CN103698523A - 特异性抗rHAP单克隆抗体及其制备方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性抗rHAP单克隆抗体及其制备方法和试剂盒，该特异性抗rHAP单克隆抗体的制备方法具有以下步骤：①免疫；②细胞融合；③阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株；④对步骤③得到的抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株进行特异性阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株。⑤用步骤④得到的特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株制备特异性抗rHAP单克隆抗体。本发明的特异性抗rHAP单克隆抗体用于制备体内药物浓度检测试剂盒，进而可以检测出rHAP在动物体内的分布情况，增强了检验的特异性和结果的准确性。

Description

特异性抗rHAP单克隆抗体及其制备方法和试剂盒

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种特异性抗rHAP单克隆抗体及其制备方法和试剂盒。

背景技术

与小分子药物在动物体内的药物代谢动力学研究不同的是，大分子药物需要特异性更强的检测方法。

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，主要适于大分子抗原，其原理是将已知抗体包被微量反应板后与待检抗原反应，然后再加酶标抗体和底物，根据显色反应对抗原进行定性和定量。在包被抗体和检测抗体的选择上需要对所检测的抗原进行具体分析。

重组人抗血栓蛋白（rHAP）系经工程菌发酵表达的重组DNA制品，它是一种以活化血小板为靶点，将分子聚集在血栓部位，并通过其分子中各主要结构域行使发挥比之更高效的抗血栓功能，达到全面、高效抗血栓作用的重组蛋白质药物，同时其靶向性也赋予了该药物较高的安全性。

中国专利文献CN1286262A公开的人胎盘抗凝蛋白介导的新型抗凝蛋白即为重组人抗血栓蛋白，它是将不同蛋白质结构域连接在一起构建成的融合蛋白，其分子两端分别为AnnexinV结构域和水蛭素片段结构域。由于Annexin V存在于多种动物体内，因此在进行药物代谢动力学研究时，所用的动物体内的Annexin V会对进入其体内的rHAP检测造成干扰，出现假阳性结果。

因此，为了最大程度地降低干扰，同时检测到rHAP分子两端的Annexin V结构域和水蛭素片段结构域，从而满足药物代谢动力学研究的需要，需要制备出针对Annexin V和水蛭素片段抗原决定簇的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的之一在于解决上述问题，提供一种用于检测rHAP在动物体内分布情况的特异性抗rHAP单克隆抗体及其制备方法。

本发明的目的之二在于解决上述问题，提供一种用于检测rHAP在动物体内分布情况的试剂盒。

实现本发明目的之一的技术方案是：一种特异性抗rHAP单克隆抗体的制备方法，具有以下步骤：

①免疫：分为三次，前两次是将抗原rHAP与弗式完全佐剂制成油包水乳剂，在小鼠颈背部皮下多点注射；第三次是将抗原rHAP用生理盐水溶解，在小鼠腹腔注射。

②细胞融合：包括常规方法进行细胞融合、HAT选择性培养以及ELISA法筛选，得到杂交瘤细胞。

③对步骤②得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株。

④对步骤③得到的抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株进行特异性阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株。

⑤用步骤④得到的特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株按照常规方法制备腹水、纯化，得到特异性抗rHAP单克隆抗体。

上述步骤④中所述的特异性阳性克隆的筛选是指分别采用rHAP一端的水蛭素片段（其氨基酸序列为：pkpqshndgdfeeipeeylq）和rHAP另一端的Annexin V（其氨基酸序列为：aqvlrgtvtdfpgfderad aetlrkamkg lgtdeesilt lltsrsnaqr qeisaafktl fgrdllddlk seltgkfeklivalmkpsrl ydayelkhal kgagtnekvl teiiasrtpe elraikqvye eeygssledd vvgdtsgyyqrmlvvllqan rdpdagidea qveqdaqalf qagelkwgtd eekfitifgt rsvshlrkvf dkymtisgfqieetidrets gnleqlllav vksirsipay laetlyyamk gagtddhtli rvmvsrseid lfnirkefrknfatslysmi kgdtsgdykk allllcgedd）作为抗原决定簇对抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株进行阳性克隆的筛选，最后分别得到作为特异性抗rHAP单克隆抗体的抗水蛭素片段单克隆抗体和抗Annexin V单克隆抗体。

实现本发明目的之二的技术方案是：一种含有上述特异性抗rHAP单克隆抗体的试剂盒，包括包被抗体（上述特异性抗rHAP单克隆抗体其中一种）、检测抗体（上述特异性抗rHAP单克隆抗体另一种）、SAV-HRP、PSB缓冲液以及封闭液。其中封闭液由BSA、蔗糖以及PBS缓冲液组成。检测抗体在应用前需要进行生物素化。

上述试剂盒在加样前需按每100μL的标准品或待测样品加10μL浓度为0.4M的EDTA混匀后再加入96孔板中。

本发明具有的积极效果：本发明的特异性抗rHAP单克隆抗体用于制备体内药物浓度检测试剂盒，进而可以检测出rHAP在动物体内的分布情况，增强了检验的特异性，大大减少动物体内Annexin V本底的干扰，增强了检验结果的准确性。

具体实施方式

（实施例1）

本实施例的特异性抗rHAP单克隆抗体的制备方法具有以下步骤：

①免疫：

第一次免疫：取40μg/mouse纯化好的抗原（即rHAP，下同），加等量的弗氏完全佐剂，制成油包水乳剂，在小鼠颈背部皮下多点注射。

第二次免疫：重复第一次免疫。

第三次免疫：取40μg/mouse纯化好的rHAP，用生理盐水溶解，在小鼠腹腔注射。

②细胞融合：

a)、SP2/0细胞的制备：融合前4～7天复苏SP2/0细胞，并在含有10%（重量）FBS的RPMI-1640培养基中传代培养至所需数量（本实施例为2×10⁷）。必须保证融合时SP2/0的数量级处于对数生长状态。

b)、冲击免疫：在融合前3天取40μg/mouse纯化好的rHAP在小鼠腹腔注射进行冲击免疫。

c)、制备滋养细胞：在融合前1天取小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞板。断髓处死小鼠，将小鼠浸泡于75%（重量）酒精中消毒3分钟。将小鼠移入超净台，腹部向上放置，剪开腹部皮肤，钝性剥离充分暴露腹膜。剪开腹膜，吸取2～5mL无血清培养基注入腹腔冲洗2～3遍，将培养基吸入离心管中。1200rpm离心7分钟，弃上清，将细胞移入适量完全培养基混匀，制备5块滋养细胞板。将滋养细胞悬液加入96孔板。将96孔板放入37℃孵箱，24小时后使用。

d)、细胞融合：将1mL的PEG和20mL无血清RPMI-1640置于37℃孵箱预热。将处于对数生长期的SP2/0细胞收集到50mL离心管中，计数，取2×10⁷个骨髓瘤细胞，1200rpm离心6分钟，弃上清，加入50mL无血清RPMI-1640，洗涤2次。将效价已达到要求，已冲击免疫的免疫小鼠摘眼球放血（收集血清留做阳性对照），断髓处死，浸泡于75%（重量）酒精中消毒2～3分钟，无菌剪开腹腔，暴露腹膜，取出脾脏，放入平皿中，将脾脏置于200目钢网上，加少量RPMI-1640，研磨，制成单个脾细胞悬液，将脾细胞悬液移入50mL离心管中，加RPMI-1640至50mL，1200rpm离心洗涤2遍。骨髓瘤细胞和脾细胞充分混合，加RPMI-1640，1300rpm离心8分钟，倒尽上清。缓缓加入1mlL的37℃预热的PEG，在60秒加完，作用60秒。向融合体系中加入无血清培养基20mL以终止PEG的作用，先慢后快，第一个1mL加2分钟，第二个1mL加1分钟，其余18mL在3分钟内加完。1000rpm离心6分钟，弃上清，加入25mL的含有20%（重量）FBS的RPMI-1640，轻轻吹打混匀。将细胞加入5块已铺有滋养细胞的96孔板中，每孔中总计含有200uL。

e)、HAT选择性培养：融合后第2天加入HAT选择性培养基。每天观察细胞形态，在加入HAT后3～4天后，融合的细胞会有克隆形成，此时用负压吸引器吸出1/2的培养基，加入新的HAT培养基。根据细胞生长状态，在筛选前再换液1～2次，筛选前一天必须换液。

f)、融合后筛选：一般在融合后8～10天，未融合的骨髓瘤细胞和其他细胞早已全部死亡，融合细胞克隆生长，可在细胞铺满孔底的1/2或2/3时采用ELISA法进行筛选。

g)、亚克隆：亚克隆前1天制备小鼠腹腔巨噬细胞滋养板。取需要亚克隆的细胞轻轻吹打，制成单细胞悬液，加入计数板计数，计算细胞密度。按每板100个细胞，取所需的体积，加入适量完全培养基中，充分混匀后加入96孔板，每孔总量200uL。

③阳性克隆的筛选（ELISA法）和细胞克隆：

a)、包被：用PBS缓冲液（参见实施例3，下同）将rHAP稀释至2μg/mL，100μL/孔加入酶标板，4℃过夜，洗板3次。

b)、封闭：封闭液（参见实施例3，下同），200μL/孔，室温（15℃～25℃，下同）2小时，洗板。

c)、加样：取单克隆孔中的杂交瘤细胞培养上清，加入筛选板，100μL/孔，37℃孵育1小时，洗板3次。

d)、加酶标抗体：每孔加入100μL辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗鼠Ig(H+L)，37℃孵育30分钟，洗板3次。

e)、显色反应：每孔加TMB底物100μL，室温避光显色10分钟。

f)、终止反应：每孔加终止液（0.2M硫酸）50μL。

g)、结果判定：酶标仪测定OD值（检测波长：450nm，参考波长：630nm）。

h)、选择阳性细胞孔进行细胞克隆，扩大后培养、冻存，得到抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株。

④特异性阳性克隆的筛选（ELISA法）和细胞克隆：

a)、包被：用PBS缓冲液将rHAP一端的水蛭素片段（其氨基酸序列为：pkpqshndgdfeeipeeylq）稀释至2μg/mL，100μL/孔加入酶标板，4℃过夜，洗板3次。

b)、封闭：封闭液，200μL/孔，室温（15℃～25℃，下同）2小时，洗板。

c)、加样：取单克隆孔中的抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清，加入筛选板，100μL/孔，37℃孵育1小时，洗板3次。

d)、加酶标抗体：每孔加入100μL辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗鼠Ig(H+L)，37℃孵育30分钟，洗板3次。

e)、显色反应：每孔加TMB底物100μL，室温避光显色10分钟。

f)、终止反应：每孔加终止液（0.2M硫酸）50μL。

g)、结果判定：酶标仪测定OD值（检测波长：450nm，参考波长：630nm）。

h)、选择阳性细胞孔进行细胞克隆，扩大后培养、冻存，得到特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株。

⑤按照常规方法用步骤④得到特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株制备小鼠腹水，收集小鼠腹水，利用Protein G纯化，制得一种特异性抗rHAP单克隆抗体——抗水蛭素片段单克隆抗体。

（实施例2）

将上述步骤④中的步骤a)中的rHAP一端的水蛭素片段替换为rHAP另一端的Annexin V，其余步骤相同，最终制得另一种特异性抗rHAP单克隆抗体——抗Annexin V单克隆抗体。

（实施例3）

本实施例的含有特异性抗rHAP单克隆抗体的试剂盒由下述成分组成：

PBS缓冲液：由8g的氯化钠、2.9g的十二水合磷酸氢二钠、0.2g的氯化钾、0.2g的磷酸二氢钾加蒸馏水至1000mL得到，浓度为0.01M。

封闭液：由2.0g的BSA（牛血清血蛋白）和3.0g的蔗糖加入到100mL上述PBS缓冲液中制成。

包被抗体：由50uL浓度为4.4mg/mL的原液和170uL的上述PBS缓冲液组成，浓度为1mg/mL（原液可以采用实施例1的特异性抗rHAP单克隆抗体，也可以采用实施例2的特异性抗rHAP单克隆抗体）。

检测抗体：由50uL浓度为0.45mg/mL的原液和40uL的上述PBS缓冲液组成，浓度为0.25mg/mL（原液可以采用经生物素化的实施例1的特异性抗rHAP单克隆抗体，也可以采用经生物素化的实施例2的特异性抗rHAP单克隆抗体，但与上述包被抗体不同）。

SAV-HRP（辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素）：由5uL原液和55uL上述PBS缓冲液组成。

（应用例1）

本应用例为实施例3的试剂盒的使用方法，具体如下：

1、包被：将浓度为1mg/mL的包被抗体（抗水蛭素片段单克隆抗体或者抗Annexin V单克隆抗体）用PBS缓冲液1000倍稀释至浓度为1μg/mL，每孔加100μL，4℃放置过夜。

2、封闭：洗板4次，每孔加200μL的封闭液，37℃孵育2小时。

3、标准品曲线制备：取rHAP样品一支，用10mL甘氨酸-精氨酸缓冲液溶解后分装得到标准品储备液，将标准品储备液用空白血浆分别稀释至800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56ng/mL，得到系列标准品溶液。

4、加样：向96孔板中加入每孔100μL的空白对照、血浆标准系列溶液（800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56ng/mL）及待检样本，加样前，需按每100μL的标准曲样品或者待测样品加10μL浓度为0.4M的EDTA混匀，每个样品设置复孔，37℃孵育90分钟，洗涤4次，吸水纸上拍干。

5、检测抗体：将浓度为0.25mg/mL的检测抗体（抗Annexin V单克隆抗体或者抗水蛭素片段单克隆抗体，且与包被抗体不同）用PBS缓冲液1000倍稀释至0.25μg/mL，每孔加100μL。37℃孵育1小时，洗涤4次，吸水纸上拍干。检测抗体在应用前需要进行生物素化。

6、SAV-HRP（辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素）：用PBS缓冲液将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素原液稀释12000倍，每孔加100μL。37℃孵育45分钟，洗涤4次，吸水纸上拍干。

7、显色反应：每孔加TMB底物100μL，37℃孵育10～15分钟。

8、终止反应：每孔加终止液（0.2M硫酸）100μL，轻轻混匀。

9、结果判定：酶标仪读取OD值：检测波长450nm，参考波长630nm。

（应用例2）

本应用例为对实施例3的试剂盒的测定范围、精密度和准确度、稳定性以及稀释效应的进行检测。

1、测定范围。

由应用例1可以看出：本实施例的试剂盒检测rHAP的可靠浓度范围是3.125～400ng/mL，在此范围内标准品rHAP与吸光度呈浓度依赖关系。

对于含量超出标准曲线范围的样品用混合空白猴血浆适当稀释至此浓度范围内即可。

2、精密度和准确度的检测。

检测方法：分别制备3.125、6.25、50以及400ng/mL的四个浓度的QC样品，每一浓度进行5个样本分析，重复4个分析批，随行标准曲线，以当日的标准曲线计算QC样品的浓度，采用单因素方差分析法计算分析方法的准确度（RE）和精密度（RSD）。结果见表1。

表1

检测结论：由表1可以看出，日内精密度为4.9～10.2%、日间精密度为5.215.4%，结果表明在浓度3.125～400ng/mL范围内测定的日内及日间重现性良好。

3、稳定性的检测。

检测方法：分别制备3.125、6.25、50以及400ng/mL的四个浓度的血浆样品，每一浓度进行5个样本分析，考察在-80℃放置1个月的稳定性。结果见表2。

表2

检测结论，由表2可以看出，在-80℃的条件下放置1个月，相对误差RE%小于7%，结果表明该试剂盒的稳定性极佳。

4、稀释效应的检测。

检测方法：由于实际样品浓度较高，超出了定量范围，需要进行稀释。分别考察了猴血浆加入rHAP稀释20、50、100和200倍后的准确度。结果见表3。

表3

检测结论：由表3可以看出，样品稀释最高的200倍后，浓度偏差仍在9%之内，结果表明不会对样品的测定造成影响。

（应用例3）

本应用例为采用实施例3的试剂盒检测猴体内rHAP浓度，方法如下：

1、血浆采集方法：按照猴体重静脉给药，于不同给药时间取血。全部血样均置于EDTA-K2抗凝管中，于4℃，5000rpm离心10min分离血浆，分装后-80℃保存，待测。

2、血浆rHAP浓度测定：按照应用例1的方法检测血浆中的rHAP浓度（单位ng/mL），结果见表4。

表4

由表4可以看出：本发明含有特异性抗rHAP单克隆抗体试剂盒可以检测出rHAP在动物体内的分布情况，增强了检验的特异性，大大减少动物体内Annexin V本底的干扰，增强了检验结果的准确性。

Claims (4)

1.一种特异性抗rHAP单克隆抗体的制备方法，具有以下步骤：

①免疫，采用的抗原为rHAP；

②细胞融合，得到杂交瘤细胞；

③对步骤②得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株；

④对步骤③得到的抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株进行特异性阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株；

⑤用步骤④得到的特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株制得特异性抗rHAP单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的特异性抗rHAP单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤④中所述的特异性阳性克隆的筛选是指分别采用rHAP一端的水蛭素片段和rHAP另一端的Annexin V作为抗原决定簇对抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株进行阳性克隆的筛选，最后分别得到作为特异性抗rHAP单克隆抗体的抗水蛭素片段单克隆抗体和抗Annexin V单克隆抗体。

3.一种权利要求1或2的方法制得的特异性抗rHAP单克隆抗体。

4.一种含有权利要求3的特异性抗rHAP单克隆抗体的试剂盒。