CN103667384B

CN103667384B - 一种酶催化抗坏血酸酯合成的方法

Info

Publication number: CN103667384B
Application number: CN201310638326.2A
Authority: CN
Inventors: 李宁; 宗敏华; 胡莹丹
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2013-12-02
Filing date: 2013-12-02
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2033-12-02
Also published as: CN103667384A

Abstract

本发明公开了一种酶催化抗坏血酸酯合成的方法，具体步骤如下：将抗坏血酸、酰基供体和4？分子筛加入含2-甲基四氢呋喃的混合溶剂中混合均匀后，再加入脂肪酶，进行酯化或转酯化反应，反应温度为40～60℃、振荡速度为150～300rpm，反应后经分离得到抗坏血酸酯。本发明具有反应条件温和、环境友好、反应区域选择性高、产物易分离、反应速度快，酶稳定性好等优点。

Description

一种酶催化抗坏血酸酯合成的方法

技术领域

本发明属于生物催化、食品生物技术领域，涉及一种酶催化抗坏血酸酯合成的方法。

背景技术

抗坏血酸是一种天然抗氧化剂，在食品、化妆品等领域有广泛的应用。但由于其强亲水性的特点，极大地限制了该化合物在脂溶性材料如油脂或脂溶性化妆品中的应用。因此，人们借助化学修饰的手段将长链脂肪酸引入抗坏血酸以增强其脂溶性。目前，抗坏血酸棕榈酸酯和硬脂酸酯已被欧盟批准用作食品或化妆品添加剂，以提高产品的抗氧化性。但是，工业上主要通过酸或碱催化的化学方法合成抗坏血酸酯。由于化学催化剂区域选择性差，副产物多，产率较低，并且需要通过复杂的下游分离纯化步骤才能制备得到目标产物。同时，酸、碱催化剂的大量使用导致严重的环境污染问题。此外，由于化学反应条件通常较激烈如在高温下进行，易使抗坏血酸发生降解及氧化反应，从而严重影响产品品质。

近年来，由于酶法具有反应条件温和、区域选择性高、环境友好、后续产物纯化相对简单等优点，故在抗坏血酸酯合成中越来越受到人们的关注。但是，由于抗坏血酸亲水性强，在酶友好的疏水性溶剂如正己烷中溶解度极低，故酶催化抗坏血酸酯合成反应通常以极性较强的有机溶剂如丙酮、叔丁醇及叔戊醇为反应介质。一方面，酶在这些极性较强的溶剂中通常活性较低，反应速度慢，并且稳定性欠佳；另一方面，叔丁醇和叔戊醇均来源于石化资源，不可再生。尽管丙酮是食品安全级、且可再生溶剂，但是抗坏血酸在丙酮中的溶解度仍偏低（50℃时溶解度仅为16mmol/L），并且丙酮沸点低（56℃），在常用的反应温度下易挥发，不仅导致溶剂回收率低，而且大规模应用时易导致严重的大气污染问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提出一种在含2-甲基四氢呋喃混合溶剂中酶催化抗坏血酸酯合成的方法。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种酶催化抗坏血酸酯合成的方法，具体步骤如下：将抗坏血酸、酰基供体和分子筛加入含2-甲基四氢呋喃的混合溶剂中混合均匀后，再加入脂肪酶，进行酯化或转酯化反应，反应温度为40～60℃、振荡速度为150～300rpm，反应后经分离得到抗坏血酸酯。

所述含2-甲基四氢呋喃的混合溶剂为2-甲基四氢呋喃与叔丁醇、叔戊醇中的一种组成的混合溶剂。

所述2-甲基四氢呋喃的体积含量为10%～90%。

所述抗坏血酸与酰基供体的摩尔比为1:1～1:15，所述脂肪酶与抗坏血酸的重量比为10:1～1:10。

所述酰基供体为羧酸、羧酸甲酯、羧酸乙酯、羧酸烯醇酯或酸酐。

所述羧酸、羧酸甲酯、羧酸乙酯或羧酸烯醇酯中的羧酸为1个苯环的芳香酸或为碳链长度为C2～C22，并含有0～4个双键的脂肪酸；酸酐的脂肪酸碳链长度为C2～C18。

所述分子筛用量为0.01～0.20g/mL。

所述脂肪酶为来源于南极假丝酵母（Candida antarctica）、嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）、根霉（Rhizomucor miehei）、洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）、皱落假丝酵母（Candida rugosa）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）或扩展青霉（Penicillium expansum）的脂肪酶。

分离抗坏血酸酯的方法为反应后的混合物经过滤除酶和分子筛，真空下除去溶剂，残渣经柱层析分离得到抗坏血酸酯。

与现有的技术相比，本发明具有如下的优点：

1)采用高效的生物催化剂——酶催化抗坏血酸酯的合成。酶反应具有高区域选择性，因此克服了传统化学方法选择性低、易生成副产物及产率低等缺点。同时，酶是易生物降解的生物大分子，克服了化学催化剂环境不友好的缺点。

2)本发明无需基团保护和脱保护操作，反应过程简单易控，产物易分离；

3)本发明是在温度为40～60℃、振荡速度为150～300rpm、常压条件下进行，反应条件温和、不易使抗坏血酸发生降解和氧化反应，故产品品质高。

4)本发明利用疏水性的2-甲基四氢呋喃与亲水性的叔丁醇或叔戊醇的混合液作为溶剂，与已报道的抗坏血酸酶法工艺如在纯叔丁醇或叔戊醇体系中的酶反应相比，不仅极大地提高了酶反应速度和酶催化效率，并且显著提高了酶的稳定性。同时，由于部分叔丁醇和叔戊醇被可再生的2-甲基四氢呋喃代替，极大提高了工艺的生态友好性。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

实施例1

将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、棕榈酸乙烯酯（1.71mmol）、0.1g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶中，然后加入16mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维信公司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-棕榈酸酯212mg，收率为90%。

实施例2

将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、油酸甲酯（3.99mmol）、0.2g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶中，然后加入100mg来源于Thermomyces lanuginosus的固定化脂肪酶（购于诺维信公司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-油酸酯201mg，收率为80%。

实施例3

将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、十一碳烯酸乙烯酯（1.71mmol）、0.3g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶中，然后加入16mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维信公司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-十一碳烯酸酯179mg，收率为92%。

实施例4

将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、十一碳烯酸乙烯酯（2.85mmol）、0.3g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶中，然后加入480mg来源于Penicillium expansum的固定化脂肪酶（购于绿微康生物工程有限公司，酶固定化参照Bioresource Technology,2010,101:1所述方法），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-十一碳烯酸酯172mg，收率为88%。

实施例5

将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、十一碳烯酸乙烯酯（1.71mmol）、0.5g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶中，然后加入16mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维信公司），常压下置于60℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-十一碳烯酸酯175mg，收率为90%。

实施例6

将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、亚油酸（5.7mmol）、0.8g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶中，然后加入200mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维信公司），常压下置于60℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-亚油酸酯202mg，收率为81%。

实施例7

将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、十一碳烯酸乙烯酯（2.85mmol）、0.2g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（2:3,v/v）加入具塞三角瓶中，然后加入16mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维信公司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-十一碳烯酸酯168mg，收率为86%。

实施例8

将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、十一碳烯酸乙烯酯（2.85mmol）、0.5g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔戊醇（3:7,v/v）加入具塞三角瓶中，然后加入50mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维信公司），常压下置于40℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-十一碳烯酸酯175mg，收率为90%。

实施例9

将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、硬脂酸乙烯酯（2.85mmol）、0.5g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔戊醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶中，然后加入80mg来源于Pseudomonas cepacia的固定化脂肪酶（购于天野酶制品公司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-硬脂酸酯224mg，收率为89%。

实施例10

将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、乙酸酐（1.14mmol）、0.5g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔戊醇（4:1,v/v）加入具塞三角瓶中，然后加入80mg来源于Pseudomonas cepacia的固定化脂肪酶（购于天野酶制品公司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-乙酸酯114mg，收率为92%。

实施例11

将抗坏血酸（100mg,0.57mmol）、苯甲酸乙烯酯（1.71mmol）、0.6g分子筛、10mL无水2-甲基四氢呋喃-叔丁醇（2:3,v/v）加入具塞三角瓶中，然后加入90mg来源于Candida antarctica B的固定化脂肪酶（购于诺维信公司），常压下置于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应结束后，过滤、真空下浓缩滤液、经柱层析分离得到抗坏血酸6-苯甲酸酯124mg，收率为78%。

Claims

1.一种酶催化抗坏血酸酯合成的方法，其特征在于，具体步骤如下：将抗坏血酸、酰基供体和分子筛加入含2-甲基四氢呋喃的混合溶剂中混合均匀后，再加入脂肪酶，进行酯化或转酯化反应，反应温度为40～60℃、振荡速度为150～300rpm，反应后经分离得到抗坏血酸酯；所述含2-甲基四氢呋喃的混合溶剂为2-甲基四氢呋喃与叔丁醇、叔戊醇中的一种组成的混合溶剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合溶剂中2-甲基四氢呋喃的体积含量为10％～90％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述抗坏血酸与酰基供体的摩尔比为1:1～1:15，所述脂肪酶与抗坏血酸的重量比为10:1～1:10。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酰基供体为羧酸、羧酸甲酯、羧酸乙酯、羧酸烯醇酯或酸酐。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述羧酸、羧酸甲酯、羧酸乙酯或羧酸烯醇酯中的羧酸为1个苯环的芳香酸或为碳链长度为C2～C22，并含有0～4个双键的脂肪酸；酸酐的脂肪酸碳链长度为C2～C18。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述分子筛用量为0.01～0.20g/mL。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶为来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)、嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、根霉(Rhizomucor miehei)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)或扩展青霉(Penicillium expansum)的脂肪酶。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，分离抗坏血酸酯的方法为反应后的混合物经过滤除酶和分子筛，真空下除去溶剂，残渣经柱层析分离得到抗坏血酸酯。