CN103409478B - 一种化学酶法合成生物素中间体内酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种化学酶法合成生物素中间体内酯Ⅲ的方法，所述方法是以生物素中间体Ⅰ二醇和乙酸乙烯酯为反应底物，在脂肪酶的作用下进行不对称酯交换反应合成生物素中间体Ⅱ单酯，然后进一步合成得到生物素中间体内酯Ⅲ的方法。本发明所述生物素中间体内酯Ⅲ的制备方法的有益效果主要体现在：酶的立体选择性强，反应转化率高，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产。

Description

一种化学酶法合成生物素中间体内酯的方法

（一）技术领域

本发明涉及一种化学酶法合成生物素中间体内酯（(3aS，6aR)-1，3-二苄基-四氢-4H-呋喃并[3，4-d]咪唑-2，4(1H-)-二酮）的方法。

（二）背景技术

生物素（vitamin H或vitamin B7）[CAS:58-85-5]是一种重要的水溶性B簇维生素，广泛应用于医疗、多维制剂及饲料添加剂方面，尤其是配制饲料的关键组分之一。我国是饲料需求大户，近年来饲料工业发展迅速，对生物素的需求也越来越大。光学纯的右旋生物素中间体内酯是生产d-生物素的重要中间体。生产d-生物素的主要技术是中间体内酯的手性合成技术。目前国内产家一直采用化学法拆分，如陈芬儿等采用化学晶析法拆分，其工艺复杂，且拆分不完全，造成原料浪费，成本较高。经化学拆分后得到内酯右旋体和左旋体的混旋物，该混旋物无法利用只能作为废弃物处理，造成了原料的极大浪费和环境污染。

因此，对当前生物素中间体内酯的合成技术改进开发研究，寻找一条适宜的绿色化学工艺路线，有着极其重要的经济价值和现实意义。利用生物酶法不对称合成生物素中间体单酯再进一步合成得到光学纯的内酯右旋体，不仅可以大大降低d-生物素的生产降低成本，而且环境友好，具有显著效果，符合绿色、环保的可持续发展战略，具有良好的社会经济效益，发展前景广阔。

（三）发明内容

本发明的目的是为了解决上述方法的不足，提供了一种以生物素中间体Ⅰ为反应底物，在脂肪酶的作用下不对称酯交换反应得到生物素中间体Ⅱ，然后经氧化、去乙酰化、闭环等合成生物素内酯Ⅲ的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种化学酶法合成式（Ⅲ）所示生物素中间体内酯的方法，所述方法包括：以式（Ⅰ）所示生物素中间体二醇为反应底物，在有机溶剂中，加入酰基供体，在脂肪酶的作用下，于10～50℃下进行酯交换不对称合成反应3～60小时，制得式（Ⅱ）所示生物素中间体单酯，再经过氧化、去乙酰化、闭环得到式（Ⅲ）所示生物素中间体内酯；所述酰基供体为下列之一：乙酸乙烯酯、乙酸乙酯、乙酸、乙酸酐、乙酸异丙烯酯、丁酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯；所述有机溶剂为下列之一或其中两种以上的混合物：1,4-二氧六环、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、甲苯、环己烷、正己烷；所述脂肪酶为本领域熟知的属于EC3.1.1.3类酶的那些酶；

本发明涉及的反应式如下：

优选的，所述脂肪酶为下列之一：Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM、Lipase PS IM、Novozym435，上述均为市购脂肪酶。

优选的，所述酰基供体为乙酸乙烯酯或丁酸乙烯酯，更优选为乙酸乙烯酯。

优选的，所述有机溶剂为1,4-二氧六环、甲苯、或其混合物，更优选为1,4-二氧六环和甲苯体积比1:3的混合物。

优选的，有机溶剂中底物初始浓度为1～200g/L，酰基供体添加浓度为1～50%，脂肪酶加入量为0.1～25U/g底物。U为1个酶活力单位，所述的1个酶活力单位是在规定的条件下测定的每分钟催化合成生物素中间体单酯Ⅱ的1μmol量的脂肪酶的量，所述的规定条件为：取0.01g酶粉，加入0.2g生物素中间体Ⅰ的二氧六环和甲苯（体积比1:3）的混合溶液10ml，加入0.1ml乙酸乙烯酯，35℃条件下搅拌转速200rpm，反应6h后，过滤除去酶粉，取反应液用液相色谱分析测定转化得到的生物素中间体Ⅱ摩尔量以及ee值。

优选的，所述酯交换不对称合成反应在30～50℃下进行，反应时间6～12小时。

生物素中间体Ⅰ和生物素中间体Ⅱ的液相色谱仪测定条件：chiralAD-H柱；柱温箱温度恒温25℃；流动相：正己烷：异丙醇=8:2；流速：0.8ml/min；UV检测器；检测波长210nm。

生物素中间体单酯Ⅱ的纯化：酶转化后过滤除去脂肪酶，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂得到产物生物素中间体单酯Ⅱ；

生物素中间体内酯Ⅲ的合成：生物素中间体单酯Ⅱ溶于丙酮，然后经过氧化，去乙酰化，闭环得到生物素中间体内酯Ⅲ产品。

本发明所述生物素中间体内酯Ⅲ的制备方法的有益效果主要体现在：酶的立体选择性强，反应转化率高，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产。

（四）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

0.01g Lipozyme RM IM（丹麦诺维信公司）加入含有50g/Ｌ生物素中间体Ⅰ的10mL二氧六环的溶液中，加入1mL乙酸乙烯酯，35℃条件下，反应6h后，反应转化率99.87%，ee值为98.65%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到生物素中间体单酯Ⅱ，然后将其溶于5ml丙酮中，加入1ml琼斯试剂（将26.72克三氧化铬溶于23毫升98.5%浓硫酸中，然后以水稀释至100毫升即得），0℃反应2h，加入3ml异丙醇，硅藻土过滤，滤饼用丙酮洗三次，无水硫酸镁干燥后旋干，加入5ml2mol/Ｌ的NaOH震荡5h后调节溶液pH为3～4，加入1mol/ＬHCl在50℃条件下回流1～2h最终得到白色固体生物素中间体内酯Ⅲ，得率80%，e.e.值98.35%。

实施例2：

0.01g Lipozyme RM IM加入含有100g/Ｌ生物素中间体Ⅰ的20mL二氧六环混合溶液中，加入2mL乙酸乙烯酯，35℃条件下，反应6h后，分离转化后的反应液。留下的酶粉，再加入新的反应底物继续反应，如此反复，重复利用5次。得到酶水解结果见表1。

表1：反复分批酶转化结果

由表1可见，酶粉使用10次后，酶转化率没有明显下降，e.e.值大于95.0%。

实施例3：

按实施例1方法，用其它的酰基供体代替乙酸乙烯酯作为酰基供体，其他条件不变，对生物素中间体Ⅰ进行酶法转化。该反应得到的生物素中间体单酯Ⅱ的得率和立体选择性见表2。

表2：不同酰基供体的酶转化结果

表2结果表明，综合考虑反应得到生物素中间体Ⅱ的得率和立体选择性，乙酸乙烯酯作为酰基供体时都要优于其他酰基供体。

实施例4：

按实施例1方法，用其它有机溶剂代替施例1的溶剂作为反应溶剂，其他条件不变，对生物素中间体Ⅰ进行酶法转化。该反应得到的生物素中间体单酯Ⅱ的得率和立体选择性见表3。

表3：不同溶剂体系的酶转化结果

表3结果表明，综合考虑反应得到生物素中间体Ⅱ的得率和立体选择性，1,4二氧六环为反应溶剂都要优于其他溶剂，立体选择性最好。

实施例5：

按实施例1方法，用其它商品化脂肪酶代替Lipozyme RM IM作为生物催化剂其他条件不变，对生物素中间体Ⅰ进行酶法转化。该反应得到生物素中间体单酯Ⅱ的得率和立体选择性见表4。

表4：不同商品化脂肪酶的转化结果

表4结果表明，以下脂肪酶对底物都具有一定的转化活性，但是立体选择性和得到的构型有所不同。

实施例6：

0.2g生物素中间体单酯Ⅱ溶于5ml丙酮中，加入0.5ml琼斯试剂，0℃反应2h，加入1.5ml异丙醇，硅藻土过滤，滤饼用丙酮洗3次。无水硫酸镁干燥后旋干，加入5ml2mol/Ｌ的NaOH震荡5h后，调节溶液pH为3.0，加入1mol/ＬHCl在50℃条件下回流2h，得到生物素中间体内酯Ⅲ0.12g，得率66.7%，e.e.值98.35%。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种化学酶法合成式(Ⅲ)所示生物素中间体内酯的方法，所述方法包括：以式(Ⅰ)所示生物素中间体二醇为反应底物，在有机溶剂中，加入酰基供体，在脂肪酶的作用下，于10～50℃下进行酯交换不对称合成反应3～60小时，制得式(Ⅱ)所示生物素中间体单酯，再经过氧化、去乙酰化、闭环得到式(Ⅲ)所示生物素中间体内酯；所述酰基供体为下列之一：乙酸乙烯酯、乙酸乙酯、乙酸、乙酸酐、乙酸异丙烯酯、丁酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯；所述有机溶剂为下列之一或其中两种以上的混合物：1,4-二氧六环、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、甲苯、环己烷、正己烷；所述有机溶剂中底物初始浓度为1～200g/L，酰基供体添加浓度为1～50％，脂肪酶加入量为0.1～25U/g底物；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述脂肪酶为下列之一：Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM、Lipase PS IM、Novozym 435。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酰基供体为乙酸乙烯酯或丁酸乙烯酯。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述有机溶剂为1,4-二氧六环、甲苯、或其混合物。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酯交换不对称合成反应在30～50℃下进行，反应时间6～12小时。