еш и выработку активных форм кислорода, вызванные фородезином. ΝΑΟ и Τίτοη (специфичные реутилизаторы О₂) практически подавили выработку активных форм кислорода, в то время как эффект глутатиона, селективного к Н₂О₂, был менее выраженным.

По результатам предыдущих исследований в клетках СЬЬ ίη νίΐτο, фородезин приводит к стабилизации р53 и запуску апоптоза (Ва1акг15Йпап с1 а1., Βίοοά, 108(7), 2392-2398 (2006)), что согласуется с действием других противоопухолевых препаратов, вызывающих повреждение ДНК и р53-опосредованный апоптоз. Однако в отличие от других аналогов пуриновых нуклеозидов фородезин не внедряется в ДНК. Что примечательно, ранние признаки исследуемого митохондриального апоптотического пути также наблюдали у пациентов с СЬЬ с делециями 17р (р53) или 11д (ΑΤΜ), свидетельствуя о наличии механизма запуска апоптоза, независимого от р53-опосредованной реакции на повреждение ДНК.

Фородезин запустил механизм цепной активации каспазы-9 и -8 и процессинг ΒΙΌ, что предполагает его роль в амплификационном цикле митохондриального апоптотического пути, опосредованного каспазой-8.

Для анализа нижерасположенных сигнальных путей, ведущих к митохондриальному апоптозу, исследовали схему активации каспаз после обработки фородезином. Зависимую от дозы и времени активацию каспазы-9, -8 и -3 наблюдали и проанализировали путём процессинга их проактивных форм. Продукты расщепления каспазы-9 и -8 появились практически одновременно, уже через 10 ч после обработки фородезином. Сначала появилась расщеплённая форма про-каспазы-9, р37, а затем повысился уровень расщеплённой формы каспазы-8 - р43/41. Позже, обнаружили активный продукт расщепления прокаспазы-3. В корреляции с активацией каспазы-8 фородезин также вызвал понижение уровня ВН3-белка ΒΙΌ, являющегося основным субстратом каспазы-8, с возникновением его расщеплённой проапоптотической формы, также активирующей митохондриальный апоптотический путь. Также обнаружили понижение уровня ингибиторов апоптоза ΧΙΑΡ и сюрвивина и протеолитическое расщепление белка репарации ΡΑΚΡ - субстрата каспазы-3, что тоже связано с запуском апоптоза. Затем, исследовали роль активации каспаз в вызываемом фородезином апоптозе, так как активация митохондриального апоптотического пути приводит как к зависимой от каспаз, так и независимой от них клеточной гибели. Обработка клеток ингибитором каспаз широкого спектра ζ-νΑΌ.ΓιηΕ частично понизила воздействие фосфатидилсерина через 24 ч после обработки фородезином, предполагая роль как зависимых от каспаз, так и независимых от них механизмов действия.

Активация каспазы-8/ΒΙΌ может играть ключевую роль во время запуска апоптоза фородезина, либо быть вторичным побочным эффектом, вызванным активацией каспазы-9, и потому следовать за митохондриальными процессами. Любопытно, что запуск апоптоза, контролируемый окрашиванием АппехшУ, частично блокировался специфичным ингибитором каспазы-8 белком ζ-ΕΕΤΌ.ΓιηΕ, в то время как обнаруженное обращение понижения А'Еш было выражено сильнее. В совокупности, эти результаты говорят о том, что активация каспазы-8 и ΒΙΌ играют роль в ранней амплификации в процессе митохондриального апоптотического пути, запускаемого фородезином.

Анализ проапоптотических и антиапоптотических регуляторов опосредованной митохондриями клеточной гибели.

Митохондриальный путь апоптоза регулируется с помощью плотного баланса между про- и антиапоптотическими членами семейства белков ΒΟΕ-2, такими как антиапоптотические белки ΒΟΕ-2 и МСЬ-Ι, и проапоптотические белки ΒΑΧ, ΒΑΚ, ΒΙΌ и ΒΙΜ, среди всех прочих. Клетки СЬЬ вырабатывают высокие уровни антиапоптотических белков МСЬ-Ι и ΒίΈ-Σ, что обратно коррелирует с ίη νίΐτο и клинической реакцией на химиотерапию. Исследовали эффект инкубации с фородезином на уровень этих антиапоптотических белков. После обработки фородезином уровень антиапоптотического белка МСЬ-Ι существенно снизился, в то время как уровень белка Βί.Έ-2 не изменился. Для индукции апоптоза ΒН3-белок ΒΙΜ взаимодействует с Βί.Έ-2 и другими антиапоптотическими белками семейства Βί.Έ-2. Фородезин вызвал повышение уровня проапоптотического белка ΒΙΜ. Денситометрический анализ семи пациентов с СЬЬ, подвергнутых лечению фородезином, подтвердил изменения в уровне белков ΒΙΜ и МСЬ-Ι. Между повышением уровня проапоптотического белка ΒΙΜ ЕЬ или понижением уровня ΜΕΈ-Ι и цитотоксической реакцией на фородезин обнаружили прямую взаимосвязь, значимую в случае с понижением Μί.Έ-Ι (р=0,04). Кроме того, когда составили график (относительно контроля) соотношения понижения Μί.Έ-Ι и индукции ΒΙΜ ЕЬ; и цитотоксичности, наблюдаемых после лечения фородезином, была выявлена существенная корреляция (р=0,04).

Βί.Έ-2 и Μί.Έ-Ι защищают митохондриальную мембрану, сохраняя её целостность от действия эффекторных проапоптотических белков, как ΒΑΧ и ΒΑΚ. ΒΙΜ и расщеплённый ΒΙΌ являются единственными ΒН3-белками, способными активировать ΒΑΧ и ΒΑΚ напрямую. Поточной цитометрией исследовали активацию ΒΑΧ и ΒΑΚ после инкубации СЬЬ клеток с фородезином. Фородезин вызвал конформа

- 12 018415 ционные изменения ВАХ и ВАК, позволившие этим белкам внедриться в наружную митохондриальную мембрану, её олигомеризацию, последующую индукцию повышения проницаемости митохондриальной мембраны и активацию аппарата клеточной смерти.

Лечение фородезином вызвало повышение уровня иРНК и белка р73, а также индукцию РОХО1 и РОХО3А.

Несмотря на то что фородезин проявил цитотоксический эффект во всех случаях СЬЬ вне зависимости от статуса р53, фородезин смог индуцировать стабилизацию белка р53 в случаях СЬЬ, не несущих делецию 17р. Индукция белка ТАр73, родственного р53 и необходимого для р53-опосредованного апоптоза, может преодолеть устойчивость р53-дефицитных клеток СЬЬ к апоптозу (И1скег е! а1., В1ооб, 108(10), 3450-3457 (2006)). Лечение фородезином вызвало чёткую повышающую регуляцию уровня иРНК р73 и белка Тар73 во всех исследованных случаях. р73 регулирует индукцию проапоптотического белка В1М путём повышающей регуляции факторов транскрипции РОХО1 и РОХО3а в опухолевых клетках частично р53-зависимым, но также и р53-независимым способом (Ашт е! а1., Сапсег Кек, 67(12), 5617-5621 (2007)), хоть механизм индукции РОХО пока неизвестен. Оценили уровень РОХО1 и РОХО3а в клетках СЬЬ, обработанных фородезином. Фородезин вызвал повышение уровня обоих белков РОХО1 и РОХО3а, в корреляции с повышением уровня белков в р73 и В1М.

Материалы и способы

Препараты и химические вещества.

Фородезин (ВСХ-1777/иммуциллин Н) для лабораторного применения предоставили ВюСгук! ΡНа^тасеиΐ^са1к 1пс. (ВиттдНат, И8А), дезоксигуанозин (бСио) приобрели у 81дта. дНТФы и [³Н] дАТФ для количественного анализа дезоксигуанозин трифосфата (дГТФ) приобрели у Атегкйат Вюкаепсек. Флударабин (8Негтд, Вегйи, Сегтапу), бендамустина гидрохлорид (Тгеапба™, предоставленный СерНа1оп, 1пс., Ргахег, ΡΑ), ритуксимаб (Косйе, Ваке1, 8\\'Цхег1апб) и 2'-дезоксицитидин (81дта) применили в процедурах определения цитотоксичности.

Изоляция и культивация первичных клеток СЬЬ и мононуклеарных клеток периферической крови, взятых у здоровых доноров.

Настоящее т νίΙΐΌ исследование проводилось в первичных лейкемических лимфоцитах, взятых у 43 пациентов с диагностированной СЬЬ, согласно классификации Всемирной организации здравоохранения. От каждого пациента получили осознанное согласие.

Мононуклеарные клетки периферической крови (ГВМСк) изолировали седиментацией Р1со11/Нурас.|ие (8еготеб, Вегйп, Сегтапу). Клетки либо использовали сразу, либо криопрезервировали в жидком азоте в присутствии 10% диметилсульфоксида и 90% инактивированной нагреванием фетальной коровьей сыворотки (ФКС, С1Ьсо Гайку, 8со11апб, ИК). После разморозки мононуклеарные клетки, взятые у пациентов с СЬЬ (2х10⁶ клеток/мл), культивировали в питательной среде ΚΡΜΙ 1640 (С1Ьсо), добавив 10% ФКС, 2 мМ глутамин и 50 мкг/мл пенициллин-стрептомицин, в увлажнённой атмосфере при 37°С, содержащей 5% углекислого газа. Процентное количество опухолевых клеток (СЭ19⁺, СЭ5⁺), уровень экспрессии ΖΑΡ-70 и СЭ38 определили с помощью поточной цитометрии и провели количественный анализ, как описано ранее (Сгекро е! а1., Ν Епд1. 1. Меб., 348(18), 1764-1775 (2003)). Предельная точка для высокого уровня экспрессии ΖΑΡ-70 была >20%, а для СЭ38 >30% (Ник е! а1., Апп Опсо1, 17(4), 683-690 (2006)). Все образцы СЬЬ, использованные в данном исследовании, содержали более чем 95% опухолевых клеток. Цитогенетические изменения оценили флуоресцентной ш кйи гибридизацией (Р18Н) с применением многозондового коммерческого набора от Уук1к (Ио^пегк Сгоуе, 1Ь), содержащего локусспецифические зонды для выявления делеций 17р13.1 (р53), 11д22.3 (АТМ) и 13д14.3 (Ό138319), а также центромерный зонд для выявления трисомии 12. Мутации гена р53 являются обычно миссенс мутациями, и мутированный белок характеризуется пролонгированным временем полужизни, позволяющим выявить его Вестерн-блоттингом. Кроме того, наличие мутаций р53 подтвердили прямым секвенированием согласно базе данных 1АКС ТР53 Международного агентства исследования рака.

Индукция (запуск) апоптоза.

Клетки инкубировали в течение разных временных интервалов с разными дозами фородезина от 1 до 12 мкМ в присутствии или в отсутствие 10-20-30 мкМ дезоксигуанозина (бСио). При необходимости, клетки преинкубировали в течение 1 ч с 80 мкМ панкаспазным ингибитором ζ-УАЬ.Гтк (бензилоксикарбонил-Вал-Ала-Асп-фтор-метилкетон; ВасНет, ВиЬепбогГ, 8^11хег1апб), 50 мкМ ингибитором каспазы-8 /-ШТЬ.Ппк ^-Иле-Глу(оксиметил)Тре-ЭЬ-Асп(оксиметил)-фторметилкетон, ВасНет), 2'дезоксицитидином (5-10-20 мкМ, 81дта), Ν-ацетил-Ь-цистеином (ЫАС, 25 мМ), Т1гоп (5 мМ, 4,5дигидрокси-1,3-бензол-дисульфоновой кислотой, 81дта) или восстановленным глутатионом (С8Н, 2 мМ; 81дта). Для комбинационных исследований клетки предварительно обрабатывали 4, 12 или 24 ч флударабином или бендамустином либо 1 ч моноклональным анти-СЭ20 антителом ритуксимабом до добавления фородезина (2 мкМ) плюс бСио (10-20 мкМ). Жизнеспособность клеток и запуск апоптоза оценивали, исследуя сложность клеток с помощью проточной цитометрии (Р8С/88С), количественный анализ воздействия фосфатидил серина (Ρ8) - с помощью двойного окрашивания АппехтУ, конъюгированного с изотиоцианатом флуоресцеина (Р1ТС) и иодидом пропидия (ΡΙ) (ВепбегМебкуйетк, У1еппа, Аикйга).

- 13 018415

Для исследования апоптоза в популяциях СЭ3' и СЭ19' мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) пометили одновременно анти-СЭ3-Р1ТС (1ттипо1сс11. МагкеШе, Ргапсе), анти-СП^-ГЕ (ВесЮп ΌίοΕίηδοη) и Αηικχίην-ΑΡΟ Графики жизнеспособности и цитотоксичности создали в виде процентного соотношения с контрольными клетками. Снижение митохондриального трансмембранного потенциала (А'Рт) оценили окрашиванием клеток 20 нМ ОГОЮС₆ (3,3-диэтилоксакарбоцианина иодид, Мо1еси1аг ВтоРек), а выработка активных форм кислорода определили окрашиванием клеток 2 мкМ дигидроэтидином (ΌΗΕ; Мо1еси1аг ЕтоРек) и поточной цитометрией. Происходящую благодаря конформационным изменениям активацию проапоптотических белков ВАХ и ВАК определили иммуноцитометрией, мечением клеток антителами, обладающими сродством к ХН₂-концу белков ВАХ и ВАК, как описано ранее (Ве11окШо е1 а1., В1ооб, 100(5), 1810-1816 (2002)). В базовых условиях этот участок закрыт (заблокирован) и недоступен для присоединения антител, специфичных к эпитопу ХН₂-конца. После апоптотического стимула конформационные изменения в данных белках высвобождают ХН₂-конец и гидрофобный СООН-конец, нацеленный на митохондрии, играя важную роль в индукции аппарата клеточной гибели, опосредованного митохондриями. Вкратце, клетки один раз промыли поли(бутен-1-сульфоном) (?В8) и зафиксировали в 4% параформальдегиде, проницаемость мембраны увеличили 0,1% сапонином и 0,5% коровьим сывороточным альбумином (КСА). Клетки окрасили 1 мкг/мл первичными антителами, специфичными к антителам против конформационно активного ВАК (Опсодепе ЯекеатсЬ) или ВАХ (клон 6А7, ВЭ ΡЬа^т^ηдеη) при комнатной температуре. После нескольких промываний в пермеабилизационном (улучшающем проницаемость) буфере клетки инкубировали с вторичным козьим антимышиным Р1ТС (ЭАКО) или козьим антикроличьим Р1ТС (8ирейесЬ8) антителом и вновь промыли пермеабилизационным буфером. Затем, десять тысяч окрашенных клеток каждого образца исследовали поточной цитометрией.

Измерение уровня внутриклеточного дГТФ.

15х10⁶ первичных клеток СЬЬ инкубировали с или без фородезина (2 мкМ) и бСио (10 мкМ) или флударабином (1 мкг/мл) в течение 18 ч, затем нуклеотиды подвергли экстракцией 60% метанолом. Количественный анализ внутриклеточного дГТФ провели с помощью ДНК полимеразной процедуры, модифицированной 8Ьегтап и РуГе (8Ьегтап е1 а1., Апа1 ВюсЬет, 180(2), 222-226 (1989)). Данные представили как кратное увеличение уровня внутриклеточного дГТФ относительно контрольных клеток. В то же время через 24 и 48 ч оценили жизнеспособность клеток.

Иммуноблоттинг.

Клетки разрушали 15 мин в буфере ИРА (150 мМ хлорида натрия, 1% Нонидета П40 |№шбе1 Ρ40], 0,5% дезоксихолата, 0,1% додецилсульфата натрия, 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0), добавив протеазу и ингибиторы фосфатазы (10 мкг/мл леупептин, 10 мкг/мл апопротинин (арортойшпе), 1 мкМ фенилметилсульфонилфторид (?М8Р), 1 мкМ ортованадат натрия, 1 мкМ ΝηΡ, 2 мкМ натрия пирофосфат декагидрат (81дта)). Совокупные клеточные белки разделили с помощью СДС-ПАГЭ в восстановительной среде и перенесли на мембраны Иммобилона-Р (М1Шроте). Для выявления белка мембраны зондировали следующими первичными антителами: анти-В1М, анти-ВАК (АЫ), анти-каспаза-8 (АР-3), анти-р53 (АР-2) (Са1РюсЬет); анти-ВЮ, анти-каспаза-9, анти-РОХО1 и анти-ΧΙΛΡ (Се11 81дпа1тд ТесЬпо1од1е8); антиВСЬ-2, анти-бСК, анти-Мс1-1 (8-19) и анти-р73 (клон 5В429) (8ап1а Сгих Вю1есЬпо1оду); анти-ΡАΚΡ (ИосЬе); анти-каспаза-3 и анти-ВАХ (с1опе 6А7) (В^-ΡЬа^т^ηдеη); анти-сюрвивин (АРеат); анти-в-актин и анти-а-тубулин (81дта) и анти-РохО3А (ирк1а1е). Кроличья анти-фосфо-бСК (Сер79) и кроличья антибСК были любезно предоставлены Сатойпе 8та1 апб Ртапсо18е ВогИетрк (ипВеткйе Са11юНс|ие бе Ьо^а1п, Ве1дшт). После инкубации с соответствующим первичным антителом с помощью реагентов усиленной хемолюминесценции (ЕСЬ) (Йетсе) получили блоты с меченными пероксидазой хрена (ΗΚΡ) антимышиными (81дта), антикроличьими (81дта) или антикозьими (Эако) антителами. Каждую зарядку белком подтвердили выявлением экспрессии β-актина или α-тубулина, а относительный количественный анализ белка провели с помощью программного обеспечения 1таде Саиде Ри)Ш1т (Рир).

Количественный анализ иРНК с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени.

Совокупную РНК выделили из 10⁷ клеток с помощью реагента ТВЕОЬ (^йтодеп, Саг1кРаб, СА) в соответствии с инструкциями производителя. Затем, 1 мкг совокупной РНК обратно транскрибировали в кДНК, используя произвольные праймеры и обратную транскриптазу М-МЬ-ν (1птПгодеп). Уровень экспрессии р73 и Мс1-1 определили с помощью системы обнаружения последовательности АВ1 Ρπκιη 7900НТ (АррЬеб ВюкукШпк, Рок1ег Сйу, СА) и стандартного набора Аккау-оп-бетапб (АррЬеб Вюкук1ет8). Количественный анализ относительной экспрессии каждого гена провели по методу ААСЬ используя глюкуронидазу (СИ8) в качестве эндогенного контроля. Уровни экспрессии иРНК задали как произвольные количественные единицы ПЦР, в каждом случае используя контрольный (необработанный) образец для калибровки.

- 14 018415

Статистический анализ.

Данные представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение (8Ό) трёх независимых экспериментов. Все статистические анализы провели с применением программного обеспечения Сгаркраб Ρπκιη 3.0 (Сгар№аб 8оП\\аге 1пс., 8ап П1едо, СА). Оценку различий между двумя группами образцов проводили с применением непараметрического критерия Манна-Уитни, а коэффициенты корреляции получали с помощью теста Спирмана. Результаты считали статистически значимыми, когда значение р<0,05 (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,0001). Для оценки комбинационного эффекта двух различных препаратов оценивали значение комбинационного индекса (С1), вычисляемого по алгоритму Скои и Та1а1ау (Са1сикуп кой^аге ν2.0, Вюкой, СатЬпбде, иК) (Скои е1 а1., Α6ν Епхуте Кеди1, 22, 27-55 (1984)). Данное значение С1 является показательным маркером, является ли комбинационный эффект для двух различных препаратов антагонистическим или синергетическим эффектом. Взаимодействие двух препаратов считалось синергетическим, если значение С1 было ниже 1, аддитивным, если оно было равно 1, и антагонистическим, если значение С1 превышало 1.

В данном изобретении описан ряд вариантов реализации согласно изобретению. Тем не менее, необходимо иметь в виду, что можно разработать различные модификации данного патента, принципиально не отходя от объёма и сущности изобретения. С учётом этого другие варианты реализации входят в объём нижеперечисленных пунктов. Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в данном изобретении, включены в настоящее описание посредством ссылки.

Claims (14)

1. Способ лечения гематологического злокачественного новообразования у субъекта, включающий следующие этапы:

(a) введение указанному субъекту эффективного количества ингибитора фосфорилазы пуриновых нуклеозидов (ΡΝΡ) и (b) введение указанному субъекту эффективного количества анти-СЭ20 агента.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный ингибитор ΡΝΡ представляет собой фородезин.

3. Способ по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что указанный анти-СЭ20 агент представляет собой ритуксимаб.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанные ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент вводят одновременно.

5. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанные ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент вводят последовательно.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанный анти-СЭ20 агент вводят один или несколько раз до введения ингибитора ΡΝΡ.

7. Фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент.

8. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что указанный ингибитор ΡΝΡ представляет собой фородезин.

9. Композиция по п.7, содержащая фородезин и ритуксимаб.

10. Набор, включающий ингибитор ΡΝΡ и анти-СЭ20 агент.

11. Набор по п.10, дополнительно включающий систему доставки ингибитора ΡΝΡ, анти-СЭ20 агента или их комбинацию.

12. Набор по п.10 или 11, дополнительно включающий инструкции по лечению субъекта.

13. Набор по любому из пп.10-12, отличающийся тем, что указанный ингибитор ΡΝΡ представляет собой фородезин.

14. Набор по любому из пп.10-13, включающий фородезин и ритуксимаб.