CN104371017B - 一种高效表达与制备外分泌型人源afp的方法 - Google Patents

Abstract

一种高效表达与制备外分泌型人源AFP的方法，该方法主要包括如下三个方面的内容：(1)利用基因合成技术合成AFP的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物学方法构建酵母重组表达质粒PpICZ α A‑AFP，并进行质粒抽提；(2)使用毕赤酵母表达系统体外诱导表达分泌型AFP重组蛋白，并通过优化表达时间、诱导剂添加量等条件得出最佳诱导条件；(3)优化硫酸铵分级沉淀,从发酵液上清中分离纯化得到分泌到胞外的AFP重组蛋白，在55％硫酸铵浓度下目的蛋白AFP几乎全部析出，且纯度高达98.844％；本发明将纯化得到的分泌重组蛋白AFP用临床检测电化学发光法检测其生物活性，其值达3500ng/mL。

Description

一种高效表达与制备外分泌型人源AFP的方法

技术领域

本发明涉及一种体外重组高效表达制备具有生物活性AFP的方法，具体涉及利用分泌型毕赤酵母表达系统表达具有生物活性的人源AFP重组蛋白的方法，属于生物医学分析领域。

背景技术

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)ORF全长1830bp，翻译后蛋白含有609个氨基酸残基，分子量约70kDa。AFP是一种肿瘤相关的单链糖蛋白，其糖链部分具有癌胚性变化的特征。AFP为胎儿时期肝脏合成的一种胚胎蛋白，出生后一周消失，以后完全被白蛋白替代。正常人不产生AFP，当患肝细胞癌、卵黄囊和胚胎样肿瘤及部分肝外肿瘤时机体可重新合成AFP，因此临床上AFP被当成一种肝癌及生殖细胞肿瘤的血清标志物来使用。目前，肝癌检查主要包括血清甲胎蛋白(AFP)和肝脏影像学检查。检测AFP是当前诊断肝癌最简便、灵敏、快捷的方法，现认为它在发现早期肝癌方面有独一无二的价值，在临床上被认为是肝癌的经典肿瘤标志物，因而被当作诊断肝癌的金标准。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。毕赤酵母表达系统主要有以下优点：1)具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；2)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；3)营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产；4)在P.pastoris中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化；5)糖基化程度低，与S.cerevisiae相比，P.pastoris不产生过度的糖基化。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种能够大规模制备具有生物活性且高纯度的AFP的高效表达具有生物活性的AFP重组蛋白及其制备方法。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种高效表达与制备外分泌型人源AFP的方法，该方法主要包括如下三个方面的内容：

(1)利用基因合成技术合成AFP的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物学方法构建酵母重组表达质粒PpICZ α A-AFP，并进行质粒抽提；

(2)使用毕赤酵母表达系统体外诱导表达分泌型AFP重组蛋白，并通过优化表达时间、诱导剂添加量等条件得出最佳诱导条件；

(3)优化硫酸铵分级沉淀,从发酵液上清中分离纯化得到分泌到胞外的AFP重组蛋白，在55％硫酸铵浓度下目的蛋白AFP几乎全部析出，且纯度高达98.844％。

本发明进一步的技术方案是：所述三个方面的内容中，分别包含有如下步骤：

第(1)方面的内容中包括如下两个步骤：

a.利用基因合成技术，合成人源AFP序列；

b.设计带酶切位点的引物，通过PCR得到带有双酶切位点的AFP克隆质粒，并进行质粒提取；

第(2)方面的内容中包括如下两个步骤：

c.将b步骤中获得的质粒通过双酶切克隆到PpICZ α A载体中，构建PpICZ α A-AFP重组表达质粒，并进行质粒抽提；

d.将c步骤中获得的质粒进行线性化后电转进入毕赤酵母GS115中，通过优化感受态细胞GS115浓度，获取高转染率，通过PCR鉴定挑取阳性克隆；

e.将d步骤中挑取的阳性克隆同时用甲醇进行小量诱导表达，通过对甲醇添加量、诱导时间、菌密度等表达条件的优化，获得最佳诱导表达条件并获取最佳表达重组菌；

f.通过步骤e中实验得出，甲醇浓度为0.5％，诱导表达第3天的重组蛋白的分泌量最大；

g.通过前面实验的基础，再将表达体系扩大至2L，收集表达第3天的发酵上清液；

第(3)方面的内容中包括如下两个步骤：

h.将g步骤中获得的发酵液通过硫酸铵分级沉淀纯化蛋白，设计不同硫酸铵浓度梯度获得沉淀蛋白；

i.将h步骤中获得的蛋白回溶后经透析，测其含量和纯度得出目的蛋白在55％硫酸铵浓度下几乎已全部析出，且经HPLC检测其纯度高达98.844％。

本发明将纯化得到的分泌重组蛋白AFP用临床检测电化学发光法检测其生物活性，其值达3500ng/mL。

附图说明

图1是毕赤酵母表达系统的质粒PpICZ α A的质粒图谱，

图2是重组表达质粒pPICZ α A-AFP构建的PCR鉴定图，

图3是酵母GS115重组菌株的菌落PCR鉴定图，

图4是Western blot分析经硫酸铵沉淀后的AFP，

图5是HPLC分析经55％硫酸铵沉淀后的AFP，

图6是硫酸铵浓缩后AFP活力测定，

图7是Western blot分析比较制备AFP与肝癌血清样本的糖基化水平。

图1中图谱的具体信息为：

5’AOX1启动子(5’AOX1promoter region):base1-941

5’AOX1引物绑定位点(5’AOX1priming site):base855-875

.因子信号序列(-factor signal sequence):base941-1207

.因子引物绑定位点(-factoe priming site):base1144-1164

多克隆位点(Multiple cloning site):base1208-1276

c-myc抗原决定基(c-myc epitope):base1275-1304

6×His标签(Polyhistidine(6×His)tag):base1320-1337

3’AOX1引物绑定位点(3’AOX1priming site):base1423-1443

AOX1转录终止区域(AOX1transcription termination region):base1341-1682

TEF1启动子(TEF1promoter):base1683-2093

EM7启动子(EM7promoter):base2095-2162

Sh ble开放阅读框架(Sh ble ORF):base2163-2537

CYC1转录终止区(CYC1transcription termination region):base2538-2855

pUC复制起始位点(pUC origin):base2866-3539(complementary strand)。

具体实施方式

下面将结合具体实施例以及附图对本发明作详细介绍，本发明在实施中选用的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所述一种高效表达与制备外分泌型人源AFP的方法，该方法主要包括如下三个方面的内容：

(1)利用基因合成技术合成AFP的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物学方法构建酵母重组表达质粒PpICZ α A-AFP，并进行质粒抽提；

(2)使用毕赤酵母表达系统体外诱导表达分泌型AFP重组蛋白，并通过优化表达时间、诱导剂添加量等条件得出最佳诱导条件；

(3)优化硫酸铵分级沉淀,从发酵液上清中分离纯化得到分泌到胞外的AFP重组蛋白，在55％硫酸铵浓度下目的蛋白AFP几乎全部析出，且纯度高达98.844％。

本发明的要点是首先构建酵母表达的AFP重组表达质粒并转入到毕赤酵母GS115中，再通过甲醇诱导表达重组蛋白AFP，最后通过硫酸铵沉淀纯化表达的AFP；具体包括以下步骤：

a.利用基因合成技术，合成人源AFP序列；

b.设计带酶切位点的引物，通过PCR得到带有双酶切位点的AFP克隆质粒，并进行质粒提取；

c.将b中获得的质粒通过双酶切克隆到PpICZ α A载体中，构建PpICZ α A-AFP重组表达质粒，并进行质粒抽提；

d.将c中获得的质粒进行线性化后电转进入毕赤酵母GS115中，通过优化感受态细胞GS115浓度，获取高转染率，通过PCR鉴定挑取阳性克隆；

e.将d中挑取的阳性克隆同时用甲醇进行小量诱导表达，通过对甲醇添加量、诱导时间、菌密度等表达条件的优化，获得最佳诱导表达条件并获取最佳表达重组菌；

f.通过e中实验得出，甲醇浓度为0.5％，诱导表达第3天的重组蛋白的分泌量最大；

g.通过前面实验的基础，再将表达体系扩大至2L，收集表达第3天的发酵上清液；

h.将g中获得的发酵液通过硫酸铵分级沉淀纯化蛋白，设计不同硫酸铵浓度梯度获得沉淀蛋白；

i.将h中获得的蛋白回溶后经透析，测其含量和纯度得出目的蛋白在55％硫酸铵浓度下几乎已全部析出，且经HPLC检测其纯度高达98.844％。

实施例1

1.研究材料：重组质粒pReceiver-AFP由外包服务公司合成；表达载体pPICZ α A均购自复能基因；限制性内切酶、T4DNA连接酶购自大连宝生物公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂购自北京天根公司；ECL Western Blot检测试剂盒购自Millipore公司；一抗购自SC Biotechnology；二抗购自GE Healthcare。

2.工作流程

(1)以原核表达重组质粒pReceiver-AFP为模板，设计含限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ识别位点的PCR引物，PCR扩增带双酶切识别位点的afp目的基因片段，再将毕赤酵母表达载体pPICZ α A(结构见图1)和afp PCR扩增基因片段同时用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后经T4DNA连接酶连接，得到重组表达质粒pPICZ α A-AFP。

(2)制备E.Coli BL21(DE3)的感受态细胞，转化重组表达质粒pPICZ α A-AFP，取100uL涂布在含zeocin抗性的低盐LB即LLB平板上，37℃培养箱培养过夜。挑取3个单克隆进行菌落PCR鉴定，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在2000bp左右的位置有特异性条带，表明重组表达质粒构建成功，如图2所示。选取其中一个单克隆置于15mL含zeocin LLB培养基中培养过夜，再用小提中量质粒提取试剂盒抽提重组表达质粒。

(3)在将重组质粒转化到毕赤酵母GS115中之前，先将(3)中提取获得的重组质粒用限制性内切酶EcoR Ⅰ进行单酶切线性化、乙醇纯化，制备新鲜的毕赤酵母GS115感受态细胞，通过电转化将重组质粒转入GS115中，并均匀地将其涂布在含zeocin的YPD平板中。待长出单克隆后，挑取10个单克隆进行PCR鉴定，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在2000bp左右的位置有特异性条带，表明重组表达质粒构建成功，如图3所示。

(4)挑取(3)中鉴定为阳性单克隆的4株重组菌株接种于10mL BMGY培养基中。30℃震荡培养至OD₆₀₀达2～6，2500r/min离心5min，弃上清，用20mL BMMY培养基重悬细胞，30℃振荡培养甲醇(0.5％)诱导蛋白表达。诱导开始后每隔24h取样，样品经8000r/min离心1min，将上清和细胞沉淀分离并放置在4℃。同时，补加无菌的100％甲醇至终浓度为0.5％以维持诱导。

(5)发酵液经8000r/min离心30min。将发酵上清液用硫酸铵分级沉淀(30％、55％和75％)进行纯化，并通过Western blot以及HPLC分析蛋白纯度。结果Western blot检测到70kDa处有AFP特异性免疫反应条带且55％硫酸铵沉淀后的AFP纯度为98.844％，表明重组AFP蛋白表达成功如图4和图5所示。

(6)将(5)中的经硫酸铵沉淀后获得的AFP和硫酸铵沉淀前的AFP用罗氏E601电化学发光免疫分析仪测定其活力，结果表明成功表达的重组AFP具有生物活性如图6所示。

(7)将55％硫酸铵沉淀后手机的AFP与临床肝癌血清样本进行Western blot比对分析，结果发现制备AFP与临床肝癌血清样本的分子量大小相当，表明两者的糖基化水平相近如图7所示。

Claims (1)

1.一种高效表达与制备外分泌型人源AFP的方法，其特征在于该方法主要包括如下三个方面的内容：

(1) 利用基因合成技术合成AFP的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物学方法构建酵母重组表达质粒PpICZ α A-AFP，并进行质粒抽提；

(2) 使用毕赤酵母表达系统体外诱导表达分泌型AFP重组蛋白，并通过优化表达时间、诱导剂添加量条件得出最佳诱导条件；

(3) 优化硫酸铵分级沉淀, 从发酵液上清中分离纯化得到分泌到胞外的AFP重组蛋白，在55％硫酸铵浓度下目的蛋白AFP几乎全部析出，且纯度高达98.844％；

所述三个方面的内容中，分别包含有如下步骤：

第(1)方面的内容中包括如下步骤：

a. 利用基因合成技术，合成人源AFP序列；

b. 设计带酶切位点的引物，通过PCR得到带有双酶切位点的AFP克隆质粒，并进行质粒提取；

第(2)方面的内容中包括如下步骤：

c.将b步骤中获得的质粒通过双酶切克隆到PpICZ α A载体中，构建PpICZ α A-AFP重组表达质粒，并进行质粒抽提；

d. 将c步骤中获得的质粒进行线性化后电转进入毕赤酵母GS115中，通过优化感受态细胞GS115浓度，获取高转染率，通过PCR鉴定挑取阳性克隆；

e. 将d步骤中挑取的阳性克隆同时用甲醇进行小量诱导表达，通过对甲醇添加量、诱导时间、菌密度表达条件的优化，获得最佳诱导表达条件并获取最佳表达重组菌；

f. 通过步骤e中实验得出，甲醇浓度为0.5％，诱导表达第3天的重组蛋白的分泌量最大；

g. 通过前面实验的基础，再将表达体系扩大至2L，收集表达第3天的发酵上清液；

第(3)方面的内容中包括如下两个步骤：

h. 将g步骤中获得的发酵液通过硫酸铵分级沉淀纯化蛋白，设计不同硫酸铵浓度梯度获得沉淀蛋白；

i. 将h步骤中获得的蛋白回溶后经透析，测其含量和纯度得出目的蛋白在55％硫酸铵浓度下几乎已全部析出，且经HPLC检测其纯度高达98.844％。