CN103710393A - 利用含短肽类离子液体反应体系制备手性醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在含短肽类离子液体体系中制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，所述方法为：以棘孢木霉ZJPH0810培养获得的湿菌丝体作为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，在短肽类离子液体构成的反应体系中，于25～45℃、100～300r/min条件下反应6～50小时，反应液经分离纯化得到(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇产物；本发明提出的含短肽类离子液体具有毒性低、绿色环保等优点，符合绿色化学发展策略，同时也克服了传统离子液体环境不友好等缺陷。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的生物催化制备方法，特别涉及一种含短肽类离子液体介质中提高微生物催化不对称还原制备阿瑞吡坦药物关键手性中间体(R)-[3,5-双（三氟甲基）苯基]乙醇反应效率的方法。
（二）背景技术
离子液体具有蒸气压低，热稳定性好，电导率高，结构可设计性等诸多优点。含离子液体介质中的生物催化已成为近年来的研究热点。随着离子液体研究的发展，功能化离子液体不断出现，而低共熔离子液体的出现，又掀起了离子液体的研究热潮。低共熔离子液体(Deep Eutectic IonicLiquids)即由中性分子与离子化合物混合，可形成具有离子液体性质的低共熔体系。目前，低共熔溶剂主要应用于有机合成，材料化学和化工分离等领域，应用于生物催化领域的报道很少。
1999年，Abbott教授首次提出了低共熔溶剂的概念。2003年，Abbott研究组发明了氯化胆碱尿素低共熔溶剂，此类低共熔溶剂由两分子尿素和一分子氯化胆碱通过氢键形成，室温下呈液态。尿素和氯化胆碱的成本低廉，易生物降解，无环境副作用，因此是一种较传统离子液体更为绿色的溶剂。大多数情况下，功能化离子液体将新功能基团引入到阳离子，而关于阴离子的功能化研究较少，目前仅有少量报道将氨基酸或者FeCl4引入到离子液体中，使其发挥特定功能。
本申请人的在先申请中国专利200910155775.5（公开号CN101724568A）提供了一株新菌种棘孢木霉及其作为催化剂不对称还原制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，该方法在水相体系中进行，反应的底物浓度（80mM）和产率偏低（53.4%）。本发明提出了在含低共熔离子液体介质中生物催化制备(R)-[3,5-双（三氟甲基）苯基]乙醇的新方法，通过离子液体对底物的增溶作用，使得转化反应在保持较高产率和较短反应时间的前提下，提高了底物浓度，从而有效提高了反应效率。将该新型低共熔离子液体用于生物催化过程中更符合当前绿色化学的发展要求。
生物催化3,5-双三氟甲基苯乙酮制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇反应式如下所示：
（三）发明内容
本发明以3,5-双三氟甲基苯乙酮不对称还原制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇为研究对象，以棘孢木霉Trichoderma asperellum ZJPH0810为催化剂，利用含短肽类离子液体的反应体系解决底物难溶性和产率偏低等问题。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种利用含短肽类离子液体反应体系制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，所述方法为：以棘孢木霉ZJPH0810发酵培养获得的湿菌丝体（制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）作为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，在短肽类离子液体与蒸馏水构成的反应体系中，于25～45℃、100～300r/min条件下反应6～50小时，反应结束后，反应液用等体积正己烷萃取，萃取液经分离纯化得到(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇产物；所述短肽类离子液体以胆碱类化合物为阳离子，以短肽化合物为阴离子，所述短肽化合物由4～9个天然氨基酸脱水缩合而成，所述胆碱类化合物与短肽化合物的物质的量之比为1：1～3；所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为10～50g/L，所述反应体系中底物初始浓度为50～300mM，所述反应体系中短肽类离子液体质量浓度为0.1～30%。
所述胆碱类化合物结构式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）中X为卤素、醋酸、戊酸或丁酸甲酯。
胆碱类化合物的合成方法：从N,N-二甲基乙醇胺出发，利用其与不同长度碳链的卤代烃的加成反应，合成在胆碱阳离子上具有不同取代基的卤代胆碱类离子液体，同时，也可以再通过离子交换的方法合成出具有不同阴离子结构的离子液体。具体参照Avalos报道的合成方法。(M.Avalos,R.Babiano,Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,3904–3908.)。
所述短肽化合物是由苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)、缬氨酸(Val)、赖氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)、精氨酸(Arg)或组氨酸(His)中的任意4～9种氨基酸残基以任意顺序脱水缩合而成，更优选由5种或7种氨基酸残基以任意顺序脱水缩合而成五肽化合物或七肽化合物。
更进一步，所述短肽化合物（即五肽化合物）氨基酸序列为A1-Lys-Asp-Val-B1，其中A1代表Arg、Ser、Cys或His氨基酸残基，B1代表Glu或Tyr氨基酸残基；较优地，所述的五肽化合物为下列之一氨基酸序列脱水缩合而成：Arg-Lys-Asp-Val-Tyr、Arg-Lys-Asp-Val-Glu、Ser-Lys-Asp-Val-Tyr、Cys-Lys-Asp-Val-Glu或His-Lys-Asp-Val-Glu。
更进一步，所述短肽化合物（即七肽化合物）的氨基酸序列为A2-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-B2，其中A2代表Arg、Phe、Lys或Glu氨基酸残基，B2代表Ser或者Asp氨基酸残基；较优地，所述的七肽化合物优选如下之一氨基酸序列脱水缩合而成：Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser、Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp、Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser或Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser。
进一步，所述胆碱类化合物为醋酸胆碱、氯化胆碱、丁酸甲酯胆碱或戊酸胆碱。
进一步，优选所述低共熔离子液体为下列之一（胆碱类化合物与短肽化合物物质的量之比均为1:1～3）：[醋酸胆碱]＋[Arg-Lys-Asp-Val-Tyr]－、[氯化胆碱]＋[His-Lys-Asp-Val-Glu]－、[丁酸甲酯胆碱]＋[Cys-Lys-Asp-Val-Glu]－、[戊酸胆碱]＋[Ser-Lys-Asp-Val-Tyr]－、[丁酸甲酯胆碱]＋[Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－、[氯化胆碱]＋[Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp]－、[戊酸胆碱]＋[Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－或[醋酸胆碱]＋[Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－。
进一步，优选所述反应是在25～35℃、150～250r/min条件下反应18～40小时，更优选30℃、200r/min条件下反应24小时。
进一步，优选所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为20～40g/L（更优选30g/L），所述反应体系中底物初始浓度为50～180mM（更优选70～120mM），所述反应体系中短肽类离子液体质量浓度为2～20%（质量更优选质量浓度2.5～15%）。
进一步，所述的含短肽类离子液体反应体系中添加有辅助底物以促进辅酶再生，所述辅助底物可为下列一种或两种及以上任意比例的混合：①甲醇、②乙醇、③异丙醇、④甘油、⑤葡萄糖、⑥果糖、⑦鼠李糖或⑧麦芽糖，所述含短肽类离子液体的反应体系中辅助底物质量浓度为0.1～20%，更优选下列之一：①反应体系中，终浓度6%(v/v)无水乙醇；②反应体系中，终浓度6%(v/v)无水乙醇和终浓度6%(v/v)异丙醇两者的混合；③反应体系中，终浓度6%(v/v)无水乙醇、终浓度6%(v/v)异丙醇和终浓度6%(w/w)葡萄糖三者的混合。
更进一步，本发明所述利用含短肽类离子液体反应体系制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法推荐按如下步骤进行：以棘孢木霉ZJPH0810培养获得的湿菌丝体（制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）作为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，在含短肽类离子液体和蒸馏水及辅助底物构成的反应体系中，于25～35℃、150～250r/min条件下反应18～40小时（优选30℃、200r/min条件下反应24小时），反应结束后，反应液用等体积正己烷萃取，萃取液经分离纯化得到(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇产物；所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为20～40g/L（优选30g/L），所述反应体系中底物初始浓度为50～180mM（优选70～120mM），所述反应体系中短肽类离子液体质量浓度为2.5～15%；所述辅助底物优选为：反应体系中，终浓度为无水乙醇(终浓度6%，v/v)和异丙醇(终浓度6%，v/v)的混合，所述短肽类离子液体中胆碱类化合物与短肽化合物的摩尔比为1：1～3。
本发明所用短肽化合物可按照Merrifield发明的固相化学合成方法合成(Merrifield,R.B.,J.Am.Chem.Soc.1963,85,2149.)。以氯甲基聚苯乙烯树脂为肽合成的固相基质，依照本发明短肽的氨基酸序列从C端开始依次进行。获得肽粗制品用C18反相柱分离纯化，分离过程的流动相为乙腈、水和三氟乙酸(乙腈：水：三氟乙酸=70:30:0.5，v/v)，经洗脱后获得本发明的肽纯品。
本发明所述短肽类离子液体的制备方法为：将胆碱化合物溶于蒸馏水中，然后加入短肽化合物，室温搅拌24～48小时，再于60℃下减压浓缩至原体积的1/3～1/4，以除去溶液中的大部分水，然后在70℃、-0.05～-0.09MPa条件下，真空旋转蒸发48～72小时，得到所述短肽类离子液体纯品。所述短肽化合物水溶液的用量以短肽化合物物质的量计，所述胆碱化合物与短肽化合物的物质的量之比为1:1～3，所述短肽化合物水溶液质量浓度为5～35%。
生物转化反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷相，经旋转蒸发器蒸馏浓缩5倍，然后加入少量的硅胶混匀后，转移至含硅胶的层析柱中，再添加少量的硅胶，然后以石油醚︰乙酸乙酯=8︰1（v/v）为洗脱剂进行洗脱分离，收集合并含有产物的洗脱液，将含有产物的洗脱液经旋转蒸发器蒸干，即得手性醇(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇纯品。(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇1H NMR(600MHz,CDCl3):7.85(s,2H),7.79(s,1H),5.06-5.03(q,1H,J=6.48Hz),1.55(d,3H,J=6.48Hz)。
萃取液中的产物和未反应底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物为十二烷。取1ml萃取液加入2μl十二烷进行分析。气相色谱的操作条件为：进样器温度250℃，检测器温度250℃，柱温80℃保留2min，以4℃/min升温至180℃，维持10min，载气为氮气，流量为1.5ml/min，分流比为1:20，进样量为1μl。根据气相色谱检测谱图，用相对校正因子法计算出反应液中产物的浓度和ee值。
产率计算方法为：
内标法：以十二烷为内标物，测得产物浓度标准曲线。测定时在样品中加入一定量的十二烷为内标物，根据内标物浓度计算得出产物浓度。
标准曲线制备方法：准确称取一系列不同浓度的底物或产物标准品，溶于正己烷，配制成一系列混合溶液，分别用气相色谱法检测。将所得色谱图积分得到峰面积，以底物或产物与正十二烷的峰面积比(S底物/S十二烷或S产物/S十二烷)为横坐标，浓度比(C底物/C十二烷或C产物/C十二烷)为纵坐标，作出标准曲线，从而得到3，5-双三氟甲基苯乙酮与内标物的相对校正因子为1.31，3,5-双三氟甲基苯乙醇与内标物的相对校正因子为1.69。
产率计算公式如下：
公式（1）中Cp为(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇浓度，C0为3,5-双三氟甲基苯乙酮初始浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess,ee)来表征。计算公式为：
公式（2）中CR和CS分别为R型和S型3,5-双三氟甲基苯乙醇的摩尔浓度。
本发明与现有技术相比，有如下优点：
本发明构建的含短肽类离子液体反应体系是以蒸馏水作为反应介质，与常用的缓冲溶液反应介质相比，更加绿色环保且易于工业化生产；与常用的单一辅助底物体系相比，将多辅助底物体系应用于生物不对称还原反应中，具有提高辅酶再生效率或保护细胞的作用；所述短肽类离子液体有效集成了胆碱和短肽的生物学特性和离子液体的优良性能，具有毒性低、绿色环保等优点，符合绿色化学发展策略，同时也克服了传统离子液体环境不友好等缺陷。与水相反应相比，在反应体系中加入此类短肽类离子液体，能有效提高催化效率，尤其是当加入[醋酸胆碱]＋[Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－)后，可使反应的底物浓度由80mM（水相转化，参见CN101724568A，具体参见实施例5）提高到100mM（含短肽类离子液体中转化），产率也相应地从53.4%（水相转化，参见CN101724568A，具体参见实施例5）提高到92.4%（含短肽类离子液体中转化）。
(四)附图说明
图1为3,5-双三氟甲基苯乙酮底物和[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇产物的标准品气相检测图谱。
图2为棘孢木霉生物还原反应萃取液气相色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述湿菌丝体的制备参见CN101724568A，具体参见实施例1。
实施例1[氯化胆碱]＋[His-Lys-Asp-Val-Glu]－的合成
氯化胆碱的合成方法参照Avalos报道的合成方法。(M.Avalos,R.Babiano,Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,3904–3908.)。
五肽His-Lys-Asp-Val-Glu的合成采用固相化学合成方法，以氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将His的咪唑环用2,2,2-三氟-1-苄氧羰基保护并共价连接在固相载体上，用冷三氟乙酸脱去保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上；第二个氨基酸Lys的氨基被酰基保护，Lys的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺（DCC）活化后，与已连在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽；第三个氨基酸Asp的侧链羧基用金刚烷醇酯保护，Asp的羧基通过DCC活化后，与已接在固相载体的第二个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的三肽，在三氟甲磺酸三甲硅烷酯的作用下，脱掉羧基的保护基，这样三肽就接到了固相载体上了；第四个氨基酸Val的氨基被叔丁氧羰基（BOC）保护，Val的羧基经DCC活化后，与已连在固相载体的第三个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的四肽，在三氟乙酸和氢氟酸的作用下，脱掉羧基的保护基；第五个氨基酸Glu的侧链羧基用金刚烷醇酯保护，Glu的羧基通过DCC活化后，与已接在固相载体的第四个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的五肽，在三氟乙酸的作用下，脱掉羧基的保护基，这样五肽His-Lys-Asp-Val-Glu就接到了固相载体上了，随后用冷三氟乙酸脱去Lys的保护基。最后对树脂上的合成肽在避光条件下，采用裂解液(三氟乙酸、苯甲醚、乙二硫醇)进行裂解，最后溶解在冰乙醚中，冷冻干燥后获得肽粗制品。肽粗制品用C18反向柱分离纯化，分离流动相为三氟乙酸、乙腈和水(乙腈：水：三氟乙酸=70:30:0.5，v/v)，经洗脱后获得五肽His-Lys-Asp-Val-Glu纯品。
[氯化胆碱]＋[His-Lys-Asp-Val-Glu]－的合成：实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。将五肽His-Lys-Asp-Val-Glu6.99g(0.01mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入1.40g氯化胆碱(0.01mol)，室温搅拌24小时，然后于60℃下旋蒸浓缩至原体积的约1/3，以除去溶液中的大部分水，再升温至70℃，在-0.09MPa条件下真空旋转蒸发48小时，得到氯化胆碱与五肽His-Lys-Asp-Val-Glu摩尔比为1:1的[氯化胆碱]＋[His-Lys-Asp-Val-Glu]－短肽类离子液体。
氯化胆碱与五肽His-Lys-Asp-Val-Glu摩尔比为1:2和1:3的[氯化胆碱]＋[His-Lys-Asp-Val-Glu]－短肽类离子液体的合成方法只需将五肽His-Lys-Asp-Val-Glu的质量分别对应增加到13.98g(0.02mol)和20.97g(0.03mol)，其余的合成步骤同氯化胆碱与五肽His-Lys-Asp-Val-Glu摩尔比为1:1的[氯化胆碱]＋[His-Lys-Asp-Val-Glu]－短肽类离子液体的合成方法。
制备得到的离子液体1HNMR(400M，D2O，DMSO):δ=7.44(s,1H),6.80(d,1H),3.86(s,2H),3.20(t,3H),3.08(s,9H),2.71(d,1H),2.63(d,2H),2.49(q,2H),2.25(q,4H),1.89(d,2H),1.55(m,4H),1.26(d,6H),1.00(d,6H)。
实施例2[醋酸胆碱]＋[Arg-Lys-Asp-Val-Tyr]－的合成
醋酸胆碱的合成方法参照Avalos报道的合成方法。(M.Avalos,R.Babiano,Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,3904–3908.)。
五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr的合成方法参加实施例1，具体的将实施例1合成五肽的第一个氨基酸His替换为Arg，第五个氨基酸Glu替换为Tyr。
[醋酸胆碱]＋[Arg-Lys-Asp-Val-Tyr]－的合成：实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。将五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr7.51g(0.01mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入1.64g醋酸胆碱(0.01mol)，其他操作参见实施例1，得到醋酸胆碱与五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr摩尔比为1:1的[醋酸胆碱]＋[Arg-Lys-Asp-Val-Tyr]－短肽类离子液体。
醋酸胆碱与五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr摩尔比为1:2和1:3的[醋酸胆碱]＋[Arg-Lys-Asp-Val-Tyr]－短肽类离子液体的合成方法只需将五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr的质量分别对应增加到15.02g(0.02mol)和22.53g(0.03mol)，其他的合成步骤同醋酸胆碱与五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr摩尔比为1:1的[醋酸胆碱]＋[Arg-Lys-Asp-Val-Tyr]－短肽类离子液体的合成方法。
制备得到的离子液体1HNMR(400M，D2O，DMSO):δ=6.91(s,2H),6.86(d,2H),4.52(d,2H),3.87(t,1H),2.81(d,3H),2.47(m,6H),1.67(d,8H),1.29(d,8H),3.86(s,2H),3.08(s,9H),2.45(q,2H),2.08(s,3H)。
实施例3[丁酸甲酯胆碱]＋[Cys-Lys-Asp-Val-Glu]－的合成
丁酸甲酯胆碱的合成方法参照Avalos报道的合成方法。(M.Avalos,R.Babiano,Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,3904–3908.)。
五肽Cys-Lys-Asp-Val-Glu的合成方法参加实施例1，具体的将实施例1合成五肽的第一个氨基酸His替换为Cys。
[丁酸甲酯胆碱]＋[Cys-Lys-Asp-Val-Glu]－的合成：实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。将五肽Cys-Lys-Asp-Val-Glu6.64g(0.01mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入1.64g丁酸甲酯胆碱(0.01mol)，其他操作参见实施例1，得到丁酸甲酯胆碱与五肽Cys-Lys-Asp-Val-Glu摩尔比为1:1的[丁酸甲酯胆碱]＋[Cys-Lys-Asp-Val-Glu]－短肽类离子液体。
丁酸甲酯胆碱与五肽Cys-Lys-Asp-Val-Glu摩尔比为1:2和1:3的[丁酸甲酯胆碱]＋[Cys-Lys-Asp-Val-Glu]－短肽类离子液体的合成方法只需将五肽Cys-Lys-Asp-Val-Glu的质量分别对应增加到13.28g(0.02mol)和19.92g(0.03mol),其他的合成步骤同丁酸甲酯胆碱与五肽Cys-Lys-Asp-Val-Glu摩尔比为1:1的[丁酸甲酯胆碱]＋[Cys-Lys-Asp-Val-Glu]－短肽类离子液体的合成方法。
制备得到的离子液体1HNMR(400M，D2O，DMSO):δ=3.85(d,3H),3.57(s,1H),3.43(s,3H),3.06(s,12H),2.91(t,2H),2.69(d,2H),2.45(q,4H),2.23(t,2H),2.08(d,4H),1.97(t,6H),1.37(q,2H),0.96(s,9H)。
实施例4[戊酸胆碱]＋[Ser-Lys-Asp-Val-Tyr]－的合成
戊酸胆碱的合成方法参照Avalos报道的合成方法。(M.Avalos,R.Babiano,Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,3904–3908.)。
五肽Ser-Lys-Asp-Val-Tyr的合成方法参加实施例1，具体的将实施例1合成五肽的第一个氨基酸His替换为Ser，第五个氨基酸Glu替换为Tyr。
[戊酸胆碱]＋[Ser-Lys-Asp-Val-Tyr]－的合成：实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。将五肽Ser-Lys-Asp-Val-Tyr6.82g(0.01mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入2.06g戊酸胆碱(0.01mol)，其他操作参见实施例1，得到戊酸胆碱与五肽Ser-Lys-Asp-Val-Tyr摩尔比为1:1的[戊酸胆碱]＋[Ser-Lys-Asp-Val-Tyr]－短肽类离子液体。
戊酸胆碱与五肽Ser-Lys-Asp-Val-Tyr摩尔比为1:2和1:3的[戊酸胆碱]＋[Ser-Lys-Asp-Val-Tyr]－短肽类离子液体的合成方法只需将五肽Ser-Lys-Asp-Val-Tyr的质量分别对应增加到13.64g(0.02mol)和20.46g(0.03mol)，其他的合成步骤同戊酸胆碱与五肽Ser-Lys-Asp-Val-Tyr摩尔比为1:1的[戊酸胆碱]＋[Ser-Lys-Asp-Val-Tyr]－短肽类离子液体的合成方法。
制备得到的离子液体1HNMR(δ=6.91(s,2H),6.86(d,2H),3.88(s,4H),3.57(s,2H),3.06(s,9H)2.94(t,4H),2.65(d,2H),2.47(q,4H),2.23(t,2H),2.08(d,2H),1.84(q,4H),1.29(q,6H),1.01(t,9H)。
实施例5[氯化胆碱]＋[Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp]－的合成
氯化胆碱的合成方法参照Avalos报道的合成方法。(M.Avalos,R.Babiano,Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,3904–3908.)。
七肽Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp的合成采用固相化学合成方法，以氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将Arg侧链用金刚烷氧羰基（Adoc）保护并共价连接在固相载体上,用冷三氟乙酸脱去保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上；第二个氨基酸Cys的氨基被酰基保护，Cys的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺（DCC）活化后，与已连在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。在三氟乙酸的作用下，脱掉羧基的保护基；第三个氨基酸Arg的侧链羧基用金刚烷氧羰基保护，Arg的羧基通过DCC活化后，与已接在固相载体的第二个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的三肽，在三氟甲磺酸三甲硅烷酯的作用下，脱掉羧基的保护基，这样三肽就接到了固相载体上了；第四个氨基酸Phe的氨基被叔丁氧羰基（BOC）保护，Phe的羧基经DCC活化后，与已连在固相载体的第三个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的四肽，在三氟乙酸和氢氟酸的作用下，脱掉羧基的保护基；第五个氨基酸Ala的氨基被BOC保护，Ala的羧基经DCC活化后，与已连在固相载体的第四个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的五肽，在三氟乙酸和氢氟酸的作用下，脱掉羧基的保护基；第六个氨基酸Tyr的酚羟基用叔丁基保护，Tyr的羧基经DCC活化后，与已连在固相载体的第五个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的六肽，在三氟乙酸的作用下，脱掉保护基；然后第七个氨基酸Asp的侧链羧基用金刚烷醇酯保护，Asp的羧基经DCC活化后，与已连在固相载体的第六个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的七肽。在三氟甲磺酸三甲硅烷酯作用下，脱掉羧基的保护基。随后对树脂上的合成七肽在避光条件下，采用裂解液(三氟乙酸、苯甲醚、乙二硫醇)进行裂解，最后溶解在冰乙醚中，冷冻干燥后获得肽粗制品。肽粗制品用C18反向柱分离纯化，分离流动相为三氟乙酸、乙腈和水(乙腈：水：三氟乙酸=70:30:0.5，v/v)，经洗脱后获得七肽Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp纯品。
[氯化胆碱]＋[Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp]－的合成：实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。将七肽Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp10.37g(0.01mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入1.40g氯化胆碱(0.01mol)，室温搅拌24小时，然后于60℃下旋蒸浓缩至原体积的约1/3，以除去溶液中的大部分水，再升温至70℃，在-0.09MPa条件下真空旋转蒸发48小时，得到氯化胆碱与七肽Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp摩尔比为1:1的[氯化胆碱]＋[Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp]－短肽类离子液体。
氯化胆碱与七肽Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp摩尔比为1:2和1:3的[氯化胆碱]＋[Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp]－短肽类离子液体的合成方法只需将七肽Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp的质量分别对应增加到20.74g(0.02mol)和31.11g(0.03mol)，其他的合成步骤同氯化胆碱与七肽Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp摩尔比为1:1的[氯化胆碱]＋[Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp]－短肽类离子液体的合成方法。
制备得到的离子液体1HNMR(400M，D2O，DMSO):δ=7.26(d,5H),7.09(d,2H),6.73(d,2H),4.78(t,2H),4.53(q,3H),4.10(t,2H),3.86(s,2H),3.49(d,1H),3.06(m,11H),2.72(d,2H),2.64(q,4H),2.45(q,2H),1.82(m,8H),1.56(t,4H)。
实施例6[戊酸胆碱]＋[Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－的合成
戊酸胆碱的合成方法参照Avalos报道的合成方法。(M.Avalos,R.Babiano,Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,3904–3908.)。
七肽Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser的合成方法参加实施例5，具体的将实施例5合成七肽的第一个氨基酸Arg替换为Glu，第七个氨基酸Asp替换为Ser。
[戊酸胆碱]＋[Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－的合成：实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。将七肽Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser9.82g(0.01mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入2.06g戊酸胆碱(0.01mol)，其他操作参见实施例5，得到戊酸胆碱与七肽Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser摩尔比为1:1的[戊酸胆碱]＋[Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－短肽类离子液体。
戊酸胆碱与七肽Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser摩尔比为1:2和1:3的[戊酸胆碱]＋[Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－短肽类离子液体的合成方法只需将七肽Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser的质量分别对应增加到19.64g(0.02mol)和29.46g(0.03mol)，其余的合成步骤同戊酸胆碱与七肽Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser摩尔比为1:1的[戊酸胆碱]＋[Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－短肽类离子液体的合成方法。
制备得到的离子液体1HNMR((400M，D2O，DMSO):δ=7.24(d,5H),7.10(d,2H),6.74(d,2H),4.83(t,1H),4.47(s,1H),4.43(q,3H),4.15(t,2H),3.34(d,1H),3.86(s,2H),3.16(d,2H),3.08(s,9H),2.65(q,2H),2.45(q,2H),2.32(m,2H),2.23(t,2H),2.11(m,2H),1.81(m,6H),1.66(t,2H),1.27(q,6H),0.93(m,3H)。
实施例7[醋酸胆碱]＋[Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－的合成
醋酸胆碱的合成方法参照Avalos报道的合成方法。(M.Avalos,R.Babiano,Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,3904–3908.)。
七肽Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser的合成方法参加实施例5，具体的将实施例5合成七肽的第一个氨基酸Arg替换为Lys，第七个氨基酸Asp替换为Ser。
[醋酸胆碱]＋[Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－的合成：实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。将七肽Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser9.82g(0.01mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入1.64g醋酸胆碱(0.01mol)，其他操作参见实施例5，得到醋酸胆碱与七肽Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser摩尔比为1:1的[醋酸胆碱]＋[Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－短肽类离子液体。
醋酸胆碱与七肽Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser摩尔比为1:2和1:3的[醋酸胆碱]＋[Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－短肽离子液体的合成方法只需将七肽Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser的质量分别对应增加到19.64g(0.02mol)和29.46g(0.03mol)，其余的合成步骤同醋酸胆碱与七肽Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser摩尔比为1:1的[醋酸胆碱]＋[Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－短肽类离子液体的合成方法。
制备得到的离子液体1HNMR(400M，D2O，DMSO):δ=7.31(d,5H),7.13(d,2H),6.83(d,2H),5.01(t,1H),4.87(s,1H),4.63(q,3H),4.11(t,2H),3.87(s,2H),3.49(d,3H),3.13(s,9H),2.84(q,4H),1.92(m,6H),1.66(t,2H)，3.16(d,2H),2.77(q,2H),2.08(s,3H),1.85(m,10H),1.51(m,4H)。
实施例8[丁酸甲酯胆碱]＋[Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－的合成
丁酸甲酯胆碱的合成方法参照Avalos报道的合成方法。(M.Avalos,R.Babiano,Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,3904–3908.)。
七肽Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser的合成方法参加实施例5，具体的将实施例5合成七肽的第一个氨基酸Arg替换为Phe，第七个氨基酸Asp替换为Ser。
[丁酸甲酯胆碱]＋[Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－的合成：实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。将七肽Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser10.0g(0.01mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入1.64g丁酸甲酯胆碱(0.01mol)，其他操作参见实施例5，得到丁酸甲酯胆碱与七肽Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser摩尔比为1:1的[丁酸甲酯胆碱]＋[Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－短肽类离子液体。
丁酸甲酯胆碱与七肽Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser摩尔比为1:2和1:3的[丁酸甲酯胆碱]＋[Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－短肽类离子液体的合成方法只需将七肽Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser的质量分别对应增加到20.0g(0.02mol)和30.0g(0.03mol)，其他的合成步骤同丁酸甲酯胆碱与七肽Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser摩尔比为1:1的[丁酸甲酯胆碱]＋[Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－短肽类离子液体的合成方法。
制备得到的离子液体1HNMR(400M，D2O，DMSO):δ=7.26(d,5H),7.18(d,4H),7.09(d,3H),6.73(d,2H),4.78(t,1H),4.57(s,1H),4.53(q,3H),4.10(t,2H),3.87(t,3H),3.50(s,3H),3.08(s,9H),3.06(d,4H),2.64(q,4H),1.97(t,2H),1.82(m,6H),1.56(t,2H),1.38(q,2H),0.95(s,3H)。
实施例9～11
将发酵所得湿菌丝体（湿菌丝体的制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，分别加入实施例2制备的终浓度10wt%[醋酸胆碱]＋[五肽]－(五肽是指Arg-Lys-Asp-Val-Tyr)，初始浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表1。
萃取液中的产物和未反应底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物为十二烷。取1ml萃取液加入2μl十二烷进行分析。气相色谱的操作条件为：进样器温度250℃，检测器温度250℃，柱温80℃保留2min，以4℃/min升温至180℃，维持10min，载气为氮气，流量为1.5ml/min，分流比为1:20，进样量为1μl。根据气相色谱检测谱图，用相对校正因子法计算出反应液中产物的浓度和ee值。
产率计算方法为：
内标法：以十二烷为内标物，测得产物浓度标准曲线。测定时在样品中加入一定量的十二烷为内标物，根据内标物浓度计算得出产物浓度。
标准曲线制备方法：准确称取一系列不同浓度的底物或产物标准品，溶于正己烷，配制成一系列混合溶液，分别用气相色谱检测。将所得色谱图积分得到峰面积，以底物或产物与正十二烷的峰面积比(S底物/S十二烷或S产物/S十二烷)为横坐标，浓度比(C底物/C十二烷或C产物/C十二烷)为纵坐标，作出标准曲线，从而得到3，5-双三氟甲基苯乙酮与内标物的相对校正因子为1.31，3,5-双三氟甲基苯乙醇与内标物的相对校正因子为1.69。
产率计算公式如下：
公式（1）中Cp为(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇浓度，C0为3,5-双三氟甲基苯乙酮初始浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess,ee)来表征。计算公式为：
公式（2）中CR和CS分别为R型和S型3,5-双三氟甲基苯乙醇的摩尔浓度。
表1产物浓度及ee值
| 实施例 | 醋酸胆碱：五肽（摩尔比） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 9 | 1:1 | 60.6 | >98 |
| 10 | 1:2 | 55.7 | >98 |
| 11 | 1:3 | 49.1 | >98 |
实施例12～14
将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，分别加入实施例1制备的终浓度10wt%[氯化胆碱]＋[五肽]－(五肽是指His-Lys-Asp-Val-Glu)，初始浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表2。
表2产物浓度及ee值
| 实施例 | 氯化胆碱：五肽（摩尔比） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 12 | 1:1 | 63.1 | >98 |
| 13 | 1:2 | 60.5 | >98 |
| 14 | 1:3 | 52.9 | >98 |
实施例15～17
将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，分别加入实施例3制备的终浓度10wt%[丁酸甲酯胆碱]＋[五肽]－(五肽是指Cys-Lys-Asp-Val-Glu)，初始浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表3。
表3产物浓度及ee值
| 实施例 | 丁酸甲酯胆碱：五肽（摩尔比） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 15 | 1:1 | 55.8 | >98 |
| 16 | 1:2 | 50.2 | >98 |
| 17 | 1:3 | 43.9 | >98 |
实施例18～20
将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，分别加入实施例4制备的终浓度10wt%[戊酸胆碱]＋[五肽]－(五肽是指Ser-Lys-Asp-Val-Tyr)，初始浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表4。
表4产物浓度及ee值
| 实施例 | 戊酸胆碱：五肽（摩尔比） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 18 | 1:1 | 56.9 | >98 |
| 19 | 1:2 | 57.1 | >98 |
| 20 | 1:3 | 60.4 | >98 |
实施例21～23
将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，分别加入实施例8制备的终浓度10wt%[丁酸甲酯胆碱]＋[七肽]－(七肽是指Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser)，初始浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表5。
表5产物浓度及ee值
| 实施例 | 丁酸甲酯胆碱：七肽（摩尔比） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 21 | 1:1 | 60.7 | >98 |
| 22 | 1:2 | 54.3 | >98 |
| 23 | 1:3 | 46.9 | >98 |
实施例24～26
将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，分别加入实施例5制备的终浓度10wt%[氯化胆碱]＋[七肽]－(七肽是指Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp)，初始浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表6。
表6产物浓度及ee值
| 实施例 | 氯化胆碱：七肽（摩尔比） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 24 | 1:1 | 54.7 | >98 |
| 25 | 1:2 | 64.8 | >98 |
| 26 | 1:3 | 55.1 | >98 |
实施例27～29
将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，分别加入实施例6制备的终浓度10wt%[戊酸胆碱]＋[七肽]－(七肽是指Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp)，初始浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表7。
表7产物浓度及ee值
| 实施例 | 戊酸胆碱：七肽（摩尔比） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 27 | 1:1 | 56.8 | >98 |
| 28 | 1:2 | 45.4 | >98 |
| 29 | 1:3 | 38.7 | >98 |
实施例30～31
将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，分别加入实施例7制备的终浓度10wt%[醋酸胆碱]＋[七肽]－(七肽是指Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser)，初始浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表8。
表8产物浓度及ee值
| 实施例 | 醋酸胆碱：七肽（摩尔比） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 30 | 1:1 | 52.2 | >98 |
| 31 | 1:2 | 66.4 | >98 |
| 32 | 1:3 | 57.3 | >98 |
实施例33～36
将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，加入实施例1制备的终浓度不同的[氯化胆碱]＋[五肽]－(氯化胆碱与五肽的摩尔比为1:1，五肽是指His-Lys-Asp-Val-Glu)，初始浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表9。由表9可知，当离子液体含量为5wt%时，(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度最高，为64.4mM，产率为92.0%。
表9产物浓度及ee值
| 实施例 | 五肽离子液体含量（wt,%） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 33 | 2.5 | 58.9 | >98 |
| 34 | 5 | 64.4 | >98 |
| 35 | 10 | 62.1 | >98 |
| 36 | 15 | 40.1 | >98 |
实施例37～40
将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，加入实施例7制备的终浓度不同的[醋酸胆碱]＋[七肽]－(醋酸胆碱与七肽的摩尔比为1:2，七肽是指Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser)，初始浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表10。由表10可知，当离子液体含量为10wt%时，(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度最高，为66.1mM，产率为94.4%。
表10产物浓度及ee值
| 实施例 | 七肽离子液体含量（wt,%） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 37 | 2.5 | 60.5 | >98 |
| 38 | 5 | 63.2 | >98 |
| 39 | 10 | 66.1 | >98 |
| 40 | 15 | 54.9 | >98 |
实施例41～51
将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，加入实施例1制备的终浓度5wt%的[氯化胆碱]＋[五肽]－(氯化胆碱与五肽的摩尔比为1:1，五肽是指His-Lys-Asp-Val-Glu)，初始浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，添加不同的糖类或醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表11。由表11可知，当以无水乙醇(终浓度6%，v/v)和异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物时，(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度最高，为64.7mM,产率为92.7%；当不加辅助底物时，(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为10.8mM，产率为15.4%。
表11产物浓度及ee值
实施例52～62
将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，加入实施例7制备的终浓度10wt%的[醋酸胆碱]＋[七肽]－(醋酸胆碱与七肽的摩尔比为1:2，七肽是指Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser)，初始浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，添加不同的糖类或醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表12。由表12可知，当以无水乙醇(终浓度6%，v/v)和异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物时，(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度最高，为66.5mM,产率为95.0%；当不加辅助底物时，(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为12.6mM,产率为18.0%。
表12产物浓度及ee值
实施例63～66
将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，加入实施例1制备的终浓度5wt%[氯化胆碱]＋[五肽]－(氯化胆碱与五肽的摩尔比为1:1，五肽是指His-Lys-Asp-Val-Glu)，初始浓度不同的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表13。由表13可知，当底物浓度为100mM时，(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度最高，达到91.0mM，产率为91.0%。
表13产物浓度及ee值
| 实施例 | 底物浓度(mM) | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 63 | 70 | 64.4 | >98 |
| 64 | 80 | 74.6 | >98 |
| 65 | 100 | 91.0 | >98 |
| 66 | 120 | 86.4 | >98 |
实施例67～70
将发酵所得湿菌丝体悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，加入实施例7制备的10wt%[醋酸胆碱]＋[七肽]－(醋酸胆碱与七肽的摩尔比为1:2，七肽是指Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser)，初始浓度不同的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，1.2ml无水乙醇(终浓度6%，v/v)和1.2ml异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见下表14。由表14可知，当底物浓度为100mM时，(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度最高，达到92.4mM，产率为92.4%。
表14产物浓度及ee值
| 实施例 | 底物浓度(mM) | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 67 | 70 | 66.1 | >98 |
| 68 | 80 | 75.2 | >98 |
| 69 | 100 | 92.4 | >98 |
| 70 | 120 | 85.2 | >98 |
Claims (10)
1.一种利用含短肽类离子液体反应体系制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，其特征在于所述方法为：以棘孢木霉ZJPH0810发酵培养获得的湿菌丝体作为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，在短肽类离子液体与蒸馏水构成的反应体系中，于25～45℃、100～300r/min条件下反应6～50小时，反应结束后，反应液用等体积正己烷萃取，萃取液经分离纯化得到(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇产物；所述短肽类离子液体以胆碱类化合物为阳离子，以短肽化合物为阴离子，所述短肽化合物由4～9个天然氨基酸脱水缩合而成，所述胆碱类化合物与短肽化合物的物质的量之比为1：1～3；所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为10～50g/L，所述反应体系中底物初始浓度为50～300mM，所述反应体系中短肽类离子液体质量浓度为0.1～30%。
2.如权利要求1所述利用含短肽类离子液体反应体系制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，其特征在于所述短肽化合物是由苯丙氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、色氨酸、谷氨酸、缬氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸或组氨酸中的任意4～9种氨基酸残基以任意顺序脱水缩合而成。
3.如权利要求1所述利用含短肽类离子液体反应体系制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，其特征在于所述短肽化合物氨基酸序列为A1-Lys-Asp-Val-B1，其中A1代表Arg、Ser、Cys或His，B1代表Glu或Tyr。
4.如权利要求1所述利用含短肽类离子液体反应体系制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，其特征在于所述短肽化合物的氨基酸序列为A2-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-B2，其中A2代表Arg、Phe、Lys或Glu，B2代表Ser或者Asp。
5.如权利要求1所述利用含短肽类离子液体制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，其特征在于所述胆碱类化合物为醋酸胆碱、氯化胆碱、丁酸甲酯胆碱或戊酸胆碱。
6.如权利要求1所述利用含短肽类离子液体反应体系制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，其特征在于所述短肽类离子液体为下列之一：[醋酸胆碱]＋[Arg-Lys-Asp-Val-Tyr]－、[氯化胆碱]+[His-Lys-Asp-Val-Glu]－、[丁酸甲酯胆碱]＋[Cys-Lys-Asp-Val-Glu]－、[戊酸胆碱]＋[Ser-Lys-Asp-Val-Tyr]－、
[丁酸甲酯胆碱]＋[Phe-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－、[氯化胆碱]＋[Arg-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Asp]－、[戊酸胆碱]＋[Glu-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－或[醋酸胆碱]＋[Lys-Cys-Arg-Phe-Ala-Tyr-Ser]－。
7.如权利要求1所述利用含短肽类离子液体反应体系制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，其特征在于所述反应是在25～35℃、150～250r/min条件下反应18～40小时。
8.如权利要求1所述利用含短肽类离子液体反应体系制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，其特征在于所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为20～40g/L，所述反应体系中底物初始浓度为50～180mM，所述反应体系中短肽类离子液体质量浓度为2～20%。
9.如权利要求1所述利用含短肽类离子液体反应体系制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，其特征在于所述含短肽类离子液体的反应体系中还添加有辅助底物，所述辅助底物可为下列一种或两种及以上任意比例的混合：①甲醇、②乙醇、③异丙醇、④甘油、⑤葡萄糖、⑥果糖、⑦鼠李糖或⑧麦芽糖，所述反应体系中辅助底物质量浓度为0.1～20%。
10.如权利要求1所述利用含短肽类离子液体反应体系制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，其特征在于所述辅助底物为下列之一：①反应体系中，体积终浓度6%无水乙醇；②反应体系中，体积终浓度6%无水乙醇和体积终浓度6%异丙醇两者的混合；③反应体系中，体积终浓度6%无水乙醇、体积终浓度6%异丙醇和质量终浓度6%葡萄糖三者的混合。
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