CN103709218B - 一种提高泰乐菌素a组分的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及泰乐菌素的提取技术，具体公开一种提高泰乐菌素A组分的提取方法，采用一种复合溶媒从泰乐菌素发酵滤液中萃取泰乐菌素，复合溶媒由甲苯和乙酸丁酯或乙酸异丁酯组成，甲苯在复合溶媒中的比例为70%~95%（V/V）。本发明的提取方法，在提高产品收率的同时，一方面解决了溶媒损耗问题，另一方面解决了泰乐菌素发酵异常的问题。

Description

一种提高泰乐菌素A组分的提取方法

技术领域

本发明属抗生素药物领域，具体涉及泰乐菌素的提取技术，可有效提高泰乐菌素产品中的A组分。

背景技术

泰乐菌素是一种十六元内酯类禽畜专用抗生素，它是由弗氏链霉菌(streptomycesfradiae)在发酵过程中同时获得A、B、C、D四个组分的混合物，其中：A组分为泰乐菌素(Tylosin)，B组分为脱碳糖泰乐菌素((Desmycosin)，C组分为大菌素(Macrosin)，D组分为雷洛菌素(Relomycin)以及结构类似物拉克亭菌素。以上四个组分中，除雷洛菌素外其它组分在试管内均有抗菌活性，而泰乐菌素A组分在体内证实有较高活性。常见泰乐菌素产品是酒石酸泰乐菌素和磷酸泰乐菌素及泰乐菌素碱。泰乐菌素对革兰氏阳性菌及某些阴性菌（如金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎双球菌等）以及支原体、弧菌及其他致病因子有很高的活性，是世界公认治疗和预防畜禽支原体感染的首选药物。

目前，国内泰乐菌素的一般提取工艺是：泰乐菌素发酵液预处理后经板框过滤获得发酵滤液，用乙酸丁酯对发酵滤液进行萃取得富含泰乐菌素的有机相，再用酸水进行反萃取，经中和、脱色、浓缩、干燥后得酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素精品。

上述工艺所用的乙酸丁酯是一种优良的萃取剂，对泰乐菌素具有较好的溶解度，但在实际生产中损耗较大。目前有关泰乐菌素萃取溶媒的专利都是从这个角度出发，优化萃取溶媒，降低溶媒损耗。

如专利CN1432575A、CN1374406A通过将泰乐菌素发酵滤液用膜过滤或喷雾干燥浓缩设备浓缩后减少发酵滤液的体积，从而减少所需萃取剂的用量来减少溶媒的损耗。又如专利CN101565438A、CN101565439A采用氯仿和乙酸丁酯复合使用的方式进行萃取，由于氯仿具有更优异的溶解性能，从而减少溶媒的用量。又如专利CN101450959A通过往发酵滤液中加盐的方式，减少泰乐菌素在水中的溶解度，进而减少或完全避免使用溶媒。

另一方面，乙酸丁酯对泰乐菌素及其结构类似物的杂质以及泰乐菌素A、B、C、D各组分之间的分离度并不是很好。上述专利中，无论是发酵滤液浓缩、采用氯仿混合溶媒还是往发酵滤液中加盐的方式，都会因为处理方法问题导致泰乐菌素发酵滤液中的杂质在水中的溶解度下降或在有机溶剂中的溶解度增加，从而增加乙酸丁酯萃取液中的杂质含量，使得产品中泰乐菌素A组分下降。

“发酵异常”是生化药物行业的一个普遍现象，泰乐菌素发酵异常会导致出现杂质含量增多、C组分无法彻底转化、D组分大幅度升高等现象。由于乙酸丁酯对杂质及泰乐菌素C、D的分离性能不好，仅仅采用乙酸丁酯作为萃取剂无法得到符合质量要求的产品。

所以尽管上述各专利方法减少了溶媒损耗并提高了产品收率，但这些方法依然无法满足对泰乐菌素产品质量方面的要求，尤其是在处理“异常发酵”批次时并无太大帮助。因此，一种可以提高泰乐菌素A组分的纯化方法还是很有需要的，本发明所提供的方法可以在一定程度上提高泰乐菌素A组分。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺点和不足，发明人旨在提供一种提高泰乐菌素A组分的提取方法，在提高产品收率的同时，一方面解决溶媒损耗问题，一方面解决泰乐菌素发酵异常的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实施的：

一种提高泰乐菌素A组分的提取方法，包括如下步骤：

在泰乐菌素发酵滤液中加入复合溶媒中进行萃取，得到的萃取液（即饱含泰乐菌素的有机相）采用磷酸溶液或酒石酸溶液进行反萃取获得水提液，获得的水提液经中和、脱色、喷雾干燥得到磷酸泰乐菌素或酒石酸泰乐菌素精品或者水提液在吹尽溶媒后加碱调pH值，使泰乐菌素碱从水提液中析出，经离心、干燥获得泰乐菌素碱，其中：所述的复合溶媒为甲苯与乙酸丁酯或乙酸异丁酯混合物，复合溶媒中甲苯比例为70%~95%（V/V），余量为乙酸丁酯或乙酸异丁酯。

研究发现，采用甲苯作为萃取剂分离纯化泰乐菌素可以获得比乙酸丁酯更高的泰乐菌素A组分，且甲苯对于泰乐菌素杂质及泰乐菌素C、D组分具有更高的分离效率。但甲苯对泰乐菌素的溶解度稍差，加入一定比例的乙酸丁酯或乙酸异丁酯形成的复合溶媒，可以增加溶媒对泰乐菌素的萃取能力。通过实验发现，复合溶媒中甲苯的比例越高，溶媒对泰乐菌素A的选择性越好。当复合溶媒中甲苯的比例低于70%时，复合溶媒对泰乐菌素A组分的提高并没有明显的帮助。另一方面，需要加入少量的乙酸丁酯或乙酸异丁酯来改善复合溶媒对泰乐菌素的溶解能力。所以复合溶媒中甲苯的合理比例为70%~95%（V/V），余量为乙酸丁酯或乙酸异丁酯。

作为优选方案，根据本发明所述的一种提高泰乐菌素A组分的提取方法，其中所述的萃取中：萃取温度为30-50℃，pH值为8.0-11.0下萃取，复合溶媒用量为：复合溶媒/泰乐菌素发酵滤液=20~100/100（V/V）。研究发现，在用复合溶媒萃取泰乐菌素的工艺条件上，萃取温度越高、pH值越高则泰乐菌素在有机溶媒相的分配比例越高，萃取收率越高。通过工艺优化实验，得到了控制萃取工艺条件。

作为优选方案，根据本发明所述的一种提高泰乐菌素A组分的提取方法，其中所述的反萃取中：所用的磷酸溶液或酒石酸溶液的质量浓度为1~3%，pH值为3.5~4.5下反萃取，反萃取温度为0~15℃。研究发现，在反萃取工艺上，萃取温度越低、pH值越低则泰乐菌素在水相的分配比例越高，反萃取收率越高；并且，若反萃取的温度太高，则会导致泰乐菌素在弱酸性条件下降解，使泰乐菌素产品的质量和收率严重下降。通过工艺优化实验，得到控制了反萃取工艺条件。

作为优选方案，根据本发明所述的一种提高泰乐菌素A组分的提取方法，其中：所述的水提液在吹尽溶媒后加碱调pH值至9.0~11.0，以便使泰乐菌素碱从水提液中析出，再经离心、干燥从而获得泰乐菌素碱。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、相较于单纯的乙酸丁酯萃取，采用本发明提供的复合溶媒，泰乐菌素A组分能够提高1~3%，提高了产品的纯度。

2、对于一些泰乐菌素发酵液发酵代谢异常的批次，比如泰乐菌素C组分无法彻底转化的发酵批次或者由于染菌导致泰乐菌素D组分偏高的批次，本发明所提供的方法能大幅度提高精品泰乐菌素的A组分，提高了发酵异常批次泰乐菌素产品的合格率。提高了泰乐菌素生产的抗风险能力。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例中的泰乐菌素发酵滤液，来源于浙江康裕生物制药有限公司大生产放罐的发酵滤液，其制备过程为：120吨发酵罐配制培养基，灭菌、接种。在pH6.0-7.0、温度28℃-37℃、空气流量800-1600m³/min、搅拌转速200rpm-300rpm的条件下培养150-200小时，放罐。发酵液经酸化、聚合氯化铝絮凝预处理后用板框压滤，获得发酵滤液。

实施例1用甲苯含量95%（V/V）的甲苯-乙酸丁酯复合溶媒萃取泰乐菌素

一种提高泰乐菌素A组分的提取方法，包括如下步骤：

泰乐菌素发酵滤液1000ml，效价9865μ/ml。用15%氢氧化钠溶液调pH值到9.0-9.5，加热到40℃后加入300ml甲苯含量95%（V/V）的甲苯-乙酸丁酯复合溶媒进行萃取；静置分层后下层水相再次用300ml甲苯-乙酸丁酯复合溶媒进行萃取分层，合并两次复合溶媒萃取液。将萃取液冷却到15℃以下，在保温的条件下缓慢加入质量浓度2.5%的酒石酸溶液进行反萃取，控制反萃取终点pH值为3.7~4.2，静置分层获得反萃取液。将反萃取液用15%氢氧化钙悬浊液调pH值到6.5，加入0.5%活性炭脱色1小时，真空抽滤获得脱色滤液。60℃真空减压干燥后得酒石酸泰乐菌素8.58g，效价921μ/mg，HPLC检测：A组分91.8%，C组分0.2%，D组分4.4%。

比较例1

其他操作同实施例1，不同之处在于：泰乐菌素发酵滤液改用乙酸丁酯萃取。在同样的提取工艺条件下获得酒石酸泰乐菌素成品8.77g，效价903μ/mg，HPLC检测：A组分89.9%，C组分0.7%，D组分5.8%。

实施例2用甲苯含量70%（V/V）的甲苯-乙酸丁酯复合溶媒萃取泰乐菌素

泰乐菌素发酵滤液1000ml，效价101325μ/ml。用15%氢氧化钠溶液调pH值到9.0-9.5，加热到30℃后加入350ml甲苯含量70%（V/V）的甲苯-乙酸丁酯复合溶媒进行萃取；静置分层后下层水相再次用350ml甲苯-乙酸丁酯复合溶媒进行萃取分层，合并两次复合溶媒萃取液。将萃取液冷却到10℃以下，在保温的条件下缓慢加入质量浓度2.0%的磷酸溶液进行反萃取，控制反萃取终点pH值为3.7~4.2，静置分层获得反萃取液。将反萃取液用15%氢氧化钙悬浊液调pH值到6.5，加入0.5%活性炭脱色1小时，真空抽滤获得脱色滤液。60℃真空减压干燥后得磷酸泰乐菌素8.86g，效价909μ/mg，HPLC检测：A组分90.7%，C组分0.5%，D组分3.8%。

比较例2

其他操作同实施例2，不同之处在于：泰乐菌素发酵滤液改用乙酸丁酯萃取。在同样的提取工艺条件下获得磷酸泰乐菌素成品9.09g，效价896μ/mg，HPLC检测：A组分89.2%，C组分1.7%，D组分5.1%

实施例3用甲苯含量80%（V/V）的甲苯-乙酸丁酯复合溶媒处理C组分未完全转化泰乐菌素发酵滤液

泰乐菌素发酵滤液1000ml，效价9361μ/ml。用15%氢氧化钠溶液调pH值到9.0-9.5，加热到50℃后加入350ml甲苯含量80%（V/V）的甲苯-乙酸丁酯复合溶媒进行萃取；静置分层后下层水相再次用350ml甲苯-乙酸丁酯复合溶媒进行萃取分层，合并两次复合溶媒萃取液。将萃取液冷却到15℃以下，在保温的条件下缓慢加入质量浓度2.5%的酒石酸溶液进行反萃取，控制反萃取终点pH值为3.7~4.2，静置分层获得反萃取液。将反萃取液用15%氢氧化钙悬浊液调pH值到6.5，加入0.5%活性炭脱色1小时，真空抽滤获得脱色滤液。60℃真空减压干燥后得酒石酸泰乐菌素8.05g，效价912μ/mg，HPLC检测：A组分90.9%，C组分1.6%，D组分3.5%。

比较例3

其他操作同实施例3，不同之处在于：泰乐菌素发酵滤液改用乙酸丁酯萃取。在同样的提取工艺条件下获得酒石酸泰乐菌素成品8.42g，效价876μ/mg，HPLC检测：A组分86.1%，C组分4.5%，D组分4.8%

实施例4用甲苯含量90%（V/V）的甲苯-乙酸丁酯复合溶媒处理C组分未完全转化泰乐菌素发酵滤液

泰乐菌素发酵滤液1000ml，效价8865μ/ml。用15%氢氧化钠溶液调pH值到8.0~8.5，加热到35℃后加入400ml甲苯含量90%（V/V）的甲苯-乙酸丁酯复合溶媒进行萃取；静置分层后下层水相再次用300ml甲苯-乙酸丁酯复合溶媒进行萃取分层，合并两次复合溶媒萃取液。将萃取液冷却到10℃以下，在保温的条件下缓慢加入质量浓度2.0%的磷酸溶液进行反萃取，控制反萃取终点pH值为3.7~4.2，静置分层获得反萃取液。将反萃取液用15%氢氧化钙悬浊液调pH值到6.5，加入0.5%活性炭脱色1小时，真空抽滤获得脱色滤液。60℃真空减压干燥后得磷酸泰乐菌素7.66g，效价887μ/mg，HPLC检测：A组分88.6%，C组分3.1%，D组分3.3%。

比较例4

其他操作同实施例4，不同之处在于：泰乐菌素发酵滤液改用乙酸丁酯萃取。在同样的提取工艺条件下获得磷酸泰乐菌素成品8.07g，效价846μ/mg，HPLC检测：A组分82.1%，C组分7.6%，D组分4.9%。

实施例5用甲苯含量90%（V/V）的甲苯-乙酸丁酯复合溶媒处理D组分偏高泰乐菌素发酵滤液

泰乐菌素发酵滤液1000ml，效价8399μ/ml。用15%氢氧化钠溶液调pH值到8.0~8.5，加热到45℃后加入400ml甲苯含量90%（V/V）的甲苯-乙酸丁酯复合溶媒进行萃取；静置分层后下层水相再次用300ml甲苯-乙酸丁酯复合溶媒进行萃取分层，合并两次复合溶媒萃取液。将萃取液冷却到10℃以下，在保温的条件下缓慢加入2.0%的磷酸溶液进行反萃取，控制反萃取终点pH值为3.7~4.2，静置分层获得反萃取液。将反萃取液用15%氢氧化钙悬浊液调pH值到6.5，加入0.5%活性炭脱色1小时，真空抽滤获得脱色滤液。60℃真空减压干燥后得磷酸泰乐菌素7.24g，效价916μ/mg，HPLC检测：A组分90.3%，C组分0.8%，D组分5.1%。

比较例5

其他操作同实施例5，不同之处在于：泰乐菌素发酵滤液改用乙酸丁酯萃取。在同样的提取工艺条件下获得磷酸泰乐菌素成品7.88g，效价853μ/mg，HPLC检测：A组分85.6%，C组分2.4%，D组分7.3%。

实施例6用甲苯含量75%（V/V）的甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒萃取泰乐菌素发酵滤液

泰乐菌素发酵滤液1000ml，效价10667μ/ml。用15%氢氧化钠溶液调pH值到9.0-9.5，加热到40℃后加入400ml甲苯含量75%（V/V）的甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒进行萃取；静置分层后下层水相再次用350ml甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒进行萃取分层，合并两次复合溶媒萃取液。将萃取液冷却到15℃以下，在保温的条件下缓慢加入2.5%的酒石酸溶液进行反萃取，控制反萃取终点pH值为3.7~4.2，静置分层获得反萃取液。将反萃取液用15%氢氧化钙悬浊液调pH值到6.5，加入0.5%活性炭脱色1小时，真空抽滤获得脱色滤液。脱色滤液滴加10%氢氧化钠溶液到pH值为9.5，45℃保温1小时后抽滤获得泰乐菌素晶体并用少量热水顶洗(指的是用水洗涤晶体)，泰乐菌素晶体70℃真空干燥，得泰乐菌素碱成品7.59g，效价1023μ/mg，HPLC检测：A组分93.3%，C组分0.3%，D组分2.5%。

比较例6

其他操作同实施例6，不同之处在于：泰乐菌素发酵滤液改用乙酸丁酯萃取。在同样的提取工艺条件下获得泰乐菌素碱成品7.80g，效价997μ/mg，HPLC检测：A组分92.1%，C组分0.7%，D组分2.8%。

实施例7用甲苯含量95%（V/V）的甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒萃取泰乐菌素

泰乐菌素发酵滤液1000ml，效价10865μ/ml。用15%氢氧化钠溶液调pH值到9.0-9.5，加热到30℃后加入500ml甲苯含量95%（V/V）的甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒进行萃取；静置分层后下层水相再次用400ml甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒进行萃取分层，合并两次复合溶媒萃取液。将萃取液冷却到15℃以下，在保温的条件下缓慢加入质量浓度1.5%的酒石酸溶液进行反萃取，控制反萃取终点pH值为3.7~4.2，静置分层获得反萃取液。将反萃取液用15%氢氧化钙悬浊液调pH值到6.2，加入0.5%活性炭脱色1小时，真空抽滤获得脱色滤液。60℃真空减压干燥后得酒石酸泰乐菌素9.41g，效价901μ/mg，HPLC检测：A组分90.8%，C组分0.6%，D组分4.7%。

比较例7

其他操作同实施例7，不同之处在于：泰乐菌素发酵滤液改用乙酸丁酯萃取。在同样的提取工艺条件下获得酒石酸泰乐菌素成品9.68g，效价882μ/mg，HPLC检测：A组分89.7%，C组分0.9%，D组分5.4%。

实施例8用甲苯含量90%（V/V）的甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒萃取泰乐菌素

泰乐菌素发酵滤液1000ml，效价7933μ/ml。用15%氢氧化钠溶液调pH值到9.0-9.5，加热到30℃后加入100ml甲苯含量90%（V/V）的甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒进行萃取；静置分层后下层水相再次用100ml甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒进行萃取分层，合并两次复合溶媒萃取液。将萃取液冷却到5℃以下，在保温的条件下缓慢加入质量浓度3.0%的磷酸溶液进行反萃取，控制反萃取终点pH值为3.7~4.2，静置分层获得反萃取液。将反萃取液用10%氢氧化钙悬浊液调pH值到6.4，加入0.5%活性炭脱色1小时，真空抽滤获得脱色滤液。60℃真空减压干燥后得磷酸泰乐菌素5.38g，效价907μ/mg，HPLC检测：A组分90.5%，C组分0.7%，D组分4.8%。

比较例8

其他操作同实施例8，不同之处在于：泰乐菌素发酵滤液改用乙酸丁酯萃取。在同样的提取工艺条件下获得磷酸泰乐菌素成品5.62g，效价891μ/mg，HPLC检测：A组分89.3%，C组分0.8%，D组分5.2%。

实施例9用甲苯含量85%（V/V）的甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒萃取泰乐菌素

泰乐菌素发酵滤液1000ml，效价11165μ/ml。用15%氢氧化钠溶液调pH值到9.0-9.5，加热到30℃后加入500ml甲苯含量95%（V/V）的甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒进行萃取；静置分层后下层水相再次用500ml甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒进行萃取分层，合并两次复合溶媒萃取液。将萃取液冷却到10℃以下，在保温的条件下缓慢加入质量浓度1.0%的酒石酸溶液进行反萃取，控制反萃取终点pH值为3.7~4.2，静置分层获得反萃取液。将反萃取液用15%氢氧化钙悬浊液调pH值到6.2，加入0.5%活性炭脱色1小时，真空抽滤获得脱色滤液。60℃真空减压干燥后得酒石酸泰乐菌素9.29g，效价916μ/mg，HPLC检测：A组分91.9%，C组分0.2%，D组分3.9%。

比较例9

其他操作同实施例9，不同之处在于：泰乐菌素发酵滤液改用乙酸丁酯萃取。在同样的提取工艺条件下获得酒石酸泰乐菌素成品9.42g，效价899μ/mg，HPLC检测：A组分90.7%，C组分0.5%，D组分4.4%。

实施例10用甲苯含量90%（V/V）的甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒萃取泰乐菌素

泰乐菌素发酵滤液1000ml，效价9983μ/ml。用15%氢氧化钠溶液调pH值到9.0-9.5，加热到30℃后加入300ml甲苯含量90%（V/V）的甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒进行萃取；静置分层后下层水相再次用300ml甲苯-乙酸异丁酯复合溶媒进行萃取分层，合并两次复合溶媒萃取液。将萃取液冷却到5℃以下，在保温的条件下缓慢加入质量浓度1.0%的磷酸溶液进行反萃取，控制反萃取终点pH值为3.7~4.2，静置分层获得反萃取液。将反萃取液用10%氢氧化钙悬浊液调pH值到6.4，加入0.5%活性炭脱色1小时，真空抽滤获得脱色滤液。60℃真空减压干燥后得磷酸泰乐菌素8.56g，效价917μ/mg，HPLC检测：A组分92.5%，C组分0.3%，D组分3.7%。

比较例10

其他操作同实施例10，不同之处在于：泰乐菌素发酵滤液改用乙酸丁酯萃取。在同样的提取工艺条件下获得磷酸泰乐菌素成品8.68g，效价906μ/mg，HPLC检测：A组分91.7%，C组分0.5%，D组分4.2%。

上述优选实施例只是用于说明和解释本发明的内容，并不构成对本发明内容的限制。尽管发明人已经对本发明做了较为详细地列举，但是，本领域的技术人员根据发明内容部分和实施例所揭示的内容，能对所描述的具体实施例做各种各样的修改或/和补充或采用类似的方式来替代是显然的，并能实现本发明的技术效果，因此，此处不再一一赘述。本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不构成对本发明的限制。

Claims (3)

1.一种提高泰乐菌素A组分的提取方法，其特征在于包括如下步骤：

在泰乐菌素发酵滤液中加入复合溶媒中进行萃取，得到的萃取液采用磷酸溶液或酒石酸溶液进行反萃取获得水提液，获得的水提液经中和、脱色、喷雾干燥得到磷酸泰乐菌素或酒石酸泰乐菌素精品或者水提液在吹尽溶媒后加碱调pH值，使泰乐菌素碱从水提液中析出，经离心、干燥获得泰乐菌素碱，其中：所述的复合溶媒为甲苯与乙酸丁酯或乙酸异丁酯混合物，复合溶媒中甲苯比例为70%~95%（V/V），余量为乙酸丁酯或乙酸异丁酯，

萃取中：萃取温度为30-50℃，pH值为8.0-11.0下萃取，复合溶媒用量为：复合溶媒/泰乐菌素发酵滤液=20~100/100（V/V）。

2.根据权利要求1所述的一种提高泰乐菌素A组分的提取方法，其特征在于所述的反萃取中：所用的磷酸溶液或酒石酸溶液的质量浓度为1~3%，pH值为3.5~4.5下反萃取，反萃取温度为0~15℃。

3.根据权利要求1所述的一种提高泰乐菌素A组分的提取方法，其特征在于所述的水提液在吹尽溶媒后加碱调pH值至9.0~11.0。