CN109568385A - 一种青钱柳提取物在制备乳腺癌药物或保健品中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种青钱柳提取物在制备乳腺癌药物或保健品中的应用，属于医药和保健品领域。针对目前治疗乳腺癌的中药治疗效果差的问题，本发明通过如下方法获得了一种青钱柳提取物：(1)青钱柳叶粉碎后，过30‑1000目筛，按照料液比为(1:5)‑(1:60)(g/mL)的比例，加入体积浓度为20％‑80％的乙醇溶液或水，在60℃‑90℃下，超声波提取获得提取液。(2)提取液离心后获得上清液，经冷冻干燥得到青钱柳提取物。所述青钱柳提取物可抑制乳腺癌细胞生长，可用于制备防治乳腺癌的药物或保健食品。

Description

一种青钱柳提取物在制备乳腺癌药物或保健品中的应用
技术领域
本发明涉及医药和保健品领域，具体涉及一种青钱柳提取物在制备乳腺癌药物或保健品中的应用。
背景技术
乳腺癌的外科治疗历史久远。乳腺癌是一全身性疾病,其生物学特性之一是早期可以发生隐匿性转移病灶,往往经过数年或更长时间,病灶发展。基于这一特点,为了提高乳腺癌患者的生存率和生活质量,乳腺癌治疗概念和模式逐渐改变。放射治疗、化学治疗、内分泌治疗、免疫生物学治疗和各种支持疗法的介入,单一手术模式逐渐被综合疗法所取代。在各种恶性肿瘤中,乳腺癌是疗效比较好的一种,然而总的生存率仍然不能令人满意。
目前市场上治疗乳腺癌的药物种类繁多，西药副作用大，现有的中药效果并不太显著。青钱柳茶是一种养生保健茶，很多研究发现青钱柳中多种有效成分对降血糖、降血脂、降血压等慢性病有一定的功效。而青钱柳对于乳腺癌防治的功效未有文献和专利报道过。
青钱柳是我国特有的药食同源的珍稀植物,而且是一种极具开发潜力的药用植物。由于其广泛的应用和良好的安全性已得到美国食品与药品管理局(FDA)颁发的质量证书，是中国第一款获得美国FDA承认的养生保健茶，作为一种具有悠久历史的养生保健产品正逐渐在市场上兴起。目前，对青钱柳和降血糖、降血脂等方面的研究已经取得了一定的成果，尤其在降血糖方面有其独特的作用。而对于青钱柳的其他药用价值研究甚至更少。对青钱柳进行进一步的化学成分和药理作用研究,弄清其确切的物质基础和作用机制对青钱柳的综合利用和市场开发都有重要意义。
发明内容
针对目前治疗乳腺癌的中药治疗效果差的问题，本发明提供了一种青钱柳提取物在制备乳腺癌药物或保健品中的应用。
进一步地限定，所述青钱柳提取物的制备方法如下：
(1)青钱柳叶粉碎后，按照料液比为(1:5)-(1:60)(g/mL)的比例，加入体积浓度为20％-80％的乙醇溶液或水，在60℃-90℃下，超声波提取获得提取液；
(2)提取液离心后获得上清液，经浓缩后冷冻干燥得到青钱柳提取物。
进一步地限定，步骤1)所述青钱柳叶粉碎后过30-1000目筛。
进一步地限定，步骤1)所述超声波提取的功率为50-300w，提取时间为1-4小时。
更进一步地限定，步骤1)所述超声波提取2-4次，然后合并每次提取液。
进一步地限定，步骤1)所述青钱柳叶为新叶、老叶或落叶。
进一步地限定，步骤2)所述离心是指4000r/min，离心10min。
进一步地限定，步骤2)所述冷冻干燥是指在-20℃～-50℃下，干燥12h-48h。
进一步地限定，将所述青钱柳提取物作为活性成分，辅以可用于药物或保健品的附加剂制备成防治乳腺癌的药物或保健品。
进一步地限定，所述防治乳腺癌的药物为固体制剂或液体制剂，所述固体制剂为颗粒剂、片剂、滴丸剂、粉针剂或胶囊；所述液体制剂为口服液或饮料。
有益效果
本发明采用青钱柳叶为原料，通过对青钱柳的有效成分进行提取，通过青钱柳的体内外药效研究，发现青钱柳对于乳腺癌有抑制作用，该有效成分可用于制备防治乳腺癌的药物或保健食品，扩展了青钱柳茶的应用领域，助力了相关产业的发展。
目前市场上治疗乳腺癌的药物种类繁多，西药副作用大，现有的中药效果并不太显著。青钱柳茶作为一种保健饮品，有长期的应用历史，安全毒副作用小，还具有防治乳腺癌的效果，可以作为一种保健饮品或被开发成相关药物。
附图说明
图1EMT6肿瘤在小鼠体内的生长曲线图，横坐标为时间(天)，纵坐标为肿瘤体积(mm3)。
具体实施方式
本发明所用的人乳腺癌细胞MCF-7购买自中国科学院细胞库。
小鼠乳腺癌细胞EMT6细胞株购买自中国科学院细胞库。
小鼠，6-8周龄，雌雄各半，购自金华市药检所下属实验动物中心。
完全培养基配方为：RPMI-1640(购自GIBCO公司)+质量分数10％胎牛血清(购自杭州四季青生物工程材料有限公司)+质量分数1％双抗溶液(含链霉素10000ug/ml、青霉素10000IU/ml；购自GIBCO公司)所述成分含量为在完全培养基中的终含量。
实施例1：青钱柳提取物的制备。
(1)青钱柳新叶洗净风干后粉碎、过30目筛，置于提取容器中，加入蒸馏水，料液比为1:60(g/mL)，在90℃下，超声波提取4次，提取功率为50W。每次提取1小时，将提取液合并得到提取液A。
(2)提取液A经4000r/min，离心10分钟，得到上清液即提取液B，B经过减压浓缩后，冷冻干燥(-20℃，12h)得到青钱柳提取物。以提取物干重计算提取率，提取率为3.81％。
实施例2：青钱柳提取物的制备。
(1)青钱柳新叶洗净风干后粉碎、过100目筛，置于提取容器中，加入体积浓度为20％的乙醇，料液比为1:5(g/mL)，在60℃下，超声波提取2次，提取功率为300W。每次提取1小时，将提取液合并得到提取液A。
(2)提取液A经4000r/min，离心10分钟，得到上清液即提取液B，B经过减压浓缩后，冷冻干燥(-40℃，24h)得到青钱柳提取物。以提取物干重计算提取率，提取率为3.22％。
实施例3：青钱柳提取物的制备。
(1)青钱柳新叶洗净风干后粉碎、过200目筛，置于提取容器中，加入体积浓度为60％的乙醇溶液，料液比为1:30(g/mL)，在80℃下，超声波提取4次，提取功率为200W。每次提取2小时，将提取液合并得到提取液A。
(2)提取液A经4000r/min，离心10分钟，得到上清液即提取液B，B经过减压浓缩后，冷冻干燥(-50℃，12h)得到青钱柳提取物。以提取物干重计算提取率，提取率为6.81％。
实施例4：青钱柳提取物的制备。
(1)青钱柳新叶洗净风干后粉碎、过1000目筛，置于提取容器中，加入体积浓度为80％的乙醇溶液，料液比为1:10(g/mL)，在80℃下，超声波提取2次，提取功率为150W。每次提取4小时，将提取液合并得到提取液A。
(2)提取液A经4000r/min，离心10分钟，得到上清液即提取液B，B经过减压浓缩后，冷冻干燥(-40℃，48h)得到青钱柳提取物。以提取物干重计算提取率，提取率为5.34％。
考察青钱柳提取物对乳腺癌细胞生长的抑制作用。
一、肿瘤细胞的体外培养
细胞复苏：取出-80℃下冻存的人乳腺癌细胞MCF-7、小鼠乳腺癌细胞EMT6细胞株，快速置于37℃水浴锅中融化，在无菌条件下接种于盛有完全培养基的离心管中1000r/min，离心5min去除上清液，用完全培养基(含质量分数10％FBS+质量分数1％双抗)悬浮后转移至含有完全培养基的细胞培养瓶中，所述双抗为链霉素(100ug/ml)和青霉素(100IU/ml)。将培养瓶放置在37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱进行培养。
细胞传代：在倒置显微镜下观察到培养瓶内细胞密度达到90％及上时可进行传代。把原有培养基吸掉，用PBS洗涤1-2次，加适当的胰蛋白酶(覆盖细胞)，置于培养箱中，消化1-2分钟；细胞变圆后加入适量完全培养基，终止消化。将细胞收集到离心管中，1000r/min，离心5分钟，弃去上清液。加入适量PBS洗涤，相同条件下再次离心，弃上清，加完全培养基，用移液管轻轻吹打混匀，计数后以1×106/mL的活细胞密度接种到新的培养瓶中，置培养箱中继续培养。
二、青钱柳提取物抑制乳腺癌细胞生长
取指数期生长的MCF-7、EMT6细胞，调节细胞的浓度为5×104个/mL，最后将调节好浓度的细胞悬液接种于96孔板，每孔100μL。采用MTT法测定青钱柳提取物体外抗癌活性，具体方法参照万文婷,李宁,刘静,金林红.CCK-8法与MTT法检测人前列腺癌PC3细胞活性的比较研究[J].时珍国医国药,2010,21(12):3046-3048.中“2方法”部分。测定浓度范围为0-500mg/mL，处理时间为72h，根据MTT法测得的OD值计算IC50。结果见表1。
表1青钱柳提取物对乳腺癌肿瘤细胞的IC50(μg/mL)(M±SE)
MCF-7细胞 EMT6细胞
青钱柳水提取物(实施例1) 56.1ug/mL 70.6ug/mL
青钱柳醇提取物(实施例3) 90.8ug/mL 121.3ug/mL
注：M-算数平均数，SE标准误差。
由IC50实验结果可知，不同溶剂提取的青钱柳提取物在体外可抑制乳腺癌细胞生长，而且不同的细胞系之间对青钱柳提取物敏感性明显不同。
三、建立EMT6乳腺肿瘤模型实验动物模型
取在倒置显微镜下观察细胞生长良好的对数生长期EMT6细胞，加入适量质量分数为0.25％胰蛋白酶(覆盖细胞)，消化1-2min，通过显微镜观察细胞收缩变圆后加入完全培养基(含质量分数10％FBS+质量分数1％双抗)终止消化，所述双抗为链霉素(100ug/ml)和青霉素(100IU/ml)，轻轻吹打使细胞分散，收集培养瓶中液体于离心管中1000r/min，离心5min去除上清液，用完全培养基(含质量分数10％FBS+质量分数1％双抗)吹打混匀。细胞板计数用完全培养基调整活细胞浓度1×107个/mL。每只小鼠后肢腋下注射0.2mL细胞悬液，待小鼠腋下瘤块达到0.5cm*0.5cm时即为造模成功。待肿瘤长到一定大小时，取出小鼠腋下瘤块将肿瘤组织剪成小块后，用玻璃匀浆器匀浆后，200目筛网过滤，收集滤液，活细胞计数，PBS稀释后用注射器接种，三代后用于评价青钱柳提取物的抗肿瘤效果。
四、青钱柳提取物对小鼠EMT6乳腺肿瘤的治疗效果
将上述造模成功小鼠随机分为3组，模型组(生理盐水)、青钱柳醇提取物组(青钱柳醇提取物)、青钱柳水提取物组(青钱柳水提取物)，每日灌胃1次，剂量为100mg/Kg。每隔一日用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b),按Carlsson公式即V＝a·b2/2计算肿瘤体积。
连续给药21天，末次给药后次日将小鼠断颈处死，剥离肿瘤称量其质量并计算肿瘤抑制率(％)。
肿瘤抑制率(％)＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％；并将肿瘤体积变化对时间作出生长曲线，研究曲线的斜率变化分析肿瘤在小鼠体内的生长速率以及青钱柳提取物对肿瘤生长的影响。
结果见图1，青钱柳提物可以抑制EMT6乳腺肿瘤的生长。图中可以发现灌胃青钱柳醇提物组小鼠肿瘤质量与模型组相比明显减轻。在一定程度上可以影响肿瘤的体积增加，青钱柳水提物对肿瘤生长有明显抑制作用。
表2青钱柳对肿瘤质量影响(M±SE)
注：M-算数平均数，SE-标准误差。
表2数据发现青钱柳水提物对肿瘤生长抑制率达到51.57％；此外与模型组相比该组小鼠肿瘤生长速度被显著抑制。
综上，本发明所述的青钱柳提取物可作为活性成分，辅以可用于药物或保健品的附加剂制备成防治乳腺癌的药物或保健品。所述防治乳腺癌的药物可以为固体制剂如颗粒剂、片剂、滴丸剂、粉针剂或胶囊；或液体制剂如口服液或饮料。

Claims (10)

1.一种青钱柳提取物在制备乳腺癌药物或保健品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述青钱柳提取物的制备方法如下：
(1)青钱柳叶粉碎后，按照料液比为(1:5)-(1:60)(g/mL)的比例，加入体积浓度为20％-80％的乙醇溶液或水，在60℃-90℃下，超声波提取获得提取液；
(2)提取液离心后获得上清液，经浓缩后冷冻干燥得到青钱柳提取物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1)所述青钱柳叶粉碎后过30-1000目筛。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1)所述超声波提取的功率为50-300w，提取时间为1-4小时。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1)所述超声波提取2-4次，然后合并每次提取液。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1)所述青钱柳叶为新叶、老叶或落叶。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤2)所述离心是指4000r/min，离心10min。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤2)所述冷冻干燥是指在-20℃～-50℃下，干燥12h-48h。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述青钱柳提取物作为活性成分，辅以可用于药物或保健品的附加剂制备成防治乳腺癌的药物或保健品。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述防治乳腺癌的药物为固体制剂或液体制剂，所述固体制剂为颗粒剂、片剂、滴丸剂、粉针剂或胶囊；所述液体制剂为口服液或饮料。
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