CN103734559A

CN103734559A - 一种麻疯树饼粕的发酵脱毒方法

Info

Publication number: CN103734559A
Application number: CN201310295700.3A
Authority: CN
Inventors: 陈放; 张晓喻; 唐琳; 尹利; 刘莹
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2013-07-15
Filing date: 2013-07-15
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2033-07-15
Also published as: CN103734559B

Abstract

本发明公开了一种麻疯树饼粕的发酵脱毒方法，包括如下步骤：（1）取日沟维肠杆菌和摩氏摩根菌，分别复苏制备日沟维肠杆菌种子液和摩氏摩根菌种子液，以1：2～2：1（v/v）的比例混合，得种子液；（2）取麻疯树饼粕，加水和碳源混匀，接种步骤（1）制备的种子液，其中，料水比为1：0.8～1.2（w/v），碳源的加入量为麻疯树饼粕的10～20%（w/w）；种子液的接种量为麻疯树饼粕的10～30%（v/w）；（3）在温度为30～37℃的条件下发酵2～8天，即可。本发明方法在有效降低麻疯树饼粕毒性的同时，还可以提高其营养价值，具有良好的市场应用前景。

Description

一种麻疯树饼粕的发酵脱毒方法

技术领域

本发明涉及一种麻疯树饼粕的发酵脱毒方法，属于发酵领域。

背景技术

麻疯树(Jatropha curcas L.)是世界公认的最有可能成为未来替代化石能源的具有巨大开发潜力的树种，利用麻疯树油加工生产的生物柴油在各项性能指标上接近甚至超过国家“0”号柴油以及国家生物柴油标准，因此以麻疯树果生产生物柴油已经成为现在研究生产生物柴油的一个活跃方向。麻疯树饼粕（Jatropha curcas seed cake，JCSC）是生物柴油生产过程中的副产物，具有很高的蛋白含量，但是蛋白的利用难度较大，并且其毒性大，多被作为肥料用或直接排放于自然环境中，不但严重地浪费了大量的优质蛋白资源，而且还造成了严重的环境污染。

麻疯树饼粕的主要毒性物质是佛波酯及其衍生物、胰蛋白酶抑制剂和Curcin。其中，胰蛋白酶抑制剂和Curcin是热不稳定性成分，简单的加热处理就可以使它们的分子构型发生变化，从而失去活性通过热处理可以使其大量减少，至几乎完全消失。但是，佛波酯(Phorbol-ester,PE)为热稳定性成分，毒性强，可以在160℃下耐受30min而不受影响，其结构属于四环二萜型，巴豆烷是佛波醇酯的基本结构部分，因此，脱除佛波酯是麻疯树饼粕利用的关键因素。目前，国内外多采用物理化学方法除去麻疯树油粕中的佛波酯，但是化学脱毒操作复杂过程繁琐、易导致化学物残留，而且脱毒范围小、成本高；而酶解只能降解某种毒素，针对性较强，钝化效果不一致；物理脱毒效率低，且对饼粕中的营养成分造成一定的破坏。微生物具有繁殖快、数量大、产酶系复杂等特点，利用微生物发酵工程技术脱毒是一种较为有效的方法，文献报道采用铜绿假单胞菌（P.aeruginosa PseA）发酵能够降解麻疯树籽粕中的佛波酯。

利用微生物发酵技术提高麻疯树饼粕的营养价值是一种较为有效的方法，如，产朊假丝酵母（C.utilis）即可发酵提高麻疯树籽粕的蛋白和氨基酸含量。

但是，目前的发酵方法都只能降低麻风树饼粕毒性或者提高其营养价值，不能兼顾麻疯树饼粕的脱毒和营养改善。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用两株新的菌株对麻疯树饼粕进行混合发酵的方法。

本发明麻疯树饼粕的发酵脱毒方法，包括如下步骤：

（1）取日沟维肠杆菌和摩氏摩根菌，分别复苏制备日沟维肠杆菌种子液和摩氏摩根菌种子液，以1：2～2：1（v/v）的比例混合，得种子液；

（2）取麻疯树饼粕，加水和碳源，混匀，接种步骤（1）制备的种子液，其中，料水比为1：0.8～1.2（w/v），碳源的加入量为麻疯树饼粕的10～20%（w/w）；种子液的接种量为麻疯树饼粕的10～30%（v/w）；

（3）在温度为30～37℃的条件下发酵2～8天，即可。

步骤（1）中，所述日沟维肠杆菌是保藏号：CCTCC NO:M2013184的日沟维肠杆菌Enterobacter gergoviae zxy-15；所述摩氏摩根菌是保藏号：CCTCC NO:M2013185的摩氏摩根菌(Morganella morganii)zxy-12-4。

步骤（1）中，所述日沟维肠杆菌种子液和摩氏摩根菌种子液由如下方法制备：在20ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中接种2-3环日沟维肠杆菌或摩氏摩根菌，37℃、200r/min下振荡培养10～14h。

步骤（1）中，日沟维肠杆菌种子液和摩氏摩根菌种子液以1：2～1：1（v/v）的比例混合。

步骤（2）中，本发明方法的处理对象可以是未脱油的麻疯树饼粕，也可以是脱油后的饼粕。未脱油饼粕可按照如下方法制备：取麻疯树种仁，粉碎，过40目筛，即可；脱油饼粕可按照如下两种方法制备：1、将干燥麻疯树种仁粉碎过40目筛，按照索氏脱油方法脱油，即得；2、将干燥麻疯树种仁粉碎过40目筛，采取榨油机榨取的方法脱油，即得。

步骤（2）中，所述料水比为1:0.8（w/v）；所述碳源的加入量为麻疯树饼粕重量的20%（w/w）；所述接种量为25%（v/w）。

步骤（2）中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖或可溶性淀粉。

步骤（3）中，所述温度为37℃；所述发酵的时间为2天。

本发明方法采用两株新菌株对麻疯树饼粕混合发酵，在有效降低麻疯树饼粕毒性成分的同时，提高其营养价值，方法简便，成本低廉。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明日沟维肠杆菌zxy-15（Enterobacter gergoviae zxy-15），于2013年5月8日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC：M2013184，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。

本发明摩氏摩根菌zxy-12-4（Morganella morganii zxy-12-4），于2013年5月8日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC：M2013185，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。

附图说明

图1zxy-15菌株16～24h的读数结果

图2zxy-15菌株的16S rDNAPCR扩增电泳图谱以及进化树

图3zxy-12-4菌株16～24h的读数结果

图4zxy-12-4菌株的16S rDNAPCR扩增电泳图谱以及进化树

图5混菌发酵对麻疯树饼粕脱毒效果的影响

图6不同饼粕发酵前后HPLC色谱图

图7混菌发酵对不同饼粕脱毒效果的影响

图8发酵前后饼粕中多肽和蛋白质的含量

图9发酵前后饼粕中氨基酸的含量(%)

图10发酵前后饼粕中氨基酸的含量(%)

具体实施方式

实施例1本发明日沟维肠杆菌、摩氏摩根菌的鉴定特征

1、日沟维肠杆菌

（1）生理生化特征

对本发明分离菌株在NB和结晶紫平板上培养24h后，取NB平板上单个菌落进行革兰氏染色观察，结合菌株在结晶紫平板上的生长情况判断其革兰氏阴阳性，并进行氧化酶实验和三糖铁实验,结果见表1：

表1生理生化特征

从生理生化实验结果可知，本发明zxy-15分离株是革兰氏阴性细菌，且属于肠道菌（GN-ENT），在后续的鉴定实验中选择Biolog鉴定系统中与肠道菌相对应的GN鉴定板。

（2）Biolog分析结果

Biolog微生物鉴定系统的结果通常包括三个参数，即可能性（Probability,PROB）、相似性（Similarity,SIM）以及位距（Distance,DIST）。而其中以SIM值最为重要。Biolog鉴定系统既可以依据培养4～6h时菌株对鉴定板上各个微孔中碳源的利用情况读数鉴定，也可以依据16～24h时的数据鉴定。在本试验中，培养16～24h的结果相对较好，取其读数进行鉴定。鉴定结果见图1以及表2。

表2Biolog鉴定结果

由图1及表2可以看出，采用Biolog分析方法得出本发明分离株为日沟维肠杆菌（Enterobacter gergoviae）。

（3）16S rDNA鉴定

对本发明分离株的总DNA进行扩增，PCR扩增后得到约1.5kb的扩增产物。对16S rDNA的序列相似性在NCBI的Blastn上进行序列相似性比对，将GenBank中的相近菌株序列作为参比序列，用Clustal X1.83软件进行多重序列匹配分析，并用Treeconw构建系统发育树。

实验结果如图2所示，菌株zxy-15与Enterobacter gergoviae同源性较高。

综上，结合生理生化特征、Biolog分析结果和16S rDNA鉴定结果，将本发明分离株鉴定为沟维肠杆菌（Enterobacter gergoviae），并将其命名为日沟维肠杆菌zxy-15（Enterobacter gergoviae zxy-15）。

2、摩氏摩根菌

（1）生理生化特征

对本发明分离菌株在NB和结晶紫平板上培养24h后，取NB平板上单个菌落进行革兰氏染色观察，结合菌株在结晶紫平板上的生长情况判断其革兰氏阴阳性，并进行氧化酶实验和三糖铁实验,结果见表3：

表3生理生化特征

从生理生化实验结果可知，本发明zxy-12-4分离株是革兰氏阴性细菌，且均属于肠道菌（GN-ENT），在后续的鉴定实验中选择Biolog鉴定系统中与肠道菌相对应的GN鉴定板。

（2）Biolog分析结果

Biolog微生物鉴定系统的结果通常包括三个参数，即可能性（Probability,PROB）、相似性（Similarity,SIM）以及位距（Distance,DIST）。而其中以SIM值最为重要。Biolog鉴定系统既可以依据培养4～6h时菌株对鉴定板上各个微孔中碳源的利用情况读数鉴定，也可以依据16～24h时的数据鉴定。在本试验中，培养16～24h的结果相对较好，取其读数进行鉴定。鉴定结果见图3以及表4。

表4Biolog鉴定结果

由图2及表4可以看出，采用Biolog分析方法得出本发明zxy-12-4分离株为摩氏摩根菌（Morganella morganii）。

（3）16S rDNA鉴定

实验结果如图4所示，菌株zxy-12-4与Enterobacter gergoviae同源性较高。

综上，结合生理生化特征、Biolog分析结果和16S rDNA鉴定结果，将本发明分离株鉴定为摩氏摩根菌（Morganella morganii），并将其命名为摩氏摩根菌zxy-12-4（Morganella morganii zxy-12-4）。

实施例2采用本发明菌株对麻疯树饼粕发酵脱毒的方法

1、实验材料

菌种：本发明日沟维肠杆菌zxy-15（Enterobacter gergoviae zxy-15），简称菌株zxy-15；本发明摩氏摩根菌zxy-12-4（Morganella morganii zxy-12-4），简称菌株zxy-12-4。

麻疯树饼粕，包括如下3种：

未脱油饼粕：将干燥麻疯树种仁粉碎过40目筛，即得。

索氏脱油后饼粕：将干燥麻疯树种仁粉碎过40目筛，在索氏提取器中用30-60℃的石油醚提取8h后的残渣，即为麻疯树饼粕。

榨油后饼粕：将干燥麻疯树种仁粉碎过40目筛，采取榨取的方法脱油，所得残渣即为麻疯树饼粕。

2、实验方法

（1）取菌株zxy-15和菌株zxy-12-4，分别复苏制备菌株zxy-15种子液和菌株zxy-12-4种子液，将二者以1：2（v/v）的比例混合，得种子液；

（2）取麻疯树饼粕，加水和蔗糖混匀，接种步骤（1）制备的种子液，其中，料水比为1：1.2（w/v），蔗糖的加入量为麻疯树饼粕的10%（w/w）；种子液的接种量为麻疯树饼粕的30%（v/w）；

（3）在温度30℃下培养8天，即可。

实施例3采用本发明菌株对麻疯树饼粕发酵脱毒的方法

1、实验材料

麻疯树饼粕，包括如下3种：

未脱油饼粕：将干燥麻疯树种仁粉碎过40目筛，即得。

2、实验方法

（1）取菌株zxy-15和菌株zxy-12-4，分别复苏制备菌株zxy-15种子液和菌株zxy-12-4种子液，将二者以1：1（v/v）的比例混合，得种子液；

（2）取麻疯树饼粕，加水和可溶性淀粉混匀，接种步骤（1）制备的种子液，其中，料水比为1：1.0（w/v），可溶性淀粉的加入量为麻疯树饼粕的15%（w/w）；种子液的接种量为麻疯树饼粕的10%（v/w）；

（3）在温度34℃下培养4天，即可。

实施例4采用本发明菌株对麻疯树饼粕发酵脱毒的方法

1材料与仪器

1.1材料

麻疯树饼粕，包括如下3种：

未脱油饼粕：将干燥麻疯树种仁粉碎过40目筛，即得。

1.2主要仪器

AIRTECH超洁净工作台SW-CJ-2F，带有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪（美国，DIONEX公司），立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50KBS，双层恒温振荡器IS-RSV1，超声波清洗仪SB-5200DTDN，FW135植物粉碎机，电热恒温鼓风干燥箱DHG-9070A，SI-234电子天平DENVER INSTRUMENT，海尔冰箱BCD-215KS，紫外分光光度计（UV1700），10ml容量瓶，可调式移液器，三角瓶，接种环，100ml烧杯，2ml注射器。

美国DIONEX高效液相色谱（ASI-100Auto Sampler Injector，P680A HPLC Pump，PDA-100Photodiode Array Detector，TCC-100ColumnThemostat）；FW135粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；SI-234电子天平（丹佛仪器北京有限公司）；Millipore超纯水器；KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SARTORIUS（BP211D型）十万分之一天平；离心机，滤膜为SERIAL NO.0952；移液管，移液枪，三角瓶，试剂瓶。榨油机：小型螺旋榨油机CA59G（德国Oekotec公司）

试剂：

佛波酯标准品TPA（Phorbol-12-myristate13-acetate）来自SIGMA公司，纯度≥99%。

JCF对照品,按照公开号为102659583的专利申请实施例1的方法制备，制得的显示佛波酯的特征峰的成分，即为JCF对照品。

佛波醇酯（JC1）对照品，按照公开号为102659583的专利申请实施例1～实施例2的方法制备，制得的化合物1（Jatropha factor C1）即为JC1。

所有试剂均为分析纯，色谱所用试剂为色谱纯，均购自成都科龙试剂公司。层析硅胶（160-200目）。

2试验方法

2.1培养基

1）种子培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏1g,蛋白胨1g,葡萄糖1g,NaCl0.5g,水1000ml，pH7.0。121℃下湿热灭菌30min备用。

2）固态发酵培养基：麻疯树饼粕粉10g，水、pH自然，115℃～120℃灭菌20min。

2.2菌悬液的制备

制备20ml牛肉膏蛋白胨液体培养基于50ml的三角瓶，用接种环分别接入2-3环菌株zxy-15和菌株zxy-12-4到两个三角瓶中，置于37℃、200r/min的恒温振荡器中进行菌悬液的培养，培养时间为10～14h，得菌株zxy-15种子液和菌株zxy-12-4种子液。

2.3混菌发酵实验

以麻疯树饼粕为基料，接种菌株zxy-15种子液和菌株zxy-12-4种子液的混合菌液，两种种子液的接种比例为1∶1、1∶2、2∶1（v/v）进行试验，接种量为25%（v/w），发酵料水比为1:0.8（w/v），葡萄糖的加入量20%（w/w），培养温度为37℃，连续分别培养2d，每组做3个平行。

分别测定总佛波酯和JC1的峰面积，考察混合菌株对发酵脱毒效果的影响。以未进行发酵的麻疯树饼粕做空白对照实验。

2.4固态发酵对不同饼粕的脱毒效果

分别选择未脱油饼粕（样品W）、榨油后饼粕（样品Z）、索氏提油后的饼粕（样品S）进行固态发酵，分别接种菌株zxy-15种子液和菌株zxy-12-4种子液的混合菌液，两种种子液的接种比例为1∶2（v/v）进行试验，接种量为25%（v/w），发酵料水比为1:0.8（w/v），葡萄糖的加入量20%（w/w），培养温度为37℃，连续分别培养2d，每组做3个平行。

分别选择两株菌的最佳固态发酵条件，以及混合菌种发酵的最佳比例条件进行样品的发酵，每组做3个平行。

取发酵后的样品适量，60℃干燥粉碎，测定佛波酯和JC1的峰面积及其含量的变化，从而考察固态发酵对三种不同饼粕的脱毒效果。

取发酵后的样品适量，60℃干燥粉碎，分别测定其中的粗蛋白质、多肽、氨基酸等的含量，综合评价其营养价值。

2.5检测方法

2.5.1固态发酵饼粕中佛波酯的提取与检测

2.5.1.1对照品溶液的配制

将1mg TPA对照品加入1mL甲醇中，配制成浓度为1.0mg·mL^-1的对照品溶液，用0.22um膜过滤，备用。

取97.82mg JCF对照品,加入1mL乙腈中，配制成浓度为97.82mg·mL^-1的JCF母液，用0.22um膜过滤，备用。

取6.0mg JC1对照品加入1mL乙醇中，制成浓度为6.0mg·mL^-1的对照品溶液，用0.22um膜过滤，备用。

2.5.1.2麻疯树饼粕样品的制备

称取1.5g麻疯树饼粕于10ml容量瓶中，加入8ml甲醇超声提取30min，冷却至室温，用甲醇定容至10ml。用0.22um膜过滤，备用。

2.5.1.3HPLC检测方法

采用HPLC-UV-DAD法对TPA、JC1、JCF制备样品及麻疯树饼粕样品进行定量鉴定。采用Agilent ZoRBox C18（250mm×4.6mm,i.d.,5μm）为色谱柱；流动相是乙腈∶超纯水=80∶20（V∶V）；流速：0.8mL·min-1；进样量：10μL；柱温：25℃；DAD扫描波长范围为190～800nm,紫外检测波长为210，230，280，310nm。

2.5.2粗蛋白含量的测定

试样采用粗脂肪测定后的残渣，其中粗蛋白（crude protein，CP）含量的测定参考国家标准GB/T5009.5-2003“食品中蛋白质的测定”，具体操作如下：

A：样品消化处理:精密称取0.5g样品移入干燥的100ml消化管中，加入0.2g硫酸铜，3.0g硫酸钾及20.0ml浓硫酸，将消化管放入消化炉中，先于150℃小火加热30min，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，升高温度至400℃，保持管内液体微沸，直至液体呈蓝绿色透明后，再继续加热0.5h。取下冷却。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。

B、将消化好的样品移入海能K9840自动凯氏定氮仪上，向接收瓶中加入20ml硼酸溶液，加3-4滴混合指示剂，进行蒸馏操作，消化管中溶液变为黑色，蒸馏至吸收液呈绿色时，继续蒸馏1min，停止蒸馏。

C、以标定摩尔浓度的标准盐酸溶液对接收瓶中的吸收液进行滴定，滴定至灰色为终点，记录滴定消耗的盐酸溶液体积。

D、计算:

X = \frac{(V_{1} - V_{2}) \times C \times 0.0140}{m} \times F \times 100

X∶样品中蛋白质的百分含量，%;

V1∶样品消耗盐酸标准液的体积，ml;

V2∶试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml;

C∶盐酸标准溶液的当量浓度;

0.0140∶1N盐酸标准溶液lml相当于氮克数;

m∶样品的质量，g;

F∶氮换算成总蛋白的系数6.25。.

2.5.3多肽的测定

多肽的测定参考大豆肽粉测定方法（GB14771-1993法，GB/T14965-1994法）三氯乙酸酸溶蛋白值可以准确地反应蛋白质的酶解情况，溶解值越高，表明小肽的含量越高。酸溶蛋白的含量减去游离氨基酸的含量即为饼粕中多肽的含量。

分别将各个试样干燥粉碎研磨，全部过40目筛，取筛下物约5克置于称样皿中，在105℃的温度下烘干3h，取出，盖好称样皿盖，在干燥器中冷却30min，称重。再同样烘干1h,冷却，称重，直至两次重量之差小于0.002g为恒重。

称取恒重后的样品m1克（注：样品约2至3克），置于烧杯中，加蒸馏水75mL，室温下电磁搅拌45min。将烧杯中溶液及沉淀摇匀，折入离心试管中，离心转速2500r/min，离心时间10min后，收集上清液（1号上清液）。

取1号上清液25mL，加入25mL10%的三氯乙酸溶液，混合后静置20min。将烧杯中溶液及沉淀摇匀，折入离心试管中，离心转速4000r/min，离心时间20min后收集上清液（2号上清液）。

取2号上清液25mL，小心移入干燥的500mL凯氏烧瓶中，按2.5.2中凯氏定氮法进行消化定氮。蒸馏后的吸收液立即用0.02mol·L-1盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。得消耗盐酸标液V1（mL），滴定的结果用空白实验校正。

另称取样品m2克（约0.5至1克），用步骤5相同的方法定氮，得消耗盐酸标液V2（mL），滴定的结果用空白实验校正。

酸溶蛋白按式（1）计算：

酸溶蛋白（%）=（（V1-V0）×m2×75）/（（V2-V0）×m1×12.5）×100……（1）

式中：

m1---测定可溶性氮时称取的试样质量，g；

m2---测定总氮时称取的试样质量，g；

V0---空白试验消耗的盐酸标准滴定溶液体积，mL；

V1---测定可溶性氮时消耗的盐酸标准滴定溶液体积，mL；

V2---测定总氮时消耗的盐酸标准滴定溶液体积，mL；

每个试样取两平行样进行测定，以算术平均值为结果，所得结果应表示至小数点后两位，两次平行测定结果绝对差值不大于3%。

2.5.4氨基酸含量及组成测定

参照GB/T18246-2000，分别称取适量试样，加10ml6mol·L-1盐酸，排除空气后在110℃下水解22-24h。取一定量定容过滤后的水解液，真空排去盐酸后，用0.02mol·L盐酸溶解定容后，用氨基酸分析仪进行测试。

（1）色谱柱：150mm*4.6mm，阳离子树脂

（2）检测波长：570nm，440nm

（3）洗脱液流量：0.45ml·min-1

（4）反应液流量：0.25ml·min-1

（5）柱温：57-74℃阶梯温度

（6）反应温度：130℃

3结果与分析

3.1混菌发酵试验

采用混合菌种发酵2d，考察不同比例混合菌株发酵对脱除麻疯树饼粕中佛波酯的影响。其结果如表5和图5。

表5混菌发酵对麻疯树饼粕脱毒效果的影响

由表5和图5可知：

采用不同接种比的混合菌株发酵麻疯树饼粕2d后，佛波酯总量均显著下降，1∶1和1∶2两个实验组的变化率相当，降解率分别为28.60%和27.26%左右，显著优于2:1组。

采用不同接种比的混合菌株发酵麻疯树饼粕2d后，佛波酯JC1含量均显著下降，1∶2实验组的降解率为28.88%，显著优于1∶1组和2:1组。

实验说明，本发明混菌发酵方法中，菌株zxy-15种子液与菌株zxy-12-4种子液的接种比为1：2和1:1时，发酵脱毒效果均较好。

3.2对三种不同饼粕的影响

3.2.1脱毒效果

分别选择未脱油饼粕（W）、榨油后饼粕（Z）、索氏提油后的饼粕（S）进行固态发酵。测定佛波酯和JC1的峰面积，各样品降解后的色谱图见图6。统计后结果如表6和图7所示。

由图6可以看出，各样品的佛波酯峰的峰形图在发酵前后相似：当在保留时间为17.000min左右时，为佛波酯的第一个峰JC1；保留时间为27.000min左右时为其最后一个峰JC6，发酵后各峰的峰面积较发酵前均有所减少，且样品S和样品Z在发酵后JC5峰面积甚至为零，说明该物质已被完全降解。

发酵后JC1和总佛波酯峰面积的变化如表6和图7所示。

表6混菌发酵对不同饼粕脱毒效果的影响

由表6和图7可以看出：

经过本发明方法发酵脱毒后，三种样品中佛波酯总量均显著降低，未脱油饼粕的降解率为31.42%，索氏脱油饼粕的降解率为47.70%，压榨脱油饼粕的降解率为51.54%；三种样品中JC1的含量也显著降低，未脱毒饼粕的降解率为26.73%，索氏脱油饼粕的降解率为41.47%，压榨脱油饼粕的降解率为49.74%

实验说明，本发明方法可以有效降低麻疯树饼粕中的毒性物质——佛波酯，其中，对压榨脱油饼粕的脱毒效果最好，降解率高达51.54%。

3.2.2营养价值

3.2.2.1蛋白质和多肽

测定结果如表7和图8所示：

表7发酵前后饼粕中多肽和蛋白质的含量

样品	CP%	NSI小肽%
			S1	48.11	11.54
S2	47.56	18.25
			Z₂	20.89	9.2
Z₁	20.17	5.33
			W₁	18.58	8.58
W₂	17.28	22.19

注：S₁：索氏脱油后饼粕 S₂：索氏脱油后发酵饼粕

Z₁：榨油后饼粕 Z₂：榨油后发酵饼粕

W₁：未脱油饼粕 W₂：未脱油发酵饼粕

由表7和图8可知：

三种饼粕在发酵前后其粗蛋白质的含量几乎无变化，但其多肽的含量却明显的增加，未脱油的饼粕中小肽的含量从8.58%增加到了22.19%，增幅达到了近3倍；榨油后饼粕中小肽含量也从5.33%增加到了9.2%，也增加了接近1倍。

实验说明，本发明方法可以有效增加麻疯树饼粕的多肽含量，提高其营养价值。

3.2.2.2氨基酸

分别测定了两种饼粕发酵前后17种氨基酸的含量，结果见表8和图9～10：

表8发酵前后饼粕中氨基酸的含量(%)

注：Z₁：榨油后饼粕 Z₂：榨油后发酵饼粕

W₁：未脱油饼粕 W₂：未脱油发酵饼粕

—：未测定

由表8和图9～10可以看出：

发酵后，两种饼粕的氨基酸量明显增加，其中，未脱油的饼粕中氨基酸含量从16.4%增加到了29.4%，增幅达到了近一倍，榨油后饼粕中含量从17.7%增加到了22.4%，说明本发明方法可以有效提高麻疯树饼粕的氨基酸含量。

实验说明，本发明发酵方法可以增加麻疯树饼粕中氨基酸的含量，提高其营养价值。

综上，采用本发明发酵方法可以有效降低麻疯树饼粕的毒性成分——佛波酯的含量，去除率高达51.54%，同时，还可以有效增加麻疯树饼粕的多肽和氨基酸含量，多肽增幅高达300%，氨基酸的增幅高达100%，非常显著地提高了麻疯树饼粕的营养价值。

本发明采用双菌混合发酵的方法处理麻疯树饼粕，在有效除去其毒性成分的同时，还提高了其营养价值，制得的产品可进一步加工成为饲用蛋白，具有极好的应用前景。

Claims

1.一种麻疯树饼粕的发酵脱毒方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）取日沟维肠杆菌和摩氏摩根菌，分别复苏制备日沟维肠杆菌种子液和摩氏摩根菌种子液，以1：2～2：1（v/v）的比例混合，得混合种子液；

（2）取麻疯树饼粕，加水和碳源，混匀，接种步骤（1）制备的混合种子液，其中，料水比为1：0.8～1.2（w/v），碳源的加入量为麻疯树饼粕的10～20%（w/w）；种子液的接种量为麻疯树饼粕的10～30%（v/w）；

（3）在温度为30～37℃的条件下发酵2～8天，即可。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述日沟维肠杆菌是保藏号：CCTCC NO:M2013184的日沟维肠杆菌Enterobactergergoviae zxy-15；所述摩氏摩根菌是保藏号：CCTCC NO:M2013185的摩氏摩根菌(Morganella morganii)zxy-12-4。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述日沟维肠杆菌种子液和摩氏摩根菌种子液按照如下方法制备：在20ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中接种2-3环日沟维肠杆菌或摩氏摩根菌，37℃、200r/min下振荡培养10～14h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，日沟维肠杆菌种子液和摩氏摩根菌种子液以1：2～1：1（v/v）的比例混合。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述麻疯树饼粕按照如下方法制备：取麻疯树种仁，粉碎，过40目筛，即可。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述料水比为1:0.8（w/v）；所述碳源的加入量为麻疯树饼粕重量的20%（w/w）；所述碳源为葡萄糖、蔗糖或可溶性淀粉；所述种子液的接种量为麻疯树饼粕的25%（v/w）。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述温度为37℃；所述发酵的时间为2天。