CN103735513B - 一种20(s)-原人参二醇纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种20(s)-原人参二醇纳米粒及其制备方法。其处方组成：20(s)-原人参二醇与稳定剂的组合比例为1∶0.05～50。本发明通过处方优化，筛选出人血清白蛋白(HSA)为最佳稳定剂，超声-沉淀联合法为最佳方法。制备的20(s)-原人参二醇纳米粒载药量高，性质稳定，处方组成简单，制备工艺简便可行，粒径范围为30-600nm；通过制备纳米粒，能明显促进20(s)-原人参二醇的溶出，提高其口服生物利用度，提高抗肿瘤活性。此外，可将20(s)-原人参二醇纳米粒进行冷冻干燥，所得的冻干粉加入适当赋形剂进一步制备口服液、片剂、颗粒剂、胶囊剂等不同剂型，还可制备成注射液供皮下、肌肉或静脉给药，以便于临床应用。

Description

一种20(s)-原人参二醇纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种20(s)-原人参二醇纳米粒、制备方法及应用。

背景技术

20(s)-原人参二醇(20(S)-protopanaxadiol(PPD))是从中药人参中提取出的一种皂苷元，水溶性差。在抗肿瘤方面，国内外研究报道，20(S)一原人参二醇具有良好的抗肿瘤活性，它对肝癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌、胃癌及黑色素瘤B16细胞株、白血病等均有明显的生长抑制作用，且能增强机体免疫力，可以作为肿瘤辅助治疗药物，在神经系统方面，PPD可以抗癫痫、抗抑郁、增强学习能力等。

水溶性差，口服生物利用度低，很大程度上限制了它的临床应用及疗效的发挥，有关20(s)-原人参二醇的制剂目前较多，载药量较低如药质体(韩美华.中国中药杂志.2010，35(7)：842；韩美华.中国新药杂志，2010，19(10)：888-890)；脂质体(公开专利号CN1850098A)等，非纳米制剂如固体分散体(公开专利号CN1879647A)；干混悬剂(公开专利号CN102631322A)；油溶液或乳剂(HanMH，etal.AnalytiealSei.2010，26：749-751)；β-环糊精包合物(公开专利号CN102178956A；HanMH，etal.JournalofAnalyticalchemistry，2013，68(8)：1-6)；注射剂(公开专利号CN1526407A，CN1850099A，CN1615901A)等，对肿瘤的靶向性较差。

纳米粒是将药物直接制备成纳米大小的微粒，并借助于稳定剂对其进行稳定而得到的给药系统，药物粒径小、比表面积大，载药量高，制备工艺简单，制备方法多样，生产过程简单，适用范围广，几乎适用于所有的水难溶性药物。纳米粒作为一种中间制剂可与传统制剂相结合以满足不同的需要。如，可以直接以液体混悬剂形式口服，也可以通过冷冻干燥技术将其转变为固体形式，制成片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂等，以方便服用和运输。因此，纳米粒是难溶性药物的理想剂型之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备方法简便、载药量高、制剂稳定性高，能显著增加20(s)-原人参二醇的生物利用度及体内外抗肿瘤活性的纳米粒。

一种20(s)-原人参二醇纳米粒由20(s)-原人参二醇和稳定剂组成，20(s)-原人参二醇与稳定剂的质量比为1∶0.05～50。

一种20(s)-原人参二醇纳米粒，选用的稳定剂为羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚维酮(PVP)、胆酸钠、泊洛沙姆188(P188)、吐温-80(Tween-80)、聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、胆固醇-PEG(500、1000、2000、5000)、聚乙二醇聚乳酸共聚物(PEG-PCL)、聚乙二醇聚己内酯共聚物(PEG-PLA)、聚乙二醇聚乳酸乙醇酸共聚物(PEG-PLGA)嵌段共聚物、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)中的一种或几种。

本发明目的之二在于提供一种20(s)-原人参二醇纳米粒制备方法，本发明采用的是超声法、沉淀法、研磨法、喷雾干燥法等制备纳米粒，技术方案如下：

(1)20(s)-原人参二醇原料药(或20(s)-原人参二醇和稳定剂)溶于有机溶剂中；

(2)超声或搅拌条件下将药物(或20(s)-原人参二醇和稳定剂)的有机溶剂滴加到含有稳定剂的水溶液(或水)中(或研磨或高压均质)；

(3)减压除去有机溶剂；

(4)加入冻干保护剂或直接冷冻干燥或喷雾干燥制成稳定的纳米粒粉。

上述制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮中的一种或两种或两种以上的混合液，药物在有机溶剂中的浓度为0.01％～1％(w／v)；步骤(2)分散介质中稳定剂的浓度为0.1％～5％(w／v)；步骤(3)中有机溶剂的浓度为1％～20％(v／v)；步骤(4)中支架剂为海藻糖、麦芽糖、甘露醇中的一种或其任意混合，浓度为0.5％～20％(w／v)。最优处方为0.5％20(s)-原人参二醇、稳定剂为0.25％白蛋白和0.25％聚维酮、10％有机溶剂、0.5％冻干保护剂。

本发明的20(s)-原人参二醇纳米粒的平均粒径范围为30-600nm。

本发明的20(s)-原人参二醇纳米粒可以通过冷冻干燥或喷雾干燥进一步固化。

20(s)-原人参二醇纳米粒在口服给药制剂中的应用包括口服纳米粒和冻干粉。

本发明的优点在于

所述纳米粒的给药方式可以是口服、注射或外用给药，所得纳米粒冻干粉加入适当赋形剂进一步制备口服液、片剂、颗粒剂、胶囊剂等不同剂型，还可制备成注射液供皮下、肌肉或静脉给药。

20(s)-原人参二醇难溶于水，口服生物利用度很低，制成纳米粒后，能明显促进20(s)-原人参二醇的溶出，提高其口服生物利用度及体内外抗肿瘤活性。

附图说明

图1为实施例1中20(s)-原人参二醇纳米粒的扫描电镜照片(×25,000)

图2为实施例1中DSC图谱(a：20(s)-原人参二醇纳米粒b：原药c：白蛋白d：物理混合)

图3为实施例1中X-衍射图谱(a：20(s)-原人参二醇纳米粒b：物理混合c：原药d：白蛋白)

图4为实施例9中20(s)-原人参二醇体外释放曲线

图5为实施例10中20(s)-原人参二醇纳米粒对细胞HepG2的毒性

图6为实施例11中大鼠口服和静脉注射纳米粒后的血药浓度与时间变化的关系曲线(n＝5)

图7为实施例12中静脉注射纳米粒后小鼠体重的变化(n＝5)

具体实施方式

下面将描述本发明的几个实施例，但本发明的内容完全不局限于此。

实施例1

精密称取人血清白蛋白200mg置于烧杯中加20mL的水溶解，再精密称取PPD200mg置于西林瓶中加4mL丙酮溶解。在25℃、250W超声、浆搅拌(300rpm)的条件下，将PPD的丙酮溶液缓慢滴入水中，滴加完50℃旋蒸去丙酮即得PPD纳米混悬剂，平均粒径为220nm(图1)。

取用PPD纳米粒冻干粉，稀释至一定的倍数，滴至专用铜网上，自然干燥后，再滴加1％磷钨酸溶液(w／v)染色15-20min，用滤纸吸干溶液，放入透射电镜下观察纳米粒的形态，如图1所示。

本发明PPD纳米粒冻干样品DSC扫描图谱如图2所示，扫描参数：以氧化铝盘为参比，氮气为载气，升温速度：10℃／min，在30～200℃范围内进行测定。

X-粉末射线衍射图谱见图3，采用Cu靶，管压40KV，管流40MA，扫描速度为10℃／min，扫描范围为3～40℃，步长0.02°。结果可知PPD纳米粒中药物以无定形态晶体形式存在。

实施例2

精密称取人血清白蛋白200mg置于烧杯中加20mL的水溶解，再精密称取PPD200mg置于西林瓶中加4mL丙酮溶解。将PPD的丙酮溶液快速注入水中后50℃旋蒸去丙酮，将所得的溶液置于高压匀质机中，常温2000bar循环3次，即得PPD纳米混悬剂，平均粒径为400nm。

实施例3

精密称取200mgPPD分散在20mL的含有200mg人血清白蛋白的水溶液中，混合均匀后，放入递质碾磨的研罐中，加入50g氧化锆研磨珠，0℃以300rpm研磨60min，即得PPD纳米混悬剂，平均粒径为1μm左右。

实施例4

精密称取PPD200mg置于100mL锥形瓶中加入40mL二氯甲烷溶解，选择4μm的喷嘴，N₂作为干燥气体(120L／min)，在入口温度为75℃，出口温度为42℃，喷嘴温度为83℃的条件下喷雾干燥制备PPD纳米粒，最后收集到60mg的PPD，将该样品用12mL水分散(含120mg人血清白蛋白)即得PPD纳米混悬剂(借助超声分散)，平均粒径为1μm左右。

实施例5

固定有机相为4mL溶有200mgPPD的丙酮溶液；制备条件：25℃、250W超声、浆搅拌(300rpm)，考察20mL水相中含等量不同类型的稳定剂对PPD纳米混悬剂中PPD纳米粒粒径、电位的影响，结果见下表：

(PVA、HPMC、P-188、Tween80、PVP-K30、牛血清白蛋白V和人血清白蛋白用量1％，w／v；SDS，胆酸钠用量0.2％，w／v)

实施例6

固定有机相为4mL溶有200mgPPD的丙酮溶液；制备条件：25℃、250W超声、浆搅拌(300rpm)，考察20ml水相中含不同量的人血清白蛋白(0.2，0.4，0.6，0.8，1，2％)对PPD纳米混悬剂中PPD纳米粒粒径的影响，结果表明1％牛血清白蛋白V最好，粒径为222nm，PDI为0.168和ZP为-28.0mV

实施例7

固定有机相为4mL溶有200mgPPD的丙酮溶液；水相为20mL含200mg人血清白蛋白水溶液；部分制备条件：25℃、浆搅拌(300rpm)。考察不同超声功率(50，100，150，250，500W)对PPD纳米混悬剂中PPD纳米粒粒径的影响，结果表明，250w制备的粒径最小。

实施例8

固定有机相为4mL溶有200mgPPD的丙酮溶液；水相为20mL含200mg人血清白蛋白水溶液；部分制备条件：250W超声、浆搅拌(300rpm)。考察不同温度(45，25和0℃)对PPD纳米混悬剂中PPD纳米粒粒径的影响，结果表明25℃制备的粒径最小。

实施例9

20(s)-原人参二醇纳米粒的体外释放实验

实验方案：制备20(s)-原人参二醇纳米粒(10mg／mL)，以20(s)-原人参二醇混悬液(20(s)-原人参二醇超声分散于水中，10mg/mL)为对照，精密吸取1mL20(s)-原人参二醇纳米粒及20(s)-原人参二醇水混悬液，采用浆法进行体外释放实验。平行3份，以50mL的pH7.4PBS溶液(含有0.1％SDS的PBS，pH＝7.4)为释放介质，在37℃水浴恒温振荡器上振荡(75rpm)。

样品采集：在预设时间点(0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、60、72h)取样1mL，同时补加同体积的37℃新鲜释放介质，每12h更换一次释放介质。将所取样品过0.1μm的滤膜后，测定释放介质中20(s)-原人参二醇的含量，计算累计释放百分率，绘制体外释放曲线。结果如图4所示。

结果表明纳米粒较原药的溶出度和溶解速率有明显的提高。

实施例10

20(s)-原人参二醇纳米粒药代动力学研究

实验动物：健康SD大鼠16只，雄性，体重200～220g。

给药方案：随机分成两组。给药前禁食12h，自由饮水。以25mg/kg的剂量分别灌胃给予20(s)-原人参二醇纳米粒和混悬剂(原药直接分散于生理盐水中)，静脉注射纳米粒及溶液(DMSO∶Tween80∶生理盐水0.5∶0.5∶9，v／v／v)。

样品采集：在0～24小时内，每隔一段时间，经大鼠眼球后静脉丛取血0.5mL，置于肝素钠试管中，5000rpm离心5min，分离血浆，取血浆200μL，加入10μL非那雄胺(10μg/mL)，涡旋混匀，加入3mLCH₂Cl₂，涡旋10min后室温下放置10min，混合物10000rpm离心5min，取上层有机相吹干，乙腈定溶后过膜，进样20μL，UPLC检测分析，绘制血浆浓度岁时间变化曲线(图5)。

结果：纳米粒口服生物利用较原药明显提高，大约为原药的3.48倍；同样是静脉注射，纳米粒的生物利用度也较注射液的高。平均血药浓度数据用PhoenixWinNonlin(version6.1)拟合，计算药代动力学参数，药代动力学参数如下表：

买施例11

20(s)-原人参二醇纳米粒对细胞HepG2的毒性研究

细胞培养：取对数增长期的HepG2细胞(7×10³cells／well)，96-孔板培养24h

实验方法：不同浓度的纳米粒和DMSO溶液(0.625，1.25，2.5，5和10μg/ml)和细胞孵育12，24和36h，RPMI1640为对照，每组6个孔，加入20μlMTT(5mg/ml)域每孔中再孵育4h，弃上清液，加入DMSO150μL／孔，溶解紫色结晶体，振摇10min，570nm测吸光度，计算抑制率(图6)和IC50。

结果：纳米粒对HepG₂细胞的生长抑制表现出明显的剂量和时间依赖关系，而且较原药显著提高，纳米粒的IC₅₀值在12、24和36h分别为2.64，1.40和1.39μg/ml，而原药为22.56，5.83和4.89μg/mlat36h。

实施例12

药效学实验

实验动物：取H22肿瘤小鼠75只，体重20g左右，随机分为五组。

给药方案：静脉注射白蛋白溶液(100mg/kg)，环磷酰胺溶液(50mg／kg)and纳米粒(20mg/kg，50mg/kg和100mg/kg)，连续给药9天，第10天处死，记录小鼠体重变化。

样品采集：取肿瘤，称重，计算抑瘤率，记录小鼠体重(图7)。

结果：100mg/kg纳米粒抑瘤率为79.47％，而50-mg/kg环磷酰胺的抑瘤率为87.81％，50mg／kg和20mg／kg纳米粒也有明显的抑瘤，分别为67.46％和34.55％，纳米粒对小鼠体重影响较小，而环磷酰胺组小鼠体重明显减小，说明纳米粒的毒性较小。

Claims (3)

1.一种20(s)-原人参二醇纳米粒，其特征在于：其通过以下方法进行制备：

精密称取人血清白蛋白200mg置于烧杯中加20mL的水溶解，再精密称取PPD200mg，置于西林瓶中加4mL丙酮溶解；在25℃、250W超声、300rpm浆搅拌的条件下，将PPD的丙酮溶液缓慢滴入水中，滴加完50℃旋蒸去丙酮即得PPD纳米混悬剂，平均粒径为220nm。

2.根据权利要求1所述的20(s)-原人参二醇纳米粒，其特征在于：在制备混悬剂后通过冷冻干燥或喷雾干燥进一步固化。

3.如权利要求1或2所述的20(s)-原人参二醇纳米粒，其特征在于：所述纳米粒的给药方式是口服、注射或外用给药，纳米粒干粉加入适当赋形剂进一步制备成口服液、片剂、颗粒剂或胶囊剂，或者制备成注射液供皮下、肌肉或静脉给药。