CN1037349A - 新颖共聚物及用该共聚物改性的超氧物歧化酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型共聚物以及其制备方法 和用这种共聚物改性而制得的用作医用药剂的新型 超氧物歧化酶衍生物。所述共聚物包含上式(a)(四 种单元中任选一种)和(b)所示的组成单元，还包含 式(c)-(i)(在内部)或式(c)-(ii)(在一端)所示的组 成单元。上列各式中各符号R¹至R⁷及Q¹¹和Q²¹ 的定义如说明书所述。

Description

本发明涉及新颖共聚物及用该共聚物改性的超氧物歧化酶。

超氧物歧化酶（以下简称SOD）迄今已知为一种广泛出现于有生命机体，例如动物、植物和微生物中的酶，并且这种酶可将对有生命机体有害的过氧化物加以分解。近来，有人试图将分离出的SOD用作消炎剂〔参见Farumashia，17，411（1981）及Current    Therapeutic    Researcn，16，706（1974）〕。

据报导，静脉给药的SOD，其血浆半衰期为4-6分钟。SOD被迅速代谢并排泄到尿中。为延长SOD的血浆半衰期，人们已进行过许多试验，用水溶性聚蔗糖菲科尔，聚乙二醇或清蛋白通过改性将SOD转化成大分子。然而，据报导，在菲科尔或聚乙二醇改性的SOD中，SOD的酶活性显著降低，而清蛋白改性的SOD则具有抗原性。人们知道，旋复花粉改性的SOD具有大为延长的血浆半衰期，但同时它的酶活力同SOD相比，有所下降〔参见JP-A-32826/58〕。

本申请的发明人中有一位原先已发现，将具有苯乙烯马来酸骨架的疏水性有机酸结构通过酸性酰胺键引到SOD分子的表面上，所得到的SOD衍生物能可逆地连到血液中的血清蛋白（主要为清蛋白）上和从其上解离下来。从而可以提高SOD的血浆半衰期和其亲器官性〔第37届蛋白质结构讨论会论文摘要，第61-64页（1986年9月10日发行）;美国专利申请序号049349〕。

上述菲科尔、聚乙二醇、清蛋白及旋复花粉改性的SOD种类，由于上面已提及的原因和/或由于分子体积增大所导致的组织渗透性降低，在其实际使用中均有问题。

迄今所知的各种改性SOD种类均是借助各种高分子物质通过SOD分子内的一些氨基连到SOD上的方法来制造。人类SOD的每个分子含22或24个氨基，而牛类SOD的每个分子含20个氨基。如上面提及的，由于SOD具有许多氨基，这就极难于指明存在于SOD分子之中，并用作SOD改性用的高分子物质键合点的氨基。然而，较好的办法是使医用药物为一种可由单一化学结构来鉴别的化合物。在这些情况下，改性的医用SOD种类最好应当是具有某种化学结构的化合物，在此结构中，改性用高分子物质在SOD分子中的特定点上与SOD键合。

本发明的一个目的是，提供一种能产生新型超氧物歧化酶衍生物的新颖化学改性剂，在所产生的超氧物歧化酶衍生物中，SOD的酶活力基本上保留下来，并且该衍生物较之SOD具有明显延长的血浆半衰期，另外由于单一的化学结构和不过份增加分子体积而且有良好的器官转移能力。

本发明的另一个目的是，提供新型超氧物歧化酶衍生物，在该衍生物中，任何上述化学改性剂均连结到SOD分子中的特定位置上，而且该衍生物分子体积适中并具有比SOD长得多的血浆半衰期，同时SOD的酶活力基本保留下来。

本发明的再一个目的是，提供所述超氧物歧化酶衍生物尤其作为抗炎药。局部缺血伤害保护药及大脑水肿治疗药的药物应用。

本发明还有一个目的是，提供一种包括使用上述超氧物歧化酶衍生物在内的治疗炎症和/或局部缺血疾病的方法。

本发明的上述目的与其它目的，以及其优越性，专业人员可由下述详细说明中清楚看出。

按照本发明，上述诸目的可借助下列办法来实现：

〔1〕提供一种包含聚合物组成单元（a）和（b）的共聚物：

（a）为选自通式

所示基团类中的一个基团，式中R¹、R³及R⁵各自独立为氢原子或甲基，R²为氢、氯或溴的原子，或者是甲基，R⁴为氢原子，含1-6个碳原子的烷基或含3-6个碳原子的环烷基，而R⁶则为甲基或乙基;以及

（b）由通式 所示的一个基团，

式中R⁷为氢原子，或者烷基部分含1-4个碳原子的乙二醇单烷基醚或烷基部分各含1-4个碳原子的丙三醇二烷基醚这两类醚当从其中除去羟基而衍生出来的含1-8个碳原子的链烷醇残基;而且该共聚物还包含：

（c）（ⅰ）在内部，由通式

所示的一个基团，式中Q¹¹和Q²¹中的一个为羧基，另一个为通式

所示的一个基团，式中A¹为二价烃残基，它可被一个或多个各自独立选自氧原子、硫原子、通式-N（R⁸）-（R⁸为氢原子或含1-4个碳原子的烷基）所示基团和通式-NH-CO-NH-所示基团类中的基团任意间断;或者

（ⅱ）在一端，通式

所代表的一个基团，式中W为二价有机基团;该共聚物的平均分子量为400-20，000〔下文中有时将该共聚物简单地统称为“共聚物”，或者有时称为“含马来酰亚氨基的共聚物”〕;

〔2〕提供一种由通式

〔SOD〕〔Z〕n

所示的超氧物歧化酶衍生物，式中〔SOD〕为从其一个或二个疏基上除去氢原子所衍生出的一价或二价超氧物歧化酶残基，n为相应于〔SOD〕价数的整数1或2，而〔Z〕则为由一种共聚物衍生的一价基团，该共聚物包含聚合物组成单元（a）和（b）：

（a）为

式中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵及R⁶为如上所定义者;

（b）为由通式 所示的一个基团，式中R⁷为如上所定义者;而且该共聚物还包含：

（c）（ⅰ）在内部，由通式

所示的一个基团，式中Q¹和Q²中的一个为羧基，而另一个为通式

所示的一个基团，式中A¹为如上所定义者，琥珀酰亚胺环碳原子有一价同〔SOD〕相连结;或者

（ⅱ）在一端，由通式

所示的一个基团，式中W为如上所定义者，琥珀酰亚胺碳原子有一价同〔SOD〕相连结;该共聚物的平均分子量为400-20，000〔该衍生物在下文中称为“SOD衍生物”〕;

〔3〕提供一种治疗炎症和/或局部缺血疾病用的药物组合物，该组合物含有对治疗炎症和/或局部缺血疾病有效量的，如上所定义的SOD衍生物和一种药物学上允许采用的SOD衍生物稀释剂或载剂;以及

〔4〕提供一种治疗炎症和/或局部缺血疾病的方法，该方法包括，给炎症和/或局部缺血疾病患者以治疗炎症和/或局部缺血疾病有效量的、如上所定义的SOD衍生物。

图1至图4分别示出实施例2、3、5及6中所制得含马来酰亚氨基团共聚物的红外吸收谱图。

图5是一个照片，它示出实施例9中所用SOD种类〔图中的（a）〕、实施例9所得反应混合物〔（b）〕、该混合物经凝胶过滤后所得含SOD和SOD衍生物的级分〔（C）〕、由该级分用亲含柱色谱法所得含SOD级分〔（d）〕以及用亲合柱色谱法所得含SOD衍生物级分〔（e）〕的电泳结果。

图6示出实施例9中所用SOD种类〔图中的（1）〕，该实施例中所用含马来酰亚氨基的共聚物〔（2）〕及该实施例中所得SOD衍生物〔（3）〕的紫外吸收谱图。

图7示出实施例10所得SOD衍生物的红外吸收谱图。

图8示出实施例11中所用SOD种类〔图中的（a）〕、该实施例中所得反应混合物〔（b）〕，由该混合物用凝胶过滤所得含SOD和SOD衍生物的级分〔（c）〕、用亲合柱色谱法从该级分中所得的含SOD级分〔（d）〕以及用亲合柱色谱法所得含SOD衍生物级分〔（e）〕的电泳结果。

图9示出实施例14中所用SOD种类〔图中的（1）〕、同一实施例中所用含马来酰亚氨基团的共聚物〔（2）〕及从其中所得SOD衍生物〔（3）〕的紫外吸收谱图。

图10示出实施例14中所得SOD衍生物的红外吸收谱图。

图11示出试验例1中所测SOD〔图中的（1）〕和一种SOD衍生物〔（2）〕的血液浓度时间过程。

图12示出试验例2中连续监测SOD处理组〔图中的（A）和SOD衍生物处理组〔（B）〕所得部分心电图（导联Ⅱ）。所示的心电图是在第二次局部缺血之前〔图中的（1）〕，第二次局部缺血之后15分钟〔（2）〕，第二次再灌注之后10秒〔（3）〕，30秒〔（4）〕及3分钟〔（5）〕时记录下来的。

共聚物

参见通式（Ⅱ），W所代表的二价有机基团不受任何特定种类的限制，只要它起到使马来二酰亚氨基的氮原子价与包含组成单元（a）和（b）的共聚物相连结的作用即可。通式

所代表的基团，其典型例子有由通式

所代表的基团，式中Q¹¹和Q²¹为如上所定义者，而Q³则为一价有机基团;通式

所代表的基团，其中A¹为如上所定义者，A²为通式-CO-O-，-CO-NH-，-CO-NH-CH₂-;-NH-CO-O-，-NH-CO-NH-，-NH-CO-NH-CH₂-，-N＝CH-NH-CH₂-或

所示的一个基团，Q⁴和Q⁵各自独立地为氢原子或含1-3个碳原子的烷基，而m为0-4的整数;以及通式

所示的一个基团，式中A¹为如上所定义者，而A³则为一个二价烃基，它可任意为一个或多个氧和/或硫铀涠稀?

这些共聚物，举例来说，可用下述方法来制备：

〔Ⅰ〕含有上述组成单元（a）和（b）并且还含有由通式

（Ⅰ）所示的内部基团或在它的一端上含有由通式

（Ⅱ-1）所示基团而且它的平均分子量为400-20，000的共聚物，可使用通式

所示化合物，式中A¹为如上所定义者而T¹为可与马来酐环反应的基团，与含有上述组成单元（a）和（b），还含有通式

所示基团（每个分子）0.5-2个且平均分子量为400-20，000的共聚物反应来制取。

〔Ⅱ〕含有上述组成单元（a）和（b）并在它们的一端上还含有通式（Ⅱ）所示基团而且它的平均分子量为400-20，000的共聚物，可通过与含1-8个碳原子的链烷醇、烷基部分含1-4个碳原子的乙二醇单烷基醚或烷基部分各自分别含1-4个碳原子的丙三醇二烷基醚的半酯化反应和/或水解这样一种共聚物来制备，该共聚物的制取方法是，使（a′）一种选自通式

所示各化合物组成的这类化合物中的单体，式中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵及R⁶为如上所定义者，与（b′）马来酐在一种含官能团或被护官能团的聚合反应引发剂和/或含官能团或被护官能团，而且在其一端上有该官能团或被护官能团，而且它的平均分子量为400-20，000的链转移剂存在下进行游离基共聚反应，然后在必要时从端部被护基上除去保护基团，并使经上述改性的共聚物与通式

所示化合物进行反应，式中W为如上所定义者，T²为一种可与上述改性共聚物的官能团起反应的基团。

下面更详细地阐明制备下列三种含马来酰亚氨基团共聚物的方法。

（1）包含上述组成单元（a）和（b）并在一端上还含有通式（Ⅱ-1）所示的一个基团或通式（Ⅰ）所示的一个内部基团的共聚物〔下文中称作“含马来酰亚氨基的共聚物（1）〕;

（2）包含上述组成单元（a）和（b）并在一端上还含通式（Ⅱ-2）所示基团的共聚物〔下文中称作“含马来酰亚氨基的共聚物”（2）〕;以及

（3）包含上述组成单元（a）和（b）并在一端上还含通式（Ⅱ-3）所示基团的共聚物〔下文中称作“含马来酰亚氨基的共聚物”（3）〕。

1）含马来酰亚氨基的共聚物（1）的制备

将相应于组成单元（a）和马来酐的共聚物半酯化和/或水解到一定程度，使产物的每个分子平均具有0.5-2个马来酐环（以1个左右为佳）。然后，使如此得到的共聚物与通式

所示化合物以半酰胺化方式反应，式中A¹为如上所定义者，制得含马来酰亚氨基的共聚物（1）。酰胺化反应一般在碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸钠、磷酸钠或磷酸钾等盐类的水溶液中进行，或者在有机溶剂如氯仿、1，2-二氯乙烷、二恶烷、四氢呋喃、乙腈、二甲亚砜或N，N-二甲基甲酰胺中进行，必要时可在有碱性物质如碳酸氢钠、碳酸钾、吡啶或三乙胺存在下进行。当反应在上述一种盐的水溶液中进行时，该反应以在pH值为9或小于9时，用冰冷却或在至多为室温的温度下进行为佳，考虑到马来酰亚胺环的稳定性，用淙锤谩７从χ芷谝话阄?小时至1天。对每摩尔上述含马来酐环的共聚物约用0.5-10摩尔的通式（Ⅲ）所示的化合物。当反应在有机溶剂中进行时，该反应用冰冷却或在至高约80℃的温度下进行约1-10小时。通式（Ⅲ）所示的化合物的用量与上述含盐水溶液中反应所用的量相同。如果用碱，则对每摩尔通式（Ⅲ）所示化合物约用1-10摩尔的碱。

上述通式（Ⅱ-1）中，Q³代表如上所述的一价有机基团，而且是游离基聚合反应所得共聚物的一个端部基团或端基。该端基可为由用作催化剂的游离基引发剂所产生的游离基团，或者由于引发剂所衍生的游离基向反应溶剂或另一种共存物质进行链转移而产生的游离基。一价有机基团Q³最好是向溶剂进行链转移而产生的游离基，例如芳烷基如苄基、α-甲苄基或α，α-二甲苄基，该基团可在其核上被一个或多个取代基所取代，该取代基选自卤原子如氯和溴的原子、低级烷氧基如甲氧基及丙氧基、甲基、甲氧基甲基、二甲氧基甲基、乙酸基甲基、乙酰基硫基、乙酰基硫代甲基、甲氧基羰基等等。

2）含马来酰亚氨基的共聚物（2）的制备

将上面（a，）中提及的单体和马来酐在通式

所示的化合物存在下进行游离基共聚，式中Q⁴、Q⁵及m为如上所定义者，Y¹为通式-O-CO-R⁹、-S-CO-R¹⁰、-CH（OR¹¹）₂、-NO₂或-CN所示的一个基团，其中R⁹、R¹⁰及R¹¹各自分别为含1-4个碳原子的烷基，该化合物用作链转移剂和反应溶剂，必要时反应可在一种有机溶剂如辛烷，苯或丙酮存在下进行，得到一种共聚物，该共聚物在一端有通式

所示的一个基团，式中Y¹、Q⁴、Q⁵及m为上述所定义者。可用作通式（Ⅳ）所示化合物的，举例来说，有乙酸对乙基苄酯，乙酸对异丙基苄酯、硫代乙酸S-对异丙基苯酯、硫代乙酸S-对异丙基苄酯、对异丙苯醛缩二甲醇、对异丙苯醛缩二丁醇、对硝基枯烯及对氰基枯烯。用常规方法将如此制得的共聚物半酯化和/或水解，使存在于该共聚物中的马来酐环消失，而存在于共聚物一端上和以Y¹代表的存在于上述通式（Ⅳ′）所示基团中的那个基团，则被转化成反应性官能团Y²，得到一种在其一端上有通式

所示基团的共聚物〔下称“共聚物（Ⅳ″）〕，式中Q⁴、Q⁵及m为如上所定义者，Y²为羟基、巯基、甲酰基、氨基或氨甲基。在Y¹所示的各基团之中，通式-O-CO-R⁹、-S-CO-R¹⁰或-CH（OR¹¹）₂所示的各基团被以常规方法水解，分别产生羟基、巯基或甲酰基，而硝基或氰基则分别转化成氨基或氨甲基。

将通式

所示的基团，其中A¹为如上所定义者，利用官能基团Y²通过偶合基团A²引入共聚物（Ⅳ″）中，生成含马来酰亚氨基的共聚物（2）。用来生成偶合基团A²的各种反应详细叙述如下。

（1）当共聚物（Ⅳ″）中Y²为羟基、氨基或氨甲基时，使共聚物（Ⅳ″）与通式

所示羧酸的反应性衍生物进行反应，式中A¹为如上所定义者，或者与通式

所示的异氰酸酯化合物进行反应，式中A¹为如上所定义者，产生含马来酰亚胺的共聚物（2）。通式（Ⅴ）所示羧酸的反应性衍生物尤其包括酸性氯化物，酸酐，N-羟基琥珀酰亚氨酯、酰基咪唑及8-羟基喹啉酯。羧酸的该反应性衍生物与共聚物（Ⅳ″）的反应，是以常规方法在水中，或在有机溶剂如三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、丙酮、苯或乙腈中进行，必要时可在有助剂如吡啶、三乙胺或碳酸氢钠存在下进行。该反应生成一种含马来酰亚氨基的共聚物（2），其中A²为通式-CO-O-，-CO-NH-或-CO-NH-CH₂-所示的基团。通式（Ⅵ）所示异氰酸酯与共聚物（Ⅵ″）的反应，是用常规方法在有机溶剂如三氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、二甲亚砜或N，N-二甲基甲酰胺中，在室温下或加热到所用溶剂的沸点来进行。该反应生成含马来酰亚氨基的共聚物（2），其中A²为通式-NH-CO-O-，-NH-CO-NH-或-NH-CO-NH-CH₂-所示的基团。

（2）当共聚物（Ⅳ″）中Y²为甲酰基时，使共聚物（Ⅳ″）与通式（Ⅲ）所示的化合物反应，生成其中A²为-N＝CH-的含马来酰亚氨基的共聚物（2）。该反应以常规方法在形成席夫碱的条件下，即在轻度脱水的条件下，通常在有机溶剂如三氯甲烷、四氢呋喃或乙腈中进行。当该反应在有例如氰基氢硼化钠存在下进行时，产物为其中A²是通式-NH-CH₂-所示基团的含马来酰亚氨基的共聚物（2）。同一产物〔共聚物（2）;A＝-NH-CH₂-〕也可用按席夫碱形成反应制得的其中A²为通式-N＝CH-所示基团的含马来酰亚氨基共聚物（2），例如用氰基氢硼化钠进行水解来制取。

（3）当共聚物（Ⅳ″）中Y²为疏基时，使共聚物（Ⅳ″）与通式

所示联马来酰亚胺化合物〔下称“联马来酰亚胺化合物（Ⅶ）〕反应，式中A¹为如上所定义者，生成一种含马来酰亚氨基的共聚物（2），其中A²为通式

所示基团。该反应通常在一种诸如水、三氯甲烷、四氢呋喃、乙醇、丙酮或乙腈之类的溶剂中进行，必要时可有一种诸如吡啶、三乙胺、碳酸氢钠或碳酸氢铵之类的助剂存在。考虑到共聚物（Ⅳ″）与联马来酰亚胺化合物（Ⅶ）的溶解度和马来酰亚胺环和巯基的稳定性，可认为三氯甲烷和乙腈是较佳的溶剂。所用的联马来酰亚胺化合物（Ⅶ）以过量于共聚物（Ⅶ″）为佳，一般对每摩尔共聚物（Ⅳ″）用1.5-10摩尔联马来酰亚胺化合物（Ⅶ），而以3-5摩尔更好。该反应用冰冷却或在至高为室温的温度下进行1-10小时。

3）含马来酰亚氨基的共聚物（3）的制备

用按下述方法制得的在一端上有通式

HS-A³-S-（Ⅸ″）所示基团的共聚物〔下称“共聚物（Ⅸ″）”〕与联马来酰亚胺化合物（Ⅶ）反应，式中A³为如上所定义者，生成一种含马来酰亚氨基的共聚物（3）。该反应以同上述2）-③中的方方法进行。

下面更详细地叙述制备含巯基共聚物的方法。含有上述组成单元（a）和（b），并在一端还包含通式SH-W′-所示基团（式中W′为一个二价有机基团）而且其平均分子量为400-20，000的共聚物，可以用上述同样的方法，使一种通过上述（a′）中的单体与上述单体（b′）在含被护巯基的链转移剂存在下进行游离基共聚制得的并在一端上含所说被护巯基而且平均分子量为400-20，000的共聚物进行半酯化和/或水解来制取;然后从上述被护巯基上除去保护基。在游离基共聚反应中用作含被护巯基的链转移剂，可考虑采用通式

所示的化合物，式中R¹²为1-3个碳原子的烷基，而Q⁴、Q⁵、A³及m为如上所定义者。

通式（Ⅷ）所示化合物的例子有对乙基苄硫醇、对异丙基苄硫醇、对乙基苯硫酚、对异丙基苯硫酚、邻异丙基苯硫酚等与乙酸、丙酸、丁酸等的酯。通式（Ⅸ）所示的化合物可采用，例如，1，2-乙基二硫酚、1，3-丙基二硫酚、1，4-丁基二硫酚、2-巯基乙基硫醚、双（2-巯基乙基）醚、2，2′-二硫代双乙硫醇，1，2-苯二硫醇、1，3-苯二硫醇、3，4-甲苯二硫醇、1，3-双（巯甲基）苯、1，4-双（巯甲基）苯等与乙酸、丙酸、丁酸等的半酯。

上述链转移剂也可用作聚合溶剂。必要时则可附加使用一种有机溶剂，例如辛烷、苯、丙酮、乙苯或甲乙酮。当反应在有上述链转移剂以及必要时有有机溶剂存在下进行时，游离基聚合反应生成一种在一端上有通式

所示基团的共聚物，式中R¹²、Q⁴、Q⁵、A³及m为如上所定义者。将如此制得的共聚物内的马来酐环半酯化和/或水解，并进而使端部的硫酯部分水解，生成一种在一端上有通式

或HS-A³-S- （Ⅸ″）

所示基团的共聚物，其中Q⁴、Q⁵、A³和m为如上所定义者。〔下面按该共聚物的端基将其称为“共聚物（Ⅷ″）或（Ⅸ″）”〕。

端部硫酯部分的水解可在适度的条件下进行。因此，例如说，水解在含水介质中，在有磷酸钠、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾或同类物存在下，用冰冷却或在至高为室温的温度下，进行数分钟至约10小时。

下面叙述从上述方法所制得的反应混合物中分离和提纯共聚物的方法。当反应在含水介质中进行时，直接将所得的反应混合物进行凝胶过滤，收集所需的洗脱液级分并使之冷冻干燥。当反应在有机溶剂中进行时，若认为有必要，就从反应混合物中除去有机溶剂。以上述的相同方法将残留物进行凝胶过滤，收集所需的洗脱液级分并使之冷冻干燥，或者在必要时可换一种方法，即将反应混合物浓缩或从反应混合物中除去有机溶剂，剩留的反应混合物用四氢呋喃、三氯甲烷、丙酮或同类物作展开溶剂，进行液体色谱分离，然后收集所需的洗脱液级分并使之冷冻干燥。

现将由相应于上述组成单元（a）的单体和马来酐制备共聚物及由该共聚物制备半酯化和/或水解共聚物的方法叙述如下。

相应于组成单元（a）的单体和马来酐之间的游离基共聚反应，是在有一种催化剂，例如过氧化二枯基、偶氮二异丁腈、过氧化苯甲酰或过苯甲酸叔丁酯存在下进行的。催化剂的用量约为相应于组成单元（a）单体重量的1-10%。当通式（Ⅳ）、（Ⅷ）或（Ⅸ）所示的化合物用作链转移剂进行游离基共聚反应时，如上已提及，该化合物也可起反应溶剂的作用。必要时，则可附加使用其他有机溶剂。此时所得的共聚物主要用来制备上述含马来酰亚氨基的共聚物（2）、（3）和含巯基的共聚物以及含活性二硫基的共聚物。当游离基共聚反应在没有式（Ⅳ）、（Ⅷ）或（Ⅸ）所示化合物存在下进行时，则分别用枯烯、繖花烃、甲苯、乙苯、丙酮、甲乙酮、四氢呋喃、二甘醇二甲醚或其他同类物分别作反应溶剂。在这些溶剂中，以枯烯、繖花烃、甲苯及乙苯为佳。在此情况下，链转移剂，例如苄醇、十二烷基硫醇或苯甲醛可存在于反应体系中。所制得的共聚物用来制备上述含马来酰亚氨基的共聚物（1）。两种情况下，对每摩尔相应于组成单元（a）的单体均用约1-5摩尔的马来酐，而以约2摩尔为佳。把在溶剂中相应于组成单元（a）的单体和马来酐的总量调节到约5～40%（重量），而以约10-30%（重量）为佳。反应在40-180℃范围内的温度下进行，以约110-160℃为佳。该游离基共聚反应以在上述温度下，将相应于组成单元（a）的单体，同催化剂一起慢慢加入溶有马来酐的溶剂中来进行为佳。如此按游离基共聚作用所制得的共聚物，不论是否进行使分子量分布段收缩的分级，都要进行使马来酐环半酯化和/或水解的后续反应。

用相应于组成单元（a）的单体和马来酐所组成的共聚物来进行的马来酐环半酯玫孽ゲ糠郑τ杼峒暗挠屑柞ァ⒁阴ァ⒈ァ⒄□ァ⒄祯ァ⒁煳祯ァ⒄乎ァ⒄刘ァ⒓籽趸阴ァ⒁已趸阴ァ⒈趸阴ァ?-丁氧基乙酯、1，3-二甲氧基-2-丙酯、2，3-二甲氧基-1-丙酯、1，3-二乙氧基-2-丙酯、2-乙氧基-3-甲氧基-1-丙酯、1，3-二丙氧基-2-丙酯、1，3-二丁氧基-2-丙酯及苄酯。这类半酯化共聚物，可用相应于组成单元（a）的单体和马来酐生成的共聚物与相应的醇，在约50-120℃范围内的温度下，必要时在有催化剂如乙酸锂存在下，进行反应而制得。相应的醇在过量使用时也能起溶剂的作用。二恶烷、四氢呋喃及其它同类物也可各自用作溶剂。

相应于组成单元（a）的单体和马来酐生成的共聚物，其马来酐环水解是用常规方法和使用氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸氢钠等碱的水溶液来进行的。所需的共聚物可借助凝胶过滤或酸沉淀以常规方法从反应混合物中分离出来并提纯。

相应于组成单元（a）的单体尤其包括苯乙烯、对氯苯乙烯、对溴苯乙烯、α-甲基苯乙烯、乙烯、丙烯、α-丁烯、异丁烯、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、乙烯基环己烷、1-己烯、1-庚烯、乙烯基乙酸酯、（甲基）丙烯酸甲酯及（甲基）丙烯酸乙酯。

最好在本发明的共聚物中组成（a）和组成（b）间的摩尔比，即组成摩尔比“（a）/（b）”，基本上约在1-1.3的范围之内。在通常情况下，该比率为1。以相应于组成单元（a）的单体与马来酐所进行的共聚作用，难以制得组成摩尔比（a）/（b）小于1的共聚物。当组成摩尔比大于1.3时，在其中的组成单元（b）处于半酯化状态的共聚物，在它按下述方法与SOD反应时，在含盐的水溶液中呈现不利的过低的溶解度。

本发明的共聚物的重均分子量在400-20，000范围之内。如下文所述的在用本发明共聚物作SOD的化学改性剂来制备SOD衍生物时，考虑到要使共聚物往SOD的作用位置上转移，则该共聚物的重均分子量应以不超过3，000为佳。该共聚物的分子量分布无关紧要。然而，重均分子量和数均分子量之比约在1.02-1.30范围内的那些共聚物，能生成优先选作药物或医用组合物有效成分的SOD衍生物。

SOD    衍生物

通式

所示存在于本发明SOD衍生物中的基团，其典型例子有通式

所示的基团。在上述各式中，Q¹和Q²中的一个为羧基，而另一个

所示的基团，而Q³、Q⁴、Q⁵、A¹、A²、A³及m则为如上所定义者。

下面的叙述阐明了使用本发明的含马来酰亚氨基共聚物来制备SOD衍生物的方法。

SOD衍生物可在pH6-10的水溶液中使SOD与本发明的含马来酰亚氨基共聚物进行反应来制备。

为使SOD与含马来酰亚氨基共聚物进行反应，一般是直接用粉末状含马来酰亚氨基的共聚物，或者先将该共聚物溶于诸如二甲亚砜、二恶烷、丙酮、四氢呋喃或乙醇之类的有机溶剂或溶于诸如三（羟甲基）氨基甲烷盐酸化物、碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸钠或磷酸钠之类盐的水溶液中制成溶液，然后将上述粉末或溶液加入一种已溶有SOD的上述水基盐溶液中，该溶液中的SOD浓度为0.5-100mg/ml，较佳为1-20mg/ml。反应过程中，溶液的pH应保持6-10。当pH小于6时，含马来酰亚氨基的共聚物溶解度减小，反应难于进行。当pH大于10时，SOD本身的酶活力因反应周期的长短而受不同影响。反应时的pH值以小于9为佳，因为在pH值为9或更高时，马来酰亚胺环可能易于开裂。至于反应温度，以室温或低于室温为佳，而在-5至+5℃范围内的温度更佳。反应周期随反应温度和添加含马来酰亚氨基共聚物的方法而变，但一般为10分钟至1天。含马来酰亚氨基的共聚物的用量为对每摩尔SOD在0.5-50摩尔的段е凇?

如此制得的反应混合物含有SOD衍生物、未反应的SOD及未反应的含马来酰亚氨基的共聚物等。SOD衍生物可从该反应混合物中以固体状态回收，其方法是过滤该混合物，将滤液进行凝胶过滤，必要时用巯水柱色谱、亲合柱色谱、离子交换柱色谱和/或其他同类方法来提纯如此制得的含SOD衍生物的洗脱级分，然后用超滤法浓缩该级分，并将浓缩物冷冻干燥。

在上述反应中，SOD的巯基与含马来酰亚氨基共聚物的马来酰亚氨基发生反应，生成所需的SOD衍生物。

SOD和共聚物间偶联位置的典型例子示于下列结构式。在下列各结构式中，〔Z¹〕和〔Z²〕分别代表共聚物的主链。

（ⅰ）当主链〔Z〕在一端上连有式（Ⅱ-A-1）所示的一个基团，或在内部连有一个式（Ⅰ-A）所示的基团时：

（ⅱ）当〔Z〕在一端上有式（Ⅱ-A-2）或（Ⅱ-A-3）所示的一个基团时：

本发明的共聚物一般每个分子含有一个马来酰亚氨。在SOD一侧，人类SOD有两个自由的反应性巯基。因此，视上述各反应条件而定，可以用一个或两个共聚物分子与一个人类SOD分子反应而制得SOD衍生物，或者分别用一个和两个共聚物分子与一个SOD分子反应而制得SOD衍生物混合物。该SOD衍生物混合物在药用组合物中用作有效或活性成分，不会引起任何麻烦。然而，鉴于药物学领域中，人们更愿选用化学结构单一的化合物作药用组合物中的活性成分，所以，最好对上述SOD衍生物混合物进行色谱柱或其他适宜的处理步骤，并将如此分离过的SOD衍生物单独用作药用组合物中的活性成分。在上述的反应和随后的处理步骤中，SOD衍生物可能生成碱金属盐或铵盐，这是因为它们具有羧基之故。但是，处于这种盐状态的SOD衍生物，可以在药用组合物中用作活性成分，而不致引起任何麻烦。

由于SOD衍生物是一分子SOD和至少两分子共聚物反应的产物，它们的特征尤其在于，SOD的酶活力在其中保持一个高水平，而且它们具有显著延长的血浆半衰期。

本发明所述的共聚物各个都是同时具有一个疏水基团和一个亲水基团，因此疏水性适度，同时还具有高度极性的羧基。所以，包含这种连结在SOD上的共聚物的SOD衍生物，能够可逆地连结到血清蛋白和生物膜上，结果，其血浆半衰期得以延长，且其向器官的转移能力也得以提高。其中，有苯乙烯衍生基团作组成单元（a）的SOD衍生物和有半酯化基团作组成单元（b）的SOD衍生物具有更高的疏水性，且从上述的效果来看，是更为可取的。

SOD

可用的SOD种类可包括存在于动物（人类、牛等）、植物、微生物及其它有生命机体中并用已知方法从其中提取隼吹腟OD种类，以及那些用基团工程方法制取的SOD种类。SOD的化学结构（配位金属、分子量、氨基酸序列等）已在很大程度上得以阐明，SOD目前计有三类，即Fl-SOD、Mn-SOD及Cu·Zn～SOD。SOD的分子量为30，000-80，000，这要根据含SOD的有生命组织而不同。SOD的氨基酸序列也在某种程度上因组织而异。关于详细的氨基酸序列等资料，可参阅Yoshihiko    Oyanagi著的“过氧化物与药物”，Kyoritsu    Shuppan，1981年5月25日出版;生物化学，246，2875-2880（1971）;同上，250，6107-6112（1975）;美国科学院科研报告集，70，3725-3729（1973）;及生物化学与生物物理档案，179，243-256（1977）。人型Cu·ZnSOD的分子量为31，200，并且具有两个自由的反应性巯基。这种人型SOD，举例来说，可将人类血液按次序进行加热处理、离子交换及凝胶过滤来制取，或者用基因工程方法来制取。

SOD    衍生物的药学应用

正如下述试验例2中所得结果证明的，SOD衍生物具有优良抗心律失常效能。此外，SOD衍生物还有许多诸如抗炎症效能、抗溃疡效能、局部缺血损伤抑制效能及防止大脑水肿效能之类的药物效能。

毒性试验证明，SOD衍生物的毒性是低的。

上述结果表明，SOD衍生物对治疗各种由于活性氧游离基参与的疾病是有效的，而且可以特别用作抗炎药、抗溃疡药、局部缺血损伤保护药、大脑水肿治疗药及百草枯中毒治疗药。SOD衍生物也可用作抗癌药的活性氧游离基所致副作用的解缓药。此外，SOD衍生物还可用作皮肤病，包括烧伤、创伤及各种皮炎的治疗药。

除上述药效外，SOD衍生物还有效地保留了已知的SOD固有药效〔参见Saishin    Igaku，39（2），339（1984）;医药与药物学杂志（日本），14（1），55（1985）;实验医药（日本），4（12），特刊“活体内自由游离基与疾病”;以及Fragrance    Journal，NO.79，89（1986）〕。SOD衍生物甚至对活性氧游离基参与的疾病也有效，而SOD对这些疾病是无效的。

SOD衍生物的剂量随疾病种类、疾病的严重程度、患者的耐受性、以及其他因素而异。但是，成人的一般日剂量为0.1-500mg，较佳为0.5-100mg，不论一次服用还是分次服用均可。SOD衍生物可制成适于各别疗程的剂型。

因此，SOD衍生物可在配制医药组合物时用任何现有的医药方法来制成剂型。含有至少一种SOD衍生物作活性成分的医药组合物，可用医药上允许的载体，赋形剂及其医药实践中常用的辅助物质，以常规方法来制备。

当这样的医药组合需用于口服时，最好将它们制成适于胃肠道吸收的剂型。片剂和胶囊是口服用的单位剂型，它们可含粘合剂，如糖、浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯酮等，赋形剂如乳糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇、甘氨酸等，润滑剂如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、二氧化硅等，分散剂如马铃薯淀粉等，医药上可用的湿润剂如十二烷硫酸钠等，以及类似的常用成分。片剂可用已知的方法包覆。口服用液体制剂可为水基悬浮液或油基悬浮液、溶液、糖浆、酏剂等，或者可为即时用水或其它适用的赋形剂复原的冷冻干燥物。这类液体制剂可含常用的添加剂，包括悬浮剂如山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/蔗糖糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶、氢化食用油及脂肪等，乳化剂如卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯、阿拉伯胶等，非水赋形剂如杏仁油、分馏椰子油、含油酯类、丙二醇、乙醇等，防腐剂如对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、山梨酸等等。

为制备注射剂，将SOD衍生物溶于适宜的溶剂中，例如生理盐水、注射用葡萄糖溶液等，并将SOD衍生物浓溶液用常规方法调节到在每2-10ml溶剂中含2-20mg    SOD衍生物，制成皮下、肌肉或静脉内给药用注射剂。制备上述注射剂时，pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、增溶剂等等，必要时可加入水溶液中。

上述医药组合物所含的SOD衍生物的浓度可按其剂型和其他因素来选定，通常浓度约为0.01-50%（重量），以约0.1-20%（重量）为佳。

本发明的优越性

本发明提供了一种新的共聚物，该共聚物可用作SOD的新化学改性剂，以用来制备一种新的SOD衍生物，这些衍生物皆有单一的化学结构，能保留大部分SOD酶活力，比SOD呈延长得多的血浆半衰期并有较强的器官转移能力。

该共聚物也可作蛋白质，除SOD以外的其他种类的酶，或高分子化合物的改性剂，条件是上述物质需能与之反应。

由该共聚物连结到SOD上所制得的SOD衍生物皆具有上述特点。此外，它们还能可逆地同血清蛋白相互作用，而这一点对SOD引入作用部位来说是优越的。该SOD衍生物具有极佳的抗心律失常效能。另外，它们还具有诸如抗炎症、抗溃疡、抑制局部缺血及防止大脑水肿之类的药效。

下述实施例用来进一步阐明本发明，但不能作为对本发明的限定。

实施例1

含马来酰亚胺基共聚物（1）的合成

（a）N-（6-氨基己基）马来酰亚胺盐酸化物的合成

在90ml二恶烷中溶解23.20g（0.20摩尔）1，6-二氨基己烷，并将24.60g（0.1摩尔）2-（叔丁氧基羰基硫基）-4，6-二甲基嘧啶溶于100ml二恶烷的溶液在3小时期间滴加于其中。滴加完毕后，将混合物搅拌过夜。把反应混合物过滤，分离出沉淀物，并将滤液浓缩到100ml左右。该浓缩物以150ml水稀释，并滤除沉淀出来的双（N，N′-叔丁氧基羰基）-1，6-二氨基己烷。将所得滤液减压浓缩到约为原始体积的一半。向该浓缩液中添加40g    Nacl并将该混合物用50ml乙酸乙酯萃取4次。汇集萃取液并减压蒸除乙酸乙酯。将残留物溶于100ml水中，并用1N盐酸将溶液调节到pH3左右。用乙酸乙酯洗涤该溶液数遍，并将Nacl加入含水层中，使N-叔丁氧基羰基-1，6-二氨基己烷盐酸化物沉淀出来。该化合物的产量为15.10g〔以2-叔丁氧基羰基硫基）-4，6-二甲基吡啶为基准计的收率：60%〕。

向75ml氯仿中加入5.15g（20毫摩尔）N-叔丁氧基羰基-1，6-二氨基己烷盐酸化物，1.95g（20毫摩朱）马来酐及2.03g（20毫摩尔）三乙胺，使反应在回流条件下进行4小时。反应完毕后，减压蒸除溶剂，并将6.30g无水乙酸钠和65ml乙酸酐加入残留物中。然后约在90℃下反应4小时。将反应混合物冷到室温，并将沉淀物滤去。从滤液中减压蒸除溶剂，并对残留物进行硅胶柱色谱分离，用丙酮和正己烷的2∶8（体积/体积）混合液作洗脱液。该步骤得到2.48g6-（N-马来酰亚胺）-N′-叔丁氧基羰基-1-氨基己烷（以N-叔丁氧基羰基-1，6-二氨基己烷盐酸化物为基准计的收率：41%）。

向溶于二恶烷的16.8ml    4N    Hcl中加入2.36g（8.0毫摩尔）6-（N-马来酰亚氨基）-N′-叔丁氧基羰基-1-氨基乙烷，并在15℃下将混合物搅拌1小时。向反应混合物中加入120ml乙醚，并将混合物继续搅拌30分钟。过滤回收所得沉淀物。用氯仿-甲醇重结晶所获得沉淀物，得到1.4gN-（6-氨基乙基）马来亚亚胺盐酸化物〔以6-（N-马来酰亚氨基）-N′-叔丁氧基羰基-1-氨基己烷为基准计的收率：76%〕。

熔点：156-158℃

元素分析（%）：

实测：C51.36、H7.48、N11.92、cl14.98

计算：C51.61、H7.36、N12.04、cl15.23

（b）部分半正丁基酯化的苯乙烯-马来酐共聚物的合成

向3.7l枯烯中加入383.0g（3.90摩尔）马来酐，并将混合物搅拌回流。然后，在约40分钟时间向上述回流混合物中滴加一种由16.3g（60毫摩尔）过氧化二异丙基和203.0g（195摩尔）苯乙烯溶于1.7l枯烯所得的溶液。滴加完毕后，将混合物在加热下继续搅拌1小时。将所获的反应混合物静置过夜，并在移去上清液后，将粘着在容器上的粘稠产物溶于丙酮，并将其回收，从该溶液中减压蒸除丙酮，得到353.0g苯乙烯-马来酐共聚物。

在3.0l丙酮中溶入120.0g上述苯乙烯-马来酐共聚物，然后在不断搅拌下，在1小时左右时间向该溶液滴加4.9l正己烷。将这种呈白色混浊的混合的丙酮-正己烷溶液转移到另一容器中，在约1.5小时的时间内向该溶液搅拌滴加9.7l正己烷，将粘着于容器壁上的浆状产物溶于丙酮并回收之。从该产物中减压蒸除丙酮，并将残留物在70-80℃下真空干燥过夜，以此得到49.2g分级沉淀的苯乙烯-马来酐共聚物。

在1.0l丙酮中溶入40.0g分级沉淀的苯乙烯-马来酐共聚物，并将3.8kg表面经硅烷处理过的玻璃珠（平均直径为0.1mm）加入该溶液中，当丙酮蒸发掉时，分级沉淀的苯乙烯-马来酐共聚物就沉积在玻璃珠上。在内径80mm、长80cm的柱中装入上述玻璃珠和1.4l丙酮与正己烷（25℃时体积比＝24∶76）的混合物。柱温控制在25℃，将1.6l（ⅰ）丙酮-正己烷（25℃时体积比为24∶76）、6.01（ⅱ）丙酮-正己烷（25℃时体积比为37∶63）及3.01丙酮从上向下流过该柱。汇集用（ⅱ）丙酮-正己烷（体积比37∶63）流过该柱时所得的级分。将低沸点级分从该洗出液中减压蒸除，并在70-80℃下将残留物真空干燥过夜，以此得到31.8g经分级的苯乙烯-马来酐共聚物。该共聚物的重均分子量（ Mw）和数均分子量（ Mn）用凝胶渗透色谱（简称GPC;洗脱液：四氢呋喃;内标：聚丙烯;下同）测定。 Mw及 Mn的值分别为1340及1220，而 Mw/ Mn比率为1.10。用蒸气压-渗透压计测得的 Mn值为1210。上述分级苯乙烯-马来酐共聚物的马来酐环含量，用电位滴定法测定为47.3%（摩尔）。

将容量约为40ml且装有磁搅拌器的细颈瓶装以10.00g分级苯乙烯-马来酐共聚物、2.20g正丁醇、0.10g无水乙酸锂及20ml二恶烷。封闭后将细颈瓶中的内容物边搅拌边在90℃加热20小时。将一部分反应混合物取作样品，并以乙基溶纤剂作内标用气相色谱法测定反应混合物中未反应的正丁醇。根据所加的正丁醇的反应比率，计算存在于共聚物中的马来酐环半丁酯化度。所得半丁酯化度为62%。然后，用20ml二恶烷稀释反应混合物，并将该稀释液滴加到400ml正己烷中，以进行再沉淀。回收所得沉淀物，并在60℃下使其真空干燥过夜，以此得到11.50g部分半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物。该共聚物的残留马来酐环含量由其红外吸收谱中在1780cm^-1及700cm^-1处的吸收强度来测定（FT-IR，KB_r片，下同）。这样测得残留含量为30.3%（摩尔）（平均在每分子中有1.8个马来酐环）。当以GPC测定时，该产物的 Mw和 Mn值分别为1530和1440，且 Mw/ Mn比为1.06。

（c）通过N-（6-氨基己基）马来酰亚胺盐酸化物和部分半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物之间的反应来合成含马来酰亚氨基的共聚物

在8.0ml的0.8M碳酸氢钠-水中加入800mg（0.5毫摩尔）上述（b）中所得的部分半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物，并在3℃左右将混合物搅拌3.5小时，以此使共聚物中的马来酐环含量减到平均每分子约为1个。向该反应混合物中添加116mg（0.5毫摩尔）上述（a）中制备的N-（6-氨基己基）马来酰亚胺盐酸化物，并使混合物约在3℃下反应24小时。对所产生的反应混合物取样，并用TNBS（三硝基苯磺酸钠）法测定氨基反应比率。所测得的反应比率为89%。过滤该反应混合物，并用Sephadex G-15（Pharmacia精细化学公司出品）作载体，对滤液进行凝胶渗透色谱分离〔柱：K50/60（Pharmacia精细化学公司出品）;洗脱液：5mM碳酸氢铵-水：5mM碳酸铵-水（6∶4，体积比;线性速度：11.0cm/hr〕。汇集富含所需产物的级分并冷冻干燥之，得到600mg含马来酰亚氨基的共聚物，其物理性能数据见下文。因此，该产物为两种共聚物的混合物，其中一种共聚物含有结构式

所示基团作组成单元（a），结构式

（式中R⁷为正丁基或氢）所示基团作组成单元（b），并在一端上含有结构式：

（式中Q¹¹和Q²¹中的一个为羧基，另一个为：

所示基团，另一种共聚物含有结构式

所示基团作组成ピ╝），结构式 （式中R⁷为正丁基或氢）所示基团作组成单元（b），并在上述组分之间含有结构式

式中Q¹¹和Q¹²中的一个为羧基，另一个为：

所示基团。该产物的平均马来酰亚氨基含量为在每共聚物分子中有0.7个。马来酰亚胺氨基含量是用4PDS（4，4′-二硫代吡啶）法（下述实施例也用此法）测定的。

紫外吸收谱：λmax    305nm

红外吸收谱：3440、2960、1730、1710、1570、1180、700cm^-1

元素分析（%）实测）：C62.80、H6.94、N3.04

分子量（GBC分析）： Mw＝1810、 Mn＝1700、

Mw/Mn＝1.06

实施例2

含马来酰亚氨基的共聚物（1）的合成

（a）部分水解的苯乙烯-马来酐共聚物的合成

在30.0ml二恶烷中溶解10.0g由实施例1（b）中所述方法制得的苯乙烯-马来酐共聚物，并在添加15.0ml水后，将溶液搅拌回流24小时。将该反应混合物直接冷冻干燥，得到10.2g具有下述物理性质的部分水解苯乙烯-马来酐共聚物。该产物的马来酐环含量用实施例1（b）的相同方式以红外吸收分光光度法测定。从而所测得的平均含量为在每一分子共聚物中有1.0个。

分子量（GPC分析）： Mw＝1460、 Mn＝1340、

Mw/Mn＝1.09

（b）借助N-（6-氨基己基）马来酰亚胺盐酸化物与部分水解的苯乙烯-马来酐共聚物之间的反应来合成含马来酰亚氨基的共聚物

向8.0ml的0.8M碳酸氢钠水溶液中添加116mg由实施例1（a）所述方法制得的（0.5毫摩尔）N-（6-氨基己基）马来酰亚胺盐酸化物，并在将该混合物边用冰冷却边搅拌的同时，逐渐添加800mg（0.55毫摩尔）上述（a）中所得部分水解的苯乙烯-马来酐共聚物，使反应在搅拌下进行4小时。对所产生的反应混合物取样，并用TNBS法测定氨基反应比率。所测得的反应比率为78%。然后，以实施例1（c）中相同的方式对反应混合物进行凝胶渗透色谱分离，并将洗出液冻干，得到560mg所需的含马来酰亚胺共聚物。该产物为两种共聚物的混合物，其中的一种共聚物含有结构式

所示基团作组成单元（a），结构式 所示基团作组成单元（b），而且在其一端上还含有结构式：

所示基团（式中Q¹¹和Q²¹中的一个为羧基，而另一个为

而另一种共聚物含有结构式

所示基团作组成单元（a），结构式 所示基团作组成单元（b），

而且还在上述组成单元之间含有通式

所示的基团（式中Q¹¹和Q²¹中的一个为羧基，另一个为

该产物的平均马来酰亚氨基含量为每一共聚物分子中有0.6个。该共聚物的红外吸收谱示于图1。

实施例3

含马来酰亚氨基的共聚物（2）的合成

（a）6-（N-马来酰亚氨基）己酰氯的合成

在80ml氯仿中添加13.20g（0.10摩尔）6-氨基-正己酸和9.80g（0.10摩尔）马来酐，并将该混合物搅拌回流5小时。从反应混合物中蒸除氯仿并添加80ml乙酸酐和2.50g无水乙酸钠。该混合物在90℃下搅拌4小时。将该反应混合物冷至室温，并滤去所生成的沉淀。从滤液中蒸除溶剂，得到一种粘稠液体。用2∶8（体积比）的丙酮和正己烷混合物作洗脱液，对该液体进行硅胶柱色谱分离。该步骤产生5.40g具有下列物理性质的6-（N-马来酰亚氨基）己酸。

熔点：84.0-85.0℃

紫外吸收光谱：λmax    298nm

红外吸收光谱：2940、1705、1406、818、700cm^-1

向5ml经蒸馏法气提过乙醇的氯仿中，添加253mg（1.2毫摩尔）6-（N-马来酰亚氨基）己酸，714mg（6.0毫摩尔）亚硫酰氯及10μl吡啶，并将该混合物在室温下搅拌5小时，从反应混合物中蒸除低沸点馏分，得到283mg6-（N-马来酰亚氨基）乙酰氯。

（b）在一端上含结构式

所示基团并经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物的合成

在30ml对异丙基苯乙酸中添加4.30g（44毫摩尔）马来酐，并在150℃下将混合物搅拌至溶解。在约17分钟的时间，向该溶液滴加一种由0.16g（0.59毫摩尔）过氧化二异丙苯和2.30g（22毫摩尔）苯乙烯一起溶于15ml对异丙基苯乙酸中的溶液。滴加完毕后，将反应混合物在加热下继续搅拌15分钟。冷却反应混合物并在约30分钟的时间边搅拌边滴加2l己烷。过滤回收所产生的沉淀物并干燥之，得到8.10g在一端有结构式

所示基团的苯乙烯-马来酐共聚物。

在160ml丙酮中溶解8.00g上述苯乙烯-马来酐共聚物。然后，将240ml正己烷在约20分钟的时间边搅拌边滴加到该溶液中。将所获呈白色混浊的丙酮-正己烷混合物转移到另一容器中，在连续搅拌下，将400ml正己烷在约30分钟的时间内滴加于其中。将所产生的浆状产物溶于丙酮中并回收之。从该溶液中减压蒸除丙酮，将残留物在70-80℃下，真空干燥过夜，得到2.80g在一端上有结构式

所示基团的分级分离的苯乙烯-马来酐共聚物。经GPC分析测定，该共聚物的 Mw和 Mn值分别为1460和1190， Mw/ Mn比为1.23。

向20ml正丁醇中添加1.00g经分级沉淀的苯乙烯-马来酐共聚物和10mg无水乙酸锂，将混合物在95℃下搅拌20小时。然后，减压蒸除正丁醇。在残留物中添加10ml二恶烷，将该混合物冻干，得到1.20g在一端上有结构式

所示基团并经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物白色粉末。红外吸收光谱分析未发现任何残留马来酐环。经GPC分析测定，该共聚物的 Mw和 Mn值分别为1，900和1，540， Mw/ Mn比为1.23。

向20ml的1N氢氧化钠水溶液中添加1.00g上述半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物，在室温下将该混合物搅拌4小时。边搅拌边渐渐添加2.5N盐酸，将该反应混合物调到pH1-2，将过滤并洗涤过的沉淀锶芙庥?0ml丙酮中。在该溶液中添加1ml的2.5N盐酸，得到均质的酸性溶液，用30ml水稀释该酸性溶液并减压蒸除丙酮。经过滤、洗涤及干燥来回收所产生的沉淀物。该步骤产生0.85g在一端上有结构式

所示基团并经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物。

红外吸收光谱：3200、2960、1740、1712、

1460、1170、708cm^-1

（c）借助6-（N-马来酰亚氨基）己酰氯和一端上有结构式

所示基团且经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物之间的反应来合成含马来酰亚氨基的共聚物

向2.0ml四氢呋喃中添加283mg（1.2毫摩尔）上述（a）中制得的6-（N-马来酰亚氨基）己酰氯，50μm吡啶及100mg（0.05毫摩尔）在一端上有结构式

所示基团且经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物，将该混合物在室温下边搅拌边反应5小时。反应混合物经过滤并除去未反应的6-（N-马来酰亚氨基）己酰氯，对滤液进行GPC法分离〔仪器：LC-9，日本分析工业有限公司出品;柱：JAIGEL IH 20×600mm（直径）×2;洗脱液：四氢呋喃〕。从富含所需产物的级分中减压蒸除四氢呋喃，得到105mg的一种固体反应产物，将该产物加入200ml磷酸盐缓冲液（pH8.0）中，在室温下将混合物搅拌3小时，使由6-（N-马来酰亚氨基）己酰氯与原料共聚物中的羧基反应所形成的混合酸酐键水解。将该反应混合物用2.5N盐酸在搅拌下调节到pH1-2。将所产生的沉淀过滤、洗涤并溶于20ml丙酮中。向所得溶液中加入0.5ml的2.5N盐酸，得到一种均质酸性溶液。用30ml水稀释该酸性溶液并减压蒸除丙酮。将所产生的沉淀过滤、洗涤并干燥之而回收。该步骤产生80mg在一端上有结构式

所示基团且经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物。每一共聚物分子的平均马来酰亚氨基含量为0.4个。上述产物的红外吸收光谱示于图2。

实施例4

含马来酰亚氨基的共聚物（2）的合成

（a）一端上有结构式 所示基团且经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物的合成

对实施例3（b）所述步骤制备的、在一端上有结构式

所示基团的苯乙烯-马来酐共聚物进行上述分级沉淀。使所产生的浆状物质保留在原容器中，而2∶8（体积比）的丙酮与正己烷混合物则转移到另一容器中，在该容器中将溶剂减压蒸除，得到3.0g的粘稠液体。将该粘稠液体溶于4.5ml四氢呋喃中，并用实施例3（c）中的相同方式对该溶液进行GPC分离。从含有所需产物的洗出液中，将四氧呋喃减压蒸除。该步骤产生0.90g在一端上有结构式 所示基团的分级苯乙烯-马来酐共聚物。经GPC分析测定，该共聚物的 Mw和 Mn值分别为790和770， Mw/ Mn比为1.03。

将如上制得的苯乙烯-马来酐共聚物（0.80g）半正丁酯化，然后以实施例3（b）中的相同方式使之水解，得到0.54g在一端上有结构式

所示基团且经半正丁酯化的苯乙烯-马来共聚物。经GPC分析测定，该产物的 Mw和 Mn值分别为1010和980， Mw/ Mn比为1.03。

（b）借助6-（N-马来酰亚氨基）己酰氯与一端上有结构式

所示基团并经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物之间的反应来合成含马来酰亚氨基的共聚物

使用0.20g（0.2毫摩尔）由上述（a）中所述方法制得的、在一端上有结构式

所示基团且经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物和0.23g（1.0毫摩尔）用实施例3（a）中的步骤所制得的6-（N-马来酰亚氨基）己酰氯，重复实施例3（c）的反应，产生0.17g在一端上有结构式

所示基团且经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物。

实施例5

含马来酰亚氨基的共聚物（2）的合成

（a）乙二醇双（3-N-马来酰亚氨基丙基）醚的合成

在25-30℃时，一边连续搅拌一边在1小时内向21.6g（0.22毫摩尔）马来酐溶于60ml丙酮的溶液中滴加17.60g（0.10摩尔）乙二醇双（3-氨基丙基）醚溶于90ml丙酮的溶液。滴加完毕后，加入0.20g溴化锂，5ml三乙胺和25.50g（0.25摩尔）乙酸酐，并在60℃下将反应混合物搅拌2小时。将该反应混合物冷至室温，并滴加200ml水。用二氯甲烷萃取混合物，用水洗涤有机层，并在无水硫酸钠上进行干燥。从有机层蒸出溶剂，产生一种粘稠液体。向该粘稠液体中添加500ml环己烷，并在50-60℃下将混合物搅拌10分钟，在此之后，使之静置一段时间。将上清液冷至室温，产生0.80g具有下列物理性质的白色乙二醇双（3-N-马来酰亚氨基丙基）醚结晶。

紫外吸收光谱：λmax    300nm

红外吸收光谱：3100、2890、1700、1410、

1116、844、698cm^-1

（b）硫代乙酸S-对异丙基苯酯的合成

在300ml氯仿中添加80.0g（0.67摩尔）异丙基苯，在-10°至0℃的冰浴中边冷却边搅拌该混合物。在约30分钟的时间，向该溶液滴加89ml（1.34摩尔）经蒸馏提纯的氯代磺酸。滴加毕，在室温下将该混合物搅拌30分钟。将反应混合物倾入冰水中，并用200ml氯仿萃取之。用每份500ml的冰水洗涤萃出物3次，然后加入无水硫酸镁使之干燥。从该萃出物中减压蒸出氯仿，得到55.0g对异丙基苯磺酰氯（以异丙基苯为基准计的收率：38%）。

在容量为2升的三颈烧瓶中装入500g冰，然后小心地加入100ml浓硫酸。将所得水溶液冷至0℃并加入55.0g（0.25摩尔）上面制备的对异丙基苯磺酰氯。然后，在将溶液温度保持在0-2℃的同时，逐渐加入锌粉。反应在搅拌下进行24小时，然后再在搅拌下回流1.5小时。将反应混合物冷至室温并用正己烷萃取。使萃出物在无水硫酸镁上干燥并进行蒸馏，得到24.2g在106.5-107.5℃/21mmHg时沸腾的对异丙基硫酚（以对异丙基苯磺酰氯为基准计的收率：63%）。

在500ml乙醚中溶解24.2g（0.13摩尔）的上述对异丙基硫酚，随之加入10.7ml（0.14摩尔）乙酰氯。将溶液置冰浴上搅拌，同时将11.4ml（0.14摩尔）吡啶在10分钟期间滴加于其中。滴加毕，将混合物在室温下搅拌过夜。过滤所产生的反应混合物以除去沉淀物。滤液用蒸馏水洗涤两遍，再在无水硫酸镁上干燥，然后进行蒸馏，得到21.6g在148-150℃/20mmHg沸腾的硫代乙酸S-对异丙基苯酯（以对异丙基硫酚为基准计的收率：85%）。

（c）一端上有结构式

所示基团并经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物的合成

在氮气流中，将4.30g（44毫摩尔）马来酐加到15ml上述（b）中所得的硫代乙酸S-对异丙基苯酯中，并在约150℃下对混合物边搅拌边加热。然后，在约15分钟的时间将0.16g（0.59毫摩尔）过氧化二异丙苯和2.30g（22毫摩尔）苯乙烯溶于10ml硫代乙酸S-对异丙基苯酯所组成的溶液滴加到上述溶液中。滴加毕，将混合物在加热下继续搅拌15分钟。在冷至室温后，在约30分钟时间内边搅拌边滴加2l正己烷。经过滤及干燥，回收所产生的沉淀物，得到7.60g在一端上有结构式

所示基团的苯乙烯-马来酐共聚物。

在150ml丙酮中加入7.60g上述苯乙烯-马来酐共聚物，然后在约30分钟的时间，边搅拌边滴加225ml正己烷于该溶液中。将产生白色混浊的丙酮-正己烷混合物转移到另一容器中，并在约40分钟的时间边搅拌边向上述混合物中滴加375ml正己烷。将产生的浆状物溶于丙酮并回收之。从该回收的溶液中减压蒸出丙酮，在室温下真空干燥残留物过夜。该步骤得到2.90g分级沉淀的、在一端上有结构式 所示基团的苯乙烯-马来酐共聚物。该产物经GPC分析测定，其 Mw及 Mn值分别为1450及1180。（ Mw/ Mn＝1.23）。

向20ml正丁醇中添加1.00g分段沉淀过的苯乙烯-马来酐共聚物和10mg无水乙酸锂，将该混合物在95℃下边加热边搅拌20小时。减压蒸馏反应混合物，除去正丁醇。在残留物中添加10ml二恶烷，并将混合物冻干，得到1.20g在一端上有结构式 所示基团、并经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物。红外吸收分光光度测定未发现在该产物中有任何残留马来酐环。该产物经GPC分析测定，其 Mw及 Mn值分别为1950及1590。（ Mw/ Mn＝1.23）。

在20ml的1N氢氧化钠水溶液中添加0.25g上述半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物，并将混合物在室温下搅拌20分钟。然后，边搅拌边逐渐添加2.5N盐酸，将反应混合物调至pH1-2。将所产生的沉淀过滤、洗涤并将其溶于20ml丙酮中。在该溶液中添加1ml的2.5N盐酸，得到一种均质的酸性溶液。用30ml水稀释该酸性溶液并减压蒸出丙酮。将沉淀物过滤、洗涤并干燥回收，得到0.23g在一端上有结构式 所示基团，且经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物。其物理性质数据如下。

红外吸收光谱：3200、2960、1740、1710、

1455、1170、705cm^-1

（a）借助乙二醇二（3-N-马来酰亚氨基丙基）醚与在一端上有结构式

所示基团且经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物的反应来合成含马来酰亚氨基的共聚物

在1ml乙腈中溶入40mg（1.2×10^-4摩尔）上述（a）中制取的乙二醇二（3-N-马来酰亚氨基丙基）醚，在该溶液于室温下搅拌的同时，将40mg（2×10^-5摩尔）上述（c）中制取的、在一端上有结构式

所示基团且经半正丁酯化的苯乙烯-马来共聚物，在约5分钟的时间逐渐加入其中。添加毕，继续将混合物搅拌5小时。过滤反应混合物，并为除去未反应的乙二醇二（3-N-马来酰亚氨基丙基）醚，对滤液进行GPC分离（仪器：LC-9，日本分析工业有限公司出品;柱：JAIGEL IH，20×600mm直径×2;洗脱液：氯仿）。从洗出液中减压蒸出氯仿，产生28mg在一端上有结构式

所示基团且经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物。该共聚物的平均马来酰亚氨基含量为每一共聚物分子有0.6个。该产物的红外吸收光谱示如图3。

实施例6

含马来酰亚氨基的共聚物（2）的合成

（a）N，N′-六亚甲基二马来酰亚胺的合成

在约1小时的时间，向11.60g（0.10摩尔）1，6-二氨基己烷溶于50ml氯仿的溶液中滴加19.60g（0.20摩尔）马来酐溶于100ml氯仿的溶液。滴加毕，反应在氯仿回流的条件下进行4小时。将所产生的反应混合物减压蒸馏以除去氯仿，并将7.5g无水乙酸钠和100ml乙酸酐加入残留物中。混合物在90℃下搅拌4小时，之后将其冷至室温。滤去所产生的沉淀物并减压蒸出溶剂，得到粘稠的液体。用丙酮和正己烷的2∶8（体积比）混合物作洗脱液，对该液体进行硅胶柱色谱分离，得到初结晶。使初结晶从苯中重结晶出来，得到1.37gN，N′-六亚甲基二马来酰亚胺，其物理常数如下。

熔点：136-137℃

紫外吸收光谱：λmax    300nm

红外吸收光谱：3000、2950、1700、1450、

1410、840、700cm^-1

（b）借助N，N′-六亚甲基二马来酰亚胺与在一端上有结构式

所示基团并经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物间的反应来合成含马来酰亚氨基的共聚物

在10ml乙腈中溶入199mg（7.2×10^-4摩尔）上述（a）中制得的N，N′-六亚甲基二马来酰亚胺。在约5分钟的时间，向该溶液滴加240mg（1.2×10^-4摩尔）用实施例5（c）中的同样方法制备的、在一端上有结构式

所示基团且经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物。滴加毕，继续将混合物搅拌5小时。然后减压蒸馏反应混合物，除去乙腈，并用3ml氯仿稀释残留物，然后加以过滤。为除去未反应的N，N′-六亚甲基二马来亚胺，对滤液用实施例5（d）的同样方式进行GPC分离。该步骤得到120mg在一端上有结构式

所示基团且经半正丁酯化的苯乙烯-马来酐共聚物。该共聚物的平均马来酰亚氨基含量为每一共聚物分子有0.5个。该共聚物的红外吸收光谱示于图4。

实施例7

含马来酰亚氨基的共聚物（1）的合成

重复实施例1（b）的步骤，但用3.02g正己醇代替2.20g正丁醇，得到9.8g经部分正己基酯化的苯乙烯-马来酐共聚物。然后，以实施例1（C）的同样方式，使116mgN-（6-氨基己基）马来酰亚胺盐酸化物与850mg经部分半正己基酯化的苯乙烯-马来酐共聚物发生反应，得到550mg所需的含马来酰亚氨基共聚物。该产物为两种共聚物的混合物，其中一种共聚物含有结构式

所示基团作组成单元（a），结构式 所示基团作组成单元（b）（式中R⁷为正己基或氢）以及在一端上由结构式

所表示的基团（式中Q¹¹和Q²¹中的一个为羧基，另一个为结构式

所示基团），另一种共聚物含有结构式 所示基团作组成单元（a）、结构式 所示基团作组成单元（b）（式中R⁷为正己基或氢）以及通式

所示位于上述两种组成单元之间的基团（式中Q¹¹和Q²¹中的一个为羧基，另一个为结构式

所示的基团）。该产物的平均马来酰亚氨基含量为每一共聚物分子有0.5个。

实施例8

含马来酰亚氨基共聚物（3）的合成

在20ml乙苯中加入2.16g马来酐，并在约110℃下搅拌该混合物。在约15分钟的时间，向上述溶液中滴加一种在10ml乙苯溶解108mg偶氮异丁腈、2.08g苯乙烯及289mg硫代乙酸S-4-巯基丁酯所成的溶液。滴加毕，将混合物继续搅拌15分钟，然后使之冷却。将该反应混合物在约30分钟期间，边连续搅拌边滴加到2l己烷中。将所产生的沉淀过滤回收，用己烷洗涤并干燥之，得到4.10g在一端上有结构式CH₃COS-（CH₂）₄-S-所示基团的苯乙烯-马来酐共聚物。

在40ml异戊醇中加入2.00g上述共聚物和20mg无水乙酸锂，将该混合物在95℃下搅拌20小时。从如此所得的反应混合物中，减压蒸出异戊醇。用20ml二恶烷稀释残留物并加以冻干，得到2.38g在一端上有结构式CH₃COS-（CH₂）₄-S-所示基团并经半异戊基酯化的苯乙烯-马来酐共聚物。

以实施例5（c）中所述用1N氢氧化钠水溶液处理在一端上具有结构式

所示基团并经半正丁基酯化的苯乙烯-马来酐共聚物的相同方法，将0.25g在一端上具有结构式CH₃COS-（CH₂）₄-S-所示基团并经半异戊基酯化的苯乙烯马来酐共聚物，用20ml的1N氢氧化钠水溶液进行处理，得到0.21g在一端上具有结构式HS-（CH₂）₄-S-所示基团并经半异戊基酯化的苯乙烯-马来酐共聚物。

然后，以同实施例5（d）的方法，使40mg在一端上具有结构式HS-（CH₂）₄-S-所示基团并经半异戊基酯化的苯乙烯-马来酐共聚物与40mg乙二醇二（3-N-马来酰亚氨基丙基）醚反应，得到24mg在一端上具有结构式

所示基团并经半异戊基酯化的苯乙释-马来酐共聚物。该产物的平均马来酰亚氨基含量为每一共聚物分子有0.4个。

实施例9

借助SOD与实施例1中含马来酰亚氨基共聚物（1）之间的反应来合成SOD衍生物

在2.5ml的0.1N三羟甲基氨基甲烷盐酸水溶液（pH8.0）中溶解360μm人型SOD水溶液（87mg/ml）。在搅拌下逐渐向该溶液添加一种由36.6mg实施例1所制含马来酰亚氨基共聚物溶于150μl二甲亚砜的溶液。在室温下将混合物搅拌3小时，然后令其在4℃下静置过夜。过滤反应混合物，并在Sephadex    G-75（Pharmacia精细化学公司出品）上使用20mM磷酸盐缓冲剂（pH7.2）作洗脱液，对滤液进行凝胶过滤。汇集富含SOD的级分和富含SOD衍生物的级分，对其进行超滤，得到3ml浓缩液。该浓缩液中的蛋白含量为7.7mg/ml。在AH-Sepharose    4B（Pharmcia精细化学公司出品）上对500μl-份的浓缩液进行亲合柱色谱（凝胶：2ml）分离，用10ml含有0.1M碳酸氢钠的10mM磷酸盐缓冲剂进行洗脱，得到含有未反应SOD的级分。然后，用10ml含0.1M碳酸氢钠和3M氯化钠的10mM磷酸盐缓冲剂继续对色谱柱进行洗脱，得到含SOD衍生物的级分。用超滤法将含SOD衍生物的级分浓缩到2000μl。SOD衍生物的产量为1mg。图5（a）、（b）、（c）、（d）及（e）分别示出原料SOD的电泳图，如上所得反应混合物的电泳图，凝胶过滤所得含SOD和SOD衍生物的级分的电泳图，亲合柱色谱所得SOD级分的电泳图，以及亲合柱色谱所得SOD衍生物级分的电泳图。图6（1）、（2）及（3）分别示出原料SOD、含马来酰亚氨基共聚物原料及产物SOD衍生物的紫外吸收光谱。

实施例10

借助SOD与实施例3中含马来酰亚氨基共聚物（2）之间的反应来合成SOD衍生物

在2.5ml磷酸盐缓冲剂（pH7.5）中加入150μl（6.4×10^-7摩尔）的人型SOD水溶液（68mg/ml），并对该混合物在5-10℃下进行搅拌。向该溶液中逐渐加入25.0mg（1.2×10^-5摩尔）实施例3中含马来酰亚氨基的共聚物（2），继续将混合物搅拌20小时。过滤反应混合物，并在Sephadex G-75SF（Pharmacia精细化学公司出品）上用10mM碳酸氢铵水溶液作洗脱液对滤液进行凝胶渗透色谱分离（柱：K26/40，Pharmacia精细化学公司出品）。将SOD衍生物级分冻干，得到11.2mg所需的SOD衍生物。该产物的红外吸收光谱示于图7。

实施例11

借助SOD与实施例3中含马来酰亚氨基共聚物（2）之间的反应来合成SOD衍生物

在400μm人型SOD（87mg/ml）水溶液中添加400μl的0.25M磷酸-氢钾水溶液，使pH为8.0。在搅拌下逐渐向该水溶液中添加一种由43.0mg实施例3中的含马来酰亚氨基共聚物（2）溶于100μl二甲亚砜中制得的溶液。添加毕，用1M三羟甲基氨基甲烷水溶液将反应混合物调至pH8.0，并在室温下将混合物搅拌3小时，然后使其在4℃下静置过夜。过滤反应混合物，并在Sephadex    G-50（Pharmacia精细化学公司出品）上，用20mM磷酸盐缓冲剂（pH7.2）作洗脱液，对滤液进行凝胶渗透色谱分离。汇集含有SOD和SOD衍生物的诸级分，并用超滤法将其浓缩至1.3ml左右。浓缩物中蛋白质含量为23.6mg/ml。在AH-Sepharose    4B（Pharmacia精细化学公司出品）上对1.2ml一份的该浓缩物进行亲合柱色谱（凝胶：15ml）分离，并用45ml的0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液作洗脱剂进行洗脱，以回收含未反应SOD的级分。然后，继续用45ml含1M氯化钠的0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液（pH8.0）进行洗脱，回收含SOD衍生物的级分。对该SOD衍生物级分进行超滤，并使浓缩物对20mM磷酸盐缓冲剂（pH7.2）渗析（1.5l×3次），得到1.6ml含SOD衍生物的溶液。SOD衍生物的产量为17mg。图8（a）、（b）、（c）、（d）及（e）分别示出原料SOD、上述所得反应混合物、凝胶渗透色谱法所得含SOD与SOD衍生物汇集级分、亲合柱色谱法所得SOD级分及亲合柱色谱法所得SOD衍生物级分的电泳图。

实施例12

借助SOD与实施例4中含马来酰亚氨基共聚物（2）之间的反应来合成SOD衍生物

重复实施例10的反应步骤与分离步骤，但用13.0mg（1.3×10^-5摩尔）实施例4中含马来酰亚氨基共聚物（2）代替25.0mg实施例3中含马来酰亚氨基共聚物。在该方法中得到8.8mg SOD衍生物。

实施例13

借助SOD与实施例5中含马来酰亚氨基共聚物（2）之间的反应来合成SOD衍生物

重复实施例10的反应步骤和分离步骤，但用29.2mg（1.3×10^-5摩尔）实施例5中含马来酰亚氨基共聚物（2）代替25.0mg实施例3中含马来酰亚氨基共聚物。在该方法中得到10.3mg SOD衍生物。

实施例14

借助SOD与实施例6中含马来酰亚氨基共聚物（2）之间的反应来合成SOD衍生物

重复实施例10的反应步骤与提纯步骤，但用26.0mg（1.3×10^-6摩尔）实施例6中含马来酰亚氨基共聚物（2）代替25.0mg实施例3中含马来酰亚氨基共聚物（2），得到9.8mg SOD衍生物。图9的（1）、（2）及（3）分别示出原料SOD、含马来酰亚氨基共聚物原料及产物SOD衍生物的紫外吸收光谱。产物SOD衍生物的红外吸收光谱示于图10。

实施例15

借助SOD与实施例7中含马来酰亚氨基共聚物（1）之间的反应来合成SOD衍生物

重复实施例9的反应步骤和分离步骤，但用45.0mg实施例7中含马来酰亚氨基共聚物（1）来代替36.6mg实施例1中含马来酰亚氨基共聚物（1），得到35.8mg    SOD衍生物。

实施例16

借助SOD与实施例8中含马来酰亚氨基共聚物（3）之间的反应来合成SOD衍生物

重复实施例10的反应步骤及分离步骤，但用30mg实施例8中含马来酰亚氨基共聚物（3）代替25.0mg实施例3中含马来酰亚氨基共聚物（2），得到13.8mg    SOD衍生物。

试验例1

SOD衍生物的血液浓度

在将实施例9中所得SOD及SOD衍生物分别溶于蒸馏水后，将2μci的¹²⁵I-博尔顿-亨特（¹²⁵I-Bolton-Hunter）试剂加到每一种溶液中，并在室温下摇振反应1小时。使如此得到的反应混合物在4℃下静置过夜，然后对含0.15M氯化钠20mM磷酸盐缓冲剂（pH7.3）进行渗析（5l×3次）。测量渗析液的每单位体积放射性，然后用生理盐水溶液将其稀释到预定浓度。将针头插入每个经戊巴比妥麻醉的大鼠（SD品种，雄性，7周龄，体重约200g）的股静脉中，并输注0.2ml肝素溶液（1，000U/ml）。然后将200，000cpm（500μl）/大鼠的上述标记过的SOD或标记过的SOD衍生物溶液注入股静脉。尔后，按一定时间间隔将血液以每份100μl从股静脉中抽出，并用伽玛计数器测量放射性，以此来测定血液浓度。SOD和SOD衍生物的血液浓度时间过程分别示于图11（1）及（2）。

试验例2

SOD衍生物对大鼠冠状动脉再发性心律失常的影响

使大鼠（Wistar种，雄性，体重约200-230g）禁食过夜，然后以腹膜内戊巴比妥（50mg/kg体重）麻醉。经气管切开术后，接上人工吸收器，并在用人工吸收器控制吸收的条件下（换气体积/次数＝1.5cm³/100g体重;60次/分钟），经中位胸骨切开术暴露出心脏。借助左冠状动脉前下行分支（anterior descending branch）吸引术，在旋动脉分支（ramus circumflexus）区域外周约3mm处闭锁冠状动脉15分钟。在30分钟间隔内进行两次局部缺血再发步骤，并在第一次再发后15分钟，将每种药物以5mg/kg体重的剂量（总体积0.1ml）注入股静脉。用作药物的是溶于生理盐水的人型红血球中分离出来的SOD和实施例9中所得的SOD衍生物。在每次再发过程中，连续监视心电图（导联Ⅱ）3分钟，并对室缩过早（PVC）、室动过速（VT）及室纤维颤动（Vf）进行研究。在第二次局部缺血之前、第二次局部缺血后15分钟及第二次再发后10秒、30秒及3分钟所记录的心电图〔下称ECG_S〕，分别示于图12的横排（1）、（2）、（3）、（4）及（5）。图12中，给予上述人型SOD的试验组，其ECG_S示于竖行（A），给予实施例9所得SOD衍生物的试验组，其ECG_S示如竖行（B）。

在不给药的对比组中，两次再发之间的心律失常发作无任何明显差别。由图12看到，尽管SOD处理组未见再发性心律失常抑制作用，但用SOD衍生物处理的组却呈现该衍生物的显著抗心律失常疗效。

制剂例1

按现有制药方法，用下列成分制备肠溶胶囊。

实施例9的SOD衍生物    20mg

乳糖    46mg

玉米淀粉    16mg

结晶纤维素    12mg

乙醇酸纤维素酯    5mg

山梨醇    10mg

总计（每个胶囊）    109mg

给入服用上述肠溶胶囊，一般每个成人服用2个胶囊，每日三次，饭后服用。

制剂例2

按现有制药方法，用下列成分制备肠溶片剂。

实施例9的SOD衍生物    20mg

乳糖    79mg

玉米淀粉    45.5mg

硬脂酸镁    0.5mg

总计（每片）    145mg

上述肠溶片剂给人服用，一般每个成人2片，每日三次，饭后服用。

制剂例3

用下述方法制备不经胃肠道的制剂。

在生理盐水中溶入10mg实施例9制得的SOD衍生物，使体积为5ml，并使该溶液滤过无菌微孔过滤器。将滤液封装到无菌琥珀色小瓶（Ⅰ型，3ml）中。

Claims (12)

1、一种共聚物，其中包含聚合物组成单元(a)和(b)：

(a)选自通式

所示基团类中的一个基团，式中R¹、R³及R⁵各自分别为氢原子或甲基，R²为氢、氯或溴的原子，或者甲基，R⁴为氢原子、含1-6个碳原子的烷基或含3-6个碳原子的环烷基，以及R⁶为甲基或乙基；而且

(b)为通式

所示的一个基团，式中R⁷为氢原子或者含1-8个碳原子的链烷醇，其烷基部分含1-4个碳原子的乙二醇单烷基醚或其烷基部分各含1-4个碳原子的丙三醇二烷基醚在从其中除去羟基而衍生的残基；

而且其中还包含：

(c)(i)在内部，通式

所示的一个基团，式中Q¹¹和Q²¹中的一个为羧基，而另一个为通式

所示的一个基团，式中A¹为二价烃残基，该残基可任选地为一个或多个基团所间断，该基团各自分别选自由氧原子、硫原子、通式-N(R⁸)-(R⁸为氢原子或含1-4个碳原子的烷基)所示基团及结构式-NH-CO-NH-所示基团类；或者

(ii)在一端上，通式

所示基团，式中W为二价有机基团；该共聚物的平均分子量为400-20，000。

2、权利要求1所述的共聚物，其中通式

所示的基团为通式

所示的一个基团，式中Q¹¹和Q²¹为如权利要求1所定义者，而Q³为一价有机基团。

3、权利要求1所述的共聚物，其中W为通式

所示的一个基团，式中A¹为如权利要求1所定义者，A²为-CO-O-、-CO-NH-、-CO-NH-CH₂-、-NH-CO-O-、-NH-CO-NH-、-NH-CO-NH-CH₂-、-N＝CH-、-NH-CH₂或

Q⁴和Q⁵各自分别为氢原子或含1-3个碳原子的烷基，m为0-4的整数，基团A¹连在马来酰亚氨基的氮原子上，或者W为通式

所示的一个基团，式中A¹为如上所定义者，A³为二价烃基，该烃基可任选地为一个或多个氧和/或硫原子所间断，基团A¹连在马来酰亚氨基的氮原子上。

4、一种由通式〔SOD〕〔Z〕n所代表的超氧物歧化酶衍生物，式中〔SOD〕为从SOD中的一个或两个巯基上除去氢原子后所衍生的一价或二价超氧物歧化酶残基，n为相应于〔SOD〕价数的整数1或2，同时〔Z〕为由一种共聚物衍生的一价基团，该共聚物包含聚合物组成单元（a）和（b）：

式中R¹、R³及R⁵各自分别为氢原子或甲基，R²为氢、氯或溴的原子或甲基，R⁴为氢原子、含1-6个碳原子的烷基或含3-6个碳原子的环烷基，同时R⁶为甲基或乙基;以及

（b）通式 所示的一个基团，式中R⁷为氢原子或为含1-8个碳原子的烷醇的、其烷基部分含1-4个碳原子的乙二醇单烷基醚的或其烷基部分各含1-4个碳原子的丙三醇二烷基醚的在除去羟基时所衍生的残基;

同时该共聚物还包含：

（c）（ⅰ）在内部，通式

所示的一个基团，式中Q¹和Q²中的一个为羧基，另一个为通式

所示的一个基团，式中A¹为二价烃残基，该残基可选选地为一个或多个基团所间断，该基团各自分别选自氧原子、硫原子、通式-N（R⁸）-所示的基团（R⁸为氢原子或含1-4个碳原子的烷基）及结构式-NH-CO-NH-所示基团类，琥珀酰亚胺环碳原子有一价连结到〔SOD〕上，或者

（ⅱ）在一端上，通式

所示基团，式中W为二价有机基团，琥珀酰亚胺碳原子有一价连结在〔SOD〕上;

该共聚物的平均分子量为400-20，000。

5、权利要求4所述的超氧物歧化酶衍生物，其中通式

所示基团为通式

所示的一个基团，式中Q¹和Q²为如权利要求4所定义者，同时Q³为一价有机基团。

6、权利要求4所述的超氧物歧化酶衍生物，其中W为通式

所示的一个基团，式中A¹为权利要求4中所定义者，A²为-CO-O-、-CO-NH-、-CO-NH-CH₂-、-NH-CO-O-、-NH-CO-NH-、-NH-CO-NH-CH₂-、-N＝CH-、-NH-CH₂-或

Q⁴和Q⁵各自分别为氢原子或含1-3个碳原子的烷基，并且m为0-4的整数，基团A¹连到马来酰亚氨基的氮原子上，或者W为通式

所示的一个基团，式中A¹为如上定义者，A³为可任选地被一个或多个氧和/或硫原子所间断的二价烃基，基团A¹连到马来酰亚氨基的氮原子上。

7、制备通式

〔SOD〕〔Z〕n

所示超氧物歧化酶衍生物的方法，式中〔SOD〕为从SOD中的一个或两个巯基上除去氢原子后所衍生的一价或二价超氧物歧化酶残基，n为相应于〔SOD〕价数的整数1或2，同时〔Z〕为由一种共聚物衍生物一价基团，该共聚物包含聚合物组成单元（a）和（b）：

（a）：

式中R¹、R³及R⁵各自分别为氢原子或甲基，R²为氢、氯或溴的原子或者甲基，R⁴为氢原子、含1-6个碳原子的烷基或含3-6个碳原子的环烷基，同时R⁶为甲基或乙基;以及

（b）通式：

所示的一个基团，式中R⁷为氢原子或为含1-8个碳原子的链烷醇，其烷基部分含1-4个碳原子的乙二醇单烷基醚或其烷基部分各含1-4个碳原子的丙三醇二烷基醚在从其中除去羟基时所衍生的残基;同时该共聚物还包含：

（c）（ⅰ）在内部，通式 所示的一个基团，式中Q¹和Q²中的一个为羧基，另一个为通式

所示的一个基团，式中A¹为二价羟残基，该残基可任选地为一个或多个基团所间断，该基团各自分别选自氧原子、硫原子、通式-N（R⁸）-所示基团（R⁸为氢原子或含1-4个碳原子的烷基）及结构式为-NH-CO-NH-所示基团类、琥珀酰亚胺环碳原子有一价连结到〔SOD〕上;或者

（ⅱ）在一端上，通式

所示的一个基团，式中W为二价有机基团，琥珀酰亚胺碳原子有一价连结到〔SOD〕上;该共聚物的平均分子量为400-20，000，

该方法包括，在pH6-10的水溶液中使超氧物歧化酶与一种共聚物反应，该共聚物的平均分子量为400-20，000并包含聚合物组成单元（a）和（b）：

（a）选自通式

这些基团类中的一个基团，式中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵及R⁶为如上所定义者;以及

（b）通式 所示的一个基团，式中R⁷为如上所定义者;而且该共聚物还包含：

（c）（ⅰ）通式 所示的一个内部基团，式中Q¹¹和Q²¹中的一个为羧基，而另一个为通式

所示的一个基团，式中A¹为如上定义者;或者

（ⅱ）在一端上，通式

所示的一个基团，式中W为如上定义者。

8、一种治疗炎症和/或局部缺血疾病用的医药组合物，该组合物包括治疗上述炎症和/或局部缺血疾病有效量的在权利要求4中所述的超氧物歧化酶衍生物和医药上允许采用的稀释剂或载体。

9、一种治疗炎症和/或局部缺血疾病的方法，该方法包括给患有上述炎症和/或局部缺血疾病的患者服用治疗上述炎症和/或局部缺血疾病有效量的在权利要求4中所述的超氧物歧化酶衍生物。

10、一种药物，该药物含有权利要求4所述的超氧物歧化酶衍生物。

11、一种制造共聚物的方法，该共聚物的平均分子量为400-20，000并且包含有组成单元（a）和（b）：

（a）选自通式

所示基团类中的一个基团，式中R¹、R³及R⁵各自分别为氢原子或甲基，R²为氢、氯或溴的原子，或为甲基，R⁴为氢原子，含1-6个碳原子的烷基或含3-6个碳原子的环烷基，同时R⁶为甲基或乙基;以及

（b）通式 所式的一个基团，式中R⁷为氢原子，或为含1-8个碳原子的链烷醇，其烷基部分含1-4个碳原子的乙二醇单烷基醚或其烷基部分各含1-4个碳原子的丙三醇二烷基醚在从其中除去羟基后所衍生的残基;而该共聚物还含有：

（c）在一端上，通式 所示的一个基团，式中Q¹¹和Q²¹中的一个为羧基，另一个为通式

所示的一个基团，式中A¹为二价烃残基，该残基可任选地被一个或多个基团所间断，该基团各自分别选自氧原子、硫原子、通式-N（R⁸）-所示的基团（R⁸为氢原子或含1-4个碳原子的烷基）及结构式-NH-CO-NH-所示的基团，同时Q³为一价有机基团;或者通式

所示的一个基团，式中Q¹¹和Q²¹为如上定义者，该方法包括，使通式

所示的化合物与一种共聚物反应，式中A¹为如上定义者，T¹为可与马来酐环反应的基团，上述共聚物的平均分子量为400-20，000并且包含有聚合物组成单元（a）和（b）：

（a）选自通式

所示基团类中的一个基团，式中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵及R⁶为如上定义者;以及

（b）通式 所示的一个基团，式中R⁷为如上定义者;该共聚物还包含：

（c）0.5-2个（每分子）通式 所示的基团。

12、一种生产共聚物的方法，该共聚物的平均分子量为400-20，000并且包含聚合物组成单元（a）和（b）：

（a）选自通式

所示基团类中的一个基团，式中R¹、R³及R⁵各自分别为氢原子或甲基，R²为氢、氯或溴原子，或甲基，R⁴为氢原子、含1-6个碳原子的烷基或含3-6个碳原子的环烷基，同时R⁶为甲基或乙基;以及

（b）通式 所示的一个基团，式中R⁷为氢原子，或者为含1-8个碳原子的链烷醇，其烷基部分含1-4个碳原子的乙二醇单烷基醚或其烷基部分各含1-4个碳原子的丙三醇二烷基醚在从其中除去羟基后所衍生的残基;而且该共聚物还包含：在一端上，通式

所示的一个基团，式中W为二价有机基团，该方法包括，用含1-8个碳原子的链烷醇、烷基部分含1-4个碳原子的乙二醇单烷基醚或烷基部分各自分别含1-4个碳原子的丙三醇二烷基醚将一种共聚物半酯化和/或使其水解，该共聚物是使（a′）与（b′）在一种具有一个官能团或一个被护官能团的聚合引发剂和/或一种具有一个官能团或被护官能团的链转移剂存在下进行游离基共聚而制得的，其中（a′）选自通式

所示化合物类中的一种单体，式中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵及R⁶为如上所定义者，

（b′）为马来酐，该共聚物在一端上具有上述官能团或被护官能团，且平均分子量为400-20，000;然后，在必要时，从端部被护官能团上除去保护基团，并使经如此改性过的共聚物与通式

所示化合物进行反应，式中W为二价有机基团，且T²为一个能与上述改性共聚物上官能团反应的基团。

Images