CN103655625B - 林蛙提取液在制备治疗及预防宫颈癌的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及林蛙提取液在制备治疗及预防宫颈癌的药物中的用途，提供了林蛙提取液新的医用用途，利用林蛙提取液对的抑制和消炎抗菌作用，对由SiHa细胞及Caski细胞引起的宫颈癌进行治疗及预防；本发明还可改变细菌细胞膜的通透性，且其不易产生耐药性；选用纯生物制剂，毒副作用小，标本兼治，疗效显著，临床症状消失迅速，还可起到预防效果。

Description

林蛙提取液在制备治疗及预防宫颈癌的药物中的用途

技术领域

本发明涉及林蛙提取液在制备治疗及预防宫颈癌的药物中的用途，以及一种治疗及预防宫颈癌的林蛙提取液软膏剂，属于医学生物制药技术领域。

背景技术

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。每年大约有47万左右宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的5%，并有23万人死于该病，其中80%的病例发生在发展中国家。目前研究己确认高危型人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是宫颈癌形成最重要的危险因子，在99.7%的浸润性宫颈癌中可以检测到它的存在。现已确认有超过200种HPV，其中大约有30种型别在子宫颈癌中被发现，根据HPV亚型与宫颈癌的相关性可将HPV分为高危型和低危型。公认的高危型有16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82型等，其中HPV16是子宫颈癌患者最常见的感染型别(58.9%)，其次分别依次为HPV18(15.0%)，HPV45(5.9%)，HPV31(4.3%)，HPV33(3.0%)，HPV52(2.3%)，HPV58(1.2%)，HPV35(0.3%)等等。

目前的治疗方法主要有物理治疗及药物治疗。物理治疗主要是采用激光、微波、冷冻、电灼、手术切除（妇科的LEEP刀等）、光动力疗法等，缺点是治疗深度需要熟练的操作者控制，伤口深愈合慢，尤其在外生殖器部位，伤口易出血、易感染、易复发，有时还会在病灶周围形成自体种植。药物治疗采用的药物大部分具有一定腐蚀性，需要保护好周围正常组织，否则易形成周围正常组织的种植。不太适合粘膜疣的应用；腐蚀性不大的药物用药时间长，有一定的刺激性，也可以出现皮肤的浅糜烂面。目前治疗HPV感染的药物无确切疗效，疫苗大规模投入临床使用尚需时日，研制开发抗HPV药物对于宫颈癌的防治具有重大意义。

本发明治疗及预防由宫颈癌SiHa细胞及Caski细胞引起的宫颈癌。经检索未见林蛙提取液治疗及预防宫颈癌的药物中的应用。

发明内容

本发明公开了林蛙提取液在制备治疗及预防宫颈癌的药物中的用途。

本发明的技术解决方案如下：

本发明所述林蛙提取液是按照下述方法制备的：

将林蛙干粉碎后，加入到1-10%醋酸中，醋酸与林蛙干的体积重量比（ml/g）为1:1-30:1（即1g林蛙干加入1-30ml醋酸），超声提取，过滤，离心，得到林蛙提取液。

优选的，超声时间为：10-80min，超声温度为-4-30℃，离心温度为-4-30℃，离心时间为5-60min，离心转速为2000-15000rpm。

本发明中由林蛙提取液制备成的治疗或预防宫颈癌的药物的用法为外用阴道给药。

所述林蛙提取液可以与药学上可接受的载体或赋形剂形成药物制剂，所述制剂可以为喷雾剂、气雾剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂、栓剂或湿巾等。

本发明提供一种治疗及预防宫颈癌的林蛙提取液软膏剂，其特征在于有以下原料按重量份数比制成的：

林蛙干10-75份，石蜡6-35份，液体石蜡5-45份，白凡士林5-40份，单硬脂酸甘油酯5-80份，司盘401-35份，乳化剂OP2-15份，对羟基苯甲酸乙酯1-8份，冰片5-20份。

本发明所提供所述治疗及预防宫颈癌的林蛙提取液软膏剂的制备方法，其包括如下步骤：

（1）林蛙提取液的制备：称取林蛙干粉碎后，加入1-30倍体积（ml：g）的1-10%醋酸超声提取10-80min，超声温度为-4-30℃；过滤，离心，离心温度为-4-30℃，离心时间为5-60min，离心转速为2000-15000rpm，得林蛙提取液；

（2）油相的制备：取石蜡、单硬脂酸甘油脂、白凡士林、液体石蜡、司盘40、乳化剂OP、对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相；

（3）林蛙提取液软膏剂的制备：将步骤（2）制得的油相与林蛙提取液分别加热至70-100℃，将林蛙提取液加入到所述油相中，边加边搅拌至冷凝，115℃灭菌10min，冰片加热到70-100℃过膜，无菌条件下混合均匀，分装。

本发明的积极效果在于：提供了林蛙提取液新的医用用途，利用林蛙提取液对的抑制和消炎抗菌作用，对由SiHa细胞及Caski细胞引起的宫颈癌进行治疗及预防；本发明还可改变细菌细胞膜的通透性，且其不易产生耐药性；选用纯生物制剂，毒副作用小，标本兼治，疗效显著，临床症状消失迅速，还可起到预防效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。本发明所用林蛙干产自是我国东北地区长白山麓。中国林蛙(Ranatemporariachensinensis)俗称田鸡、哈士蟆、雪哈等，在动物分类上属两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属，是我国东北地区长白山麓的特有品种，属于药、食两用的珍贵蛙种，并且资源丰富。

实施例1林蛙提取液的制备

取林蛙干15g（中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房）粉碎后，加入20倍体积（ml：g）的9%醋酸300ml；超声提取，超声时间为10min，超声温度为18℃；超声后进行过滤，离心，离心温度为4℃，离心时间为16min，离心转速为5500rpm，得林蛙提取液。

实施例2林蛙提取液软膏剂的制备

处方组成（按重量份）：林蛙干24份、石蜡17份，液体石蜡45份，白凡士林18份，单硬脂酸甘油酯34份，司盘4029份，乳化剂OP6份，对羟基苯甲酸乙酯3份，冰片7份。

制备方法：

（1）林蛙提取液的制备：称取林蛙干20g（中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房）粉碎后，加入25倍体积（ml：g）的7%醋酸超声500ml；超声提取，超声时间为60min，超声温度为4℃；超声后进行过滤，离心，离心温度为4℃，离心时间为5min，离心转速为4000rpm，得林蛙提取液；

（2）油相的制备：取石蜡、单硬脂酸甘油脂、白凡士林、液体石蜡、司盘40、乳化剂OP、对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相；

（3）林蛙提取液软膏剂的制备：将步骤（2）制得的油相与林蛙提取液分别加热至90℃，将林蛙提取液加入到所述油相中，边加边搅拌至冷凝，115℃灭菌10min，冰片加热到90℃过膜，无菌条件下混合均匀，分装，即可。

实施例3林蛙提取液软膏剂的制备

处方组成（按重量份）：林蛙干36份、石蜡14份，液体石蜡39份，白凡士林22份，单硬脂酸甘油酯37份，司盘4029份，乳化剂OP3份，对羟基苯甲酸乙酯4份，冰片8份。

制备方法：

（1）林蛙提取液的制备：取林蛙干26g（中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房）粉碎后，加入15倍体积（ml：g）的6%醋酸390ml；超声提取，超声时间为16min，超声温度为28℃；超声后进行过滤，离心，离心温度为28℃，离心时间为40min，离心转速为8000rpm，得林蛙提取液；

（2）油相的制备：取石蜡、单硬脂酸甘油脂、白凡士林、液体石蜡、司盘40、乳化剂OP、对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相；

（3）林蛙提取液软膏剂的制备：将步骤（2）制得的油相与林蛙提取液分别加热至90℃，将林蛙提取液加入到油相中，边加边搅拌至冷凝，115℃灭菌10min，冰片加热到90℃过膜，无菌条件下混合均匀，分装，即可。

实施例4林蛙提取液软膏剂的制备

处方组成（按重量份）：林蛙干62份、石蜡15份，液体石蜡43份，白凡士林29份，单硬脂酸甘油酯19份，司盘4021份，乳化剂OP8份，对羟基苯甲酸乙酯1份，冰片3份。

制备方法：

（1）林蛙提取液的制备：取林蛙干20g（中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房）粉碎后，加入13倍体积（ml：g）的4%醋酸260ml，超声提取，超声时间为20min，超声温度为17℃；超声后进行过滤，离心，离心温度为4℃，离心时间为35min，离心转速为4000rpm，得林蛙提取液；

（2）油相的制备：取石蜡、单硬脂酸甘油脂、白凡士林、液体石蜡、司盘40、乳化剂OP、对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相；

（3）林蛙提取液软膏剂的制备：将步骤（2）得到的油相与林蛙提取液分别加热至60℃，将林蛙提取液加入到油相中，边加边搅拌至冷凝，115℃灭菌10min，冰片加热到60℃过膜，无菌条件下混合均匀，分装，即可。

实施例5林蛙提取液喷雾剂的制备

处方组成（按重量份）：林蛙干67份、氯化钠18份PEG₄₀₀29份，苯扎溴铵4份。

制备方法：

（1）林蛙提取液制备：取林蛙干30g（中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房）粉碎后，加入16倍体积（ml：g）的2%醋酸480ml，超声提取，超声时间为48min，超声温度为16℃；超声后进行过滤，离心，离心温度为10℃，离心时间为5min，离心转速为4000rpm，得林蛙提取液；

（2）林蛙提取液喷雾剂的制备：加入PEG4₄₀₀、氯化钠、苯扎溴铵，混匀，115℃灭菌10min。冷却，分装入气雾剂瓶，即得。

实施例6林蛙提取液栓剂的制备

处方组成（按重量份）：林蛙干37份、β-CD包合物10份、半合成脂肪酸甘油酯21份，酒精1份，甘油1份。

制备方法：

第一步：林蛙提取液制备，取林蛙干40g（中国林蛙长白山亚种，购自吉林大药房）粉碎后，加入14倍体积（ml：g）的6%醋酸560ml，超声提取，超声时间为19min，超声温度为10℃；超声后进行过滤，离心，离心温度为15℃，离心时间为17min，离心转速为4600rpm，得林蛙提取液；

第二步：取8gβ-CD包合物加入240ml水中混合，于60℃水浴中研成糊状，加入林蛙提取液，充分研磨，于恒温干燥器中干燥，得到林蛙提取液包合物；

第三步：取20g半合成脂肪酸甘油酯置蒸发皿中，于水浴上加热，使其充分融熔制得均匀的基质溶液；

第四步：将第二步所得林蛙提取液包合物及适量双蒸水混合均匀，然后在搅拌下将其加入到第三步的基质溶液中，加入石蜡，搅匀，趁热注入已涂有酒精、甘油等润滑剂的栓模中，冷却，削去模口溢出部分，脱模，即得栓剂。

试验例1

林蛙提取液治疗宫颈癌体外实验

1.实验原理

MTT法生物活性测试又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。本实验根据光密度值的变化观察样品对宫颈癌细胞的抑制作用。

2.实验材料

（1）细胞系

Caski细胞，HPV16阳性的人宫颈癌细胞株，由吉林大学基础医学院提供。细胞在含5%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃，5%CO₂的饱和湿度二氧化碳培养箱中培养，细胞接种密度均为：100ml培养瓶，10.0×10⁴/10ml；6孔培养板，3.0×10⁴/10ml；24孔培养板，1.0×10⁴/1ml；96孔培养板，0.2×10⁴/0.2ml。

SiHa细胞株为人宫颈癌细胞，香港大学馈赠。悬浮生长于RPMI-1640培养液中，内含10%小牛血清，1mmol/L谷胺酞胺及100U/ml青霉素、100μg/m1链霉素。于37℃，5%CO₂的饱和湿度二氧化碳培养箱中培养，每2-3天换液传代一次。

（2）主要试剂及仪器

RPMI-1640培养基(赛默飞世尔科技有限公司)，青霉素、链霉素(华北制药厂)，小牛血清、胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，台盼蓝(美国Sigma公司)；超净工作台（上海智城有限公司，ZHJH-C1109C)，二氧化碳培养箱(日本SANYO，MCO-18AIC)，倒置相差显微镜(德国Olympus，CKX41)，全自动酶联免疫检测仪(美国BioTek，Gen5)，细胞培养板及血球计数板。

（3）林蛙提取液

林蛙提取液为实施例1制备得到的林蛙提取液。

3.试验方法及结果

以培养液作为对照，取对数生长期的细胞，将Caski、SiHa细胞接种于6板96孔细胞培养板，每孔加100μl细胞悬液（细胞数量控制在2~5×10³个细胞/孔），第二天更换为含林蛙提取液的培养基，培养基所含林蛙提取液的浓度分别为5mg/l、10mg/l、20mg/l，每孔加入药液100μl，并设正常对照，每个浓度平行12孔。培养板置于二氧化碳培养箱中，37℃5%CO₂培养24h，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，生理盐水配制），继续培养4h，弃上清液，每孔加入DMSO150μl，37℃放置20min，缓慢震荡，待蓝紫色结晶完全溶解后用酶标仪于波长570nm下测定OD值，并计算抑制率；连续6天测点做生长曲线。结果见表1。

细胞抑制率（%）=（正常OD值－加药组OD值/正常OD值）×100%

表1本发明对于Caski、SiHa细胞抑制率统计表

由表1可以看出，MTT检测发现不同浓度林蛙提取液对宫颈癌细胞Caski、SiHa细胞均有生长抑制作用，随着作用时间以及药物浓度增加作用越明显。

试验例2

林蛙提取液治疗宫颈癌体内实验

1.实验材料

（1）细胞系

Caski细胞，HPV16阳性的人宫颈癌细胞株，由吉林大学基础医学院提供。细胞在含5%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃，5%CO₂的饱和湿度二氧化碳培养箱中培养，细胞接种密度均为：100ml培养瓶，10.0×10⁴/10ml；6孔培养板，3.0×10⁴/10ml；24孔培养板，1.0×10⁴/1ml；96孔培养板，0.2×10⁴/0.2ml。

SiHa细胞株为人宫颈癌细胞，本实验室冻存。悬浮生长于RPMI-1640培养液中，内含10%小牛血清，1mmol/L谷胺酞胺及100U/ml青霉素、100μg/m1链霉素。于37℃，5%CO₂的饱和湿度二氧化碳培养箱中培养，每2-3天换液传代一次。

（2）实验动物

雌性裸鼠(由吉林大学实验动物中心提供)，动物使用许可证号：第2007000544675号。

（3）主要试剂及仪器

RPMI-1640培养基(赛默飞世尔科技有限公司)，青霉素、链霉素(华北制药厂)，小牛血清、胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，台盼蓝(美国Sigma公司)；超净工作台（上海智城有限公司，ZHJH-C1109C)，二氧化碳培养箱(日本SANYO，MCO-18AIC)，倒置相差显微镜(德国Olympus，CKX41)，全自动酶联免疫检测仪(美国BioTek，Gen5)，细胞培养板及血球计数板。

（4）林蛙提取液

林蛙提取液为实施例1制备得到的林蛙提取液。

2.试验方法及结果

细胞培养：Caski、SiHa细胞长至80%融合时进行实验。

体内试验：Caski、SiHa细胞常规传代培养，收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，按照2×10⁶个/只(即0.2ml/只)于实验动物左前肢皮下接种，为种鼠。2周后，选择肿瘤生长旺盛且无溃破、健康情况良好的荷瘤种鼠，脱颈处死，在无菌条件下剥取肿瘤，剔除坏死组织后称重，按照1:3的比例加入生理盐水用组织匀浆器研磨成单细胞悬液。随后将瘤细胞悬液接种于实验动物右前肢皮下，0.2ml/只。次日将实验动物随机分为林蛙提取液大剂量组、林蛙提取液中剂量组、林蛙提取液小剂量组、阳性对照组和阴性对照组。

给药方案：

口服给药组：每组10只，灌胃林蛙提取液高、中、低剂量组分别为：40mg/kgb.wt.、20mg/kgb.wt.、10mg/kgb.wt.；阳性对照组为环磷酞胺6.0mg/kgb.wt.；阴性对照组为生理盐水0.lml/kgb.wt.。每天一次，连续5天。

注射组：每组10只，尾静脉给药，林蛙提取液高、中、低剂量组分别为：40mg/kgb.wt.、20mg/kgb.wt.、10mg/kgb.wt.；阳性对照组为环磷酞胺4.0mg/kgb.wt.；每天给药1次，连续给药5天。

每2日记录体重1次并测量肿瘤大小。待阴性对照组瘤重约为lg时将动物处死，解剖分别取其肿瘤、肺、心、肝、肾等器官(组织)并称重。计算各器官的脏器系数，按下列公式计算肿瘤抑制率(抑瘤率)，并进行组间t检验；

抑瘤率=（W_{阴性对照组平均瘤重}－W_{给药组平均瘤重}）/W_{阴性对照组平均瘤重}×100%

实验结果如表2-3所示。

注：与阴性对照组比较**P<0.01

试验例3

林蛙提取液预防宫颈癌体内实验

1.实验材料

（1）细胞系

Caski细胞，HPV16阳性的人宫颈癌细胞株，由吉林大学基础医学院提供。细胞在含5%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃，5%CO₂的饱和湿度二氧化碳培养箱中培养，细胞接种密度均为：100ml培养瓶，10.0×10⁴/10ml；6孔培养板，3.0×10⁴/10ml；24孔培养板，1.0×10⁴/1ml；96孔培养板，0.2×10⁴/0.2ml。

SiHa细胞株为人宫颈癌细胞，本实验室冻存。悬浮生长于RPMI-1640培养液中，内含10%小牛血清，1mmol/L谷胺酞胺及100U/ml青霉素、100μg/m1链霉素。于37℃，5%CO₂的饱和湿度二氧化碳培养箱中培养，每2-3天换液传代一次。

（2）实验动物

雌性裸鼠(由吉林大学实验动物中心提供)，动物使用许可证号：第2007000544675号。

（3）主要试剂及仪器

RPMI-1640培养基(赛默飞世尔科技有限公司)，青霉素、链霉素(华北制药厂)，小牛血清、胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，台盼蓝(美国Sigma公司)；超净工作台（上海智城有限公司，ZHJH-C1109C)，二氧化碳培养箱(日本SANYO，MCO-18AIC)，倒置相差显微镜(德国Olympus，CKX41)，全自动酶联免疫检测仪(美国BioTek，Gen5)，细胞培养板及血球计数板。

（4）林蛙提取液

林蛙提取液为实施例1制备得到的林蛙提取液。

2.试验方法及结果

细胞培养：Caski、SiHa细胞长至80%融合时进行实验。

预防宫颈癌给药方案：

口服给药组：每组10只，灌胃林蛙提取液高、中、低剂量组分别为：40mg/kgb.wt.、20mg/kgb.wt.、10mg/kgb.wt.；阳性对照组为环磷酞胺6.0mg/kgb.wt.；阴性对照组为生理盐水0.lml/kgb.wt.。每天一次，连续30天。

注射组：每组10只，尾静脉给药，林蛙提取液高、中、低剂量组分别为：40mg/kgb.wt、20mg/kgb.wt、10mg/kgb.wt；阳性对照组为环磷酞胺4.0mg/kgb.wt；每天给药1次，连续给药30天。

体内试验：Caski、SiHa细胞常规传代培养，收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，按照2×10⁶个/只(即0.2ml/只)于实验动物左前肢皮下接种，为种鼠。2周后，选择肿瘤生长旺盛且无溃破、健康情况良好的荷瘤种鼠，脱颈处死，在无菌条件下剥取肿瘤，剔除坏死组织后称重，按照1:3的比例加入生理盐水用组织匀浆器研磨成单细胞悬液。随后将瘤细胞悬液接种于进行预防宫颈癌给药各组实验动物右前肢皮下，0.2ml/只。

每2日记录体重1次并测量肿瘤大小。待阴性对照组瘤重约为lg时将动物处死，解剖分别取其肿瘤、肺、心、肝、肾等器官(组织)并称重。计算各器官的脏器系数，按下列公式计算肿瘤抑制率(抑瘤率)，并进行组间t检验；实验结果如表4-5所示。

。

试验例4

林蛙提取液制备的药物制剂的抗炎实验

一、对大鼠蛋清性关节炎的影响实验

1.实验材料

实验药物：本发明实施例2、实施例3、实施例4制备的林蛙软膏剂(每次用量为1ml，每毫升林蛙软膏剂含有0.5ml林蛙提取液)；实施例6制备的林蛙栓剂(每次用量为1.5g/粒，每粒含有0.5ml林蛙提取液)；康妇特栓，剂量2.0g/粒，含生药0.5g/粒，太阳石药业有限公司生产。

实验动物：雌性Wistar大鼠60只，体重130-150g，由吉林大学实验动物中心提供。

2.实验方法及结果

将60只雌性Wistar大鼠随机分为6组：阴性对照组为空白栓剂，阳性对照组为康妇特栓，实验组分别为实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例6组、实验各组均阴道给药。实施例6组、阴性对照组、阳性对照组每次给药一枚，实施例2组、实施例3组、实施例4组每次给药2ml，隔日一次，共10次。于末次给药后30分钟开始造模，10%蛋清生理盐水0.05ml注入每只大鼠右后足部，于不同时间测量左右后足关节周长，差值为肿胀度。分别记录给药0.5、1、2、3、4、5、6小时足关节周长。结果见表6。

注：与康妇特栓组比较^★P<0.05^★★P<0.01；与阴性对照组比较*P<0.05**P<0.01

二、对大鼠角叉采胶足踌肿的影响实验

1.实验材料

实验药物：本发明实施例2、实施例3、实施例4制备的林蛙软膏剂(每次用量为1ml，每毫升林蛙软膏剂含有0.5ml林蛙提取液)；实施例6制备的林蛙栓剂(每次用量为1.5g/粒，每粒含有0.5ml林蛙提取液)；康妇特栓，剂量2.0g/粒，含生药0.5g/粒，太阳石药业有限公司生产。

实验动物：雌性Wistar大鼠60只，体重130-150g，由吉林大学实验动物中心提供。

2.实验方法及结果

将60只雌性Wistar大鼠随机分为6组：阴性对照组为空白栓剂，阳性对照组为康妇特栓，实验组分别为实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例6组、实验各组均阴道给药。实施例6组、阴性对照组、阳性对照组每次给药一枚，实施例2组、实施例3组、实施例4组每次给药2ml，隔日一次，共10次。于末次给药后30分钟开始造模，1%角叉采胶生理盐水0.05ml注入每只大鼠右后足跖皮下，于不同时间测量左右后肢踝关节周长，差值为肿胀度。分别记录给药0.5、1、2、3、4、5、6小时足关节周长。

结果见表7。

注：与康妇特栓组比较^★P<0.05^★★P<0.01；与阴性对照组比较*P<0.05**P<0.01

大部分宫颈癌是由于长期宫颈糜烂所引起的，宫颈糜烂主要是宫颈部位受炎症侵蚀，通过大鼠的抗炎实验——蛋清性关节炎和角叉采胶足踌肿，来检验林蛙提取液在治疗及预防宫颈癌中的作用。实验结果表明，林蛙提取液能具有良好的预防和抑制人宫颈癌细胞生长的效应和抗击引起宫颈癌的人乳头瘤病毒和相关细菌的攻击方面的作用。对比临床现有治疗方法，林蛙提取液用于治疗宫颈癌，不仅疗效显著，而且因为毒副作用极低，对机体综合改善良好，更有利于患者全身机能恢复，便于患者长期使用，而林蛙提取液在对宫颈癌的预防和治疗方面的功效和用途目前尚未见有文献报道。

试验例5

林蛙提取液制备的药物制剂的安全性试验

试验材料：家兔1.8-2.2kg，小鼠15-20g，雌雄各半。

（一）皮肤刺激性试验

取健康家兔每10只为一组，设置多组实验，使用实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6制得药物制剂及康妇特栓制成药液进行皮肤刺激性试验；家兔的皮肤给药前24小时将家兔背部二侧皮肤去毛约表面积的10%。将取实施例2、实施例3、实施例4、实施例5各2ml，加生理盐水制成20ml药液；取实施例6药物1枚（1.5g/粒），溶解后制成20ml药液；取康妇特栓1枚制成20ml药液；分别涂在各组的家兔的皮肤上，1小时，24小时，48小时检查药物对家兔皮肤的刺激反应，结果见表8-9。

表8皮肤刺激性试验红斑产生结果

红斑反应级数	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6	康妇特栓	正常对照组
								0无红斑的完整皮肤	10	10	10	10	10	9	10
1 轻微红斑	0	0	0	0	0	1	0
								2 中度红斑	0	0	0	0	0	0	0
3 重度红斑	0	0	0	0	0	0	0
								4 重度红斑至轻度焦痂	0	0	0	0	0	0	0

表9皮肤刺激性试验水肿产生结果

水肿反应级数	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6	康妇特栓	正常对照组
								0无水肿的完整皮肤	10	10	10	10	10	9	10
1 轻度水肿（勉强可见）	0	0	0	0	0	1	0
								2 轻微水肿（隆起轮廓清晰）	0	0	0	0	0	0	0
3中度水肿	0	0	0	0	0	0	0
								4 重度水肿	0	0	0	0	0	0	0

综合以上结论可以知道林蛙提取液在减少刺激性方面效果均佳。

（二）皮肤变态反应试验

取健康小鼠每20只为一组,设置多组实验，把实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的药物制剂制成药液；小鼠的皮肤给药前24小时将小鼠背部二侧皮肤去毛约表面积的10%，取实施例2、实施例3、实施例4、实施例5各1ml，加生理盐水制成2ml药液；取实施例6药物1枚（1.5g/粒），溶解后制成20ml药液；取康妇特栓1枚制成20ml药液；分别涂在各组的小鼠皮肤上，每日给药3次，连续给药60天，检查药物对小鼠皮肤变态反应。与正常对照组比较，各组均无皮肤变态现象出现。

（三）致畸试验

取健康小鼠每20只为一组，设置多组实验，使用实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6制得的药物制剂，进行致畸试验。小鼠的皮肤给药前24小时将小鼠背部二侧皮肤去毛约表面积的10%，取实施例2、实施例3、实施例4、实施例5各1ml，加生理盐水制成2ml药液；取实施例6药物1枚（1.5g/粒），溶解后制成20ml药液；取康妇特栓1枚制成20ml药液；分别涂在各组的小鼠皮肤上，每日给药3次，连续给药90天，各组小鼠进行交配，检查所生仔鼠各项生理指标，与正常对照组比较，各组仔鼠生理指标正常，药物对实验动物无致畸影响。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (3)

1.林蛙提取液在制备治疗及预防由Caski或SiHa细胞引起宫颈癌的药物中的用途；

所述林蛙提取液的制备工艺如下：

称取林蛙干，加入1-10%醋酸超声提取，过滤，离心，得林蛙提取液；所述1-10%醋酸与林蛙干的体积重量比为1g林蛙干加入1-30ml醋酸。

2.一种治疗及预防由Caski或SiHa细胞引起宫颈癌的林蛙提取液软膏剂，其特征在于由以下原料按重量份数比制成的：

林蛙干10-75份，石蜡6-35份，液体石蜡5-45份，白凡士林5-40份，单硬脂酸甘油酯5-80份，司盘401-35份，乳化剂OP2-15份，对羟基苯甲酸乙酯1-8份，冰片5-20份。

3.根据权利要求2所述的治疗及预防由Caski或SiHa细胞引起宫颈癌的林蛙提取液软膏的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1）称取林蛙干，加入1-10%醋酸超声提取，过滤，离心，得林蛙提取液；所述1-10%醋酸与林蛙干的体积重量比（ml：g）为林蛙干1加入醋酸1-30；

2）油相的制备：取石蜡、单硬脂酸甘油脂、白凡士林、液体石蜡、司盘40、乳化剂OP、对羟基苯甲酸乙酯研磨混匀，得到油相；

3）林蛙提取液软膏剂的制备：将步骤2）制得的油相与林蛙提取液分别加热至70-100℃，将林蛙提取液加入到所述油相中，边加边搅拌至冷凝，115℃灭菌10min，冰片加热到70-100℃过膜，无菌条件下混合均匀，分装。