CN103664839A - 滇南羊耳菊内酯a及其衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域。本发明提供了一类滇南羊耳菊内酯A及其衍生物，其化学结构如通式I所示。本发明还提供了该滇南羊耳菊内酯A及其衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明对滇南羊耳菊内酯A及其衍生物进行肿瘤细胞的毒性杀伤作用研究试验，证明了其对人肝癌细胞、人前列腺癌细胞、人胃癌细胞、人白血病细胞、人鼻咽癌细胞有强烈的毒性杀伤作用，特别是在小鼠H22肝癌实体瘤模型实验中发现，滇南羊耳菊内酯A表现出良好的抗肿瘤能力，显著抑制肿块的增长。本发明的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物具有较好的抗肿瘤作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及滇南羊耳菊内酯A及其衍生物以及在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
菊科(Compositae)旋覆花属(Inula L.)植物约有100种，主要分布于地中海地区，在欧洲、非洲及亚洲的其它地区也有分布。本属植物在我国有20余种和多数变种，其中过半的植物有药用记载（中国科学院中国植物志编辑委员会，中国植物志[M]，北京：科学出版社，1979,75:248-281）。国内外学者先后从该属植物中分离得到黄酮、倍半萜内酯、萜类等结构类型的化合物（Zhao YM,Zhang ML,Shi QW,Kiyota H.Chemical constituents of plants from the genus Inula.Chemistry&Biodiversity2006;3:371-383）。倍半萜内酯是本属植物的特征性成分，也是主要的活性成分具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、驱虫杀虫、免疫抑制等多种作用。倍半萜内酯还因为其结构简单，并且具有多种母核结构类型，可作为研发药物的先导化合物。
我国特有植物滇南羊耳菊(Inula wissmanniana Hand.-Mazz.)为旋覆花属植物，云南地区俗称“火把梗”，为亚灌木，产云南南部(元江、屏边)。生于低山开旷坡地，海拔1200～1650米。
本发明人长期致力于滇南羊耳菊的化学成分及生物活性的相关研究。目前已从滇南羊耳菊中分离得到28个倍半萜类成分，其中滇南羊耳菊总提取物及6个吉玛烷型倍半萜内酯具有良好的抗炎及抗抗肿瘤活性，已经申请中国专利：中国专利申请CN201310014911.5，发明名称为滇南羊耳菊提取物及其制备与在制备抗炎药物中的应用，公开号为CN103058970A；中国专利申请CN201310014913.4，发明名称为滇南羊耳菊提取物及其制备与在制备抗肿瘤药物中的应用，公开号为CN103102336A。
有关从滇南羊耳菊中寻找到新的具有生物活性的化学成分仍是本领域的研究重点。
发明内容
本发明的目的在于从滇南羊耳菊中寻找到新的具有生物活性的化学成分，本发明的第一发明目的是提供一类滇南羊耳菊内酯A及其衍生物，本发明的第二发明目的是提供上述的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明人从滇南羊耳菊中分离得到了一个新骨架化合物（命名为滇南羊耳菊内酯A），发现该化合物具有显著的抗肿瘤活性。进一步对滇南羊耳菊内酯A进行化学合成与结构修饰，得到一系列的合成衍生物，发现这一系列衍生物均表现出强烈的抗肿瘤活性。经对现有技术的文献检索发现，尚未见与本发明的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物的提取分离方法、化学合成方法、用途有关的报道。
本发明的第一方面，是提供了一类滇南羊耳菊内酯A及其衍生物，其化学结构如通式I所示：
其中，
R1基团，选自H、Br、CF3、NH2、CH3，或OH；
R2基团或R3基团，分别选自CH3、C2H5、OH、OCH3、OAc、NH2、N(CH2CH2Cl)2、Br或CF3；
7*为7S、7R，或7S与7R混旋体。
其中从滇南羊耳菊中分离得到的天然的滇南羊耳菊内酯A的结构式及绝对构型为：
本发明的第二方面，是提供了上述的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物的制备方法。
其中天然的滇南羊耳菊内酯A的制备方法包括如下步骤：
滇南羊耳菊全草干燥，粉碎，以8～10倍量（W/L）80～95％乙醇室温浸泡提取3～4次，每次12～24小时,合并得提取液；减压浓缩提取液至干，得滇南羊耳菊总提取物，随后加入1～3倍量（W/L）水稀释，依次用2～6倍量（W/L）石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压回收各萃取部分，得滇南羊耳菊各提取部位样品；上述二氯甲烷部位应用硅胶柱色谱，以体积比为100：0～2：1的二氯甲烷/甲醇系统梯度洗脱，薄层色谱检测，收集含有滇南羊耳菊内酯A的流分，再经葡聚糖凝胶柱色谱，以体积比为1：1的二氯甲烷/甲醇洗脱，最后经液相色谱制备，得到滇南羊耳菊内酯A。化合物的结构经高分辨质谱结合一维、二维核磁共振波谱分析结合量子化学计算方法确定其结构和构型。
其中的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物，可通过下列化学合成方法制备而得：
合成路线为：
反应步骤如下:
(i)以丙炔酸为起始原料，二氯甲烷作溶剂，室温条件下，在二环己基碳二酰亚胺和4-二甲氨基吡啶存在下与顺-2-丁烯-1,4-二醇反应生成顺-4-羟基丁-2-烯基丙炔酸酯（中间体1）；
(ii)以二氯乙烷作溶剂，室温条件下，中间体1在双（1,5-环辛二烯）二氯化铑、六氟锑化银和不对称合成催化剂（如S/R-1,1'-联萘-2,2'-双苯基膦）催化下反应生成(S/R)-2-（4-亚甲基-5-氧代四氢呋喃-3-基）乙醛（中间体2）；
(iii)中间体2在室温下经硼烷四氢呋喃还原得(S/R)-4-（2-羟乙基）-3-亚甲基二氢呋喃-2(3H)-酮（中间体3）；
(iv)室温下以二氯甲烷作溶剂，中间体3与四溴化碳和三苯基膦反应生成(S/R)-4-（2-溴乙基）-3-亚甲基二氢呋喃-2(3H)-酮（中间体4）；
(v)室温下以四氢呋喃作溶剂，在溴化钯、二叔丁基甲基磷四氟硼酸盐和四丁基氟化铵存在下，中间体4与不同的取代苯基三甲氧基硅醚进行反应，制备而得R1，R2，R3位不同取代基团的滇南羊耳菊内酯化合物。
滇南羊耳菊内酯结构通式中，不同取代基团的滇南羊耳菊内酯是通过改变亲电试剂反应合成的（步骤v），而不同手性衍生物则在手性试剂1,1'-联萘-2,2'-双苯基膦催化下制备而得（步骤ii）。
本发明的第三方面，是提供了上述的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物抑制的肿瘤为：肝肿瘤、胃肿瘤、前列腺肿瘤、白血病、鼻咽肿瘤等。
本发明人对一系列人工合成的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物进行肿瘤细胞的毒性杀伤作用研究试验，证明了其对人肝癌细胞、人前列腺癌细胞、人胃癌细胞、人白血病细胞、人鼻咽癌细胞有强烈的毒性杀伤作用，其IC50值为0.12-34.43μM。
滇南羊耳菊内酯A对人肝癌细胞HepG2的杀伤IC50值为2.49μM，是对正常人肝细胞LO2杀伤作用的20倍，表明滇南羊耳菊内酯A能显著地、选择性地抑制肝癌细胞的增殖，而相同条件下对正常肝细胞的增殖影响不显著。经细胞周期分析结果表明，滇南羊耳菊内酯A能显著阻滞肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞MGC-803于细胞分裂的G2/M期，而选择性地抑制肿瘤细胞的增殖，导致肿瘤细胞的死亡。
在小鼠H22肝癌实体瘤模型实验中发现，滇南羊耳菊内酯A表现出良好的抗肿瘤能力，显著抑制肿块的增长，结果说明滇南羊耳菊内酯A具有强烈杀伤在体肿瘤细胞的作用。以上研究结果表明滇南羊耳菊内酯A具有较好的抗肿瘤作用。
本发明所述滇南羊耳菊内酯A及其衍生物制备抗肿瘤药物为由滇南羊耳菊内酯A或其衍生物作为活性成分与常规药用载体制成的药物组合物。所述 药物组合物可以是片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等。
本发明为恶性肿瘤的治疗提供了新的药物，有较大的临床应用价值。
附图说明
图1为滇南羊耳菊内酯A实验与计算的圆二色谱曲线比较
其中：—□—在甲醇中的实验值；—△—7S异构体在甲醇中的COSMO模型B3LYP-SCRF/6-31G*//B3LYP/6-31G*条件下的计算曲线；—■—7R异构体在甲醇中的COSMO模型B3LYP-SCRF/6-31G*//B3LYP/6-31G*条件下的计算曲线。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：天然滇南羊耳菊内酯A的提取和制备
滇南羊耳菊全草(10.0kg)干燥粉碎后，室温25℃下用95%乙醇(30L)冷浸提取4次(24,12,12,12h),回收溶剂，浓缩得干燥无水的滇南羊耳菊总提取物(631.4g)；滇南羊耳菊总提取物混悬于1.5L水中依次用5L石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯分别萃取3次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位(133.2g)、二氯甲烷部位(179.6g)和乙酸乙酯部位(28.1g)。
将滇南羊耳菊的二氯甲烷部位120g上正相硅胶柱，依次用二氯甲烷-甲醇(100%二氯甲烷,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100%甲醇)梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得8个洗脱部分。取其中第1个洗脱部分，上硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯（50:1）洗脱，经薄层色谱检测合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得6个洗脱流分。把其中第2个洗脱流分(0.9g)用7mL色谱纯甲醇溶解、过滤后经过制备色谱方法，以70%甲醇洗脱，经高分辨质谱结合一维、二维核磁共振波谱分析鉴定得到化合物滇南羊耳菊内酯A(tR32.5min,300.0mg)。
滇南羊耳菊内酯A为无色油状，结合HR-ESI-MS:m/z253.1206[M+Na]+(calcd for C15H18O2Na,253.1204),1H和13C-NMR谱确定分子式为C15H18O2，其旋光光谱、紫外光谱、红外光谱、质谱及高分辨质谱数据分别为：
91.2(c0.10,CH2Cl2);UV(MeOH) max(log ):220(3.15)nm;IR(KBr)νmax2952,1765,1661,1489,1405,1267,1165,1115,1013,947
ESIMS m/z253.1[M+Na],m/z229.1;HR-ESI-MS m/z253.1206[M Na.](calcd for C15H18O2Na,253.1204)；核磁共振波谱数据见表1。化合物进一步采用量子化学计算的方法，模拟旋光值和圆二色谱，与实验值比较，确定滇南羊耳菊内酯A的绝对构型为7S，模拟数据及图谱见表2、图1。
表1滇南羊耳菊内酯A的1H和13C NMR数据(CDCl3,400/100MHz)
| Pos. | C | H |
| 1 | 128.4d | 7.02m(overlap) |
| 2 | 126.2d | 7.02m(overlap) |
| 3 | 128.4d | 7.02m(overlap) |
| 4 | 135.7s | |
| 5 | 137.5s | |
| 6 | 71.0t | 4.55dd(8.8,8.4),4.09dd(8.8,5.2) |
| 7 | 39.2d | 3.18m |
| 8 | 32.9t | 1.84m,1.70m |
| 9 | 26.4t | 2.67m |
| 10 | 135.7s | |
| 11 | 138.1s | |
| 12 | 170.6s | |
| 13 | 122.2t | 6.33d(2.6),5.67d(2.6) |
| 14 | 19.8q | 2.31s |
| 15 | 19.8q | 2.31s |
表2滇南羊耳菊内酯A的实验与计算旋光值
a计算旋光值由二氯甲烷中的PCM模型在B3LYP-SCRF/6-31G(d)//B3LYP/6-311++G(2d,p)条件下得出；b为实验值(CH2Cl2,0.10)。
实施例2：滇南羊耳菊内酯A的合成
(i)以丙炔酸（0.93g,13.2mmol）为起始原料，二氯甲烷（30mL）作溶剂，室温条件下，在二环己基碳二酰亚胺（2.79g,13.5mmol）和4-二甲氨基吡啶（0.12g,0.09mmol）存在下与顺-2-丁烯-1,4-二醇（1.05g，12.0mmol）反应生成顺-4-羟基丁-2-烯基丙炔酸酯（1，1.41g,76%）；
(ii)以二氯乙烷作溶剂，室温条件下，中间体（1，1.14g,8.14mmol）在双（1,5-环辛二烯）二氯化铑(I，50.2mg,0.102mol)、六氟锑化银（70.0mg,0.204mol）和不对称合成催化剂(S)-1,1'-联萘-2,2'-双苯基膦（127mg,0.204mol）催化下反应生成关键中间体(S)-2-（4-亚甲基-5-氧代四氢呋喃-3-基）乙醛（2，0.67g,59%）；
(iii)中间体（2，39mg,0.28mmol）在室温下经硼烷四氢呋喃（0.31mL,0.31mmol）还原得中间体(S)-4-（2-羟乙基）-3-亚甲基二氢呋喃-2(3H)-酮（3，0.26g,65%）；
(iv)室温下以二氯甲烷（10mL）作溶剂，中间体（3，71mg,0.5mmol）与四溴化碳和三苯基膦（157mg,0.6mmol）反应生成(S)-4-（2-溴乙基）-3-亚甲基二氢呋喃-2(3H)-酮（4，79mg,77%）；
(v)室温下以四氢呋喃（2.5ml）作溶剂，在溴化钯（10.6mg,0.04mmol）、二叔丁基甲基磷四氟硼酸盐（24.8mg,0.10mmol）和四丁基氟化铵（2ml）存在下，中间体（4，205mg,1.0mmol）与2,6-二甲基苯基三甲氧基硅醚（224mL,1.2mmol）反应生成目标化合物(S)-3-亚甲基-4-（2,6-二甲基苯乙基）二氢呋喃-2(3H)-酮（108mg,53%），即为滇南羊耳菊内酯A。
实施例3：滇南羊耳菊内酯A手性异构体（化合物2）及其它衍生物的合成(i)以二氯乙烷作溶剂，室温条件下，中间体（1，实施例2制备）在双（1,5-环辛二烯）二氯化铑(I，49.2mg,0.1mol)、六氟锑化银（68.6mg,0.2mol）和不对称合成催化剂(R)-1,1'-联萘-2,2'-双苯基膦（127mg,0.204mol）催化下反应生成关键中间体(R)-2-（4-亚甲基-5-氧代四氢呋喃-3-基）乙醛（2，0.57g,50%）；
(ii)中间体（2，39mg,0.28mmol）在室温下经硼烷四氢呋喃（0.31mL,0.31mmol）还原得中间体(R)-4-（2-羟乙基）-3-亚甲基二氢呋喃-2(3H)-酮（3，0.27 g,67%）；
(iii)室温下以二氯甲烷（10mL）作溶剂，中间体（3，71mg,0.5mmol）与四溴化碳和三苯基膦（157mg,0.6mmol）反应生成(R)-4-（2-溴乙基）-3-亚甲基二氢呋喃-2(3H)-酮（4，77mg,75%）；
(iv)室温下以四氢呋喃（2.5ml）作溶剂，在溴化钯（10.6mg,0.04mmol）、二叔丁基甲基磷四氟硼酸盐（24.8mg,0.10mmol）和四丁基氟化铵（2ml）存在下，中间体（4，205mg,1.0mmol）与2,6-二甲基苯基三甲氧基硅醚（224mL,1.2mmol）反应生成目标化合物(R)-3-亚甲基-4-（2,6-二甲基苯乙基）二氢呋喃-2(3H)-酮（81.5mg,40%），即为化合物2，滇南羊耳菊内酯A的手性异构体。
滇南羊耳菊内酯结构通式中，不同取代基团的滇南羊耳菊内酯是通过改变亲电试剂反应合成的（实施例1，步骤v），而不同手性衍生物则在手性试剂1,1'-联萘-2,2'-双苯基膦催化下制备而得（实施例1，步骤ii）。根据上述反应合成路线，合成滇南羊耳菊内酯A及其衍生物具体为化合物1-13，具体结构见表3。
表3滇南羊耳菊内酯A及其衍生物的结构
实施例4：滇南羊耳菊内酯A及其衍生物对5种人肿瘤细胞的杀伤作用
滇南羊耳菊内酯A及其衍生物（实施例2及3制得）对人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞MGC-803、人前列腺癌细胞PC-3、人白血病细胞K562、人鼻咽癌细胞KB（购于上海生科院细胞资源中心）的毒性杀伤作用进行研究。
实验药物滇南羊耳菊内酯A及其衍生物与肿瘤细胞共同孵育72h；药物分别浓度设置为0，0.5，5，20，50μM；药物溶解于DMSO（二甲亚砜,Merck公司）。以阿霉素(Doxorubicin)为阳性对照，DMSO为阴性对照。
实验方法：CCK-8法（细胞计数试剂盒-8）。96孔板每孔加入浓度为4～6×104个/mL的细胞悬液100uL，置37℃，5%CO2培养箱内。24h后，加入不同浓度药物1uL/孔，设双复孔，37℃，5%CO2作用72h。每孔加入10uL的CCK-8试剂，培养2-4h后，用全自动酶标仪测450nm OD值。
评价及统计方法：用全自动酶标仪(WellscanMK-2型，Labsystems)测450nm处OD值，各种实验结果以SPSS15软件(SPSS公司，芝加哥)one-way ANNOVA方法进行统计分析。
实验结果表明滇南羊耳菊内酯A及其衍生物对人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞MGC-803、人白血病细胞K562、人前列腺癌细胞PC、人鼻咽癌细胞KB均具有较好的毒性杀伤作用，其IC50值为0.12-34.43μM。滇南羊耳菊内酯A对5种人肿瘤细胞的杀伤作用分别为2.49，1.35，3.35，3.27，4.52μM，说明其具有广泛的肿瘤细胞毒性杀伤作用。
根据活性测试结果，结合滇南羊耳菊内酯A及其衍生物的结构，进一步总结了它们的构效关系。在R1位引入吸电子基团，可增强化合物的肿瘤细胞杀伤活性，若R1位引入给电子基团，则活性降低；如R1位Br、CF3取代的衍生物，其活性普遍强于滇南羊耳菊内酯A（R1位为H），而R1位NH2、OH取代的衍生物仅表现出中等的肿瘤细胞杀伤作用（见表4）。在R2或R3位引入给电子基团，可增强化合物的肿瘤细胞杀伤作用，若引入吸电子基团，则活性降低；如R2或R3位引入给电子的OH、OCH3、NH2、烷基等，均可提高抗肿瘤细胞活性，而引入吸电子的Br、CF3基团，则活性减弱（见表4）。C-7位是滇南羊耳菊内酯A及其衍生物唯一的一个手性中心，实验结果表明， 7S构型的化合物活性优于7R的化合物，但7R构型的衍生物也具有较好的肿瘤细胞杀伤作用。实验结果也进一步提示7S与7R混旋体也应具有较好的肿瘤细胞杀伤作用。
表4滇南羊耳菊内酯A及其衍生物对5种人肿瘤细胞的杀伤作用
实施例5：滇南羊耳菊内酯A对人肝癌细胞HepG2和正常人肝细胞LO2增殖的影响
实验时间梯度：0，24，48，72小时；实验药物：滇南羊耳菊内酯A（实施例1制得）；浓度梯度设置：0，1，5，10，25，50μM；药物溶解于DMSO（二甲亚砜,Merck公司）。
实验方法：CCK-8法。96孔板每孔加入浓度为4～6×104个/mL的细胞悬液100uL，置37℃，5%CO2培养箱内。24h后，加入不同浓度药物1uL/孔，设双复孔，37℃，5%CO2培养。
评价方法：每24小时检测细胞活力。每孔加入10uL的CCK-8试剂，培养2-4h后，用全自动酶标仪测450nm OD值。
研究结果表明，滇南羊耳菊内酯A能显著抑制人肝癌细胞株HepG2的增殖，在5μM的时候就能收到显著的抑制效果，而对正常肝细胞株LO2而言， 在50μM的时候才出现比较明显的增殖抑制作用。滇南羊耳菊内酯A抑制正常人肝细胞LO2增殖的IC50值为53.7μM。因此，本实验说明滇南羊耳菊内酯A能显著地、选择性地抑制人肝癌细胞的增殖，而相同条件下对正常人肝细胞的增殖没有显著的抑制作用。
实施例6：滇南羊耳菊内酯A对人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞MGC-803的细胞周期抑制作用研究
滇南羊耳菊内酯A（实施例1制得）浓度梯度设置：0，1，5μM；药物溶解于DMSO（二甲亚砜,Merck公司）；滇南羊耳菊内酯A处理时DMSO的含量低于0.1%，处理12小时后分析细胞的周期。
实验步骤：肿瘤细胞以不同浓度滇南羊耳菊内酯A处理12小时后，吸去细胞上清，胰酶消化后离心收集细胞，之后以70%的乙醇4℃固定过夜，加入50μg/mL PI溶液，15min后上流式细胞仪检测。
细胞周期分析结果表明，滇南羊耳菊内酯A能显著阻滞人肝癌细胞HepG2及人胃癌细胞MGC-803于细胞分裂的G2/M期，该结果与这两个化合物能显著地、选择性地抑制肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MGC-803的增殖相一致。因此，推测滇南羊耳菊内酯A可能通过显著地阻滞人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞MGC-803于细胞分裂的G2/M期而选择性地抑制肿瘤细胞的增殖，导致癌细胞的死亡。
实施例7：滇南羊耳菊内酯A的体内抗肿瘤活性
动物处理与分组：无菌条件下抽取肝癌小鼠腹水中的H22细胞,以无菌PBS（磷酸盐缓冲液）调整为5×106/ml。于BALB/c小鼠左侧下腹部行无菌皮下接种,接种量0.2ml细胞悬液。接种后对小时随机分为14组,每组10只。接种后第3天给药。第1组为阴性对照，给予生理盐水；第2组为阳性对照组，给予环磷酰胺（上海华联制药有限公司,20mg/kg/d）；第3组给予高浓度滇南羊耳菊内酯A(50mg/kg/d)；第4组给予中浓度滇南羊耳菊内酯A(20mg/kg/d)；第5组给予低浓度滇南羊耳菊内酯A(10mg/kg/d)。连续给药观察15天。
抑瘤作用评价：每日观察荷瘤小鼠的生长情况。给药后第5天起隔日称重并测量瘤块体积,用电动游标卡尺测量瘤体的最长径和最短径。
肿瘤体积=[(瘤体长径+瘤体短径)/2]2;
抑瘤率=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。
根据抑瘤率绘制肿瘤生长曲线。停药后次日处死小鼠，剥瘤称重。
实验结果表明在实验浓度下，滇南羊耳菊内酯A均表现出明显的抑瘤效应，特别是对荷瘤小鼠给予高浓度滇南羊耳菊内酯A50mg/kg/d时，抑瘤率与阳性药相当。观察给予不同高浓度药物治疗的荷瘤小鼠肿瘤的生长情况，可见给予生理盐水组肿瘤生长迅速，在给药后第7天，其肿块明显大于其他给药组，给予滇南羊耳菊内酯A均能有效地抑制肿块的增长。
表5滇南羊耳菊内酯A对荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用
*与生理盐水组比较,P<0.01
实施例8：滇南羊耳菊内酯A片剂制备
制备方法：将滇南羊耳菊内酯A、乳糖和玉米淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重200mg，滇南羊耳菊内酯A含量为10mg。
实施例9：滇南羊耳菊内酯A注射液制备
滇南羊耳菊内酯A 2g
葡萄糖 50g
制备方法：将滇南羊耳菊内酯A和葡萄糖溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入输液瓶（每瓶100ml）中，每瓶含滇南羊耳菊内酯A2mg。
实施例10：滇南羊耳菊内酯A注射用冻干粉针剂制备
滇南羊耳菊内酯A 2g
甘露醇 28g
制备方法：将滇南羊耳菊内酯A和甘露醇溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入西林瓶（10ml西林瓶，每瓶2ml）中，冻干，每支含滇南羊耳菊内酯A2mg。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (8)
1.一类滇南羊耳菊内酯A及其衍生物，其特征在于，该类化合物的化学结构如通式I所示：
其中，
R1基团，选自H、Br、CF3、NH2、CH3，或OH；
R2基团或R3基团，分别选自CH3、C2H5、OH、OCH3、OAc、NH2、N(CH2CH2Cl)2、Br或CF3；
7*为7S、7R，或7S与7R混旋体。
2.根据权利要求1所述的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物，其特征在于，该类化合物的R1基团、R2基团、R3基团、7*的组合如下：
3.一种如权利要求1所述的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物的制备方法，其特征在于，该类化合物的合成路线为：
该类化合物的反应步骤如下：
(i)以丙炔酸为起始原料，二氯甲烷作溶剂，室温条件下，在二环己基碳二酰亚胺和4-二甲氨基吡啶存在下与顺-2-丁烯-1,4-二醇反应生成顺-4-羟基丁-2-烯基丙炔酸酯（中间体1）；
(ii)以二氯乙烷作溶剂，室温条件下，中间体1在双（1,5-环辛二烯）二氯化铑、六氟锑化银和不对称合成催化剂（如S/R-1,1'-联萘-2,2'-双苯基膦）催化下反应生成(S/R)-2-（4-亚甲基-5-氧代四氢呋喃-3-基）乙醛（中间体2）；
(iii)中间体2在室温下经硼烷四氢呋喃还原得(S/R)-4-（2-羟乙基）-3-亚甲基二氢呋喃-2(3H)-酮（中间体3）；
(iv)室温下以二氯甲烷作溶剂，中间体3与四溴化碳和三苯基膦反应生成(S/R)-4-（2-溴乙基）-3-亚甲基二氢呋喃-2(3H)-酮（中间体4）；
(v)室温下以四氢呋喃作溶剂，在溴化钯、二叔丁基甲基磷四氟硼酸盐和四丁基氟化铵存在下，中间体4与不同的取代苯基三甲氧基硅醚进行反应，制备而得R1，R2，R3位不同取代基团的滇南羊耳菊内酯化合物。
4.一种如权利要求1所述的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物的制备方法，其特征在于，其中的滇南羊耳菊内酯A是从滇南羊耳菊中分离得到的，分离方法如下：滇南羊耳菊全草干燥，粉碎，以8～10倍量的80～95％乙醇室温浸泡提取3～4次，每次12～24小时,合并得提取液；减压浓缩提取液至干，得滇南羊耳菊总提取物，随后加入1～3倍量的水稀释，依次用2～6倍量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压回收各萃取部分，得滇南羊耳菊各提取部位样品；上述二氯甲烷部位应用硅胶柱色谱，以体积比为100：0～2：1的二氯甲烷/甲醇系统梯度洗脱，薄层色谱检测，收集含有滇南羊耳菊内酯A的流分，再经葡聚糖凝胶柱色谱，以体积比为1：1的二氯甲烷/甲醇洗脱，最后经液相色谱制备，得到滇南羊耳菊内酯A。
5.一种如权利要求1所述的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝肿瘤、胃肿瘤、前列腺肿瘤、白血病、鼻咽肿瘤。
7.根据权利要求5或6所述的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，该抗肿瘤药物是由滇南羊耳菊内酯A或其衍生物作为活性成分与常规药用载体制成的药物组合物。
8.根据权利要求5或6所述的滇南羊耳菊内酯A及其衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物是片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂。
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