CN103665194B

CN103665194B - 一种从琼脂中直接分离琼脂糖和琼胶酯的方法

Info

Publication number: CN103665194B
Application number: CN201310637069.0A
Authority: CN
Inventors: 肖美添; 柯庆勇; 叶静; 黄雅燕; 张学勤; 赵鹏
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: CN103665194A

Abstract

本发明涉及一种从琼脂中直接分离制备琼脂糖和琼胶酯的方法，包括以下步骤：1、分别配制琼脂和聚乙二醇（PEG）溶液，恒温，混合，搅拌，静置，出现沉淀物；2、将混合液离心，得到沉淀物和上清液；3、将沉淀物用纯净水和无水乙醇洗涤，过滤得到滤饼和滤液；4、将滤饼烘干，粉碎，得到琼脂糖；5、往浓缩后的上清液加入乙醇，静置，得到沉淀物；6、将混合液离心，过滤得到沉淀物和滤液；7、将沉淀物烘干，得到琼胶酯；8、合并滤液，减压浓缩，收集馏分，回收乙醇；9、进一步减压浓缩至熔融状态，冷却凝固，干燥，回收PEG。本发明不但在沉淀法制备琼脂糖过程中同时得到琼胶酯，而且解决了回收沉淀剂PEG和乙醇的问题，达到循环利用和保护环境的作用。

Description

一种从琼脂中直接分离琼脂糖和琼胶酯的方法

技术领域

本发明涉及一种以琼脂为原料分离琼脂糖和琼胶酯的生产工艺，不仅同时得到高品质琼脂糖和琼胶酯，更是解决了沉淀剂回收的问题。

技术背景

琼脂（Agar）作为世界三大工业海藻胶之一，广泛用于食品、生物技术和医药等方面，而从琼脂中分离所得的琼脂糖（Agarose）性能比琼脂更优异。琼脂糖是琼脂中不含有硫酸基的中性多糖，是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相间结合的链状多糖，它不但广泛应用于食品工业，还是高级生物化学、分子生物学、免疫学和现代生物技术的基础物质和重要材料，特别是在电泳、色谱等生物技术领域更需要中性琼脂糖。而琼胶酯（Agaropectin）是琼脂中的另一组成成分，它是一种分子常上带有硫酸基、丙酮醛酸和甲氧基等的链状多糖。如果琼脂糖中含有较多的琼胶酯，作为电泳支持物使用时，电内渗过大，用于亲和层析，非特异性吸附蛋白能力较强，影响分离效果，所以琼胶酯是商业提取制备琼脂糖中力图去掉的组分。但是据研究报道，琼胶酯具有较好的生物活性，如扁江蓠含硫酸基多糖的初筛抑瘤率为60%(邓志峰，1995），为利用红藻含硫酸基多糖在抗肿瘤药物方而的应用提供科学依据；紫菜多糖具有抗凝血活性(周慧萍等，1991)，抗凝血活性不但与多糖中硫酸基含量有直接关系，而且可能与海藻种类、多糖构成和硫酸基结合状态有关。国外也有报道，据Springer等人从墨角藻中分离出的褐藻多糖硫酸酯，在体内和体外实验中都表现出强抗凝血活性。

目前琼脂糖的制备方法主要有二甲亚砜（DMSO）法、EDTA-2Na法、果胶酶法、DEAE-纤维素法和聚乙二醇（PEG）沉淀法等。而PEG沉淀法无疑是种简易而有效的方法。除了聚乙二醇（PEG）沉淀法外，其他方法均存在操作繁琐、费用昂贵和产率低等问题，但是PEG回收问题一直难以解决。因此，从该方法中回收PEG是琼脂糖生产工艺中的关键环节。

聚乙二醇（PEG）是由乙二醇缩聚或由环氧乙烷与水加聚而得，无毒、无刺激性，具有良好的水溶性，并与许多有机物组分有良好的相溶性。它具有优良的润滑性、保湿性、分散性、粘接剂、抗静电剂及柔软剂等，在化妆品、制药、化纤、橡胶、塑料、造纸、油漆、电镀、农药、金属加工及食品加工等行业中均有着极为广泛的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从琼脂中直接分离琼脂糖和琼胶酯的方法，其在制备琼脂糖时可同时得到琼胶酯，更是解决了在聚乙二醇（PEG）沉淀法制备琼脂糖过程中PEG回收的问题。

为了解决上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种从琼脂中直接分离制备琼脂糖和琼胶酯的方法，所述方法包括在聚乙二醇沉淀法制备琼脂糖过程中同时获得琼胶酯，并回收乙醇和PEG的过程，具体包括如下步骤：

a.配制浓度为1.0～6.0wt％的琼脂溶液，加热搅拌溶解成半透明溶液，并置于60～100℃的水浴锅中恒温；

b.配制浓度为20～60wt％的PEG溶液，水浴加热搅拌使之完全溶解并保持60～100℃的温度，其中，PEG的分子量为2,000～10,000；

c.将步骤a所得的琼脂溶液与步骤b所得的PEG溶液按1∶0.5～1∶5.0的体积比于60～100℃的水浴锅中迅速混合并不断搅拌，得到具有白色沉淀的悬浊液，静置，出现白色沉淀；

d.将步骤c所得的悬浊液从水浴锅中取出，静置,冷却，将冷却后的悬浊液进行离心，得到白色沉淀和上清液，白色沉淀则用纯净水反复洗涤，最后用无水乙醇洗涤，过滤，得到白色沉淀和滤液一；

e.将白色沉淀烘干，粉碎，得到琼脂糖产品；

f.将步骤d的上清液浓缩至1/4～2/3体积，然后将浓缩液和体积百分比浓度为95%的乙醇按1∶0.5～1∶4.0体积比混合，静置，得到絮状物，将离心获得的絮状物用纯净水反复洗涤，最后用无水乙醇洗涤，过滤，得到絮状沉淀和滤液二；

g.将絮状沉淀烘干，粉碎，得到琼胶酯；

h.将滤液一和滤液二混合后，进行减压浓缩，收集30～50℃馏分，回收乙醇；

i.将滤液一和滤液二的混合液进一步减压浓缩至熔融状态，冷却凝固，干燥，回收PEG。

采用上述方案后，通过本发明方法不但在制备琼脂糖的同时可得到琼胶酯，更是解决了在采用聚乙二醇沉淀法制备琼脂糖过程中聚乙二醇回收的问题，使得整个生产工艺能够达到循环利用和保护环境的作用。

本发明在琼胶酯的提取过程中，采用的是乙醇沉淀法。它是根据琼胶酯不溶于乙醇的原理进行的。所用的乙醇较其它有机溶剂更具廉价性和易回收，且制备工艺简易和实用，具有可实现工业化生产的可行性。聚乙二醇和乙醇的回收过程原料廉价、操作简易，可达到循环利用和保护环境的双重作用，同样具有可实现工业化生产的可行性。

具体实施方式

实施例1：

本发明一种从琼脂中直接分离制备琼脂糖和琼胶酯的方法，具体包括如下步骤：

a.取16g琼脂（646g/cm²,1%gel)，配制浓度为1wt％的琼脂溶液，加热搅拌溶解成半透明溶液，并置于60℃的水浴锅中恒温30min；其中，采用的琼脂来源于江蓠、石花菜或伊谷藻属海洋红藻植物；

b.取100gPEG配制浓度为60wt％的PEG溶液，水浴加热搅拌使之完全溶解并保持60℃的温度30min，其中，PEG的分子量为2,000；

c.将步骤a所得的琼脂溶液与步骤b所得的PEG溶液于60℃的水浴锅中迅速混合并不断搅拌，搅拌时间5min后，得到具有白色沉淀的悬浊液,停止搅拌，静置10min，出现白色沉淀；

d.将步骤c所得的悬浊液从水浴锅中取出，静置,在室温下冷却，温度不低于15℃，将冷却后的悬浊液进行离心，离心的悬浊液的温度为20～50℃，在3,000r/min下离心15min，得到白色沉淀和上清液，白色沉淀则用纯净水反复洗涤，直至无PEG残留，最后用无水乙醇洗涤，过滤，得到白色沉淀和滤液一；

e.将白色沉淀烘干，粉碎，得到粉末状琼脂糖，重复步骤a～d2-3次，可得到高品质的琼脂糖产品；

f.将步骤d的上清液减压浓缩至600mL，加入600mL的95%（v/v）乙醇搅拌，静置45min，得到絮状沉淀物，将絮状沉淀物离心后用纯净水反复洗涤，最后用无水乙醇洗涤，过滤，得到絮状沉淀和滤液二；

g.将絮状沉淀烘干，粉碎，得到粉末状琼胶酯；

h.将滤液一和滤液二混合后，进行减压蒸馏，收集30℃馏分，回收乙醇，乙醇回收率为92.2%；

i.将滤液一和滤液二的混合液进一步减压蒸馏至熔融状态，减压蒸馏的温度控制在70-80℃，然后冷却，冷却温度控制在0～25℃，干燥，回收固体PEG，PEG回收率为89.5%。

本实施例的实验分析结果见表1。

表1

实施例2：

a.取16g琼脂（646g/cm²,1%gel)，配制浓度为3wt％的琼脂溶液，加热搅拌溶解成半透明溶液，并置于90℃的水浴锅中恒温30min；其中，采用的琼脂来源于江蓠、石花菜或伊谷藻属海洋红藻植物；

b.取80gPEG配制浓度为50wt％的PEG溶液，水浴加热搅拌使之完全溶解并保持90℃的温度30min，其中，PEG的分子量为4,000；

c.将步骤a所得的琼脂溶液与步骤b所得的PEG溶液于水浴锅中迅速混合并不断搅拌，搅拌时间维持10min后，停止搅拌，得到具有白色沉淀的悬浊液，静置10min，出现白色沉淀；

d.将步骤c所得的悬浊液从水浴锅中取出，静置,在室温下冷却，温度不低于15℃，将冷却后的悬浊液进行离心，离心的悬浊液的温度为20～50℃，在4,000r/min下离心15min，得到白色沉淀和上清液，白色沉淀则用纯净水反复洗涤，直至无PEG残留，最后用无水乙醇洗涤，过滤，得到白色沉淀和滤液一；

e.将白色沉淀烘干，粉碎，得到粉末状琼脂糖，重复步骤a～d2-3次，得到高品质的琼脂糖产品；

f.将步骤d的上清液减压浓缩至250mL，加入500mL的95%（v/v）乙醇搅拌，静置50min，得到絮状沉淀物，将絮状沉淀物离心后用纯净水反复洗涤，最后用无水乙醇洗涤，过滤，得到絮状沉淀和滤液二；

g.将絮状沉淀烘干，粉碎，得到粉末状琼胶酯；

h.将滤液一和滤液二混合后，进行减压蒸馏，收集40℃馏分，回收乙醇，乙醇回收率为91.2%；

i.将滤液一和滤液二的混合液进一步减压蒸馏至熔融状态，减压蒸馏的温度控制在75-85℃，然后冷却，冷却温度控制在0～25℃，干燥，回收固体PEG，PEG回收率为88.7%。

本实施例的实验分析结果见表2。

表2

实施例3：

a.取16g琼脂（646g/cm²,1%gel)，配制浓度为4wt％的琼脂溶液，加热搅拌溶解成半透明溶液，并置于80℃的水浴锅中恒温30min；其中，采用的琼脂来源于江蓠、石花菜或伊谷藻属海洋红藻植物；

b.取100gPEG配制浓度为40wt％的PEG溶液，水浴加热搅拌使之完全溶解并保持80℃的温度30min，其中，PEG的分子量为6,000；

c.将步骤a所得的琼脂溶液与步骤b所得的PEG溶液于水浴锅中迅速混合并不断搅拌，搅拌时间维持15min后，停止搅拌，得到具有白色沉淀的悬浊液，静置25min，出现白色沉淀；

d.将步骤c所得的悬浊液从水浴锅中取出，静置,在室温下冷却，温度不低于15℃，将冷却后的悬浊液进行离心，离心的悬浊液的温度为20～50℃，在8,000r/min下离心15min，得到白色沉淀和上清液，白色沉淀则用纯净水反复洗涤，直至无PEG残留，最后用无水乙醇洗涤，过滤，得到白色沉淀和滤液一；

f.将步骤d的上清液减压浓缩至380mL，加入500mL的95%（v/v）乙醇搅拌，静置55min，得到絮状沉淀物，将絮状沉淀物离心后用纯净水反复洗涤，最后用无水乙醇洗涤，过滤，得到絮状沉淀和滤液二；

g.将絮状沉淀烘干，粉碎，得到粉末状琼胶酯；

h.将滤液一和滤液二混合后，进行减压蒸馏，收集45℃馏分，回收乙醇，乙醇回收率为90.6%；

i.将滤液一和滤液二的混合液进一步减压蒸馏至熔融状态，减压蒸馏的温度控制在80-85℃，然后冷却，冷却温度控制在0～25℃，干燥，回收固体PEG，PEG回收率为87.7%。

本实施例的实验分析结果见表3。

表3

实施例4：

a.取16g琼脂（646g/cm²,1%gel)，配制浓度为6wt％的琼脂溶液，加热搅拌溶解成半透明溶液，并置于100℃的水浴锅中恒温30min；其中，采用的琼脂来源于江蓠、石花菜或伊谷藻属海洋红藻植物；

b.取100gPEG配制浓度为20wt％的PEG溶液，水浴加热搅拌使之完全溶解并保持100℃的温度30min，其中，PEG的分子量为10,000；

c.将步骤a所得的琼脂溶液与步骤b所得的PEG溶液于100℃的水浴锅中迅速混合并不断搅拌，搅拌时间20min后，停止搅拌，得到具有白色沉淀的悬浊液，静置20min，出现白色沉淀；

d.将步骤c所得的悬浊液从水浴锅中取出，静置,在室温下冷却，温度不低于15℃，将冷却后的悬浊液进行离心，离心的悬浊液的温度为20～50℃，在10,000r/min下离心15min，得到白色沉淀和上清液，白色沉淀则用纯净水反复洗涤，直至无PEG残留，最后用无水乙醇洗涤，过滤，得到白色沉淀和滤液一；

f.将步骤d的上清液减压浓缩至350mL，加入700mL的95%（v/v）乙醇搅拌，静置60min，得到絮状沉淀物，将絮状沉淀物离心后用纯净水反复洗涤，最后用无水乙醇洗涤，过滤，得到絮状沉淀和滤液二；

g.将絮状沉淀烘干，粉碎，得到粉末状琼胶酯；

h.将滤液一和滤液二混合后，进行减压蒸馏，收集50℃馏分，回收乙醇，乙醇回收率为91.5%；

i.将滤液一和滤液二的混合液进一步减压蒸馏至熔融状态，减压蒸馏的温度控制在85-90℃，然后冷却，冷却温度控制在0～25℃，干燥，回收固体PEG，PEG回收率为90.4%。

本实施例的实验分析结果见表4。

表4

Claims

1.一种从琼脂中直接分离制备琼脂糖和琼胶酯的方法，其特征在于：所述方法包括在聚乙二醇沉淀法制备琼脂糖过程中同时获得琼胶酯，并回收PEG和乙醇的过程，具体包括如下步骤：

d.将步骤c所得的悬浊液从水浴锅中取出，静置冷却，将冷却后的悬浊液进行离心，得到白色沉淀和上清液，白色沉淀则用纯净水反复洗涤，最后用无水乙醇洗涤，过滤，得到白色沉淀和滤液一；

e.将白色沉淀烘干，粉碎，得到琼脂糖产品；

g.将絮状沉淀烘干，粉碎，得到琼胶酯；

2.根据权利要求1所述的一种从琼脂中直接分离制备琼脂糖和琼胶酯的方法，其特征在于：采用的琼脂来源于江蓠、石花菜或伊谷藻属海洋红藻植物。

3.根据权利要求1所述的一种从琼脂中直接分离制备琼脂糖和琼胶酯的方法，其特征在于：所述步骤c中搅拌时间维持2～20min后，停止搅拌，静置时间维持在5～60min。

4.根据权利要求1所述的一种从琼脂中直接分离制备琼脂糖和琼胶酯的方法，其特征在于：所述步骤d中在室温下冷却，温度不低于15℃，离心的悬浊液的温度为20～50℃，离心的转数控制在3,000～10,000r/min，离心时间维持在10～60min，白色沉淀用纯净水和无水乙醇洗涤，直至无PEG残留。

5.根据权利要求1所述的一种从琼脂中直接分离制备琼脂糖和琼胶酯的方法，其特征在于：所述步骤e中重复步骤a～d2-3次，得到高品质的琼脂糖产品。

6.根据权利要求1所述的一种从琼脂中直接分离制备琼脂糖和琼胶酯的方法，其特征在于：所述步骤f中静置时间维持在10～60min。

7.根据权利要求1所述的一种从琼脂中直接分离制备琼脂糖和琼胶酯的方法，其特征在于：所述步骤h中减压蒸馏，温度控制在30～50℃。

8.根据权利要求1所述的一种从琼脂中直接分离制备琼脂糖和琼胶酯的方法，其特征在于：所述步骤i中减压蒸馏，温度控制在70～90℃。

9.根据权利要求1所述的一种从琼脂中直接分离制备琼脂糖和琼胶酯的方法，其特征在于：所述步骤i中冷却温度控制在0～25℃。