CN103695456B - 一套高效铜抗性标记酿酒酵母表达系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一套高效铜抗性标记酿酒酵母表达系统及其应用，包括一种铜离子敏感型酿酒酵母W303-1A cup1Δ及含有CUP1铜抗性筛选标记的酵母表达载体，本发明通过基因敲除酿酒酵母铜抗性基因cup1，获得一株铜离子敏感型酿酒酵母W303-1A cup1Δ，其对Cu2+的最低抑制浓度（SC培养基上）由1.2mM降为0.08mM；以pYX212载体为基本构架，以铜离子敏感型酿酒酵母为宿主菌，构建了以CUP1作为铜抗性标记的pYX212M酿酒酵母高效表达系统，并成功表达了绿色荧光蛋白基因（gfp），可用于酿酒酵母高效表达外源蛋白，拓宽了酿酒酵母的使用领域。
Description
发明领域
本发明涉及一种酿酒酵母表达系统及其应用，特别是一种高效铜抗性标记酿酒酵母表达系统的构建方法与应用。
背景技术
酿酒酵母是一种极为重要的工业微生物，常被用于生产多种物质如酒精、酶、谷胱甘肽、氨基酸等行业，它被美国食品与药品管理局认证为安全的微生物，广泛用于食品、制药等行业。酿酒酵母同时也是实验室研究中常用的真核模式生物，它具有许多内在的优势：⑴易于培养和操作、增殖快。⑵能够稳定的在单倍体和二倍体的状态下生长，并且可以控制单倍体与二倍体的相互转化。⑶有很多适合真核生物基因表达的穿梭表达载体。⑷基因组测序已经完成。筛选标记是酿酒酵母表达体系的重要组成部分，特定异源抗性基因的抗生素(如G418、Zeocin、腐草霉素等)可以作为酿酒酵母遗传操作的选择压力，进行有效筛选转化，但这些抗性因子不仅成本较高，而且对安全具有潜在危害性。
金属硫蛋白(Metallothionein,简称MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白，其主要功能是参与体内微量元素的平衡及重金属的解毒作用，同时具有很强的清除氧自由基的能力。酿酒酵母的铜金属硫蛋白基因（cup1）决定其铜离子抗性，位于8号染色体上的CUP1基因座中，该基因的开放阅读框由183个碱基组成，编码含有一条61个氨基酸残基的肽链-金属硫蛋白（Cu-MT），属于第Ⅱ型金属硫蛋白，具有与动物金属硫蛋白相似的功能和性质对铜有特别亲和力。然而，目前对酿酒酵母铜抗性的研究多集中在生物修复功能应用方面与及其分子机理研究方面，而以酵母铜抗性作为筛选标记并构建其相应表达体系的相关报道较少，以酿酒酵母铜抗性作为筛选标记不仅廉价、灵敏度高，而且可以解决抗药性标记基因带来的安全性问题，是一种理想的抗性筛选标记。本专利旨在利用酿酒酵母cup1基因作为筛选标记，构建一种廉价、安全、高效的铜抗性酿酒酵母表达体系，并应用于外源蛋白的表达，丰富酵母的表达系统，拓宽了酿酒酵母的使用领域。
发明内容：
本发明公开了一种高效铜抗性标记酿酒酵母表达系统，一种铜离子敏感型酿酒酵母W303-1A cup1Δ及含有CUP1铜抗性筛选标记的酵母表达载体，所述酿酒酵母W303-1A cup1Δ的构建方法为：
1）以质粒pFA6a-His3Mx6为模板，设计引物，PCR扩增出敲除片段P1-his-P2；
2）将步骤1）获得的敲除片段醋酸锂转化进入野生型酿酒酵母W303-1A，得到铜离子敏感型酿酒酵母W303-1A cup1Δ；
所述含有CUP1铜抗性筛选标记的构建方法为：
3）以野生酿酒酵母为模版，设计引物，扩增出cup1基因；
4）将步骤3）获得的cup1基因连接到酵母表达载体上。
所述表达载体为pYX212；所述含有CUP1铜抗性筛选标记的酵母表达载体为pYX212M。
本发明还公开了一种上述表达系统的应用，具体为将表达载体pYX212M承载的基因转化酿酒酵母W303-1A cup1Δ，选择0.3mMCu2+的SC培养基作为筛选培养基，得到了含有以CUP1为高效筛选标记的pYX212M表达载体的酵母转化子。
具体的采用上述表达系统表达了绿色荧光蛋白基因，将gfp基因插入表达载体pYX212M，采用醋酸锂转化酿酒酵母W303-1A cup1Δ，可高效表达绿色荧光蛋白。
本发明提供了一种高效的酿酒酵母高效表达系统，并成功表达了绿色荧光蛋白基因（gfp），拓宽了酿酒酿酒酵母比较少的表达途径，可以实现无外源筛选标记使用，具有更好生物安全性。
附图说明：
图1表达载体pYX212M的质粒图谱
图2含有GFP基因重组表达载体的质粒图谱
图3不同Cu2+浓度下野生型酿酒酵母（A）、酿酒酵母cup△（B）菌落形态
图4不同Cu2+浓度下酿酒酵母cup1Δ(A)、转入pYX212的酿酒酵母cup1Δ（B）、转入pYX212M的酿酒酵母cup1Δ菌落形态
图5转化铜离子敏感型酿酒酵母W303-1A cup1Δ中绿色荧光蛋白的检测
具体实施：
实施实例1：构建铜离子敏感型酿酒酵母W303-1A cup1Δ（参见附图3）
利用PCR-mediated Technique方法（Longtine,1998,yeast,14:953–961），以pFA6a-His3Mx61(WACH ET AL.:'New heterologous modules for classical or PCR-based genedisruptions in Saccharomyces cerevisiae'YEAST vol.10,1994,pages1793-1808)为模版，设计引物P1、P2（P15‘-TCATTGAAAGTGACGGGGAT AACAGCATTTTACCGGATCCCCGGGTTAATTAA-3’，P2：5‘-TTTGAGCTGTCTGTTAA GCTTCCAGATAAAAGATTTCAAGTTATTCCATTGAATTCGAGCTCGTTTAAAC-3’），PCR扩增出敲除片段P1-his-P2（PCR条件为：94℃预变性4min；变性1min，52℃退火40s，72℃延伸120s，循环40次；72℃保温10min）。将PCR产物醋酸锂转化酿酒酵母W303-1A感受态细胞，提取转化子的DNA作为模版，以P3、P4（P3:5‘-CGAAGAAACCCACGAAGATGACATG-3’，P4:5‘-GAAACCTCTCAGACAATCAACATGC-3’）为引物进行PCR扩增。由于转化子中的cup1被敲除片段P1-his-P2替换，P3位于cup1基因的上游，P4位于his基因内部，野生菌株是组氨酸缺陷性，因此，经琼脂糖凝胶电泳转化子能PCR得到1496bp的条带，野生型没有条带，表明酿酒酵母的cup1基因已经被敲除，即为S.cerevisiae W303-1A cup1Δ。
S.cerevisiae W303-1A cup1Δ获得的方法不限与上述交代的方法，本领域的普通技术人员按照本发明的设计思路，可采用其它方法获得S.cerevisiae W303-1A cup1Δ。将此铜离子敏感型酿酒酵母在SC培养基中预培养后,按10-1，10-2，10-3，10-4进行稀释,然后取4μL点种至含有不同铜离子浓度下的SC完全培养基上，结果表明，该菌株在0.08mmol/LCu2+停止生长，而野生型的酿酒酵母则生长良好，表明S.cerevisiae W303-1A cup1Δ铜离子的抑制浓度明显降低，其对铜离子抗性的灵敏度大大提高。
实施实例2：构建以CUP1作为高效铜抗性筛选标记的酿酒酵母表达系统（参见附图1）
以酿酒酵母基因为模板以P5:5‘-GGGGTACCTAAGCCGATCCCATTACCGACA-3’，P6:5‘-GGGGTACCGAGATCTTCTAGCGAGCTTGT-3’为引物进行PCR反应。PCR条件为：94℃预变性4min；变性1min，61℃退火40s，72℃延伸120s，循环30次；72℃保温10min。将将纯化后的PCR产物与质粒pMD18T连接，测序正确后，将pMD18T-Cup和pYX212同时用KpnI进行单酶切，割胶回收。将酶切后的载体与目的基因片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素的LA平板上。提取阳性克隆的质粒DNA，琼脂糖电泳验证，单酶切验证，得到pYX212M。
pYX212M经醋酸锂转化分别导入到铜离子敏感型酿酒酵母W303-1A cup1Δ，选择0.3mM Cu2+的SC培养基作为筛选培养基，挑取转化子，酵母细胞培养至对数生长期OD=1.2，按10-1，10-2，10-3，10-4进行稀释,然后取4μL点种至含有不同铜离子浓度下的SC完全培养基上，30℃生长两天（参见附图4）。
实施实例3：利用以CUP1为高效铜抗性筛选标记的酿酒酵母表达系统表达gfp基因
以实验室保存的pCAMBIA1302为模版，以P7:5‘-CCGGAATTCATGGTAGATCTGATGACTAG-3’，P8:5‘-CCCAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAG-3’为引物，或采用化学全合成方法获得gfp基因，将gfp基因插入表达载体中得到pYX212MGFP（参见附图2），醋酸锂转化进入铜离子敏感型酿酒酵母W303-1A cup1Δ，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。
Claims (5)
1.一套高效铜抗性标记酿酒酵母表达系统，其特征在于包括一种铜离子敏感型酿酒酵母W303-1A cup1Δ及含有CUP1铜抗性筛选标记的酵母表达载体，所述酿酒酵母W303-1A cup1Δ的构建方法为：
1)以质粒pFA6a-His3Mx6为模板，设计引物，PCR扩增出敲除片段P1-his-P2；
2)将步骤1)获得的敲除片段醋酸锂转化进入野生型酿酒酵母W303-1A，得到铜离子敏感型酿酒酵母W303-1A cup1Δ；
所述含有CUP1铜抗性筛选标记的构建方法为：
3)以野生酿酒酵母为模版，设计引物，扩增出cup1基因；
4)将步骤3)获得的cup1基因连接到酵母表达载体上。
2.权利要求1所述的表达系统，其特征在于所述表达载体为pYX212；所述含有CUP1铜抗性筛选标记的酵母表达载体为pYX212M。
3.权利要求1所述表达系统的应用，其特征在于将表达载体pYX212M承载的基因转化酿酒酵母W303-1A cup1Δ，选择0.3mM Cu2+的SC培养基作为筛选培养基，得到了含有以CUP1为高效筛选标记的pYX212M表达载体的酵母转化子。
4.一种表达系统表达绿色荧光蛋白基因(gfp)的方法，其特征在于，将gfp基因插入表达载体pYX212M，采用醋酸锂转化酿酒酵母W303-1A cup1Δ，可高效表达绿色荧光蛋白。
5.一种酿酒酵母表达表达异源蛋白的方法，其特征在于，将异源蛋白基因插入表达载体pYX212M，采用醋酸锂转化酿酒酵母W303-1A cup1Δ，可高效表达异源蛋白。
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